CN106588581A

CN106588581A - 芪类衍生物及其应用

Info

Publication number: CN106588581A
Application number: CN201510671186.8A
Authority: CN
Inventors: 李龙; 方晒
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Guangzhou City Love New Pu Pharmaceutical Technology Co Ltd
Priority date: 2015-10-15
Filing date: 2015-10-15
Publication date: 2017-04-26

Abstract

本发明涉及DNA螺旋酶抑制剂技术领域，具体为一种芪类衍生物及其作为DNA螺旋酶抑制剂的应用。本发明通过研究新合成了一种对DNA螺旋酶具有抑制活性的芪类衍生物，该芪类衍生物的结构简单、易于改造，并且细胞毒性试验显示该芪类衍生物的毒性小。另外，本发明公开了该芪类衍生物可以用于抗菌，包括可用于治疗由耐药菌(如MRSA)等菌种引起的感染等严重危害人体健康的疾病。本发明公开的芪类衍生物在作为先导化合物优化研究方面具有良好的发展前景。

Description

芪类衍生物及其应用

技术领域

本发明涉及DNA螺旋酶抑制剂技术领域，尤其涉及一种芪类衍生物及其作为DNA螺旋酶抑制剂的应用。

背景技术

细菌耐药已经成为严重的公共卫生危机，细菌耐药导致患者治疗失败、医疗费用增加、病死率上升，更为严重的是耐药菌的进一步发展可能使人类重新面临感染性疾病的威胁。然而近二十年来却很少有新型抗菌药物上市，2001-2012年，美国FDA批准上市的新药中仅有12个属于抗菌药物，且仅有三类新骨架，但这三类结构较复杂；除此之外，以上发现的抗菌药物仅对革兰氏阳性菌有抑制作用，尚未被发现对耐药革兰阴性菌有良好抗菌活性的抗菌药物。面对以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，MRSA)、肠杆菌(Enterobacter，大肠杆菌E.coli)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等为代表的多药耐药菌大幅度扩散，感染性疾病致死率持续攀高的局面，寻找和设计有效抑制耐药菌的新策略、新药物具有重大意义。

DNA螺旋酶是目前作为抗菌药物的一个重要靶标，被广泛研究。DNA螺旋酶已从多种细菌中分离出来，通过基因序列比对发现不同菌种的酶具有高度的序列同源性。随着X-ray晶体结构信息的完善，DNA旋转酶的结构特征也更加明了。DNA螺旋酶是一个四聚体(A₂B₂)，有两个A亚基(大小90-100KDa，具体大小取决于不同菌种)和两个B亚基(大小70-90KDa)。具体到大肠杆菌DNA旋转酶，两种亚基GyrA、GyrB分别具有不同的功能域：DNA断裂-重接域(DNA Breakage-Reunion Domain)和ATP酶结合域(ATPase Domain)。大肠杆菌DNA旋转酶是最早被克隆、表达和纯化的用于细菌螺旋酶的抑制剂发现的研究。

葛兰素史克等药企及个人对DNA螺旋酶抑制剂都有相关的研究，相关文献中已报到的DNA螺旋酶抑制剂的代表性活性化合物有GSK 299423，NXL 101和gyramide等。其中NXL 101是唯一一个发展到临床试验，并且对耐氟喹诺酮细菌具有一定的活性DNA螺旋酶抑制剂。因此，继续寻找DNA螺旋酶抑制剂是非常重要的。

发明内容

本发明针对现有的DNA螺旋酶抑制剂的结构复杂、副作用多，DNA螺旋酶抑制剂治疗耐药菌等引起的炎症的尝试仍未成功的问题，提供一种结构简单、易于改造的芪类衍生物，该种芪类衍生物可作为DNA螺旋酶抑制剂。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种芪类衍生物，其结构式如下：

