CN1215070C - 前胡丙素在制备治疗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了具有抗肿瘤作用的式(I)结构的化合物，从天然植物特别是从中药中制备该化合物的方法以及该化合物在制备治疗肿瘤药物中的应用，该化合物可以单独使用，通过诱导肿瘤细胞凋亡而杀伤肿瘤细胞，也可以与化疗药物联合使用，通过抑制肿瘤细胞产生的MDR而对化疗药物起到增效作用。

Description

前胡丙素在制备治疗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种具有抗肿瘤作用并可抑制肿瘤细胞产生的多重耐药性(MDR)的新化合物。
本发明还涉及该化合物的制备方法。
本发明还涉及该化合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。
背景技术
肿瘤的多重耐药性(Muti-drug Resistance，MDR)被临床上认为是引起化疗失败的最常见的原因，对肿瘤进行的时间较长的化疗常常导致癌细胞的选择性存活，这些存活的癌细胞对于结构上和功能上不相关的广谱的化疗药物具有交叉抗性。可能导致MDR的几种机理包括细胞由于适应化疗而未能进入程序性死亡(细胞凋亡)、或药物未能到达或作用于细胞内靶位。抗癌治疗，例如药物治疗、生物治疗或放射治疗都必须击中肿瘤的细胞内靶位，并且随后应引起某种形式的细胞改变或细胞破坏。与直接杀死肿瘤细胞不同，大多数情况下抗癌药物引发细胞程序性死亡，或细胞凋亡的发生。因此，对多种药物的抗性可能是由于细胞的防御机制引起，该细胞防御机制广泛地限制药物进入细胞靶位，或阻止该细胞进入细胞凋亡并被杀伤。
Ling等鉴定了一种170KD的膜P-糖蛋白(P-gp)，后来从MDR肿瘤细胞中发现它介导每种癌症治疗药物的ATP依赖的流出，这些药物包括anthracyclines，长春花生物碱、表鬼臼毒素和Taxanes。P-gp位于细胞膜上，其功能是作为天然产生的亲脂生物异源物质的向外运输者。导致MDR的其他机制包括19-kDa的ATP-依赖的多重耐药性相关蛋白(MRP)的表达，它显示出可转运某些anthracyclines、长春花生物碱和表鬼臼毒素，但是不能转运Taxanes。与P-gp不同，MRP可以位于细胞膜上和胞质内膜上，包括内质网和高尔基体。作为MRP的药物底物既可以以GSH共轭物进行转运，也可以与GSH共同转运。GSH的缺乏使MRP过度表达细胞变得对由MRP转运的药物敏感。
过去几年进行的研究表明，先天的和后天的P-gp表达在临床MDR上扮演了一个主要角色。未接受化疗而常常表达P-gp的肿瘤类型包括结肠直肠癌、肾细胞癌、肝细胞癌、肾上腺皮质癌和慢性白血病。在几种其他的肿瘤中发现有10～50％的病例在诊断时发现P-gp表达，这些肿瘤的例子包括乳腺癌、急性髓性白血病和卵巢癌。这些肿瘤在诊断时P-gp表达可能在治疗结果中扮演了重要的角色。例如，有P-gp表达的乳腺癌病人比P-gp阴性的肿瘤病人发生化疗失败的要多三倍。
诸如阿霉素的化疗药物可以对导致P-gp表达增加的突变进行选择，并且发现了一种抑制MDR1基因表达活性并降低对阿霉素抗性的突变率的P-gp抑制物。最近，在体内用阿霉素治疗后的人转移性肉瘤中观察到MDR1基因表达的瞬时活化。根据这一发现显示，使用化疗药物的最有效的途径是在肿瘤诊断时将P-gp底物与P-gp抑制剂协同使用。
MDR的逆转是癌症化疗的主要目标。对P-gp有效的逆转剂已鉴别出来，使用这些逆转剂的临床追踪也正在进行。用于逆转P-gp介导的MDR的第一个尝试是采用例如异博定和环孢菌素A的钙离子通道阻断剂。这些药物虽然有一些功效，但是它们是相对较弱的P-gp抑制剂(EC50s，2-10μM)，常常是作为P-gp的底物，并且表现出剂量限制的副作用，这一缺陷严格限制了这类药物的使用。为解决这一问题，人们开始研究在需要抑制P-gp时不会引起明显的剂量毒性的第二代P-gp抑制剂，对于这类化合物，通常的剂量限制毒性是共济失调和高胆红素血，这些症状随着药物治疗的停止是可逆的。
最早是通过形态特征来描述细胞凋亡的，这些形态特征包括细胞收缩、膜起泡、染色质浓缩以及核碎片。由于凋亡程序可以对细胞死亡产生巨大的改变，因此控制细胞凋亡的基因和蛋白是有效的药物靶。许多从经验上得出的细胞毒性药物已经可以将细胞凋亡作为目标，虽然其作用是间接的和非特异的，这些药物也对正常组织具有诱变性和毒性。相反，直接诱导细胞凋亡的药物发生获得性药物抗性的机会较少，它还可减少诱变和降低毒性。
在治疗癌症方面植物药具有较长的使用历史。已将中药用于改善癌症病人的普通状况，但是从未将中药用于MDR癌细胞的具体根除上。自然界提供了许多植物来源的抗癌药物，例如长春花碱、irinotecan、toptancan、表鬼臼毒素吡喃葡糖苷和紫杉醇。这些从植物中分离的有效成分表现出良好的抗肿瘤效应，且相对于人工合成的化学药物来说，其毒性较低的优点使这些植物来源的抗癌药物在肿瘤治疗中得到了大量的应用。
