CN114712569B - 一种可再生抗菌兼促成骨钛基金属材料及其制备方法和应用 - Google Patents

一种可再生抗菌兼促成骨钛基金属材料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医用高分子技术领域，具体涉及一种可再生抗菌兼促成骨钛基金属材料及其制备方法和应用，包括以下步骤：将清洗干燥的钛基金属材料进行碱热活化；将处理之后的钛基金属材料用硅烷偶联剂进行处理；将上述处理的钛基金属材料与甲基丙烯酸、N,N'‑亚甲基二丙烯酰胺进行自由基聚合反应；再将其进行酰胺化改性；最后将酰胺化改性钛基金属材料经次氯酸盐溶液浸泡后洗涤干燥。本发明创造性地将亚精胺共价结合到材料表面，使其成为N‑卤胺抗菌高分子的核心成分，不仅可引入高效可再生抗菌性能，还可在卤素消耗后得到亚精胺结构，引入潜在的促成骨作用，有望在骨科治疗中预防感染并促进成骨。

Description

一种可再生抗菌兼促成骨钛基金属材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医用高分子技术领域，具体涉及一种可再生抗菌兼促成骨钛基金属材料及其制备方法和应用。
技术背景
钛及其合金(Ti)因具有良好的力学性能、耐腐蚀性及生物相容性，是广泛应用于临床的骨科内植物材料，仅中国每年应用内植物进行骨折治疗超过500万例。内植物周围组织与天然骨周围组织不同，对细菌侵袭的防御能力较弱，一旦细菌在内植物表面形成生物膜，难以被机体的免疫系统清除。目前内植物相关感染率高达0.5％-6％，约占院内感染的45％，是引起骨科手术失败的主要原因，经常导致二次手术或外固定物更换，增加患者的治疗成本和安全风险。通过表面改性或整体改性向Ti中加入抗菌成分，来抑制或杀灭细菌，已成为控制植入物相关感染的有效途径。然而现有研究中的抗生素涂层或银、铜等金属涂层因其可能引起抗生素耐药或重金属离子释放造成的细胞毒性等，从而干扰植入物与骨组织的界面成骨，引起植入物治疗失败，无法满足骨科临床需要。
作为一种有机非抗生素类抗菌剂，N-卤胺化合物具有广谱抗菌性和高生物安全性。如N-Cl卤胺化合物不仅可通过与细菌的直接接触杀菌还可通过释放氯正离子杀菌，这种双重的抗菌功能还可在Cl消耗完后重新卤化进行充能。作为可形成这种N-卤胺结构的前体物质，亚精胺这一人体内天然存在的多胺，在人体细胞的增殖和分化过程中起重要作用。大量研究表明，亚精胺不仅能够上调骨髓间充质干细胞和成骨细胞中骨桥蛋白、Runx2、碱性磷酸酶等成骨标志物的表达，还能够抑制破骨细胞中的分化标志物如组织蛋白酶K、基质金属蛋白酶9、抗酒石酸酸性磷酸酶5b的表达。此外，体内实验的研究证明给予口服亚精胺治疗，不仅能够提升老年雌性小鼠的骨量和骨的机械强度，还能够有效逆转去卵巢骨质疏松模型小鼠的骨量下降和破骨细胞增多。因此，使用亚精胺这一人体内天然存在的多胺类物质，使其成为N-卤胺抗菌高分子的核心成分，不仅能够获得良好的抗菌性和生物安全性，还可以在卤素释放后得到具有潜在促成骨作用的亚精胺结构。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的问题，提供一种可再生抗菌兼促成骨钛基金属材料及其制备方法和应用。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
一种可再生抗菌兼促成骨钛基金属材料的制备方法，包括以下步骤：
S1.将清洗干燥的钛基金属材料进行碱热活化；
S2.将步骤S1处理之后的钛基金属材料用硅烷偶联剂进行处理；
