CN107951878A - 螺缩酮多炔类化合物在制备抗外泵耐药金葡菌增敏药物中的用途 - Google Patents

螺缩酮多炔类化合物在制备抗外泵耐药金葡菌增敏药物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于药学领域，涉及螺缩酮多炔类化合物在制备抗外泵耐药金葡菌增敏药物中的用途，本发明经抑菌实验结果显示，所述螺缩酮多炔类化合物对苯唑西林能以协同作用方式产生抑菌增效作用，尤其是通过螺缩酮多炔类化合物与苯唑西林组合使用，能显著降低苯唑西林的最低抑菌浓度，对苯唑西林产生了抗耐药金葡菌的增效作用。所述的螺缩酮多炔类化合物可用于抗含有mecA外排泵耐药基因的多药耐药金葡菌菌种EMRSA‑16的增敏药物中，以及所述的化合物与苯唑西林制成具有抗耐药金黄色葡萄球菌作用的药物组合物。

Description

螺缩酮多炔类化合物在制备抗外泵耐药金葡菌增敏药物中的 用途
技术领域
本发明属于药学领域，涉及螺缩酮多炔类化合物在制备抗外泵耐药金葡菌增敏药物中的用途，尤其是螺缩酮多炔类化合物在用于抗含有mecA外排泵耐药基因的多药耐药金葡菌菌种EMRSA-16的增敏药物中的用途。
背景技术
耐甲氧西林金黄葡萄球菌(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus，MRSA)为医院内最常见的传染病菌之一。研究显示，MRSA对所有内酰胺类抗生素如青霉素等药物均显示出具有耐药性，而且对大环内酯类，氟喹诺酮类，四环素类等抗生素也都产生了耐药性，这使得它的感染变得更加难以治疗。目前，可用于治疗MRSA的抗生素只有万古霉素，然而不幸的是，2002年在美国已经出现了完全抗万古霉素MRSA菌株。近年来，我国由于抗生素广泛的使用，甚至是滥用，特别是在万古霉素成为多家医院常规抗生素类用药之后，这一形势变得愈加严峻。除了通过采取限制滥用抗生素的相关措施以减缓耐药MRSA增长的速度外，同时必须加速研发新的抗耐药MRSA药物，以防现有的抗菌药物无法起作用时，出现耐药细菌感染的大规模爆发。
研究显示，细菌耐药性(Drug Resistance)的产生具有多种原因，其中细菌对药物产生外排作用而导致的外泵(efflux)耐药性是最重要的耐药性机制之一。根据世界卫生组织的报告，具有多药耐药外排泵的细菌引起的感染已经占到了院内感染的60％。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有多种耐药机制，除了具有染色体为40kb的耐药基因(mecA)通过编码甲氧西林接合蛋白(Penicilin Binding Protein，PBP)产生对β-内酰胺类抗生素的耐药性之外，还对多种类型抗生素产生耐药性。细菌细胞通过外排泵将普遍使用的绝大多数抗生素泵出细胞外，使细胞内的抗生素浓度降低而无法起到抗菌作用。
苯唑西林是一种青霉素类抗生素，为耐青霉素酶青霉素，其抗菌作用方式与青霉素相仿，对产青霉素酶葡萄球菌具有良好抗菌活性，通过抑制细菌细胞壁合成而发挥杀菌作用，主要用于耐青霉素葡萄球菌所致的各种感染，如败血症、呼吸道感染、脑膜炎、软组织感染等，也可用于化脓性链球菌或肺炎球菌与耐青霉素葡萄球菌所致的混合感染。也正因为苯唑西林在临床及畜牧业的广泛应用，细菌对其产生了严重耐药性，从而限制了苯唑西林的临床应用。产生耐药性的机制多样，其中之一便是细菌外排泵。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟通过选择具有mecA外泵基因的MRSA细菌株作为外泵抑制剂的筛选靶标寻找具有外泵抑制作用的抗耐药金葡菌抗生素增敏剂。
与本发明相关的现有技术有，
[1]David Greenwood.Antimicrobial drugs：chronicle of a twentiethcentury medical triumph.Oxford University Press US.pp.124-.
[5]Hooper DC.Emerging mechanisms of fluoroquinoloneresistance.Emerging Infectious Diseases.2001，7：337-341.
发明内容
本发明目的是提供螺缩酮多炔化合物对外泵耐药金葡菌的协同抗菌作用，具体涉及螺缩酮多炔类化合物在制备抗外泵耐药金葡菌曾敏药物中的用途，尤其是螺缩酮多炔类化合物在用于抗含有mecA外排泵耐药基因的多药耐药金葡菌菌种EMRSA-16的增敏药物中的用途。
本发明所述的螺缩酮多炔化合物其本身没有抑制细菌生长作用，但当其与抗生素苯唑西林配伍时，所述苯唑西林的最低抑菌浓度值明显降低；本发明的实施例中，采用螺缩酮多炔化合物天然成分一枝蒿素甲(Rupesdiyne A)和一枝蒿素乙和(Rupesdiyne B)分别与苯唑西林配伍成组合药物，采用含有mecA外排泵耐药基因的多药耐药金黄色葡萄球菌EMRSA-16为实验耐药菌，进行细菌外排泵(efflux)耐药机制试验，结果显示，所述的一枝蒿素甲和一枝蒿素乙分别使苯唑西林的最低抑菌浓度值降低了4倍。
本发明中，采用螺缩酮多炔类天然化合物一枝蒿素甲与一枝蒿素乙与苯唑西林不同浓度下进行对多药耐药金葡菌EMRSA-16菌株单独抑菌实验，及两者形成不同配比的组合物进行抑菌试验，
1)细菌培养及检测
细菌培养在细胞培养室超净台中操作，在96孔板中进行细菌培养，米勒-亨顿肉汤(Mueller-Hinton Brooth，MHB)为培养基。取化合物样品及抗生素苯唑西林各适量，以DMSO溶解配置成一定浓度的两种母液，以肉汤稀释。不加药物作为阴性对照。接种细菌96孔板于37℃的培养箱中培养18-24小时，加入MTT，观察结果。以细菌完全不生长时所需药物的最低浓度为药物对此菌种的MIC值。以MTT溶液3-[4，5-二甲基噻唑基-2]-2，5-二苯基四唑蓝溴化物(Sigma)，用于检测细菌的生长，MTT由黄色变成蓝色则指示有细菌生长；