中药白花前胡是伞形科植物白花前胡(Peucedanum praeruptorumDunn)的干燥根，载于中国药典上，通常用于止咳化痰，白花前胡中含有多种斜型非—糖苷吡喃香豆素。从白花前胡中分离的白花前胡甲素和白花前胡乙素、白花前胡戊素、前胡香豆素I、前胡香豆素II、前胡香豆素III和北美芹素已有报道，从白花前胡中分离的香豆素具有诸如钙离子拮抗作用、组胺释放和钙离子流入肥大细胞、抑制人血小板聚集、抗肿瘤启动活性和抗癌等生物学作用。
由于目前使用的化疗药物具有明显的细胞毒性作用，其在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常的细胞也具有很大的伤害，而且通过抑制肿瘤细胞产生的MDR已成为目前提高治疗效果的有效手段，因此从诱导细胞凋亡和抑制肿瘤细胞的MDR的机制入手，寻找高效、低毒的治疗肿瘤的药物已成为目前抗癌药物研究的方向。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗肿瘤作用的新的化合物——吡喃香豆素，它具有诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞多重耐药性(MDR)的作用，可以单独作为杀伤肿瘤细胞的药物，同时与化疗药物联合应用时，对常规化疗药物的细胞毒性作用有增效作用。
本发明的另一目的在于提供制备该化合物的方法。
本发明的再一目的在于提供该化合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。
根据本发明的一方面，提供具有下列化学结构式的化合物：
Figure C0114386000061
其中，上述结构式中，R1可以为饱和或不饱和酸基，优选为具有2～5个碳原子的饱和或不饱和酸基，更优选R1为乙酰氧基；R2可以为饱和或不饱和酸基，优选为具有2～5个碳原子的饱和或不饱和酸基，更优选R2为丁烯酰氧基，最优选，本发明的化合物为2-丁烯酸，2-甲基-，10-(乙酰氧基)-9，10-二氢-8，8-二甲基-2-氧代-2H，8H-苯并[1，2-b：3，4-b’]二吡喃-9-酯，[9R，10R-[8β，9(Z)，10β]]。
根据本发明的另一方面，提供本发明化合物的制备方法，本发明的化合物可以人工合成，但优选的是从天然植物中分离提取，以获得天然存在的、低毒性的天然化合物。在本发明的一个优选实施方案中，从中国传统中药白花前胡中分离纯化了本发明的化合物，其制备步骤包括：
1)将干的白花前胡粉碎；
2)将粉碎的白花前胡用50％冷乙醇抽提72小时；
3)将抽提液过滤并去除乙醇；
4)用氯仿抽提有机部分后去除氯仿，获得粗品；
5)将获得的粗品进行柱层析纯化，用甲醇—二乙醚(1∶5)作溶剂，从乙醇中重复重结晶得到纯的化合物。
根据本发明的再一方面，提供含有本发明化合物的药物组合物，可以通过将本发明化合物添加药学上可接受的载体或赋形剂或可选的其它成分而制成适于临床使用的药物组合物。
根据本发明的再一方面，提供本发明化合物在制备治疗肿瘤药物中的应用，本发明的化合物可单独使用，通过选择性诱导MDR细胞凋亡而达到杀伤肿瘤细胞的目的；本发明化合物同时通过下调MDR1/P-gp和MRP/MRP的表达，而抑制肿瘤细胞产生的MDR，进而可对细胞毒性的化疗药物有极强的增效作用，因此可与化疗药物联合应用来治疗肿瘤，这类化疗药物包括但不限于抗代谢产物、微管抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂和铂化合物；本发明化合物还可以在治疗前用于预防肿瘤细胞产生MDR。
本发明提供了一种新的稳定的化合物，其具有杀伤肿瘤细胞的作用，同时该化合物还具有抑制肿瘤细胞MDR的作用，当与细胞毒性的化疗药物协同使用时，对化疗药物具有明显的增效作用。同时，经过对中国传统中药的筛选，发明人成功地从中药白花前胡中分离纯化了本发明化合物，得到的本发明化合物因是天然存在的成分，因此毒性较低。本发明开辟了肿瘤联合化学预防和治疗的新途径。
附图的简要说明
图1为在本发明化合物(1)的1H-1H COSY NMR光谱中观察到的结构图；
图2为在本发明化合物(1)的NOESY NMR光谱中观察到的结构图；
图3为本发明化合物(1)a的透视图；
图4为本发明化合物(1)b的透视图；
图5为本发明化合物两个可相互转换的“半—椅”构象的投影图；
图6为通过动力学可变温度NMR进行的本发明化合物(1)的构型研究；
图7为APC处理KB-3-1细胞和KB-V1细胞24小时后的DNA梯度电泳图谱，使用的APC浓度为：对照(0)、1×LD50(+)、2×LD50(2+)、10×LD50(10+)，在三次独立的实验中得到相同的结果；
图8为对阿霉素和APC的各种药物联合作用的研究，A和B分别代表KB-3-1细胞和KB-V1细胞，在APC和阿霉素的联合作用中，分别以CI＞1、CI＝1和CI＜1表示对抗、附加效果和增效，图中
Figure C0114386000081
CI＝0.0-0.2  
Figure C0114386000082
CI＝0.2-0.4