S3.在引发剂作用下，将经由步骤S2处理的钛基金属材料与甲基丙烯酸、N,N'-亚甲基二丙烯酰胺进行自由基聚合反应；
S4.将经由步骤S3处理的钛基金属材料进行酰胺化改性；
S5.将步骤S4酰胺化改性钛基金属材料经次氯酸盐溶液浸泡后洗涤干燥，即得。
本发明提供的可再生抗菌兼促成骨钛基金属材料制备方法，首先对钛基金属材料进行碱热活化，得到带有活性羟基的表面；接着用硅烷偶联剂改性处理后再与甲基丙烯酸单体进行自由基聚合反应完成甲基丙烯酸接枝，随后再用亚精胺进行酰胺改性，再用次氯酸钠溶液进行浸泡处理，即可在钛基金属材料表面形成可再生抗菌兼促成骨的涂层。我们创造性地将亚精胺这一物质引入到材料表面，不仅使其成为N-卤胺抗菌高分子的核心成分，而且在卤素释放后还可得到具有潜在促成骨作用的亚精胺结构。此外，不同于其它化学合成胺类所具有的毒副作用(如乙二胺和三乙胺对肝、肾等重要器官的损伤)，亚精胺是一种广泛存在于机体内的天然多胺，具有良好的生物安全性。因此，这类含天然亚精胺的可再生抗菌兼促成骨涂层具有较高的临床应用价值。
优选地，所述步骤S1的具体步骤包括：将清洗干燥的钛基金属材料置于氢氧化钠溶液中在55-60℃下反应22-24h。
优选地，所述步骤S2的具体步骤包括：将步骤S1处理后的钛基金属材料放入乙醇水溶液中，在惰性气体保护下缓慢加入乙酸和硅烷偶联剂，搅拌后升温至50-60℃，继续搅拌1.5-4h，依次用无水乙醇和水分别清洗后烘干。
进一步优选地，步骤S2中所述硅烷偶联剂为带双键硅烷偶联剂。更进一步优选为KH570。
优选地，所述步骤S3的具体步骤包括：将步骤S2处理后的钛基金属材料加入到水中，搅拌状态下缓慢加入甲基丙烯酸、N,N'-亚甲基二丙烯酰胺(MBAA)和偶氮二异丁咪唑盐(AIBA)引发剂，待完全溶解后，在惰性气体保护下50-70℃加热搅拌22-26h，清洗后干燥保存。
进一步优选地，步骤S3中MBAA和甲基丙烯酸的摩尔比为0：1、1:1000、2:1000中至少一种，更进一步优选为1:1000。
优选地，所述步骤S4的具体步骤包括：将步骤S3处理后的钛基金属材料加入到水中，搅拌状态下缓慢加入2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(CDMT)，再缓慢滴加亚精胺，在惰性气体保护下70-90℃加热搅拌23-26h，清洗后干燥保存。
进一步地，步骤S4中CDMT与亚精胺(Spd)的质量体积比为1:3-6g/mL。
优选地，所述步骤S5的具体步骤包括：将步骤S4处理后的钛基金属材料加入到4％-7.5％的次氯酸盐溶液中(进一步优选为次氯酸钠溶液)，于0-4℃下避光浸泡0.5-6h，清洗后避光干燥保存。
进一步优选地，步骤S5中于4％-7.5％次氯酸盐溶液中浸泡时间设置为0.5h、1h、3h、6h系列梯度的反应条件，更进一步优选为7.5％次氯酸盐溶液浸泡3h。
所述可再生抗菌兼促成骨钛基金属材料的制备方法制备得到的可再生抗菌兼促成骨钛基金属材料。
所述可再生抗菌兼促成骨钛基金属材料在制备骨科植入物和外固定物上的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
本发明公开的一种可再生抗菌兼促成骨钛基金属材料及其制备方法和应用，对碱热活化处理后的钛片经过硅烷偶联剂改性、与甲基丙烯酸进行自由基聚合反应、接枝亚精胺进行酰胺改性，然后经过次氯酸钠溶液浸泡，即可得到含有亚精胺的抗菌兼促成骨的高分子涂层。本发明创新造性地将亚精胺共价结合到材料表面，使其成为N-卤胺抗菌高分子的核心成分，不仅可引入高效可再生抗菌性能，还可在卤素消耗后得到亚精胺结构，引入潜在的促成骨作用，有望在骨科治疗中预防感染并促进成骨。