优选的，上述结构式中的R为氢、羟基、卤素或苯基。

R为氢时，所述芪类衍生物是(E)-5-(3-氯苯乙烯)苯-1,3-二醇，其结构式是(化合物1)：

R为羟基时，所述芪类衍生物是(E)-5-(3-氯苯乙烯)苯-1,2,3-三醇，其结构式是(化合物2)：

R为溴时，所述芪类衍生物是(E)-2-溴-5-(3-氯苯乙烯)苯-1,3-二醇，其结构式是(化合物3)：

R为苯基时，所述芪类衍生物是(E)-4-(3-氯苯乙烯)-[1,1'-联二苯]-2,6-二醇，其结构式是(化合物4)：

以上所述的芪类衍生物或其药学上可接受的盐或含有其的药物组合物的用途，用于治疗和预防由细菌引起的感染性疾病。

优选的，以上所述的芪类衍生物或其药学上可接受的盐或含有其的药物组合物的用途，用于治疗和预防由耐药菌引起的感染性疾病。

优选的，以上所述的芪类衍生物或其药学上可接受的盐或含有其的药物组合物的用途，用于治疗和预防由MRSA耐药菌引起的感染性疾病。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过研究新合成了一种对DNA螺旋酶具有抑制活性的芪类衍生物，该芪类衍生物的结构简单、易于改造，并且细胞毒性试验显示该芪类衍生物的毒性小。另外，本发明公开了该芪类衍生物可以用于抗菌，包括可用于治疗由耐药菌(如MRSA)等菌种引起的感染等严重危害人体健康的疾病。本发明公开的芪类衍生物在作为先导化合物优化研究方面具有良好的发展前景。

附图说明

图1为化合物1-4对不同菌种的抗菌活性数据；

图2为化合物1对DNA螺旋酶的抑制活性结果；

图3为化合物2对DNA螺旋酶的抑制活性结果；

图4为化合物3对DNA螺旋酶的抑制活性结果；

图5为化合物4对DNA螺旋酶的抑制活性结果；

图6为化合物1-4的细胞毒性测试数据。

具体实施方式

为了更充分理解本发明的技术内容，下面结合具体实验对本发明的技术方案作进一步介绍和说明。下述实验中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实验1合成目标化合物

反应式如下(合成化合物1-3)：

试剂和条件：

(a)3-氯苯基膦酸二乙酯，NaH，无水四氢呋喃，回流；92％-96％；

(b)盐酸吡啶，71％-89％。

基本合成方法：在氮气保护的条件下，将3-氯苯基膦酸二乙酯(1.0mmol，0.22mL)加入到5mL的无水四氢呋喃中，然后在冰浴环境中加入2.0eq.的NaH，室温搅拌30min。接着向上述的混合物中加入相关的芳基醛(1.0mmol)，升温回流反应，TLC监测反应。反应完毕后，向反应混合物中缓慢加入冰水淬灭反应，用乙酸乙酯萃取反应混合物，合并有机相并减压浓缩，得到粗产物。粗产物经柱层析分离纯化(洗脱剂是：乙酸乙酯/石油醚＝1/10)即可得到目标化合物1-3。

化合物1是(E)-5-(3-氯苯乙烯)苯-1,3-二醇，为白色固体，质量为43.8mg，产率为89％，纯度为95.5％。

化合物2是(E)-5-(3-氯苯乙烯)苯-1,2,3-三醇，为白色固体，质量为37.2mg，产率为71％，纯度为95.4％。

化合物3是(E)-2-溴-5-(3-氯苯乙烯)苯-1,3-二醇，为白色固体，质量为34.1mg，产率为76％，纯度为95.6％。

合成目标化合物4的反应式如下：

试剂和条件：

(c)苯基硼酸，醋酸钯，K₂CO₃，PEG-400，89％；

(d)盐酸吡啶；77％。

基本方法合成：在氮气保护的条件下，化合物X(0.2mmol)与10.0eq.的吡啶盐酸盐混合，在180℃的条件下加热反应2h。反应完毕后，将反应混合物冷却至室温，然后向反应混合物中缓慢加入冰水，接着用乙酸乙酯萃取反应混合物，合并有机相并减压浓缩，得到粗产品。粗产物经柱层析分离纯化(洗脱剂：甲醇/二氯甲烷)即得目标产物4，(E)-4-(3-氯苯乙烯)-[1,1'-联二苯]-2,6-二醇，为白色固体，质量为49.6mg，产率为77％，纯度为95.3％。

分别测化合物1-4的质谱、核磁共振氢谱及核磁共振碳谱，验证上述合成的化合物的结构。测试数据及结果如下：

(E)-5-(3-氯苯乙烯)苯-1,3-二醇(化合物1)