Figure C0114386000083
CI＝0.4-0.6   CI＝0.6-0.8
CI＝0.8-1.0  
Figure C0114386000086
CI＞1.0
在三次独立的实验中得到相同的结果；
图9为APC处理24小时后MDR1和MRP的RT-PCR结果，以及P-gp和MRP的Western印迹，使用的APC浓度分别为对照(0)、1×LD50(+)、2×LD50(++)，肌动蛋白和β-肌动蛋白用作实验的内标，在两次独立的实验中获得了相同的结果；
图10为阿霉素累积研究结果，A和B分别代表KB-3-1细胞和KB-V1细胞，从实验开始时(时间0)测定1×104个药物处理的细胞的平均荧光强度并与未经APC处理的细胞比较，异博定用作阳性对照，在两次独立的实验中获得了相同的结果。
发明的具体实施方式
下面通过对本发明实施例的描述，详细说明但不限制本发明。
实施例
实施例1  化合物的制备
材料来源  白花前胡(Peucedanum praeruptorum Dunn)购自中国安徽省，该白花前胡的植物标本样本保藏在中国香港特别行政区，香港城市大学。
提取和分离  将干的和粉碎的白花前胡用50％冷乙醇抽提72小时，抽提液用2号滤纸过滤，用旋转蒸发器去除乙醇。用氯仿抽提有机部分，接着通过旋转蒸发器去除氯仿，然后将粗品在硅胶上进行柱层析纯化，用甲醇—二乙醚(1∶5)作溶剂，从乙醇中重复重结晶得到纯的化合物(1)。
实施例2  化合物(1)的化学结构测定
结构测定  用Electrothermal 8100熔点仪测定熔点并进行纠正，用Jasco DIP-370 Digital Polarimeter测定旋光度，用Perkin-Elmer 1600分光光度计记录FTIR光谱，用Shimadzu UV-3100分光光度计测定紫外光谱，在CDCl3溶液中用Varian NMR-300MHz分光光度计记录NMR光谱，采用TMS作为内标。将硅胶60(200-300目)用于柱层析，用C18 RocketSilicon柱与PE系列200微型泵进行高效液相层析(HPLC)，60％甲醇作为溶剂系统，用紫外检测仪进行检测，在PE SCIEX API 365 LC/MS/MS系统上记录LC/MS/MS。
化合物(1)的理化性质  本发明化合物(1)为白色粉末，熔点(mp)153～154℃、[α]D 20-4.2°(c 0.03，CHCl3)、UV(EtOH)λmax(logε)328(2.363)，209(0.013)、IRυmaxKBrcm-11740.86，1654.23，1607.50，1492.08，1284.79，1235.80，1147.73，1115.20；1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ7.608(1H，d，J＝9.53Hz，H-4)，7.360(1H，d，J＝8.51Hz，H-5)，6.808(1H，d，J＝8.51Hz，H-6)，6.600(1H，d，J＝4.99Hz，H-10)，6,243(1H，d，J＝9.53Hz，H-3)，6.139(1H，qq，J＝7.33Hz，H-3’)，5.410(1H，d，J＝4.99Hz，H-9)，2.113(3H，s，H-2”)，1.960(3H，dd，J＝7.33，1.47Hz，H-4’)，1.871(3H，qu，J＝1.47Hz，H-2’a)，1.479 & 1.438(3H，s，gem-(Me)2)、13C NMR(CDCl3，300MHz)δ169.801(s，C-1”)，166.459(s，C-1’)，159.901(s，C-2)，156.740(s，C-6a)，154.007(s，C-12)，143.277(d，C-4)，139.803(d，C-3’)，129.126(d，C-5)，126.958(s，C-2’)，113.197(d，C-6)，112.525(s，C-4a)，114.330(d，C-3)，107.051(s，C-11)，77.719(s，C-8)，69.741(d，C-9)，61.023(d，C-10)，24.881 &22.995(q，gem-(Me)2))，20.663(q，C-2’a)，20.510(q，C-2”)，15.769(q，C-4’)、EMIS m/z 409[M+Na]+(54)，349.2(7)，327.2(11)，284.2(7)，227.2(25)，198.9(4)，128(2)，83(23)，55(42)、CHN元素分析，anal.从65.00％，H 6.08％，用C21H22O7计算，C 65.28％，H 5.74％。
晶体值，C21H22O7，Mr＝386.40；单斜晶的，空间基团P21/c(#14)，a＝16.970(1)，b＝12.5520(7)，c＝18.671(1)，β＝97.94(1)，V＝3938.9(4)3。Dc＝1.303g/cm3；F000＝1632.00；μ＝(MoKα)＝0.98cm-1，样品：0.22×0.11×0.07mm；nv＝505；|Δρmax|＝0.14e-3.