附图说明
图1为对比例1、实施例1-6制备得到的不同钛基金属材料有效氯含量柱状图；
图2为实施例2制备得到的Ti-Spd-Cl释放性抗菌及接触性抗菌性能检测图；
图3为实施例2制备得到的Ti-Spd-Cl抗菌再生能力检测图；
图4为实施例2制备得到的Ti-Spd-Cl及对比例1制备得到的Ti的扫描电镜照片；
图5为实施例2制备得到的Ti-Spd-Cl、对比例2制备得到的Ti-Spd及对比例1制备得到的Ti的细胞毒性检测图；
图6为实施例2制备得到的Ti-Spd-Cl、对比例2制备得到的Ti-Spd及对比例1制备得到的Ti对hBM-MSC成骨分化功能的影响情况图；
图7为对比例1制备得到的Ti、对比例3制备得到的Ti-OH、对比例4制备得到的Ti-KH570、对比例5制备得到的Ti-PMAA、对比例2制备得到的Ti-Spd及实施例2制备得到的Ti-Spd-Cl对hBM-MSC细胞骨架形态的影响情况图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例和对比例将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
除特殊说明，本实施例中所用的设备均为常规实验设备，所用的材料、试剂若无特殊说明均为市售得到，无特殊说明的实验方法也为常规实验方法。
实施例1一种可再生抗菌兼促成骨钛基金属材料的制备方法(无MBAA)
该制备方法具体包括以下步骤：
步骤(1)：取直径为9.5mm、厚为0.3mm的圆片状钛基金属片用#800、#1200、#2000、#3000SiC砂纸逐级打磨，然后用丙酮、无水乙醇和去离子水进行超声清洗并烘干处理。
步骤(2)：将步骤(1)处理后的钛基金属片置于5mol/L NaOH溶液，升温至60℃反应24h进行碱热处理；然后用去离子水、乙醇交替搅拌清洗3次各15min后烘干，得到带活化羟基的钛基金属片。
步骤(3)：将步骤(2)处理后的钛基金属片放入装有100mL 75％乙醇的圆底烧瓶中，密封后通0.5h氮气除氧，搅拌下用注射器缓慢注入1.5mL乙酸和3mL KH570硅烷偶联剂，再于55℃油浴锅中加热搅拌3h，用无水乙醇和水交替搅拌清洗3次，每次15min，得到表面含有双键的钛基金属片。
步骤(4)将步骤(3)处理后的钛基金属片置于装有160mL去离子水的圆底烧瓶中，室温搅拌下加入0.1mol甲基丙烯酸、0.5mmolAIBA，搅拌至完全溶解后，密封通0.5h氮气除氧，在65℃油浴锅中搅拌24h，反应结束后使用去离子水及无水乙醇交替搅拌清洗3次，每次10分钟以去除多余单体、引发剂。
步骤(5)将步骤(4)处理后的钛基金属片置于装有35mL去离子水的圆底烧瓶中，缓慢加入0.1g CDMT并于室温下搅拌30min，再缓慢滴加0.58mL亚精胺，密封后通0.5h氮气除氧，置于80℃油浴锅中加热搅拌反应24h，用去离子水搅拌清洗3次，每次5分钟，得到酰胺改性的钛基金属片。
步骤(6)将步骤(5)处理后的钛基金属片置于约80mL约7.5％的次氯酸钠溶液中，4℃温度下避光浸泡3h，去离子水清洗3次并烘干，得到卤胺改性的钛基金属片(Ti-Spd-Cl)。
实施例2一种可再生抗菌兼促成骨钛基金属材料的制备方法(MBAA：甲基丙烯酸＝1：1000)
除步骤(4)中还多涉及MBAA外，其他步骤的制备方法同实施例1，该实施例的步骤(4)为：
