CN107648217A - 新藤黄酸或其衍生物在制备用于预防和/或治疗由细菌引起的相关疾病的药物中的用途 - Google Patents

新藤黄酸或其衍生物在制备用于预防和/或治疗由细菌引起的相关疾病的药物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供新藤黄酸及其衍生物在制备用于预防和/或治疗由敏感或耐药的葡萄球菌、链球菌或肠球菌的细菌引起的疾病的药物或饲料添加剂或食品中的用途，它们分别为式(I)、(II)和(III)所示。本发明还提供用于预防和/或治疗由敏感或耐药的葡萄球菌、链球菌或肠球菌的细菌引起的疾病的药物或饲料添加剂或食品，其包含有效量的式(I)所示的新藤黄酸或式(II)或(III)所示的衍生物。

Description

新藤黄酸或其衍生物在制备用于预防和/或治疗由细菌引起 的相关疾病的药物中的用途
技术领域
本发明涉及制药技术领域，特别涉及新藤黄酸或其衍生物在制备用于与预防和/或治疗由细菌引起的相关疾病的药物中的用途。
背景技术
千百年来，细菌感染致人死亡在人类疾病致死中一直排名首位，人们对细菌感染束手无策。自年发现青霉素以来，人们对抗生素的研究与应用越来越广泛，在防治细菌性疾病方面，抗生素发挥了巨大作用，使许多疾病得到有效控制和彻底治疗，已成为当前最常用的药物[1-3]。随着青霉素的发现，氨基糖苷类抗生素(如庆大霉素)、β内酰胺类(青霉素)抗生素、四环素类抗生素(四环素、大环内酷类抗生素(红霉素) 等抗生素也相继被开发出来。随着广谱抗生素的广泛应用，抗生素的耐药问题也日趋严重，细菌耐药性的产生和传播速度之快、耐药率之高、耐药谱之广，已经引起了全世界的广泛关注，给细菌性疾病的预防、控制和治疗造成困难并威胁人类健康[4-10]。然而，更令人棘手的是由耐药病原菌引起的宿主感染，这给临床抗感染治疗带来了新的挑战。因此寻找高效、安全的新型抗菌药物成为当前药物研发的热点之一。
近年来，随着耐药菌株的增加、抗生素的滥用，天然抗菌药物已经成为研究的热点。从天然产物中寻找具有显著抗菌效果的化合物或先导化合物并进行结构修饰获得其衍生物，从而得到高效低毒的潜在药物具有重要价值。
发明内容
本发明的一个目的是经过筛选候补化合物而提供一种新型的预防和/或治疗由葡萄球菌、链球菌和肠球菌感染引起的相关疾病的药物，安全无耐药性；本发明的另一个目的是提供该种药物作为预防和/或治疗由葡萄球菌、链球菌和肠球菌感染引起的相关疾病的应用。
为了实现上述目的，本发明人筛选发现新藤黄酸或新藤黄酸衍生物能够用于预防或治疗由敏感的或耐药的细菌引起的相关疾病，其中新藤黄酸由式(I)所示，新藤黄酸衍生物由式(II)或(III)所示：
在本发明中，术语“新藤黄酸”或“新藤黄酸化合物”通常包括其单独的异构体、异构体的外消旋或非外消旋混合物或其药学上可接受的盐和水合物。
在式(II)和式(III)中，R1、R5各自独立地选自-OH、＝O或-OCOR，其中R为烃基；R2、R3、R6、R7各自独立地选在氢、-CN、-COOH、-OH或-NH2；R4、R9各自独立地选自氢或烃基；R8选自-CN、-COOH、-COOR或-CONH2，其中R为烃基。
本发明涉及所述的烃基为烷基、环烷基、环烯基、烯基、炔基或芳基；其中，烷基的碳的数目为1-10，环烷基的碳的数目为3-8，环烯基的碳的数目为5-6，烯基的碳的数目为2-6，炔基的碳的数目为2-6，芳基的碳的数目为6-10。
具体地，本发明提供下式(IV)-(VIII)所示的新藤黄酸衍生物：
藤黄酸及其衍生物能够抑制的细菌包括，但不限于，敏感以及耐药的葡萄球菌、链球菌、肠球菌。藤黄酸及其衍生物能够用于预防或治疗哺乳动物中的细菌感染，尤其是葡萄球菌、链球菌或肠球菌感染，所述哺乳动物包括人和非人哺乳动物。
一般地，本发明所述的藤黄酸及其衍生物的药学上可接受的盐选自钾盐或钠盐。
在第二方面，本发明提供新藤黄酸或其衍生物在制备用于预防和/或治疗由敏感或耐药的细菌感染引起的相关疾病的药物中的应用。其中所述新藤黄酸如式(I) 所示，新藤黄酸衍生物如式(II)或(III)所示。优选地，所述新藤黄酸衍生物如式 (IV)-(VIII)中任一项所示。优选地，所述敏感或耐药的细菌选自葡萄球菌、链球菌或肠球菌。
