CN104274454A - 一种抗药耐药金黄色葡萄球菌组合药物及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药学领域，涉及一种抗药耐药金黄色葡萄球菌组合药物及用途。本发明的抗药耐药金黄色葡萄球菌组合药物由大豆异黄酮与诺氟沙星组成，其中天然化合物大豆异黄酮可从植物中分离得到，尤其在豆科植物中的含量较高，且没有明显的毒副作用；经抑菌实验，结果显示，对于含有norA基因的耐氟喹诺酮类耐甲氧西林金黄色葡萄球菌SA1199B，大豆异黄酮本身没有抑制细菌生长作用，但与抗生素诺氟沙星以1:1配伍时形成的组合药物能使诺氟沙星的最低抑菌浓度值降低4倍，与阳性对照品利血平的增效能力相同；本发明所述组合药物，能降低诺氟沙星的最低抑菌浓度，对诺氟沙星产生抗耐药金黄色葡萄球菌的增效作用，可进一步制成抗耐药金黄色葡萄球菌药物或外用药物制剂。
Description
技术领域
本发明属于药学领域，涉及一种抗药耐药金黄色葡萄球菌组合药物及用途。具体涉及一种具有协同抗耐药金黄色葡萄球菌的化合物，尤其涉及化合物3-(4-羟基苯基)-5,7-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮及其在制备抗耐氟喹诺酮类耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(drug
resistant MRSA)药物中的用途。
背景技术
耐甲氧西林金黄葡萄球菌 (Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus,
MRSA) 为医院内最常见的传染病菌之一，除了浅表皮肤感染，还可以引起人体深度感染。研究显示，目前，对所有内酰胺类抗生素如青霉素等药物具有耐药性的MRSA，对大环内酯，氟喹诺酮，四环素等抗生素也都产生了耐药性，使其感染变得更加难以治疗。当前，可用于治疗MRSA的抗生素只有万古霉素，然而，完全抗万古霉素MRSA菌株2002年在美国已经出现。我国近年来由于抗生素广泛的使用，甚至滥用，特别是万古霉素在多家医院成为常规抗生素类用药之后，使抗生素类用药形势变得愈加严峻。本领域研究者认为，除了采取措施通过限制滥用抗生素以减缓耐药MRSA增长的速度，同时研发新的抗耐药MRSA药物势在必行，以防现有的抗菌药物无法起作用时，细菌的大规模爆发。
现有技术公开了细菌可通过多种途径产生耐药性 (Drug Resistance)，其中细菌对药物产生外排作用而导致的外泵 (efflux) 耐药性是重要的耐药性机制。根据世界卫生组织的报告，具有多药耐药外排泵的细菌引起的感染已经占到了院内感染的60%。
研究显示，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有多种耐药机制，除了具有染色体为40 kb的耐药基因 (mecA) 通过编码甲氧西林接合蛋白
(Penicilin Binding Protein，PBP) 产生对β-内酰胺类抗生素的耐药性之外，还对多种类型抗生素产生耐药性。对氟喹诺酮类
(fluoroquinolones) 通过过度表达NorA外泵蛋白产生耐药性。细菌细胞通过外排泵将普遍使用的绝大多数抗生素泵出细胞外，使细胞内的抗生素浓度降低而无法起到抗菌作用。
诺氟沙星是一种氟喹诺酮类抗生素，1986年开始被用于临床；因其对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌，尤其是金黄色葡萄球菌，具有较强的抑制作用而广泛用于尿道、呼吸道等的抗感染治疗；随着诺氟沙星在临床及畜牧业的广泛应用，细菌对其产生了严重耐药性，从而限制了诺氟沙星的应用。目前已知，产生耐药性的机制多样，其中之一便是细菌外排泵；因此，选择具有NorA外泵基因的MRSA细菌株作为外泵抑制剂的筛选靶标是寻找具有外泵抑制作用的抗耐药金葡菌抗生素增敏剂的一种重要途径。本发明的申请人针对目前的抗生素类用药形势拟提供一种新的抗药耐药金黄色葡萄球菌组合药物。
与本发明有关的技术参考文献：