(4)将步骤(3)处理后的钛基金属片置于装有160mL去离子水的圆底烧瓶中，室温搅拌下加入0.1mol甲基丙烯酸、0.5mmol AIBA、0.1mmol MBAA，搅拌至完全溶解后，密封通0.5h氮气除氧，在65℃油浴锅中搅拌24h，反应结束后使用去离子水及无水乙醇交替搅拌清洗3次，每次10分钟以去除多余单体、引发剂。
实施例3一种可再生抗菌兼促成骨钛基金属材料的制备方法(MBAA：甲基丙烯酸＝2：1000)
该实施例的制备方法同实施例2，不同之处在于MBAA的用量为0.2mmol。
实施例4一种可再生抗菌兼促成骨钛基金属材料的制备方法
该实施例的制备方法同实施例2，不同之处在于步骤(6)中酰胺改性的钛基金属片在次氯酸钠溶液中浸泡的时间为0.5h。
实施例5一种可再生抗菌兼促成骨钛基金属材料的制备方法
该实施例的制备方法同实施例2，不同之处在于步骤(6)中酰胺改性的钛基金属片在次氯酸钠溶液中浸泡的时间为1h。
实施例6一种可再生抗菌兼促成骨钛基金属材料的制备方法
该实施例的制备方法同实施例2，不同之处在于步骤(6)中酰胺改性的钛基金属片在次氯酸钠溶液中浸泡的时间为6h。
对比例1一种未经抗菌改性处理的钛基金属材料的制备方法，具体包括以下步骤：
取直径为9.5mm、厚为0.3mm的圆片状钛基金属片用#800、#1200、#2000、#3000SiC砂纸逐级打磨，然后用丙酮、无水乙醇和去离子水进行超声清洗并烘干保存，即得钛片(Ti)。
对比例2一种可再生抗菌兼促成骨钛基金属材料的制备方法
该实施例的制备方法同实施例2，不同之处在于未进行步骤(6)的次氯酸钠溶液卤化处理，得到Ti-Spd。
对比例3一种经碱热活化处理的钛基金属材料的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤(1)：取直径为9.5mm、厚为0.3mm的圆片状钛基金属片用#800、#1200、#2000、#3000SiC砂纸逐级打磨，然后用丙酮、无水乙醇和去离子水进行超声清洗并烘干保存。
将步骤(1)处理后的钛基金属片置于5mol/L NaOH溶液，升温至60℃反应24h进行碱热处理；然后用去离子水、乙醇交替搅拌清洗3次各15min后烘干保存，得到带活化羟基的钛基金属片Ti-OH。
对比例4一种接枝硅烷偶联剂KH570的钛基金属材料的制备方法，具体包括一下步骤：
该实施例的制备方法同对比例3，不同之处在于后续还进行以下步骤：将处理后的钛基金属片放入装有100mL 75％乙醇的圆底烧瓶中，密封后通0.5h氮气除氧，搅拌下用注射器缓慢注入1.5mL乙酸和3mLKH570硅烷偶联剂，再于55℃油浴锅中加热搅拌3h，用无水乙醇和水交替搅拌清洗3次，每次15min后烘干保存，得到表面含有双键的钛基金属片Ti-KH570。
对比例5一种接枝聚甲基丙烯酸PMAA的钛基金属材料的制备方法，具体包括以下步骤：
该实施例的制备方法同对比例4，不同之处在于后续还进行以下步骤：处理后的钛基金属片置于装有160mL去离子水的圆底烧瓶中，室温搅拌下加入0.1mol甲基丙烯酸、0.5mmolAIBA，搅拌至完全溶解后，密封通0.5h氮气除氧，在65℃油浴锅中搅拌24h，反应结束后使用去离子水及无水乙醇交替搅拌清洗3次，每次10分钟以去除多余单体、引发剂，烘干保存，得到Ti-PMAA。
实验例1碘量法检测氯离子含量
本发明中样品的抗菌结构为亚精胺形成的N-卤胺结构，测量样品中有效氯含量可反映N-卤胺结构接枝率及抗菌性能，故本实验采用传统的碘量法测量样品的有效氯含量。首先将实施例1-6及对比例1的样品烘干后备用，在小烧瓶中加入10mL蒸馏水，橡皮塞封口，通氮气除氧，快速加入样品和2g碘化钾。加入2mL10％硫酸溶液，避光静置10min。加入3滴淀粉指示剂，使溶液从黄色变成紫蓝色，用0.001mol/L的硫代硫酸钠溶液滴至溶液变澄清为止。记录各组Na2SO3溶液的使用体积，根据所消耗Na2SO3溶液的体积计算有效氯含量。
