CN115708824B - 7,8-二羟基黄酮作为铁稳态扰动剂在制备多粘菌素增效剂中的应用 - Google Patents
7,8-二羟基黄酮作为铁稳态扰动剂在制备多粘菌素增效剂中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115708824B CN115708824B CN202211500686.1A CN202211500686A CN115708824B CN 115708824 B CN115708824 B CN 115708824B CN 202211500686 A CN202211500686 A CN 202211500686A CN 115708824 B CN115708824 B CN 115708824B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- salmonella
- polymyxin
- dihydroxyflavone
- iron
- steady state
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- COCYGNDCWFKTMF-UHFFFAOYSA-N 7,8-dihydroxyflavone Chemical compound OC=1C(O)=CC=C(C(C=2)=O)C=1OC=2C1=CC=CC=C1 COCYGNDCWFKTMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 119
- 108010040201 Polymyxins Proteins 0.000 title claims abstract description 70
- WWGFXSLWIRYIBP-UHFFFAOYSA-N 7,8-dihydroxy-4H-chromen-4-one Natural products O1C=CC(=O)C=2C1=C(O)C(O)=CC=2 WWGFXSLWIRYIBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 59
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract description 91
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 title abstract description 44
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 title abstract description 13
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims abstract description 75
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 18
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 7
- 206010039438 Salmonella Infections Diseases 0.000 claims description 5
- 206010039447 salmonellosis Diseases 0.000 claims description 5
- ZZLQHXCRRMUGQJ-UHFFFAOYSA-N 2'-Hydroxyflavone Natural products OC1=CC=CC=C1C1=CC(=O)C2=CC=CC=C2O1 ZZLQHXCRRMUGQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- HVQAJTFOCKOKIN-UHFFFAOYSA-N flavonol Chemical compound O1C2=CC=CC=C2C(=O)C(O)=C1C1=CC=CC=C1 HVQAJTFOCKOKIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 26
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 10
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 abstract description 9
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 abstract description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 7
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 abstract description 6
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 abstract description 5