(1)的IR光谱显示α-吡喃酮环(1740.86cm-1)、芳环(1654.23，1607.50，1492.08cm-1)和芳基酯基团(1284.79，1235.80，1147.73，1115.20cm-1)的存在，(1)的质谱显示在m/z409[M+Na]+(54)349.2(7)，327.2(11)，284.2(7)，227.2(25)，198.9(4)，128(2)，83(23)，55(42)有一分子峰。
在(1)的芳族质子区的1H-NMR光谱在δ＝6.243和7.608(每个1H，J＝9.53Hz)和δ＝7.360和6.808.608(每个1H，J＝8.51Hz)包含了两对二重峰，这与α-吡喃酮环的3-H和4-H信号一致，并且与由于在斜香豆素环上的5-H和6-H形成的明显的o-偶联信号一致，在δ＝5.410和6.600ppm(每个1H，d，J＝4.99Hz)的一对二重峰在H-9和H-10被分配给与两个酯基团接触的次甲基质子，在δ＝6.139(1H，qq，J＝7.33，1.47Hz)的四重峰四重峰偶联与在δ＝1.960(3H，dd，J＝7.33，1.47Hz)的二重峰二重峰偶联被分别分配给H-3’和H-4’。在δ＝2.113ppm(3H，s)的信号来自于在H-2”的乙酰基，而在δ＝1.871ppm(3H，qu，J＝1.47Hz)的五重峰信号来自于在2-甲基—丁酸盐部分的H-2a’。在δ＝1.479和1.438ppm(Δ＝0.041ppm)的两个闭合的单峰来自于二氢吡喃环的8-gem-(Me)2基团，表明在9-H和10-H的一个顺式—构型。通过(1)的1H-1H COSY和NOESY值的分析测定了(1)的1H和13C NMR共振的分配(图1和图2)。
从乙醇-n-正己烷重结晶(1)产出了足够量的(1)的晶体用于X-射线结构分析，这完整地导出在化合物(1)的二氢吡喃环中的两个半—椅构象结构的解答(表1，图3和图4)。
表1  化合物(1)的原子位置和各向同性位移参数
  原子 x y z Beq(2)
  O(1)O(2)O(3)O(4)O(5)O(6)O(7)O(8)O(9)O(10)O(11)O(12)O(13)O(14)C(1)C(2)C(3)C(4)C(5)C(6)C(7)C(8)C(9)C(10)C(11)C(12)C(13)C(14)C(15)C(16)C(17)C(18)C(19) 0.5357(2)0.6434(2)0.2935(2)0.3229(2)0.4087(2)0.3963(2)0.4795(2)0.0832(2)0.0067(2)0.2437(2)0.1275(2)0.0049(2)0.0437(2)-0.0746(2)0.6006(3)0.6092(3)0.5564(3)0.4892(3)0.4807(2)0.4168(2)0.3593(3)0.3669(3)0.4307(3)0.4117(2)0.3458(3)0.2711(3)0.2318(3)0.2129(3)0.3595(3)0.3252(4)0.2555(4)0.3515(5)0.4139(5) 0.2238(2)0.3242(3)0.0293(2)0.1420(2)0.0406(3)0.2705(2)0.2854(3)-0.1473(2)-0.0259(3)-0.3933(2)-0.3134(2)-0.3320(3)-0.2159(2)-0.2819(3)0.2663(4)0.2383(4)0.1768(4)0.1343(4)0.1612(3)0.1278(3)0.0657(3)0.0350(4)0.0694(4)0.1567(4)0.0933(3)0.0827(4)0.1882(4)0.0051(4)0.1089(5)0.1708(5)0.2537(5)0.1556(6)0.0843(6) 1.0456(1)1.0569(2)1.0253(1)1.2066(1)1.2770(2)1.1187(1)1.2229(2)1.2334(1)1.2735(2)1.1235(1)1.0118(1)0.9504(2)1.0988(1)1.1172(2)1.0171(3)0.9444(3)0.9047(2)0.9342(2)1.0048(2)1.0384(2)0.9982(2)0.9274(2)0.8964(2)1.1158(2)1.1431(2)1.0887(2)1.0661(2)1.1159(3)1.2716(3)1.3303(3)1.3044(3)1.3957(4)1.4271(3) 4.42(7)6.04(9)4.97(8)4.72(8)7.9(1)4.25(7)6.89(10)4.12(7)5.87(9)4.14(7)4.34(7)7.0(1)4.23(7)7.9(1)4.8(1)5.4(1)5.1(1)4.2(1)3.8(1)3.8(1)4.2(1)5.1(1)5.0(1)4.1(1)4.2(1)4.3(1)5.2(1)6.0(1)5.5(2)7.2(2)8.8(2)9.7(3)9.7(2)