如图1所示，以碘量法计算样本有效氯含量(柱状图显示对比例1及实施例1-6材料的有效氯含量；NS表示经统计学分析后无明显差异；****表示经统计学分析后实施例组与对比例数据p＜0.0001；####表示经统计学分析后实施例4与实施例5数据间p＜0.0001)。
对比例1及实施例1-6有效氯含量的平均值分别为0、142.9ppm、198.5ppm、200.9ppm、142.4ppm、161.3ppm和199.1ppm，实施例1-6制备得到的Ti-Spd-Cl与对比例1制备得到的Ti存在显著的统计学差异(p<0.001)，实施例2、3、6含氯量相近。考虑到样本制作的时间和经济成本及抗菌性能与生物相容性的平衡，以实施例2(Ti-Spd-Cl)进行下一步的抗菌性能、生物相容性、成骨性能及物理化学特性检测。
实验例2体外抗金葡萄球菌检测
为明确改性钛基金属材料的抗菌性能，对实施例2制备得到的Ti-Spd-Cl进行释放性抗菌及接触性抗菌性能评估。释放性抗菌实验具体实施方法为：将Ti-Spd-Cl及Ti(对比例1)分别放置在48孔板上各对应的组中，每组3个样本。调整金黄色葡萄球菌菌液浓度至106CFU/mL，然后向每个孔中加入300μL的金黄色葡萄球菌菌液，然后分别将Ti-Spd-Cl及Ti与菌液共培养12h，培养结束后吸取上清液用涂板计数法测量细菌数量，检测Ti-Spd-Cl的释放性抗菌性能。接触性实验具体实施方式为：首先将Ti-Spd-Cl及Ti(对比例1)分别放置在48孔板上各对应的实验组中，每组3个样本。其中，以对比例1所在的实验组为对照组。调整金黄色葡萄球菌菌液浓度调至106CFU/ml，向每个样本上滴加25μL的金黄色葡萄球菌菌液，使菌液均匀的覆盖在样本表面上。分别将Ti-Spd-Cl及Ti与菌液共培养6h后，在各实验组中加入500μL PBS并超声5min，吸取上清液用涂板计数法测量细菌数量，检测Ti-Spd-Cl的接触性抗菌性能。
释放性抗菌及接触性抗菌结果如图2显示，图A表示Ti-Spd-Cl释放性抗菌能力检测结果，具体为金黄色葡萄球菌分别与Ti及Ti-Spd-Cl共培养后的菌落形成单位情况及抗菌率统计表；图B表示Ti-Spd-Cl接触性抗菌能力检测结果，具体为金黄色葡萄球菌分别在Ti及Ti-Spd-Cl表面接触培养后，材料表面的菌落形成情况及抗菌率统计表；****表示经统计学分析后两组数据间p＜0.0001。
Ti-Spd-Cl平均接触性抗金黄色葡萄球菌率为95.4％，对照组Ti与Ti-Spd-Cl存在显著的统计学差异(p<0.0001)。Ti-Spd-Cl平均释放性抗金黄色葡萄球菌率为79.8％，且对照组Ti与Ti-Spd-Cl存在显著的统计学差异(p<0.0001)，Ti-Spd-Cl对金黄色葡萄球菌表现出了优异的抗菌性能，且接触性抗菌效果更为优异。
实验例3抗菌再生能力检测
为明确实施例2制备得到的Ti-Spd-Cl的抗菌再生能力，对抗菌实验后的Ti-Spd-Cl进行再氯化和有效氯含量测量。将经抗菌实验后的Ti-Spd-Cl于水中超声清洗表面的残留物，再使用75％乙醇消毒后烘干保存。首先使用碘量法检测Ti-Spd-Cl样本残留氯的含量，根据所消耗Na2SO3溶液的体积计算有效氯含量。再将干燥后的样本放入7.5％的次氯酸钠溶液中，于4℃下避光浸泡3h进行再氯化，使用碘量法根据消耗Na2SO3溶液的体积来计算有效氯含量。
结果如图3所示，柱状图显示Ti-Spd-Cl在抗菌前、抗菌后和再氯化后的有效氯含量；**表示经统计学分析后两组数据间差异有统计学意义。