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 5
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 abstract description 5
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 abstract description 5
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 abstract description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 abstract description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 20
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 15
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 12
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethyl sulfoxide Natural products CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 5
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 5
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 4
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 4
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 3
- 229940041153 polymyxins Drugs 0.000 description 3
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 101100008048 Caenorhabditis elegans cut-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078777 Colistin Proteins 0.000 description 1
- 208000034801 Enterobacteriaceae Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 1
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 101150004219 MCR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010048685 Oral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 208000030886 Traumatic Brain injury Diseases 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001430 anti-depressive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000935 antidepressant agent Substances 0.000 description 1
- 229940005513 antidepressants Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 1
- 231100000313 clinical toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 230000006999 cognitive decline Effects 0.000 description 1
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 1
- 229960003346 colistin Drugs 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- JORAUNFTUVJTNG-BSTBCYLQSA-N n-[(2s)-4-amino-1-[[(2s,3r)-1-[[(2s)-4-amino-1-oxo-1-[[(3s,6s,9s,12s,15r,18s,21s)-6,9,18-tris(2-aminoethyl)-3-[(1r)-1-hydroxyethyl]-12,15-bis(2-methylpropyl)-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,4,7,10,13,16,19-heptazacyclotricos-21-yl]amino]butan-2-yl]amino]-3-h Chemical