本发明还提供一种用于预防和/或治疗由敏感或耐药的细菌引起的疾病的药物，其包含有效量的藤黄酸或其衍生物。其中所述新藤黄酸或其衍生物分别为式(I)、(II) 或(III)所示。优选地，所述新藤黄酸衍生物如式(IV)-(VIII)中任一项所示。优选地，所述敏感或耐药的细菌选自葡萄球菌、链球菌或肠球菌。
本发明还提供新藤黄酸或其衍生物在制备饲料添加剂中的应用。所述饲料添加剂包含有效量的新藤黄酸或新藤黄酸衍生物，能够用于预防和/或治疗由敏感或耐药的细菌感染引起的相关疾病。其中所述新藤黄酸或其衍生物分别为式(I)、(II)或(III) 所示。优选地，所述新藤黄酸衍生物如式(IV)-(VIII)中任一项所示。优选地，所述敏感或耐药的细菌选自葡萄球菌、链球菌或肠球菌。
本发明还提供新藤黄酸或新藤黄酸衍生物在制备人或动物食品中的应用。所述食品包含有效量的新藤黄酸或新藤黄酸衍生物，能够用于预防和/或治疗由敏感或耐药的细菌感染引起的相关疾病。其中所述新藤黄酸或其衍生物分别为式(I)、(II)或(III) 所示。优选地，所述新藤黄酸衍生物如式(IV)-(VIII)中任一项所示。优选地，所述敏感或耐药的细菌选自葡萄球菌、链球菌或肠球菌。
本发明还提供一种预防和/或治疗由敏感或耐药的细菌引起的疾病的食品，所述食品包含有效量的新藤黄酸或其衍生物，或它们的异构体、异构体的外消旋或非外消旋混合物或其药学上可接受的盐和水合物。其中所述新藤黄酸或其衍生物分别为式(I)、 (II)或(III)所示。优选地，所述新藤黄酸衍生物如式(IV)-(VIII)中任一项所示。优选地，所述敏感或耐药的细菌选自葡萄球菌、链球菌或肠球菌。
具体实施方式
下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。
除非另外说明，下述实施例中所用的试剂均为市售分析纯级别的试剂。
在实施本发明的过程中，使用了动物学、药物有机化学、细胞生物学、免疫学、微生物学等很多传统技术。这些技术是熟知的。
下面结合实施例对本发明作进一步详细描阐述：
实施例1制备4-氧代新藤黄酸(XTHS-1)
在配备机械搅拌的50mL二口瓶中，依次加入丙酮(15mL)、冰醋酸(2mL)、新藤黄酸(0.65g，0.001mol，购自成都普菲德生物技术有限公司，货号：JOT10142)，搅拌均匀后降温至-5℃左右，搅拌下滴加新制的琼斯试剂(2.67g三氧化铬溶于23ml浓硫酸中，然后以蒸馏水稀释至100ml即得)1.0mL，搅拌反应2小时后，加入2mL 乙醇终止反应，减压过滤，将滤液倒入50mL冰水中，过滤，水洗，将滤饼经真空干燥，得黄色固体0.51g，经硅胶柱分离(流动相为：丙酮-乙酸乙酯的不同体积比例溶液进行梯度洗脱)，收集丙酮-乙酸乙酯(10∶3体积比)的洗脱部分，减压回收溶剂后，得4-氧代新藤黄酸(式(IV))0.21g，收率为32.31％。
1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ：12.79(1H，S，COOH)，7.53(1H，d，H-10)，6.45(1 H，t，H-27)，5.80(1H，m)，5.09(2H，m，H-37；H-32)，3.48(1H，dd)，3.12-3.34(5H，m)，2.90 (3H，m，H-3；H-11)，2.31(1H，d，H-22)，1.96-2.16(2H.m)，1.74(3H，s)，1.70(3H，s)，1.67 (3H，s)，1.65(9H，s)，1.57(3H，s)，1.34(1H，dd)，1.28(3H，s)。
EI-MS m/z：645.88[M+1]+。
实施例2制备35，39-二腈基新藤黄酸(XTHS-2)
在50mL二口瓶中，依次加入无水吡啶(50mL)、新藤黄酸(0.65g，0.001mol，购自成都普菲德生物技术有限公司，货号：JOT10142)，N-溴代丁二酰亚胺(0.40g，0.0 023mol)，回流反应12小时后，加入氰化钠(0.078g，0.002mol)，减压过滤，将滤液倒入500mL冰水中，过滤，水洗，将滤饼经真空干燥，得黄色固体0.81g，经硅胶柱分离(流动相为：丙酮-乙酸乙酯的不同体积比例溶液进行梯度洗脱)，收集丙酮-乙酸乙酯(10∶1体积比)的洗脱部分，减压回收溶剂后，得35，39-二腈基新藤黄酸(式 (V))0.41g，收率为57.40％。