2)协同作用方法试验化合物对抗生素的增效作用
在96孔板上以二倍稀释法形成的不同浓度进行化合物与抗生素协同作用抗菌试验；
取适量苯唑西林溶于DMSO配成抗生素母液，取适量苯唑西林母液溶于肉汤中配成苯唑西林原液。取化合物样品适量溶于DMSO配成母液。用肉汤稀释，化合物和抗生素起始抑制浓度分别为512和256μg/mL。以此进行正交实验，记录每行恰好细菌不生长的微孔所对应的苯唑西林的浓度即为与化合物样品联用时苯唑西林的MIC值；
结果显示，所述两个化合物对苯唑西林皆以协同作用方式产生抑菌增效作用，尤其是通过螺缩酮多炔类天然化合物一枝蒿素甲和一枝蒿素乙与苯唑西林组合使用，能显著降低苯唑西林的最低抑菌浓度，对苯唑西林产生了抗耐药金葡菌的增效作用。
本发明的实验中，实验菌EMRSA-16为对苯唑西林耐药的金黄色葡萄球菌，苯唑西林对其最低抑制浓度为(MIC)值为256μg/mL；对于耐药菌株EMRSA-16，上述两个化合物对此菌株的MIC均大于512μg/mL，但化合物一枝蒿素甲与一枝蒿素乙分别与苯唑西林配伍时，能使苯唑西林对菌株EMRSA-16的MIC值均降至64μg/mL，降低了4倍，实验结果表明，所述两个化合物均具有明显的协同抗菌活性，可进一步用于制备抗外泵耐药金葡菌增敏药物中。
本发明中，还提供一种抗耐药金黄色葡萄球菌的药物组合物，其由螺缩酮多炔类天然化合物和苯唑西林组成。
本发明中，所述的药物组合物可制成抗耐药金葡菌外用药物制剂或其它形式药物制剂。
本发明中，螺缩酮多炔类天然化合物一枝蒿素甲和一枝蒿素乙化合物采用下述方法分离，鉴定：
菊科蒿属植物新疆一枝蒿(Artemisia rupestris L.)和亚菊属细裂亚菊(Ajaniaprzewalskii Poljak)分别用95％乙醇提取物的石油醚萃取部位和三元混合溶剂(石油醚∶乙醚∶甲醇＝1∶1∶1)提取物进行硅胶柱层析分离纯化后所得化合物加入氘代氯仿溶解进行核磁共振和质谱结构测试。
本发明提供了螺缩酮多炔类化合物在制备抗外泵耐药金葡菌曾敏药物中的用途，经抑菌实验结果显示，所述螺缩酮多炔类化合物对苯唑西林能以协同作用方式产生抑菌增效作用，尤其是通过螺缩酮多炔类化合物与苯唑西林组合使用，能显著降低苯唑西林的最低抑菌浓度，对苯唑西林产生了抗耐药金葡菌的增效作用。所述的螺缩酮多炔类化合物可用于抗含有mecA外排泵耐药基因的多药耐药金葡菌菌种EMRSA-16的增敏药物中，以及所述的化合物与苯唑西林制成具有抗耐药金黄色葡萄球菌作用的药物组合物。
具体实施方式
实施例1.从植物新疆一枝蒿中分离增效化合物Rupesdiyne A和Rupesdiyne B
菊科蒿属植物新疆一枝蒿(Artemisia rupestris L.)的95％乙醇提取物的石油醚萃取部位27.3g浸膏，用200-300目的硅胶拌样进行柱层析，每20mL为一个流分，以石油醚-二氯甲烷(7∶3)洗脱，收集流分8-54，记为Fr01-12。对Fr01-8进行分离，以石油醚-二氯甲烷(7∶3)洗脱，收集流分10-18和流分18-35，分别记为Fr01-8-10和Fr01-8-18，减压蒸干后称重分别为3.2g和2.4g。分别对Fr01-12-2和Fr01-12-23纯化数次，终得白色固体Fr01-8-10-2重37.1mg，淡黄色固体Fr01-8-18-6重68.9mg，经薄层色谱和液相检测为纯品，分别为Rupesdiyne A和Rupesdiyne B。
实施例2、从植物细裂亚菊中分离增效化合物Rupesdiyne A和Rupesdiyne B。
菊科亚菊属植物细裂亚菊(Ajania przewalskii Poljak)干燥全草粉碎后，用三元混合溶剂(石油醚∶乙醚∶甲醇＝1∶1∶1)反复提取的浸膏36g。取部分此浸膏(26g)用200-300目的硅胶拌样进行柱层析，经石油醚-丙酮体系梯度洗脱，得到Fr-1～Fr-6六个组分。对Fr-3(1.9g)继续硅胶柱色谱分离，经石油醚-二氯甲烷(8∶2)洗脱得Fr-3-1～Fr-3-8八个组分。对Fr-3-4(820mg)继续以硅胶柱色谱分离，以石油醚-二氯甲烷洗脱，反复分离纯化，最后进一步经反相硅胶柱色谱和正相硅胶柱色谱分离纯化得Rupesdiyne A和Rupesdiyne B分别23mg和54.2mg。质谱实验显示两个化合物的分子量均为230，1H-NMR及13C-NMR数据分别列于表1。
表1.化合物1和2的NMR数据(化学位移ppm，峰形，耦合常数Hz，溶剂CDCl3)
实施例3、化合物与苯唑西林组合联用的协同增效试验
在96孔板上以二倍稀释法形成的不同浓度进行化合物与抗生素协同作用抗菌试验；
取适量苯唑西林溶于DMSO配成抗生素母液，取适量苯唑西林母液溶于肉汤中配成苯唑西林原液。取化合物Rupesdiyne A和Rupesdiyne B样品按计算量溶于DMSO配成母液。用肉汤稀释，化合物和抗生素起始抑制浓度分别为512和256μg/mL。以此进行正交实验，记录每行恰好细菌不生长的微孔所对应的苯唑西林的浓度是与化合物样品联用时苯唑西林的MIC值。试验结果如表2所示。
表2.化合物及抗生素苯唑西林对耐药菌的最低抑菌浓度(MIC)和部分抑菌浓度指数(FICI)
1.FICI≤0.5为协同作用；0.5＜FICI≤1相加作用；1＜FICI≤2为无相关作用；；2＜FICI≤4为拮抗作用。
2.两个化合物对EMRSA-16菌种皆无直接作用，但与苯唑西林联用时分别均能使抗生素用量降低4倍，协同作用明显。