compound CC(C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)CN[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCN)NC1=O.CCC(C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)CN[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCN)NC1=O JORAUNFTUVJTNG-BSTBCYLQSA-N 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- XDJYMJULXQKGMM-UHFFFAOYSA-N polymyxin E1 Natural products CCC(C)CCCCC(=O)NC(CCN)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)NC(CCN)C(=O)NC1CCNC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CCN)NC1=O XDJYMJULXQKGMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KNIWPHSUTGNZST-UHFFFAOYSA-N polymyxin E2 Natural products CC(C)CCCCC(=O)NC(CCN)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)NC(CCN)C(=O)NC1CCNC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CCN)NC1=O KNIWPHSUTGNZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000009529 traumatic brain injury Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于生物技术领域,公开了7,8‑二羟基黄酮作为铁稳态扰动剂在制备多粘菌素增效剂中的应用。使用ELISA试剂盒检测沙门菌胞内的铁含量,并通过RT‑PCR验证与铁摄取相关基因的表达量变化,证实7,8‑二羟基黄酮通过抑制与铁摄取相关基因的表达进而扰乱沙门菌胞内的铁稳态。7,8‑二羟基黄酮作为铁稳态扰动剂联合多粘菌素对沙门菌在体外和体内实验都具有很好的协同作用。相比传统抗生素与抗生素联合直接杀死沙门菌的作用机制,植物提取物7,8‑二羟基黄酮可直接抑制沙门菌对铁元素的摄取与利用,从而提高沙门菌对多粘菌素的敏感性,不容易诱导细菌耐药性的产生,具有来源广泛、价格低和治疗效果好的特点。
Description
技术领域
本发明属于医学生物技术领域,更具体地,涉及7,8-二羟基黄酮作为铁稳态扰动剂在制备多粘菌素增效剂中的应用。
背景技术
沙门菌是一种革兰氏阴性细菌,人或养殖动物食用了被沙门菌污染的食物后,会导致食源性疾病,可引起从局部胃肠炎到全身性疾病。沙门菌的耐药性问题已对全球公共卫生构成威胁,随着临床检测中沙门菌耐药率升高,以及新型抗生素的供应有限,多粘菌素已作为抗生素治疗多重耐药沙门菌的最后一道防线。
从上世纪50年代开始,多粘菌素已被用作抗生素对抗人类和兽医环境中革兰氏阴性细菌导致的临床感染。然而,由于多粘菌素使用容易有临床毒性,使其在上世纪80年代使用率显著减少。但随着耐药菌的危害加剧,多粘菌素又重新被使用,并作为治疗多重耐药菌的最后治疗手段。从2016年,质粒介导的可移动多粘菌素抗性基因(mcr-1)被报道后,多粘菌素耐药性是世界范围内新出现的公共卫生威胁。多粘菌素已在我国兽医领域停用,并有效减少耐多粘菌素大肠杆菌的检出率。但是在临床治疗,多粘菌素还是十分重要的抗生素药物。基于肠杆菌科细菌的多粘菌素耐药性问题相当重要和突出,因此筛选有效的多粘菌素增效剂来治疗耐药多粘菌素的肠杆菌科感染成了当务之急。从天然化合物库中提取与多粘菌素具有协同作用的天然化合物,可以有效的恢复耐多粘菌素肠杆菌科细菌对多粘菌黏的敏感性,这也是有效挖掘抗生素替代方法和解决细菌耐药性问题的策略之一。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述问题,首先提供7,8-二羟基黄酮作为沙门菌铁稳态扰动剂的应用。
本发明的第二个目的是提供7,8-二羟基黄酮在制备耐多粘菌素沙门菌的增效剂中的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现:
7,8-二羟基黄酮作为沙门菌铁稳态扰动剂的应用。
本发明所述铁稳态扰动剂7,8-二羟基黄酮,CAS登录号为38183-03-8,分子式为C15H10O4,分子质量254.24。
结构式:
7,8-二羟基黄酮是脑源性神经营养因子的模拟物,主要作为抗抑郁药、创伤性脑损伤恢复以及预防认知能力下降和神经退行性疾病。目前,国内外未见7,8-二羟基黄酮通过扰乱沙门菌胞内铁稳态来增强沙门菌对多粘菌素敏感性的报道。