  C(20)C(21)C(22)C(23)C(24)C(25)C(26)C(27)C(28)C(29)C(30)C(31)C(32)C(33)C(34)C(35)C(36)C(37)C(38)C(39)C(40)C(41)C(42)H(1)H(2)H(3)H(4)H(5)H(6)H(7)H(8)H(9)H(10)H(11)H(12)H(13)H(14)H(15)H(16)H(17)H(18)     0.4351(3)0.4124(3)0.0726(3)0.1421(3)0.2131(3)0.2233(2)0.1563(2)0.1585(2)0.2320(2)0.3011(2)0.2958(2)0.0854(2)0.1049(2)0.1741(3)0.2010(3)0.1529(3)0.0693(3)0.0979(3)0.1825(3)0.0486(3)-0.0372(3)-0.0356(3)-0.0638(3)0.65380.56310.32790.43530.3270.26820.18590.21680.19440.1690.23890.27180.2440.20910.39270.4350.4550.4395 0.3256(4)0.4398(4)-0.0623(4)-0.0267(4)-0.0721(4)-0.1569(3)-0.[922(3)-0.2717(3)-0.3164(3)-0.2831(4)-0.2048(4)-0.3092(3)-0.3805(3)-0.4551(3)-0.5145(4)-0.5317(4)-0.2911(4)-0.2126(3)-0.1760(4)-0.1758(4)-0.2000(4)-0.2099(4)-0.0996(5)0.26410.1609-0.00950.04880.19650.23180.17590.22290.0339-0.0061-0.06080.32330.25240.23460.08450.04720.12430.4778   1.1757(3)1.1698(3)1.2788(2)1.3252(2)1.3239(2)1.2743(2)1.2292(2)1.1775(2)1.1729(2)1.2175(2)1.2675(2)1.1298(2)1.0681(2)1.0931(2)1.0297(2)1.1503(2)0.9556(2)0.9055(2)0.9214(2)0.8498(2)0.8247(3)1.1011(3)1.0812(3)0.9240.85610.90110.84821.42931.0451.03181.10731.15761.07921.12791.31991.25321.32481.45781.38971.45461.2098   4.8(1)7.4(2)4.4(1)4.8(1)4.6(1)37(1)3.41(10)3.27(10)3.5(1)4.1(1)4.4(1)3.65(10)4.0(1)4.1(1)5.7(1)5.4(1)4.4(1)4.1(1)5.7(1)4.9(1)6.2(1)5.1(1)9.0(2)6.43846.07926.10975.989811.6416.23866.23866.23867.22627.22627.226210.588210.588210.588211.641611.641611.64168.8793
H(19)H(20)H(21)H(22)H(23)H(24)H(25)H(26)H(27)H(28)H(29)H(30)H(31)H(32)H(33)H(34)H(35)H(36)H(37)H(38)H(39)H(40)H(41)H(42)H(43)H(44)  0.42650.35660.13750.25760.35110.34240.07170.1590.21510.24590.14150.10750.19640.20770.20970.1838-0.0675-0.0427-0.0559-0.0373-0.0525-0.11950.46090.36530.05220.0593 0.46830.44640.0305-0.048-0.3146-0.1828-0.1257-0.5585-0.4647-0.5575-0.4926-0.5722-0.5784-0.2102-0.1935-0.101-0.1364-0.2289-0.2502-0.0502-0.0831-0.09530.14090.0238-0.347-0.4211  1.12621.16961.35761.35641.21291.29810.82071.00770.99531.04661.19131.13121.16440.96390.88180.92850.82450.77730.85661.11491.0341.08211.14461.15551.1581.0497  8.87938.87935.75055.56484.90785.28385.93876.82186.82186.82186.42066.42066.42066.88966.88966.88967.44357.44357.443510.756910.756910.75694.96425.0854.38424.7834
如果我们从二氢吡喃环的平面方向看，，可以将这种可互相转换的“半—椅”构象作为就环己烯来说的投影来描述(图5)。