抗菌实验前的Ti-Spd-Cl有效氯含量为197.3ppm，抗菌实验后的Ti-Spd-Cl的有效氯含量为48.5ppm，经再氯化处理后其有效氯含量为183.2ppm，达到初始值的92.9％以上，说明Ti-Spd-Cl的抗菌有效成分具有可重复再生的能力。
实验例4物理化学特性检测
本实验使用扫描电镜观察实施例2制备的Ti-Spd-Cl和对比例1制备的Ti的表面形貌，观察比较改性前后钛金属材料的表面形貌差异，结果如图4所示。
图A表示120k倍放大倍数下Ti-Spd-Cl和Ti表面形貌；图B表示相同位置200k倍放大倍数下Ti-Spd-Cl和Ti表面形貌。
如图4所示，未改性Ti具有较光滑的表面，可见打磨时产生的划痕；而Ti-Spd-Cl表面具有无序格栅样结构，说明含有天然亚精胺的抗菌高分子成分在钛表面成功接枝形成了聚合物高分子层。
实验例5细胞毒性检测
将实施例1制备的Ti-Spd-Cl、对比例2制备的Ti-Spd及对比例1制备的Ti，分别作为实验组1、实验组2及对照组，每组样品各取3片放入48孔板中，用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养hBM-MSC；细胞贴壁生长后，更换新鲜的培养基，当细胞达到80％的聚集程度时，将细胞以3*104/孔的密度接种在48孔板中的材料表面培养24h。使用CCK-8试剂盒进行细胞毒性检测，在450nm波长下通过酶标仪测定各组吸光度。
实验结果如图5所示，图示为使用CCK8试剂检测Ti-Spd-Cl、Ti-Spd及Ti表面hBM-MSC的细胞活性情况；NS表示经统计学分析后无明显差异。
由图5可知1天，3天，7天时Ti-Spd-Cl、Ti-Spd与Ti表面细胞的CCK8检测结果相近，相互之间均无统计学差异。说明Ti-Spd-Cl与Ti-Spd的细胞相容性良好，细胞能在其表面正常生长增殖。
实验例6体外成骨活性检测
将实施例2制备的Ti-Spd-Cl、对比例2制备的Ti-Spd及对比例1制备的Ti分别作为实验组1、实验组2及对照组，每组样品各取3片放入48孔板中。用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养人骨髓来源间充质干细胞(hBM-MSC)；细胞贴壁生长后，更换新鲜的培养基；待细胞达到80％的聚集程度时，将细胞以3*104/孔的密度接种在48孔板中的样品表面上，待细胞贴壁生长后，更换为含有体积分数10％的胎牛血清、1％双抗、1％磷酸甘油、1‰维生素C、0.1‰地塞米松的DMEM培养基作为成骨诱导培养基，诱导hBM-MSC进行成骨分化。在成骨诱导分化的第10天和第14天使用多聚甲醛固定细胞，加入茜素红染液对材料表面的钙结节进行染色，观察不同样本材料表面的着色情况。
如图6所示，图A表示Ti-Spd-Cl、Ti-Spd及Ti表面的hBM-MSC经10天成骨诱导后，材料表面的茜素红染色情况；图B表示Ti-Spd-Cl、Ti-Spd及Ti表面的hBM-MSC经14天成骨诱导后，材料表面的茜素红染色情况。
结果如图所示，Ti-Spd-Cl及Ti-Spd在成骨诱导hBM-MSC分化的10天和14天时，茜素红染色结果显示表面的红染的钙沉积区域明显高于未改性Ti，表现出较多的红色颗粒钙结节，证明Ti-Spd-Cl及Ti-Spd具有良好的促进hBM-MSC的成骨分化能力。在第14天时未改性Ti表面细胞凋亡加重，露出具有金属光泽的Ti表面；而Ti-Spd-Cl随着卤素的释放，逐渐还原为含有天然亚精胺的结构，其表面茜素红染色较10天时加深。