1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ：12.80(1H，S，COOH)，7.53(1H，d，H-10)，6.45(1 H，t，H-27)，5.80(1H，m)，5.09(2H，m，H-37；H-32)，3.48(1H，dd)，3.14-3.32(5H，m)，3.05 -3.07(4H，d，H-35；H-39)2.90(1H，m，H-11)，2.31(1H，d，H-22)，1.96-2.16(4H.m)，1.68 (3H，s)，1.65(9H，s)，1.57(3H，s)，1.34(1H，dd)，1.28(3H，s)。
EI-MS m/z：697.40[M+1]+。
实施例3制备10-腈基氢化新藤黄酸(XTHS-3)
在50mL二口瓶中，依次加入无水吡啶(50mL)、新藤黄酸(0.65g，0.001mol，购自成都普菲德生物技术有限公司，货号：JOT10142)，氢氰酸(0.027g，0.001mol)，在0℃左右，搅拌反应24小时后，将反应液倒入500mL冰水中，过滤，水洗，将滤饼经真空干燥，得浅黄色固体0.71g，经硅胶柱分离(流动相为：丙酮-乙酸乙酯的不同体积比例溶液进行梯度洗脱)，收集丙酮-乙酸乙酯(10∶3体积比)的洗脱部分，减压回收溶剂后，得10-腈基氢化新藤黄酸(式(VI))0.54g，收率为80.23％。
1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ：12.80(IH，S，COOH)，7.53(1H，d，H-10)，6.45(1 H，t，H-27)，5.80(1H，m)，5.09(2H，m，H-37；H-32)，3.48(1H，dd)，3.14-3.32(6H，m)，2.90 (1H，m，H-11)，2.31(1H，d，H-22)，1.96-2.16(4H.m)，1.68(3H，s)，1.65(9H，s)，1.60(1H， d，H-9)，1.57(3H，s)，1.34(1H，dd)，1.28(3H，s)。
EI-MS m/z：674.80[M+1]+。
实施例4制备10-羧基氢化新藤黄酸(XTHS-4)
在50mL二口瓶中，依次加入无水吡啶(50mL)、新藤黄酸(0.65g，0.001mol，购自成都普菲德生物技术有限公司，货号：JOT10142)，氢氰酸(0.027g，0.001mol)，在0℃左右，搅拌反应24小时后，将反应液倒入500mL冰水中，过滤，水洗，将滤饼经真空干燥，得浅黄色固体，将所得黄色固体溶于50mL2％氢氧化钠水溶液中，加热回流2小时后，加入稀盐酸调节至pH值为5，过滤，水洗，将滤饼经真空干燥，得浅黄色固体0.69g，经硅胶柱分离(流动相为：丙酮-乙酸乙酯的不同体积比例进行梯度洗脱)，收集丙酮-乙酸乙酯(2∶1体积比)的洗脱部分，减压回收溶剂后，得10-羧基氢化新藤黄酸(式(VII))0.45g，收率为65.11％。
1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ：12.80(1H，S，COOH)11.45(1H，S，COOH)，7.53 (1H，d，H-10)，6.45(1H，t，H-27)，5.80(1H，m)，5.09(2H，m，H-37；H-32)，3.75(1H，s，H-10) 3.48(1H，dd)，3.14-3.32(6H，m)，2.90(1H，m，H-11)，2.31(1H，d，H-22)，1.96-2.16(5H. m)，1.68(3H，s)，1.65(9H，s)，1.57(3H，s)，1.34(1H，dd)，1.28(3H，s)。
EI-MS m/z：694.77[M+2]+。
实施例5制备4，6-二甲氧基-35，39-二腈基新藤黄酸(XTHS-5)