在(1)a中，H-10和H-9分别是平伏的和轴向的，而在(1)b中，H-10和H-9则分别是轴向的和平伏的。在室温下，在δ＝6.600和5.410ppm(每个1H，d，J＝4.99Hz)的一对双峰被分别分配给与两个酯基团接触的在H-10和H-9的次甲基质子。在升高的温度下，动力学可变温度NMR研究揭示在较低的δ(更高的域)下，H-10移位达到共振，而在较高的δ(更低的域)下，H-9移位达到共振(图6)。在二氢吡喃环中的轴向质子将表现出在双健平面以上或以下的屏蔽效应，并且在比平伏的质子更低的δ(较高的域)下达到共振。
动力学可变温度NMR研究提示(1)是一个稳定的化合物，在室温下其构象结构可以用(1)a来表示。因此，(1)的结构是2-丁烯酸，2-甲基-，10-(乙酰氧基)-9，10-二氢-8，8-二甲基-2-氧代-2H，8H-苯并[1，2-b：3，4-b’]二吡喃-9-酯，[9R，10R-[8β，9(Z)，10β]]。
实施例3  化合物(1)抗癌作用的生物学实验及分析
1、材料和方法
细胞系和试剂  用人癌细胞系KB-3-1和KB-V1(从KB-3-1中用长春花碱筛选的MDR细胞)。将这些细胞在含10％胎牛血清(FBS)和1％抗生素溶液(Gibco，MD，USA)的MEM(Gibco，MD，USA)中培养，加入300ng/ml的长春花碱以维持对KV-V1细胞的药物抗性。在5％CO2的孵箱中进行培养。
研究发现，KB-V1细胞对抗代谢产物、微管抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂和铂化合物均发生多重耐药，在以下实验中，选择拓扑异构酶II抑制剂中的阿霉素作为代表进行相关的实验。
长春花碱、阿霉素和异博定从Sigma公司商购，从中药白花前胡中分离的斜型吡喃香豆素，即2-丁烯酸，2-甲基-，10-(乙酰氧基)-9，10-二氢-8，8-二甲基-2-氧代-2H，8H-苯并[1，2-b：3，4-b’]二吡喃-9-酯，[9R，10R-[8β，9(Z)，10β]](下文中以APC代表)，其特征如前描述。经NMR和HPLC测定APC的纯度超过98％。
细胞增值分析  基本如Sulfo-Rhodamine(SRB)描述的细胞毒性分析和培养基作用方程在96孔板上一式三份从3天剂量反应曲线测定APC和阿霉素的各自细胞增值LD50s，通过测定515nmOD估计与细胞数正相关的SRB的颜色强度。在所有样本中APC的药物溶剂浓度(20％DMSO和80％乙醇)均≤0.1％DMSO，溶剂对照一同进行分析，并且没有产生细胞毒性效应。
细胞凋亡分析  用不同浓度的APC(17.26μM和172.56μM)处理细胞24小时后，通过DNA梯度分析细胞凋亡。将5×106个细胞用PBS洗后，用凋亡DNA梯度试剂盒-Best.Nr.1 835 246(Roche)按照其操作手册提取基因组DNA，用含0.1％溴化乙锭的TAE缓冲液中进行2％琼脂糖凝胶电泳(99v，30分钟)分析DNA，用Multi-Imager(Bio-Rad，California，USA)观察并记录DNA带。
联合指数和增效作用  用Chou和Talalay的CI-isoboloigram测定APC和阿霉素的联合指数(CI)。为了对APC的增效作用有一个全面的理解，在联合作用的研究中采用了各种药物浓度的联合使用(表2)。用相互非特异方程计算CIs并从的平均影响数计算每个药物浓度的CI。CI＞1、CI＝1和CI＜1分别表示对抗、附加效果和增效。
表2 APC与各种浓度的阿霉素联合指数和增效作用研究
                    KB-3-1细胞
 药物  阿霉素(μM)    APC(μM)     浓度比
  A    0.0108    129.3996    11981.44
  B    0.0216    129.3996    5990.72
  C    0.0431    129.3996    3002.31
  D    0.0862    129.3996    1501.16
  E    0.0862    64.6998    750.58
  F    0.0862    32.3499    375.29
  G    0.0862    16.1749    187.64
  H    0.0862    8.0875    93.82
  I    0.0862    4.0437    46.91
  J    0.0862    2.0219    23.46
                      KB-V1细胞
  药物  阿霉素(μM)   APC(μM)     浓度比
  A  1.0776   129.3996     120.08
  B  2.1552   129.3996     60.04
  C  4.3104   129.3996     30.02
  D  8.6208   129.3996     15.01
  E  8.6208   64.6998     7.51
  F  8.6208   32.3499     3.75
  G  8.6208   16.1749     1.88