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ_H 7.42(s,1H),7.31(d,J＝7.6Hz,1H),7.20(t,J＝7.7Hz,1H),7.14(d,J＝8.0Hz,1H),6.95(d,J＝4.8Hz,2H),6.56(d,J＝2.0Hz,2H),6.32(t,J＝1.9Hz,1H)；¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δ_C 159.7,140.8,140.5,135.7,131.5,131.1,128.4,128.2,127.3,125.8,106.6,103.7；MS(ESI):m/z 245.2[M-H]^-；HR-ESIMS:m/z Calcd for C₁₄H₁₀ClO₂[M-H]^-,245.0375；Found,245.0367。

(E)-5-(3-氯苯乙烯)苯-1,2,3-三醇(化合物2)

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ_H 7.36(s,1H),7.28(d,J＝7.8Hz,1H),7.17(t,J＝7.8Hz,1H),7.07(dd,J＝7.9,0.9Hz,1H),6.86(d,J＝16.3Hz,1H),6.73(d,J＝16.2Hz,1H),6.48(s,2H)；¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δ_C 147.1,141.5,135.6,135.0,131.9,131.1,129.7,127.7,126.9,125.4,125.3,107.1；MS(ESI):m/z 261.0[M-H]^-；HR-ESIMS:m/z Calcd for C₁₄H₁₀ClO₃[M-H]^-,261.0324；Found,261.0316。

(E)-2-溴-5-(3-氯苯乙烯)苯-1,3-二醇(化合物3)

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ_H 7.36(s,1H),7.23(t,J＝7.8Hz,2H),7.17(d,J＝1.8Hz,1H),6.91(d,J＝16.2Hz,2H),6.29(d,J＝2.6Hz,2H)；¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δ_C 157.8,140.8,137.4,135.8,131.3,130.5,128.8,127.8,127.5,126.0,105.4,104.5；MS(ESI):m/z 225.2[M+H]⁺。

(E)-4-(3-氯苯乙烯)-[1,1'-联二苯]-2,6-二醇(化合物4)

¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ_H 7.53(t,J＝1.7Hz,1H),7.44-7.37(m,5H),7.32-7.26(m,2H),7.23(ddd,J＝7.9,1.9,1.0Hz,1H),7.05(d,J＝1.9Hz,2H),6.68(s,2H)；¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δ_C 156.7,141.0,138.6,135.7,135.7,132.2,131.4,131.2,128.8,128.3,127.9,127.7,127.3,125.8,118.2,106.8；MS(ESI):m/z 321.0[M-H]^-；HR-ESIMS:m/z Calcd for C₂₀H₁₄ClO₂[M-H]^-,321.0688；Found,321.0675。

实验2化合物1-4对不同菌种的抗菌活性测试

化合物1-4对不同菌种的抗菌活性测试使用的是肉汤稀释法，具体测试步骤如下：

1、菌种复苏：将至于负80℃冰箱的不同菌种分别接种在牛血清培养基上，置于37℃、5％CO₂培养箱进行培养24h。

2、菌液稀释：取复苏的单一菌落于1mL生理盐水中，观察浊度至菌液浓度为1×10⁸CFU/mL，然后将该菌液使用培养基(如MH培养基或胰蛋白胨肉汤)稀释为1×10⁶CFU/mL，待用。

3、化合物处理：圆底96孔板中，第一列加入培养基90μL，其他除空白对照均加入培养基50μL；然后第一列中加入用DMSO溶解的化合物10μL，混合均匀；吸取第一列中的混合物50μL，置于第二列中混合均匀，以此类推，最终将化合物进行梯度稀释(256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/mL)；最后分别加入50μL步骤2中待用的菌液；其中最后一列为培养基和菌液的空白对照，最后一排为阳性对照(氨苄西林和/或万古霉素)；将96孔板置于37℃，5％CO₂培养箱培养48h。