在50mL二口瓶中，依次加入无水吡啶(50mL)、新藤黄酸(0.65g，0.001mol，购自成都普菲德生物技术有限公司，货号：JOT10142)，碘甲烷(0.30g，0.0021mol)回流反应12小时后，加入N-溴代丁二酰亚胺(0.40g，0.0023mol)，回流反应12小时后，加入氰化钠(0.078g，0.002mol)，减压过滤，将滤液倒入500mL冰水中，过滤，水洗，将滤饼经真空干燥，得黄色固体0.81g，经硅胶柱分离(流动相为：丙酮-乙酸乙酯的不同体积比例溶液进行梯度洗脱)，收集丙酮-乙酸乙酯(10∶5体积比)的洗脱部分，减压回收溶剂后，得35，39-二腈基新藤黄酸(式(VIII))0.41g，收率为57.40％。
1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ：12.80(1H，S，COOH)，7.53(1H，d，H-10)，6.45(1 H，t，H-27)，5.80(1H，m)，5.09(2H，m，H-37；H-32)，3.81(3H，s，Ar-OCH 3)3.48(1H，dd)， 3.10-3.37(8H，m)，3.05-3.07(4H，d，H-35；H-39)2.90(1H，m，H-11)，2.31(1H，d，H-22)， 1.96-2.16(4H.m)，1.68(3H，s)，1.65(9H，s)，1.57(3H，s)，1.34(1H，dd)，1.28(3H，s)。
EI-MS m/z：725.40[M+1]+。
实施例6.新藤黄酸的抗葡萄球菌活性
药品与试剂：
Mueller-Hinton培养基(缩写为MH培养基，牛肉浸粉5g，酪蛋白水解物17.5g，淀粉1.5g，琼脂12.5g，加入1000mL蒸馏水中)、新藤黄酸(购自成都普菲德生物技术有限公司，货号：JOT10142)、苯唑西林、DMSO、乙醇、均为分析纯试剂、PBS 缓冲液(磷酸盐缓冲液0.01mol/L，pH7.4，Na2HPO4-12H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，蒸馏水1000mL)。
菌种：
溶血性葡萄球菌：SH2017；ZC240-1；SH322-1；ZC117(均为临床分离敏感株)
小牛葡萄球菌：SH134；MH121；MH313-1(均为临床分离敏感株)
表皮葡萄球菌：MH118-1；SH2032-2；ZC219-1；SH2025-3(均为临床分离敏感株)
金黄色葡萄球菌：ATCC29213(标准株)；SH118-2(临床分离株，耐甲氧西林)；SH121(临床分离株，耐甲氧西林)；SH324-1(临床分离敏感株)
产色葡萄球菌：SH315-1；SH329-2；SH2014-2(均为临床分离敏感株)
琥珀葡萄球菌：MH313-1；MH324-1；MH309-4(均为临床分离敏感株)
上述菌株除ATCC29213购自美国ATCC菌株库外，其余均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所自己分离所得，目前保存在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，如果公众需要，申请人承诺从申请日起二十年内向公众发放该分离株。
实验方法：
培养基的配制
取牛肉浸粉5g，酪蛋白水解物17.5g，淀粉1.5g，琼脂12.5g，加入1000mL蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟备用。
葡萄球菌的培养
在无菌室内，将葡萄球菌菌株于酒精灯下用接种针在试验菌株斜面上，刮取少量斜面菌苔，用一定量的无菌水制成菌悬液，然后取一定量加到已融化又冷却至50℃左右的MH培养基中，摇匀，即刻倒入无菌培养皿中，待充分冷凝后用胶塞密封后，于37℃培养18-24h备用。吸取菌液1mL，用MH培养基按1∶1000体积比稀释，使菌液浓度约为105cfu/mL。
抗菌实验
将待测药品(即，新藤黄酸，购自成都普菲德生物技术有限公司，货号：JOT10142)和对照药品(即，苯唑西林，购自美国Sigma公司，货号：1481000)作为阳性对照) 分别溶于DMSO和水中配制成2560μg/mL的母液，然后用二倍稀释法将药品稀释为一定浓度梯度(128μg/mL，64μg/mL，32μg/mL，16μg/mL，8μg/mL，4μg/mL，2μg/mL， 1μg/mL，0.5μg/mL，0.25μg/mL)。于灭菌微量滴定板中分别加入100μL的培养基，加入100μL菌悬液。其余的孔中加入90μL的菌悬液和10μL的待测药物溶液。每个药物溶液浓度平行3次。于灭菌微量滴定板中分别加入100μL的培养基，加入100μL菌悬液。其余的孔中加入90μL的菌悬液和10μL的溶液。每个药物溶液浓度平行3次。将处理完的培养皿于37℃培养24h，观察。