Claims (7)

1.螺缩酮多炔类化合物在制备抗外泵耐药金葡菌增敏药物中的用途，所述的螺缩酮多炔类化合物为Rupesdiyne A和Rupesdiyne B，分子式为C14H14O3，分子量为230，
2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的螺缩酮多炔类化合物逆转苯唑西林耐药金葡菌的耐药性，降低苯唑西林实验耐药金葡菌的最低抑菌浓度(MIC)。
3.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的耐药金葡菌是具有mecA基因的外泵蛋白机制的多药耐药金黄色葡萄球菌EMRSA-16，其对抗生素苯唑西林不敏感。
4.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的螺缩酮多炔类化合物与苯唑西林组合使用提高抗生素对耐药金葡菌EMRSA-16的抑制效果。
5.一种抗耐药金黄色葡萄球菌的药物组合物，其特征在于，由螺缩酮多炔类天然化合物和苯唑西林组成。
6.按权利要求5所述的抗耐药金黄色葡萄球菌的药物组合物，其特征在于，所述的螺缩酮多炔类化合物为Rupesdiyne A和Rupesdiyne B，分子式为C14H14O3，分子量为230。
7.按权利要求5所述的抗耐药金黄色葡萄球菌的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物制成抗耐药金葡菌外用药物制剂或其它形式药物制剂。
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