本发明以沙门菌胞内铁稳态作为多粘菌素增效剂筛选的靶标,并筛选到7,8-二羟基黄酮可以通过扰动细菌胞内的铁稳态,减少胞内可用的铁元素的含量,并且显著降低铁元素的转运蛋白的表达量。
因此,优选的,上述应用中,7,8-二羟基黄酮用于减少沙门菌细胞内铁元素的含量。
体外试验表明,在有效浓度范围内7,8-二羟基黄酮不具有抑菌能力,经7,8-二羟基黄酮与多粘菌素联合可以显著增强耐多粘菌素沙门菌对多粘菌素敏感性。
因此,本发明还提供了7,8-二羟基黄酮在制备耐多粘菌素沙门氏菌的增效剂中的应用。
优选的,上述应用中,所述7,8-二羟基黄酮的浓度为25mg/L,所述沙门氏菌的浓度为1×106CFU/mL,多粘菌素的浓度为16-32mg/L。
体内试验中,通过构建小鼠沙门菌肠道感染模型,7,8-二羟基黄酮联合多粘菌素腹腔注射,可以减少肝和脾的沙门菌菌量并显著提高动物的生存率。
因此,本发明还提供了7,8-二羟基黄酮与多粘菌素联用在制备抗沙门氏菌感染的药物中的应用。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明公开了7,8-二羟基黄酮作为铁稳态扰动剂在制备多粘菌素增效剂中的应用。使用ELISA试剂盒检测沙门菌胞内的铁含量,并通过RT-PCR验证与铁摄取相关的基因的表达量变化,证实7,8-二羟基黄酮通过抑制与铁摄取相关基因的表达进而扰乱沙门菌胞内的铁稳态。7,8-二羟基黄酮作为铁稳态扰动剂联合多粘菌素对沙门菌在体外和体内实验都具有很好的协同作用。相比传统抗生素与抗生素联合直接杀死沙门菌的作用机制,植物提取物7,8-二羟基黄酮可直接抑制沙门菌对铁元素的利用,从而提高沙门菌对多粘菌素的敏感性,不容易诱导细菌耐药性的产生,具有来源广泛、价格低和治疗效果好的特点。
附图说明
图1显示7,8-二羟基黄酮扰动细菌包内的铁稳态,并显著降低铁元素的相关转运蛋白的表达量;
图2显示7,8-二羟基黄酮联合多粘菌素对沙门菌的棋盘法热图和体外杀菌曲线;
图3显示7,8-二羟基黄酮与多粘菌素联用显著降低沙门菌感染小鼠的肝和脾的载菌量,并显著提高小鼠的生存率。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是,对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明,但并不构成对本发明的限定。此外,下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例以及实验例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法;所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,为可从商业途径得到的试剂和材料;所用的设备,如无特殊说明,均为常规实验设备。
实施例1沙门氏菌铁稳态扰动剂的筛选
以检测细菌胞内总铁含量的ELISA试剂盒来检测受试化合物对沙门菌铁稳态的影响,通过天然化合物与沙门菌共孵育后检测沙门菌胞内的总铁含量进行铁稳态扰动剂的筛选,具体实验过程如下:
1、将经高压灭菌的pH值为5.8的LPM肉汤冷却备用。沙门菌标准菌株ATCC14028为实验室保存。
2、试验前的准备工作:
(1)配制实验室已有的植物提取物,溶剂为二甲基亚砜,使药物终浓度为5000mg/L,混匀后用滤膜过滤,备用。
(2)将沙门菌标准菌株ATCC14028接种至LB琼脂培养板上,培养至合适大小。
3、植物提取物影响沙门菌胞内铁含量的检测
(1)受试沙门菌标准菌株ATCC14028接到装有4mL LB肉汤试管中,放入37℃摇床中180转孵育至对数生长期;
(2)使用pH值为5.8的LPM肉汤将孵育后的菌稀释到100倍后添加终浓度为25mg/L的植物提取物使总体积4mL,并设置空白对照组;
(3)将(2)中的菌液放入37℃摇床中180转孵育至对数生长期后,调整使每一植物提取物处理组的OD值达一致;
(4)吸取等体积的(3)中调整好的菌液,在低温环境下收集菌体,并使用低温去离子水进行3次洗脱细菌胞外的铁元素;
(5)加入1mL 低温去离子水重悬(4)洗脱后的菌体,并使用超声破碎仪低温完全破碎菌体;
(6)根据检测细菌胞内总铁含量的ELISA试剂盒的说明书步骤,检测沙门菌胞内的总铁含量。
利用RT-PCR检测化合物对沙门菌铁转运相关基因的mRNA表达水平试验的影响。具体实验过程如下:
1、将经高压灭菌的pH值为5.8的LPM肉汤冷却备用。沙门菌标准菌株ATCC14028为实验室保存。
2、试验前的准备工作:
(1)配制适量的7,8-二羟基黄酮,溶剂为二甲基亚砜,使药物终浓度为5000mg/L,混匀后用滤膜过滤,备用。
(2)将沙门菌标准菌株ATCC14028接种至LB琼脂培养板上,培养至合适大小。
3、7,8-二羟基黄酮对沙门菌的铁转运相关基因mRNA水平检测
(1)受试沙门菌标准菌株ATCC14028接到装有4mL LB肉汤试管中,放入37℃摇床中180转孵育至对数生长期;
(2)使用pH值为5.8的LPM肉汤将孵育后的菌稀释到100倍后添加终浓度为25mg/L的7,8-二羟基黄酮使总体积4mL,并设置空白对照组;
(3)将(2)中的菌液放入37℃摇床中180转孵育至对数生长期后;收集菌体,并使用RNA提取试剂盒提取菌体总RNA;再使用反转录试剂盒将提取的RNA反转录成cDNA,并放于-20℃冰箱备用;