MIC的测定
在每个微量滴定板都可以直观的测定其MIC值之后，在板的每个孔中加入50μLPBS缓冲液(磷酸盐缓冲液0.01mol/L，pH7.4，Na2HPO4-2H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g， NaCl18.0g，KCl 10.2g，蒸馏水1000mL)，其中包含2mg MTT/mL。在室温下继续孵育4-5h。将孔中的物质移出并加入100uL含有5％HCl的异丙醇来萃取染料。继续在室温下孵育12h，于酶标仪测定各孔光吸收(OD值)，测定波长550nm。根据各孔OD 值计算药物对细菌生长的最小抑制浓度。
最小抑制浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)：在特定环境下孵育24小时，可抑制某种微生物出现明显增长的最低药物浓度即最小抑制浓度，根据测定的光密度(OD值)，制作细菌生长抑制率的标准曲线，在标准曲线上求得其对应的药物浓度。
测得新藤黄酸针对葡萄球菌的平均MIC见表1所示。
表1.新藤黄酸对葡萄球菌的抑制MIC值(μg/mL)
结果表明：新藤黄酸对葡萄球菌(包括敏感株和耐药株)有一定的抑制作用，其抑菌效果与阳性对照苯唑西林大致相当。
实施例7.新藤黄酸的抗肠球菌活性
药品与试剂：
Mueller-Hinton培养基(缩写为MH培养基，牛肉浸粉5g，酪蛋白水解物17.5g，淀粉1.5g，琼脂12.5g，加入1000mL蒸馏水中)、新藤黄酸(购自成都普菲德生物技术有限公司，货号：JOT10142)、氟苯尼考、DMSO、乙醇、均为分析纯试剂、PBS 缓冲液(磷酸盐缓冲液0.01mol/L，pH7.4，Na2HPO4-12H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，蒸馏水1000mL)。
菌种：
肠球菌：MH223-1；SH112；SH257-1(均为临床分离敏感株)
粪肠球菌：ATCC29212(标准株)；MH145-1；MH133-1；MH216-1(均为临床分离敏感株)
屎肠球菌：MH249-1；MH272-1；SH161-1；ZC231-1(均为临床分离敏感株)
溶血性肠球菌：MH244-1；MH144-1；MH134-1；MH157(均为临床分离敏感株)
假鸟肠球菌：ZC235-1；ZC183-1；ZC318-1(均为临床分离敏感株)
解糖肠球菌：MH286-1；SH199-1；SH259-1(均为临床分离敏感株)
上述菌株除ATCC29212购自美国ATCC菌株库外，其余均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所自己分离所得，目前保存在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，如果公众需要，申请人承诺从申请日起二十年内向公众发放该分离株。
培养基的配制
取牛肉浸粉5g，酪蛋白水解物17.5g，淀粉1.5g，琼脂12.5g，加入1000mL蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟备用。
肠球菌的培养
在无菌室内，将肠球菌菌株于酒精灯下用接种针在试验菌株斜面上，刮取少量斜面菌苔，用一定量的无菌水制成菌悬液，然后取一定量加到已融化又冷却至50℃左右的MH培养基中，摇匀，即刻倒入无菌培养皿中，待充分冷凝后用胶塞密封后，于37℃培养18-24h备用。吸取菌液1mL，用MH培养基按1：1000体积比稀释，使菌液浓度约为105cfu/mL。
抗菌实验