4、吸光度测试：测量在600nm处的吸收值，确定化合物对不同菌种的MIC值。

测试结果如图1所示，化合物1-4对不同菌种均有一定抗菌活性。

实验3化合物1-4对DNA螺旋酶抑制活性测试

DNA超螺旋实验，利用化合物作用后抑制DNA的超螺旋过程，从而利用其光密度值来研究化合物对DNA螺旋酶的抑制作用。具体测试步骤如下：

1、化合物的配制：化合物1-4分别用DMSO溶解后，梯度稀释成不同浓度，并且保证终浓度中含1％DMSO，待用。

2、DNA超螺旋实验：将Rel-DNA，5×缓冲液(35mM Tris-HCl,pH 7.5,24mM KCl,6mM MgCl₂,1.8mM亚精胺,0.36mg/mL牛血清白蛋白)和ddH₂O按照一定比例混合，去上述混合液17μL加入EP管中，然后分别加入2μL的1中待用的化合物和1μL的DNA螺旋酶，将EP管置于37℃恒温水浴锅中1h，其中设置空白对照和阳性对照(新生霉素)等；孵育完成后个加入4μL终止缓冲液后，置于37℃恒温水浴锅中30min。

3、琼脂糖胶的配制：取1g琼脂糖胶粉加入到98mL超纯水中，然后加入5×缓冲液2μL，加热至完全溶解，倒入凝胶板至凝固，待用。

4、凝胶电泳实验：将3中待用的琼脂糖胶置于电泳槽中，依次加样后，60V、3h后于254nm波长下进行紫外观测结果。

5、数据处理：利用数据分析软件Quntity One分析条带的光密度值，进而转化为抑制率，进而利用GraphPad换算为IC₅₀。

化合物1的测试结果如图2所示，化合物2的测试结果如图3所示，化合物3的测试结果如图4所示，化合物4的测试结果如图5所示，化合物1-4对DNA螺旋酶超螺旋具有一定的抑制作用。

实验4化合物1-4的细胞毒性测试

利用人类肾胚胎HEK 293细胞模型，应用MTT法评估上述四个芪类衍生物(化合物1-4)的细胞毒性。具体测试方法如下：

1、配置MTT溶液：取125mg MTT粉末用50mL无菌PBS(0.01mM，pH＝7.4)溶解，配成2.5mg/mL，在超声清洗仪振荡数十秒，过滤除菌，然后于4℃避光保存。两周内使用有效，最好现配现用。

2、HEK 293细胞培养：HEK 293细胞使用含10％牛血清的DMEM培养基，在37℃、5％CO₂培养箱进行培养。

3、接种细胞：将生长良好的HEK 293细胞，小心弃去培养皿内的大部分细胞培养液，然后800rpm/min离心3min；弃去离心后的上清液，重新加入培养基，用血细胞计数板计数。用8道加样器吸取单细胞悬液加入96孔板中，100μL/孔，即50000个细胞/孔。

4、药物干预：在37℃，5％CO₂培养箱培养24h，待细胞贴壁后，分别用培养基稀释不同浓度药物处理细胞，设立不加任何处理因素的对照组、空白孔，每个浓度设3个平行复孔，将待测药物(化合物1-4)配置成10μM。加入待测药物溶液至100μL微孔中，与细胞于37℃，5％CO₂培养箱培养48h。每孔加入2.5mg/mL的MTT 20μL，于37℃，5％CO₂培养箱培养4h。弃去上清，每孔加100μL的DMSO，振荡20min，测量492nm处吸收值(A)。

细胞毒性评价：各组细胞抑制率(％)＝1-(A_实验组-A_空白组)/(A_对照组-A_空 _白组)×100％，进而得出各组细胞抑制率。

测试结果如图6所示，由图6可以看出，化合物1-4对HEK 293细胞均无明显毒性。

以上所述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容，以便于读者更容易理解，但不代表本发明的实施方式仅限于此，任何依本发明所做的技术延伸或再创造，均受本发明的保护。

Claims

1.一种芪类衍生物，其特征在于，所述芪类衍生物的结构式如下：

2.根据权利要求1所述一种芪类衍生物，其特征在于，所述芪类衍生物的结构式中，R为氢、羟基、卤素或苯基。

3.一种如权利要求1所述芪类衍生物或其药学上可接受的盐或含有其的药物组合物的用途，其特征在于，用于治疗和预防由细菌引起的感染性疾病。

4.根据权利要求3所述芪类衍生物或其药学上可接受的盐或含有其的药物组合物的用途，其特征在于，用于治疗和预防由耐药菌引起的感染性疾病。

5.根据权利要求4所述芪类衍生物或其药学上可接受的盐或含有其的药物组合物的用途，其特征在于，用于治疗和预防由MRSA耐药菌引起的感染性疾病。