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Infectious Diseases. 2001, 7: 337–341.。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗药耐药金黄色葡萄球菌组合药物。具体涉及一种具有协同抗耐药金黄色葡萄球菌的化合物，尤其涉及化合物3-(4-羟基苯基)-5,7-二羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮及其在制备抗耐氟喹诺酮类耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(drug
resistant MRSA)药物中的用途。
本发明的抗药耐药金黄色葡萄球菌组合药物，其特征在于，由大豆异黄酮与诺氟沙星组成；其中，
所述大豆异黄酮与诺氟沙星的质量比为5 : 1 ，4 : 1，3 : 1，2 : 1，1 : 1，1 : 2，1 : 3，1 : 4，1 : 5，本发明的一个实施例中优选大豆异黄酮与诺氟沙星的质量比为1 : 1；
本发明中，所述大豆异黄酮（genistein），又称染料木素，分子式为C15H10O5，具有如式（Ⅰ）所示的结构，
（Ⅰ）；
所述大豆异黄酮可从植物中分离得到，尤其在豆科植物中的含量较高，且没有明显的毒副作用；该大豆异黄酮在制备抗药耐药金黄色葡萄球菌组合药物中的作用为抗菌增效剂；
本发明中，所述的金黄色葡萄球菌为对甲氧西林类抗生素具有耐药性的金黄色葡萄球菌，其同时具有对氟喹诺酮类抗生素药物的耐药性。本发明的一个实施例中优选耐氟喹诺酮金葡菌SA1199菌株进行抑菌试验。
本发明进行了天然化合物大豆异黄酮与抗生素诺氟沙星不同浓度下对耐氟喹诺酮金葡菌SA1199菌株单独抑菌实验，及两者形成不同配比的组合物进行抑菌试验，结果表明，大豆异黄酮对诺氟沙星以协同作用方式产生抑菌增效作用；所述大豆异黄酮与诺氟沙星在组合物中的比例以1:1为抑菌效果最佳。
本发明的抑菌实验包括步骤：
（1）协同作用方法试验化合物对抗生素的增效作用
诺氟沙星（购买于阿拉丁化学试剂公司，Aladdin
Chemistry Co. Ltd）及MTT购于西格玛公司 (Sigma Chemical Co. Ltd.)，米勒-亨顿肉汤(Mueller-Hinton Brooth, MHB) 购于Oxoid公司；
将利血平用作阳性对照药物，采用本发明中协同作用实验方法测试利血平与诺氟沙星联用对SA1199B的抑制作用；
观察记录诺氟沙星的抑菌浓度，以及诺氟沙星单用时的MIC，与genistein联用时诺氟沙星的MIC值；
（2）抗菌实验方法
取genistein及诺氟沙星，观察细菌完全不生长时所需药物的最低浓度为药物对此菌种的MIC值；
实验菌SA1199B（本领域公知的耐药菌株，公众可通过市购渠道获得）为过度表达NorA多药耐药外泵蛋白的金黄色葡萄球菌，
结果表明，所述genistein具有明显的协同抗菌活性；
（3）化合物鉴定方法
取分离所得大豆异黄酮化合物，加入氘代丙酮溶解进行核磁共振和质谱结构测试；质谱实验显示，所述化合物的分子量为270，13C-NMR及1H-NMR数据如表1所示；
表1. 大豆异黄酮的13C-NMR及1H-NMR数据
本发明的实验结果表明，对于含有norA基因的耐氟喹诺酮类耐甲氧西林金黄色葡萄球菌SA1199B，大豆异黄酮本身没有抑制细菌生长作用，但与抗生素诺氟沙星组成的组合药物能使诺氟沙星的最低抑菌浓度值降低，与阳性对照品利血平(reserpine)的增效能力相同，尤其是以1:1配伍时组成的组合药物能使诺氟沙星的最低抑菌浓度值降低4倍，与阳性对照品利血平(reserpine)的增效能力相同。
本发明的优点是：抗药耐药金黄色葡萄球菌组合药物中的的天然化合物大豆异黄酮可从植物中分离得到，尤其在豆科植物中的含量较高，且没有明显的毒副作用，本抗药耐药金黄色葡萄球菌组合药物能有效降低诺氟沙星的最低抑菌浓度，以及对诺氟沙星产生了抗耐药金黄色葡萄球菌的增效作用，可进一步制成抗耐药金黄色葡萄球菌药物制剂或外用药物制剂。
具体实施方式
实施例
1.