  H  8.6208   8.0875     0.94
  I  8.6208   4.0437     0.47
  J  8.6208   2.0219     0.23
MDR1和MRP的RT-PCR  用High PureTM RNA分离试剂盒(Roche)提取总RNA，将1μg总RNA与100ng随机引物(Gibco BRL)和DEPC处理的水(总体积10μl)一起在65℃孵育10分钟，然后置于冰中5分钟。逆转录混合物含有4μl 5×反应缓冲液(50mM Tris-HCL，100mM NaCl，1mM EDTA，10mM DTE，0.05％ polydocanol v/v，50％甘油v/v，PH8.4)、2μl 10mM dNTP、2μl 100mM二硫苏糖醇和1μl 50单位/μl的ExpandTM逆转录酶(Roche)，反应42℃持续1.5小时，用ExpandTM长模板PCR系统(Roche)进行PCR扩增，引物为：
P-gp的cDNA序列5’-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3’(正义)和5’-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3’(反义)；MRP5’-GGAAACCATCCACGACCCTAATCCCT-3’(正义)和5’-CCACCTCCTCATTCGCATCCACCTTG-3’(反义)；β-肌动蛋白5’-GATGATATCGCCGCGCTCGTCGTCGAC-3’(正义)和5’-AGCCAGGTCCAGACGCAGGATGGCATG-3’(反义)。在25μl扩增反应混合物中加入5μCi的[α-32P]dATP，在Gene CyclerTM(Bio-Rad)中进行27个PCR循环，反应条件为94℃1分钟、57℃1分钟及72℃1分钟，在第一个循环前，将样品在94℃加热5分钟，在最后一个循环中，延伸时间为10分钟。在10％聚丙烯酰胺凝胶电泳上以大小分级PCR产物，用BioMax胶片(Kodak)进行放射自显影，用药物敏感的KB-3-1细胞作为实验对照。
P-gp和MRP的Western印迹  为进行P-gp和MRP分析，将细胞用冰冷的裂解缓冲液(1％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、1％Triton X-100、2mM苯甲基磺酰氯、1％抑蛋白酶肽)进行裂解，将总的裂解产物加到SDS/PAGE上并电转移至硝酸纤维膜(Bio-Rad)上。然后将膜在封闭缓冲液(10mM Tris pH7.5、100mM NaCl、0.1％Teween 20、5％脱脂奶粉)中与抗-P-gp或抗-MRP或抗-β-肌动蛋白抗体(Calbiochem)一起在室温下孵育1小时，然后在室温下与辣根过氧化物酶—结合的抗(兔IgG)或抗—(鼠IgG)抗体(Gibcol BRL)一同孵育1小时。通过ECL方法(Amersham)检测免疫结合，用β-肌动蛋白多克隆抗体(OncogeneScience，Uniondale，NY，USA)作为内标，药物敏感的KB-3-1用作实验对照。
阿霉素累积分析  将5×106细胞用胰蛋白酶消化并收集，用对于不同时间常数(0、2、4和6小时)的LD50浓度的APC处理后再用2mlHBSS重新悬浮细胞。在37℃、5％ CO2的孵箱中将细胞与作为染料的2μM阿霉素一同培养30分钟，通过使用Becton Dickinson流式细胞仪(FACSCalibur)在激发488nm/发射600nm处测定阿霉素的浓度。数据用CellQuest软件采集并用ModFitLT V2.0分析，定量1×104个经药物处理细胞的平均荧光强度并与未用APC处理的细胞进行对比，异博定用作阳性对照。
2、结果
MDR细胞的选择性杀伤作用  Sulfo-Rhodarnine B(SRB)细胞毒性分析和培养基影响方程表明药物敏感的KB-3-1细胞和MDR KB-V1细胞其阿霉素的LD50分别为0.0639±0.0106μM和3.0510±0.2846μM。然而，药物敏感的KB-3-1细胞和MDR KB-V1细胞其APC的LD50则分别为41.9153±2.8016μM和17.2656±8.2441μM。在MDRKB-V1细胞和药物敏感的KB-3-1细胞上的APC的LD50之比提示对于MDR KB-V1细胞APC要敏感2.4倍(表3)。该结果显示APC对MDR癌细胞有选择性杀伤活性。细胞凋亡研究显示该选择性杀伤作用是通过APC与某些未知的抑制细胞凋亡的途径发生联系，DNA梯度提示APC的凋亡诱导作用是剂量依赖的，并且在同样的APC浓度下MDR KB-V1细胞比药物敏感的KB-3-1细胞更敏感(图7)。这些实验显示APC对MDR细胞具有剂量依赖的选择性凋亡诱导作用。
    表3  APC和阿霉素的细胞毒性(LD50)分析
  细胞系                LD50(μM±SD)
    阿霉素     APC
  KB-3-1KB-V1比值     0.0639±0.01063.0510±0.284647.7     41.9153±2.801617.2656±8.24410.41