(4)在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上收集并设计沙门菌与铁转运相关基因的引物,并将引物合成;
(5)使用(3)中准备好的cDNA和(4)中已合成的引物进行RT-PCR试验,检测沙门菌与铁转运相关基因的mRNA表达水平。
结果:细菌胞内总铁含量的ELISA试剂盒检测结果显示,与对照组相比,7,8-二羟基黄酮在浓度为25mg/L时可以显著减少沙门菌胞内总的铁含量;RT-PCR结果显示,经25mg/L的7,8-二羟基黄酮预处理后,沙门菌与铁转运相关的基因表达水平均出现不同程度的下降,该结果表明7,8-二羟基黄酮通过抑制沙门菌铁摄取相关的基因表达水平,从而扰乱沙门菌胞内的铁稳态(见图1)。
实施例2 7,8-二羟基黄酮增强体外沙门氏菌对多粘菌素的敏感性
1、将经高压灭菌的pH值为5.8的LPM肉汤冷却备用。沙门菌标准菌株ATCC14028,耐多粘菌素沙门菌(17ES)均为实验室保存。
2、试验前的准备工作:
(1)配制适量的7,8-二羟基黄酮,溶剂为二甲基亚砜,使药物终浓度为5000mg/L,混匀后用滤膜过滤,备用。多粘菌素按照CLSI配成浓度为5120mg/L的储备液备用。
(2)将沙门菌标准菌株ATCC14028和耐多粘菌素沙门菌(17ES)接种至LB琼脂培养板上,培养至合适大小。
3、7,8-二羟基黄酮与多粘菌素对沙门菌的MIC和FICI
(1)受试沙门菌标准菌株ATCC14028和耐多粘菌素沙门菌(17ES)接到装有4mL LB肉汤试管中,放入37℃摇床中180转孵育至对数生长期;
(2)使用pH值为5.8的LPM肉汤将孵育后的菌稀释到100倍,约为106CFU/mL,备用;
(3)取无菌96孔板,第1孔加180μL LPM肉汤培养基,第2-11孔分别加入100μLLPM肉汤培养基;
(4)在第1列加入20μL药,吹打均匀后,吸取100μL到第2孔,依次类推,第10孔吸取100μL弃去;
(5)第1到11孔加入稀释好的菌液100μL,第12孔加入200μL LPM肉汤培养基肉汤;
(6)重复步骤(3)到(5),进行三次重复平行;
(7)将接种好的96孔板放入37℃培养箱中孵育16-18h后,读取结果;
(8)根据MIC结果,再进行棋盘法。7,8-二羟基黄酮浓度范围为1-100mg/L,多粘菌素抗生素的作用浓度范围为16-32mg/L。
MIC结果如表1,7,8-二羟基黄酮对沙门菌标准菌和耐多粘菌素沙门菌的MIC值>100mg/L;当7,8-二羟基黄酮与多粘菌素联用时,能显著降低耐药菌和标准菌对多粘菌素的敏感性,棋盘法结果如图2所示,并且棋盘法结果显示FICI均小于0.5,表明7,8-二羟基黄酮与多粘菌素在治疗沙门菌时有很好的协同作用。
表1
4、7,8-二羟基黄酮与多粘菌素对沙门菌的体外杀菌曲线
(1)受试沙门菌标准菌株ATCC14028和耐多粘菌素沙门菌(17ES)接到装有4mL LB肉汤试管中,放入37℃摇床中180转孵育至对数生长期;
(2)使用pH值为5.8的LPM肉汤将孵育后的菌稀释到10倍,约为107CFU/mL,备用;
(3)在pH值为5.8的LPM肉汤离心管中,添加25mg/L浓度的7,8-二羟基黄酮或有抑菌浓度的多粘菌素单独或联合使用,然后加入步骤(2)所稀释得到的稀释菌液各0.4mL,涡旋5s混匀。设立一个空白对照组作为质控,对照组除了不加入药之外,其余条件都与试验组保持一致。此时的菌液浓度约为1×106CFU/mL左右,放置于37℃摇床内180转培养,菌液体系为4mL;
(4)分别取培养时间的0、3、6、9和24h时的菌液吸取100μL菌液加入装有900μL0.85%生理盐水的2mL离心管中进行10倍的梯度稀释,稀释后吸取25μL滴在MH琼脂培养基上,在37℃培养箱孵育18h,进行计数,实验结果经过三个生物学重复后进行统计分析。统计各时间点的菌落数,并绘制杀菌曲线图。
结果:图2体外杀菌曲线显示7,8-二羟基黄酮与多粘菌素联用24h后载菌量相较于单药下降超过100倍,展现7,8-二羟基黄酮与多粘菌素联合在体外具有优异的杀灭沙门菌的效果。
实施例3 7,8-二羟基黄酮增强体内多粘菌素对沙门氏菌杀伤效果
1、试验材料:广东省南方医科大学购买8周龄C57BL/6J雌鼠64只,小鼠灌胃针,无菌注射器。
2、试验前的准备工作:配备5mg/kg多粘菌素、5mg/kg 7,8-二羟基黄酮储备液,链霉素100000mg/L。将沙门氏菌ATCC14028菌株接种至LB琼脂培养板上,培养至合适大小。每组8只小鼠,一共4组(对照组,多粘菌素治疗组,7,8-二羟基黄酮治疗组,联合治疗组)。
3、沙门氏菌感染小鼠模型的建立
(1)每只老鼠口服20mg的链霉素处理肠道菌群,并在处理前提前4h进行断水断粮。
(2)链霉素处理一天后,灌胃100μL的约为109的ATCC14028菌液。受试ATCC14028菌株接到装有4mL LB肉汤试管中,放入37℃摇床中180转孵育至对数生长期取出离心管(约108菌量),并集菌到109的菌量。
4、小鼠感染后靶器官菌落定植数检测
(1)小鼠感染1天后,7,8-二羟基黄酮(5mg/kg,腹腔注射,一天一次)与多粘菌素(5mg/kg,腹腔注射,一天一次)进行单药以及联合给药。
(2)使用上述药物剂量持续治疗3天后,以颈部关节脱位法处死治疗组和质控组的小鼠,收集脾脏、肾脏,并进行菌落计数。
结果:与最好的单药治疗组相比,7,8-二羟基黄酮与多粘菌素联合治疗后,小鼠靶器官(肝、脾)显著减少,菌量较单药处理下降超过100倍(见图3)。