从植物中分离增效化合物大豆异黄酮
(genistein)
槐属植物砂生槐 ((Sophora moorcroftiana) 的地上部分1.0 kg，干燥粉碎后用95%的乙醇45oC下提取三次，合并提取液，减压浓缩得浸膏124 g，依次用石油醚和水萃取，残留的部分挥去溶剂后重量为35 g。将此35 g提取物用200-300目的硅胶拌样，用石油醚和乙酸乙酯梯度洗脱（起始比例为8:2，最后用纯乙酸乙酯冲柱），以每60 mL为一个流分。合并第21-34个流分，回收溶剂后得记为流分Fr 03-21，共1.7 g。将馏分21拌样，先用氯仿冲洗两个柱体积，再用氯仿-丙酮 ( 9:1 )洗脱，每20 mL为一个流分。收集馏分32-40，减压蒸干后得淡黄色固体，共260
mg，记为Fr 03-21-32。继续对Fr 03-21-32进行纯化得一淡黄色固体，经薄层色谱和液相检测为一纯品，得到大豆异黄酮。
实施例
2.
从大豆制品类商业食品原料
Bioisogen®
中分离得到大豆异黄酮
食品原料Bioisogen®购自韩国太平洋公司济春公厂(Jichun
Factory, Amorepacific Co. Ltd., Korea)。将Bioisogen®原料100 g用1升丙酮或氯仿-甲醇(1:1)溶剂分三次提取，蒸干溶剂，得到约23克淡黄无定形固体。取其中1克用硅胶柱色谱层析，氯仿-甲醇(95:5)流动相洗脱，每8 mL为一个流份，合并第8-25流份，蒸干得到300 mg大豆异黄酮(genistein)。
实施例
3.
确定化合物大豆异黄酮
(genistein)
与诺氟沙星联用时的最佳比例
大豆异黄酮和诺氟沙星分别配制母液，并按下表所示的比例移取母液混合，得到编号为1-12的12个组合物，每个组合物的体积为120 µL。移取100 µL的编号为1的组合物加至1.5 mL肉汤中得到组合物1的原液，用同样的方法处理组合物2-11，组合物12不含genistein及诺氟沙星，为阴性对照。将各个组合物进行抗菌实验并记录每种组合物的MIC值（如表2所示）。
表2. 组合物1-12的组成及其对耐药金葡菌的MIC值
| 组合物编号 | G与N的比例 | 组合药物浓度(µg/mL) | 组合物对耐药金葡菌的MIC值(µg/mL) |
| 1 | 5:1 | 256 | 128 |
| 2 | 4:1 | 256 | 128 |
| 3 | 3:1 | 256 | 64 |
| 4 | 2:1 | 256 | 64 |
| 5 | 1:1 | 256 | 32 |
| 6 | 1:2 | 256 | 64 |
| 7 | 1:3 | 256 | 64 |
| 8 | 1:4 | 256 | 64 |
| 9 | 1:5 | 256 | 64 |
| 10 | 1:0 | 256 | >256 |
| 11 | 0:1 | 256 | 128 |
| 12 | DMSO | 0 | >256 |
G: genistein; N: norfloxacin. MIC: 最低抑菌浓度。
实施例 4 抑菌实验，抗菌实验
（1）协同作用方法试验化合物对抗生素的增效作用
诺氟沙星及MTT购于西格玛公司
(Sigma Chemical Co. Ltd.)，米勒-亨顿肉汤(Mueller-Hinton Brooth, MHB) 购于Oxoid公司；将诺氟沙星2.5 mg溶于DMSO配成溶液，取100 µL诺氟沙星溶液溶于1.5 mL肉汤中配成诺氟沙星原液；取genistein 4 mg溶于DMSO配成溶液；取125 µL的genistein溶液加至含9.875 mL的肉汤的试管1中，混匀，再从试管1中取5 mL溶液加至含5 mL肉汤的试管2中，依次类推，直至试管7；菌悬液配置成106 CFU/mL；往96孔板每孔加入80 µL肉汤，再往第一列中每孔加入80 µL诺氟沙星原液，将第一列中的溶液混匀，移出80 µL加至第2列，依次类推，将第十列中吸出的80 µL溶液加至第12列；往第8行的每孔加入80 µL肉汤，第7行的每孔加入80 µL从7号试管中取出的溶液，依次类推，第1行的每孔加入80 µL从1号试管中取出的溶液；往除第十二列外的每孔中加入80 µL菌悬液；将该96孔板于37℃的培养箱中培养18-24小时，加入MTT，观察结果；记录每行细菌刚好不生长的那个孔所对应的诺氟沙星的浓度，其中96孔板H行显示的是诺氟沙星单用时的MIC，其他行显示的是与genistein联用时诺氟沙星的MIC值；