与阿霉素协同对MDR细胞的增效相互作用  联合作用的结果显示，在MDR KB-V1细胞中，特别是在部分杀伤＞50％时，APC与阿霉素有极强的增效作用(图8)。这些实验还表明，在MDRKB-V1细胞中，APC与阿霉素的增效作用是剂量依赖的，APC的浓度范围从2.0219μM至129.3996μM。在浓度范围为2.0219μM至129.3996μM的相同的APC浓度下，用作对照实验的KB-3-1细胞没有表现出有相互的增效作用(图8A)，联合作用的研究显示对MDR细胞APC将产生增效活性，这将开辟未来联合化学预防和治疗战略上的潜在途径(表2)。
MDR1/P-gp和MRP/MRP的下调  在这里我们确定了APC是MDR1/P-gp和MRP/MRP的抑制剂。MDR1和MRP的RT-PCR结果显示MDR KB-V1细胞相对于药物敏感的亲本细胞KB-3-1表现出高水平的MDR1和MRP表达，PT-PCR还显示在MDR KB-V1细胞中以APC的剂量依赖方式下调了MDR1和MRP信息的水平。P-gp和MRP的Western印迹结果显示在MDR KB-V1细胞中以APC的剂量依赖方式下调了P-gp和MRP的水平(图9)。这些实验提示，APC可下调MDR1和MRP的mRNA水平，并且以剂量依赖方式在MDR KB-V1细胞中抑制P-gp和MRP的表达。
药物抗性的调节  为了确定由APC引起的MDR1/P-gp和MRP/MRP的下调，对MDR KB-V1细胞和药物敏感的KB-3-1细胞进行了细胞内阿霉素累积测试。与异博定相比，在经过APC培养6小时后，APC使MDR KB-V1细胞的阿霉素累积增加了25％(图10B)。在亲本细胞KB-3-1细胞中未观察到明显的增加阿霉素的作用(图10A)。还发现在MDR KB-V1细胞中APC使细胞内阿霉素累积增加的作用是时间依赖性的。
本发明提供了一种未报道过的可克服MDR的有药学价值的化合物(1)。在本实验室中采用的前所未有的筛选方法导致了从普通的具有止咳化痰功效的中药——白花前胡中分离纯化出了具有该新化合物特征的吡喃香豆素。
经过对本发明化合物对MDR癌细胞的选择性杀伤作用的研究，结果表明本发明化合物选择性杀伤MDR细胞是与对MDR细胞对诱导凋亡的较高的易感性相关的。以往的研究结果已显示，当用2-脱氧-D-葡萄糖或葡糖神经酰胺合成酶PDMP和PPPP的抑制剂处理时，MDR细胞系比敏感细胞更容易发生凋亡。这些研究提示，葡糖神经酰胺水平的操纵可能是导致MDR细胞选择性杀伤的有效途径。本发明化合物是与2-脱氧-D-葡萄糖、PDMP和PPPP完全不同的一类药物，目前的研究结果提示可能由广泛的刺激引起MDR细胞对杀伤和诱导凋亡选择性地敏感。虽然目前尚不知本发明化合物选择性根除MDR癌细胞的机制，但是本发明的结果在理解MDR和凋亡的联系上可以给出很肯定的结果。
人们对于研究本发明化合物与其他诸如阿霉素等细胞毒性药物在选择性杀伤MDR细胞上的联合作用可能更有兴趣。本发明化合物增强阿霉素对MDR细胞的效力，并且开辟了将来联合化学预防和治疗战略的潜在可能。
P-gp和MRP都是从MDR肿瘤细胞中介导流出癌症疗法的ATP依赖的转运者，发明人检测了MDR1和MRP的mRNA水平以及P-gp和MRP水平，吡喃香豆素导致的MDR1和MRP的mRNA的下调将抑制P-gp和MRP的表达，这些实验提示吡喃香豆素是P-gp介导的MDR和MRP介导的MDR的抑制剂。
通过对P-gp和MRP表达的抑制，本发明化合物可以调节MDR，MDR KB-V1细胞具有P-gp和MRP的过量表达，因此本发明化合物的效果较明显，药物敏感的细胞没有过量的P-gp和MRP表达，因此本发明化合物的效果较小，在本发明中细胞内阿霉素累积分析支持这一假定。
总而言之，本发明化合物与常用的化疗药物相比具有轻微的细胞毒性，可选择性诱导MDR细胞凋亡，在MDR细胞中与化疗药物联合应用具有增效作用，对P-gp和MRP介导的MDR细胞具有潜在的抑制作用。本发明同时提供了对难以控制的疾病的选择和/或治疗前防止MDR的治疗学研究的基本原理。本发明化合物是一种在体外可逆转MDR的新的特异性药物。
以上对本发明实施例的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明的范围。

Claims (5)

1.下式化合物(1)在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述化合物(1)与化疗药物联合使用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述化疗药物选自抗代谢产物、微管抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂或铂化合物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述化疗药物为阿霉素。
5.化合物(1)在制备防治MDR肿瘤细胞的药物中的应用。
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