将待测药品(即，新藤黄酸，购自成都普菲德生物技术有限公司，货号：JOT10142)和对照药品(即，氟苯尼考，购自百灵威科技有限公司，货号：223120，作为阳性对照)分别溶于DMSO和水中配制成2560μg/mL的母液，然后用二倍稀释法将药品稀释为一定浓度梯度(128μg/mL，64μg/mL，32μg/mL，16μg/mL，8μg/mL，4μg/mL，2μg/mL， 1μg/mL，0.5μg/mL，0.25μg/mL)。于灭菌微量滴定板中分别加入100μL的培养基，加入100μL菌悬液。其余的孔中加入90μL的菌悬液和10μL的待测药物溶液。每个药物溶液浓度平行3次。于灭菌微量滴定板中分别加入100μL的培养基，加入100μL菌悬液。其余的孔中加入90μL的菌悬液和10μL的溶液。每个药物溶液浓度平行3次。将处理完的培养皿于37℃培养24h，观察。
MIC的测定
在每个微量滴定板都可以直观的测定其MIC值之后，在板的每个孔中加入50μLPBS缓冲液(磷酸盐缓冲液0.01mol/L，pH7.4，Na2HPO4-2H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g， NaCl18.0g，KCl 10.2g，蒸馏水1000mL)，其中包含2mg MTT/mL。在室温下继续孵育4-5h。将孔中的物质移出并加入100uL含有5％HCl的异丙醇来萃取染料。继续在室温下孵育12h，于酶标仪测定各孔光吸收(OD值)，测定波长550nm。根据各孔OD 值计算药物对细菌生长的最小抑制浓度。
最小抑制浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)：在特定环境下孵育24小时，可抑制某种微生物出现明显增长的最低药物浓度即最小抑制浓度，根据测定的光密度(OD值)，制作细菌生长抑制率的标准曲线，在标准曲线上求得其对应的药物浓度。
测得的新藤黄酸对肠球菌的平均MIC见表2所示。
表2.新藤黄酸对肠球菌的抑制MIC值(μg/mL)
结果表明：新藤黄酸对肠球杆菌有一定的抑制作用，其抑菌效果与阳性对照氟苯尼考大致相当。
实施例8.新藤黄酸抑制链球菌活性实验
药品与试剂：
THB Medium培养基(缩写为THB培养基，牛肉粉10g，胰蛋白胨20g，葡萄糖 2g，碳酸氢钠2g，氯化钠2g，磷酸氢二钠0.4g，加入1000mL蒸馏水中)、新藤黄酸 (购自成都普菲德生物技术有限公司，货号：JOT10142)、氟苯尼考、DMSO、乙醇、均为分析纯试剂、PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液0.01mol/L，pH7.4，Na2HPO4-12H2O 2.9g， KH2PO4 0.2g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，蒸馏水1000mL)。
菌种：
无乳链球菌：MH203-1；MH319-1；MH328-1；MH311-1(均为临床分离敏感株)
停乳链球菌：ZC224-1；MH128-1；ZC326-1(均为临床分离敏感株)
化脓链球菌：MH156-1；SH209；SH113；MH221-2(均为临床分离敏感株)
肺炎链球菌：MH112-2；SH116；SH205(均为临床分离敏感株)
猪链球菌：MH214-1；SH214-1；ZC312-1(均为临床分离敏感株)
乙型溶血性链球菌：SH322-1；SH264-1；MH311-1(均为临床分离敏感株)
上述菌株均来自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所自己分离所得。
培养基的配制
牛肉粉10g，胰蛋白胨20g，葡萄糖2g，碳酸氢钠2g，氯化钠2g，磷酸氢二钠0.4g，加入1000mL蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟备用。
链球菌的培养
在无菌室内，将肠球菌菌株于酒精灯下用接种针在试验菌株斜面上，刮取少量斜面菌苔，用一定量的无菌水制成菌悬液，然后取一定量加到已融化又冷却至50℃左右的THB培养基中，摇匀，即刻倒入无菌培养皿中，待充分冷凝后用胶塞密封后，于 37℃培养18-24h备用。吸取菌液1mL，用MH培养基按1∶1000体积比稀释，使菌液浓度约为105cfu/mL。
抑菌实验