所述药物利血平(reserpine)具有抑制外排泵作用，其能抑制耐药细菌对药物的外排作用，增加抗生素的抑菌效果；在本发明中，将利血平用作阳性对照药物，采用本发明中协同作用实验方法测试利血平与诺氟沙星联用对SA1199B的抑制作用，结果显示，在利血平浓度为8 µg/mL时可将诺氟沙星对SA1199B的最低抑菌浓度降低4倍，由128 µg/mL降至32 µg/mL；
利血平药物购买于阿拉丁化学试剂公司（Aladdin
Chemistry Co. Ltd）；
（2）抗菌实验
取genistein及诺氟沙星各2 mg，以DMSO溶解配置成浓度均为16.384 mg/mL的两种母液，取该母液100 µL加分别至1.5
mL肉汤中得genistein及诺氟沙星的原液；往96孔板每孔加入100 µL肉汤，再往第一列的A-D孔加入100 µL诺氟沙星原液，E-H孔加入100 µL genistein原液；将第一列中的溶液混匀，移出100
µL加至第2列，依次类推，将第十列中吸出的100
µL溶液加至第12列；往除第十二列外的每孔中加入100
µL菌悬液；将该96孔板于37℃的培养箱中培养18-24小时，加入MTT，观察结果；以细菌完全不生长时所需药物的最低浓度为药物对此菌种的MIC值；
浓度为5 mg/mL的3-[4,5-二甲基噻唑基-2]-2,5-二苯基四唑蓝溴化物 (MTT；Sigma) 每孔加入20 µL用于检测细菌的生长，MTT由黄色变成蓝色则指示有细菌生长；
实验菌SA1199B（本领域公知的耐药菌株，公众可通过市购渠道获得）为过度表达NorA多药耐药外泵蛋白的金黄色葡萄球菌，其对诺氟沙星的MIC值为128
µg/mL，所述的NorA蛋白是金葡菌的主要外排泵（efflux
pump）；
对于耐药菌株SA1199B，诺氟沙星的MIC值为32 µg/mL，化合物genistein对此菌株的MIC大于128 µg/mL，但所述化合物genistein与诺氟沙星按1:1配伍时，能使诺氟沙星对菌株SA1199B的MIC值降至32 µg/mL；结果表明，所述genistein具有明显的协同抗菌活性；
（3）化合物鉴定方法
取分离所得大豆异黄酮化合物5 mg，加入氘代丙酮溶解进行核磁共振和质谱结构测试；质谱实验显示，该化合物的分子量为270，13C-NMR及1H-NMR数据如表1所示；
表1. 大豆异黄酮的13C-NMR及1H-NMR数据
本发明的实验结果表明，对于含有norA基因的耐氟喹诺酮类耐甲氧西林金黄色葡萄球菌SA1199B，大豆异黄酮本身没有抑制细菌生长作用，但与抗生素诺氟沙星组成的组合药物能使诺氟沙星的最低抑菌浓度值降低，与阳性对照品利血平(reserpine)的增效能力相同，尤其是以1:1配伍时组成的组合药物能使诺氟沙星的最低抑菌浓度值降低4倍，与阳性对照品利血平(reserpine)的增效能力相同。
Claims (7)
1.一种抗药耐药金黄色葡萄球菌组合药物，其特征在于，由大豆异黄酮与诺氟沙星组成；其中，所述大豆异黄酮与诺氟沙星的质量比为5 : 1 ，4 : 1，3 : 1，2 : 1，1 : 1，1 : 2，1 : 3，1 : 4或1 : 5；
所述大豆异黄酮，又称染料木素，分子式为C15H10O5，具有如式（Ⅰ）所示的结构，
（Ⅰ） 。
2.按权利要求1所述的抗药耐药金黄色葡萄球菌组合药物，其特征在于，所述大豆异黄酮与诺氟沙星的质量比为1 : 1。
3.按权利要求1所述的抗药耐药金黄色葡萄球菌组合药物，其特征在于，所述的金黄色葡萄球菌为对甲氧西林类抗生素具有耐药性、同时对氟喹诺酮类抗生素药物具有耐药性的金黄色葡萄球菌。
4.按权利要求1所述的抗药耐药金黄色葡萄球菌组合药物，其特征在于，所述的金黄色葡萄球菌是耐氟喹诺酮金葡菌SA1199菌株。
5.权利要求1所述的抗药耐药金黄色葡萄球菌组合药物中的大豆异黄酮在制备抗菌增效剂中的用途。
6.权利要求1所述的组合药物在制备抗耐药金黄色葡萄球菌药物制剂中的用途。
7.按权利要求6的用途，其特征在于，所述的药物制剂是外用药物制剂。
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