实验例7细胞骨架染色观察
将实施例2制备的Ti-Spd-Cl与对比例1制备的i、对比例2制备的Ti-Spd、对比例3制备的Ti-OH、对比例4制备的Ti-KH570、对比例5制备的Ti-PMAA每组样品各取3片放入48孔板中。用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养人骨髓来源间充质干细胞(hBM-MSC)；细胞贴壁生长后，更换新鲜的培养基；待细胞达到80％的聚集程度时，将细胞以0.5*104/孔的密度接种在48孔板中的样品表面上培养24h。之后使用多聚甲醛固定细胞、0.5％Triton试剂破膜，山羊血清进行封闭，并使用鬼笔环肽对细胞骨架进行着色，使用DAPI细胞核进行着色，使用激光共聚焦显微镜(LSM-710)于400×放大倍数下进行观察不同样本表面细胞骨架形态。
如图7所示，结果表明培养24小时后不同材料表面的hBM-MSC细胞表现出不同的形态。Ti组、Ti-KH570组、Ti-PMAA组细胞骨架形态差，细胞未完全伸展，微丝微管结构不明显，其中Ti-PMAA组细胞皱缩成团。Ti-OH组、Ti-Spd组及Ti-Spd-Cl组细胞完全伸展，细胞核形完整，染色质均匀。尤其在Ti-Spd组细胞可清晰分辨微丝微管结构，微丝之间已建立良好连接，且细胞伸展呈现明显的梭形形态，可见细胞伸出明显伪足形成牢固附着，说明Ti-Spd更有利于hBM-MSC细胞后续的成骨分化以及相关蛋白的表达。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (3)

1.一种可再生抗菌兼促成骨钛基金属材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将清洗干燥的钛基金属材料进行碱热活化；
S2.将步骤S1处理之后的钛基金属材料用硅烷偶联剂进行处理；
S3.在引发剂作用下，将经由步骤S2处理的钛基金属材料与甲基丙烯酸、N,N'-亚甲基二丙烯酰胺进行自由基聚合反应；
S4.将经由步骤S3处理的钛基金属材料进行酰胺化改性；
S5.将步骤S4酰胺化改性钛基金属材料经次氯酸盐溶液浸泡后洗涤干燥，即得；
所述步骤S1的具体步骤包括：将清洗干燥的钛基金属材料置于氢氧化钠溶液中在55-60℃下反应22-24h，清洗后烘干；
所述步骤S2的具体步骤包括：将步骤S1处理后的钛基金属材料放入乙醇水溶液中，在惰性气体保护下缓慢加入乙酸和硅烷偶联剂，搅拌后升温至50-60℃，继续搅拌1.5-4h，清洗后烘干；
所述步骤S3的具体步骤包括：将步骤S2处理后的钛基金属材料加入到水中，搅拌状态下缓慢加入甲基丙烯酸、N,N'-亚甲基二丙烯酰胺和引发剂，待完全溶解后，在惰性气体保护下50-70℃加热搅拌22-26h，清洗后烘干；
所述步骤S4的具体步骤包括：将步骤S3处理后的钛基金属材料加入到水中，搅拌状态下缓慢加入2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪，再缓慢滴加亚精胺，在惰性气体保护下70-90℃加热搅拌23-26h，清洗后烘干；
所述步骤S5的具体步骤包括：将步骤S4处理后的钛基金属材料加入到4％-7.5％的次氯酸盐溶液中，于0-4℃下避光浸泡0.5-6h，清洗后避光干燥保存。
2.权利要求1所述方法制备得到的可再生抗菌兼促成骨钛基金属材料。
3.权利要求2所述可再生抗菌兼促成骨钛基金属材料在制备骨科植入物和外固定物上的应用。
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