将待测药品(即，新藤黄酸，购自成都普菲德生物技术有限公司，货号：JOT10142)和对照药品(即，氟苯尼考)分别溶于DMSO和水中配制成2560μg/mL的母液，然后用二倍稀释法将药品稀释为一定浓度梯度(128μg/mL，64μg/mL，32μg/mL，16μg/mL，8μg/mL，4μg/mL，2μg/mL，1μg/mL，0.5μg/mL，0.25μg/mL)。于灭菌微量滴定板中分别加入100μL的培养基，加入100μL菌悬液。其余的孔中加入90μL的菌悬液和10μL 的待测药物溶液。每个药物溶液浓度平行3次。于灭菌微量滴定板中分别加入100μL 的培养基，加入100μL菌悬液。其余的孔中加入90μL的菌悬液和10μL的溶液。每个药物溶液浓度平行3次。将处理完的培养皿于37℃培养24h，观察。
MIC的测定
在每个微量滴定板都可以直观的测定其MIC值之后，在板的每个孔中加入50μLPBS缓冲液(磷酸盐缓冲液0.01mol/L，pH7.4，Na2HPO4-2H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g， NaCl18.0g，KCl 10.2g，蒸馏水1000mL)，其中包含2mg MTT/mL。在室温下继续孵育4-5h。将孔中的物质移出并加入100uL含有5％HCl的异丙醇来萃取染料。继续在室温下孵育12h，于酶标仪测定各孔光吸收(OD值)，测定波长550nm。根据各孔OD 值计算药物对细菌生长的最小抑制浓度。
最小抑制浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)：在特定环境下孵育24小时，可抑制某种微生物出现明显增长的最低药物浓度即最小抑制浓度，根据测定的光密度(OD值)，制作细菌生长抑制率的标准曲线，在标准曲线上求得其对应的药物浓度。
测得平均MIC见表1所示
表3.新藤黄酸抑制链球菌的最小抑菌浓度(μg/mL)
结果表明：新藤黄酸对链球杆菌有一定的抑制作用，其抑菌效果与阳性对照氟苯尼考大致相当。
实施例9.检测新藤黄酸衍生物的抑菌活性
以葡萄球菌、链球菌、肠球菌为受试菌株，按照实施例6-8的检测方法，检测并对比新藤黄酸及部分新藤黄酸衍生物(XTHS-1、XTHS-2、XTHS-3、XTHS-4、XTHS -5)的最小抑制浓度(MIC)，结果见表4-表18。
表4.XTHS-1对葡萄球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表5.XTHS-1对肠球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表6.XTHS-1对链球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表7.XTHS-2对葡萄球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表8.XTHS-2对肠球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表9.XTHS-2对链球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表10.XTHS-3对葡萄球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表11.XTHS-3对肠球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表12.XTHS-3对链球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表13.XTHS-4对葡萄球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表14.XTHS-4对肠球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表15.XTHS-4对链球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表16.XTHS-5对葡萄球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表17.XTHS-5对肠球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表18.XTHS-5对链球菌的抑制MIC值(μg/mL)
表4-18所示的实验结果表明，新藤黄酸衍生物(即XTHS-1、XTHS-2、XTHS-3、 XTHS-4、XTHS-5)同样具有显著的抗葡萄球菌、肠球菌和链球菌活性，新藤黄酸衍生物XTHS-1和XTHS-5的抑菌活性与新藤黄酸相近，新藤黄酸衍生物XTHS-2、 XTHS-3、XTHS-4的抑菌活性优于新藤黄酸。
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。
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Claims (9)

1.新藤黄酸或其衍生物在制备用于预防和/或治疗由敏感或耐药的细菌引起的疾病的药物中的用途，其中所述新藤黄酸或其衍生物分别为下式(I)、(II)和(III)所示，并且所述新藤黄酸或其衍生物包括式(I)、(II)和(III)所示的化合物的单独的异构体、异构体的外消旋或非外消旋混合物、或其药学上可接受的盐和水合物，
在式(II)和(III)中，R1、R5各自独立地选自-OH、＝O、-OCOR，其中R为烃基；R2、R3、R6、R7各自独立地选自氢、-CN、-COOH或-OH或-NH2；R4、R9各自独立地选自氢或烃基；R8选自-CN、-COOH、-COOR或-CONH2，其中R为烃基。
2.根据权利要求1所述的新藤黄酸衍生物，其特征在于：所述的烃基为烷基、环烷基、环烯基、烯基、炔基或芳基；其中，烷基的碳的数目为1-10，环烷基的碳的数目为3-8，环烯基的碳的数目为5-6，烯基的碳的数目为2-6，炔基的碳的数目为2-6，芳基的碳的数目为6-10。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的药学上可接受的盐选自钾盐或钠盐。
4.新藤黄酸或其衍生物在制备用于预防和/或治疗由敏感或耐药的细菌引起的疾病的饲料添加剂中的用途，其中所述新藤黄酸为式(I)所示，所述衍生物为式(II)或(III)所示，并且所述新藤黄酸或其衍生物包括式(I)、(II)和(III)所示的化合物的单独的异构体、异构体的外消旋或非外消旋混合物、或其药学上可接受的盐和水合物，其中，在式(II)和(III)中，R1、R5各自独立地选自-OH、＝O或-OCOR，其中R为烃基；R2、R3、R6、R7各自独立地选自氢、-CN、-COOH、-OH或-NH2；R4、R9各自独立地选自氢或烃基；R8选自-CN、-COOH、-COOR或-CONH2，其中R为烃基。
5.新藤黄酸或其衍生物在制备用于预防和/或治疗由敏感或耐药的细菌引起的疾病的食品中的用途，其中所述新藤黄酸为式(I)所示，所述衍生物为式(II)或(III)所示，并且所述新藤黄酸或其衍生物包括式(I)、(II)和(III)所示的化合物的单独的异构体、异构体的外消旋或非外消旋混合物、或其药学上可接受的盐和水合物，其中，在式(II)和(III)中，R1、R5各自独立地选自-OH、＝O或-OCOR，其中R为烃基；R2、R3、R6、R7各自独立地选自氢、-CN、-COOH、-OH或-NH2；R4、R9各自独立地选自氢或烃基；R8选自-CN、-COOH、-COOR或-CONH2，其中R为烃基。
6.根据权利要求4或5所述的用途，其特征在于：所述的烃基为烷基、环烷基、环烯基、烯基、炔基或芳基；其中，烷基的碳的数目为1-10，环烷基的碳的数目为3-8，环烯基的碳的数目为5-6，烯基的碳的数目为2-6，炔基的碳的数目为2-6，芳基的碳的数目为6-10。
7.根据权利要求1和4-5中任一项所述的用途，其中所述细菌选自葡萄球菌、链球菌或肠球菌。
8.根据权利要求1和4-5中任一项所述的用途，所述衍生物为式(IV)-(VIII)所示的化合物中的任一种：
9.根据权利要求4或5所述的用途，其特征在于：所述的药学上可接受的盐选自钾盐或钠盐。
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