5、小鼠感染后治疗生存率试验
(1)小鼠感染1天后,7,8-二羟基黄酮(5mg/kg,腹腔注射,一天一次)与多粘菌素(5mg/kg,腹腔注射,一天一次)进行单药以及联合给药。
(2)使用(1)药物剂量持续治疗8天后,记录并绘制治疗组和质控组的小鼠生存曲线。
结论:治疗第八天后,对照组存活率0%,7,8-二羟基黄酮治疗组存活率12.5%,多粘菌素治疗组存活率25%,7,8-二羟基黄酮联合多粘菌素生存率为87.5%;7,8-二羟基黄酮联合多粘菌素保护率显著高于多粘菌素治疗组(见图3)。这表明7,8-二羟基黄酮和多粘菌素联合使用治疗体内沙门菌感染也有很好的协同效果。
综上所述,本研究以沙门菌的铁稳态为靶标,筛选出铁稳态扰动剂7,8-二羟基黄酮,并展示7,8-二羟基黄酮与多粘菌素联合具有很好的体外杀伤沙门菌作用。最后通过口服感染沙门菌的方式成功建立沙门氏菌感染小鼠模型,进一步证实7,8-二羟基黄酮与多粘菌素联用可以减少肝脏、脾脏的菌落定殖,并降低沙门菌感染小鼠的死亡率,这些研究将为多粘菌素增效剂的新药研发提供思路和基础。
以上对本发明的实施方式作了详细说明,但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言,在不脱离本发明原理和精神的情况下,对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型,仍落入本发明的保护范围内。
Claims (3)
1.7,8-二羟基黄酮与多粘菌素组合在制备抗耐多粘菌素沙门菌感染的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述7,8-二羟基黄酮的浓度为25 mg/L,所述耐多粘菌素沙门菌的浓度为1×106 CFU/mL,多粘菌素的浓度为16-32 mg/L。
3.7,8-二羟基黄酮与多粘菌素组合在制备抗沙门菌感染的药物中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211500686.1A CN115708824B (zh) | 2022-11-28 | 2022-11-28 | 7,8-二羟基黄酮作为铁稳态扰动剂在制备多粘菌素增效剂中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211500686.1A CN115708824B (zh) | 2022-11-28 | 2022-11-28 | 7,8-二羟基黄酮作为铁稳态扰动剂在制备多粘菌素增效剂中的应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115708824A CN115708824A (zh) | 2023-02-24 |
CN115708824B true CN115708824B (zh) | 2023-11-21 |
Family
ID=85234963
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202211500686.1A Active CN115708824B (zh) | 2022-11-28 | 2022-11-28 | 7,8-二羟基黄酮作为铁稳态扰动剂在制备多粘菌素增效剂中的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN115708824B (zh) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113209058A (zh) * | 2021-05-14 | 2021-08-06 | 吉林大学 | 去甲二氢愈创木酸在制备mcr-1酶抑制剂中的应用 |
-
2022
- 2022-11-28 CN CN202211500686.1A patent/CN115708824B/zh active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113209058A (zh) * | 2021-05-14 | 2021-08-06 | 吉林大学 | 去甲二氢愈创木酸在制备mcr-1酶抑制剂中的应用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Mutagenicity of flavones, chromones and acetophenones in Salmonella;Carl A.Elliger et al;《Mutation Research》(第135期);第77-86页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN115708824A (zh) | 2023-02-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111096964A (zh) | 一种槲皮素与抗菌药物的联合应用 | |
Kuo et al. | Isolation of endophytic fungi with antimicrobial activity from medicinal plant Zanthoxylum simulans Hance | |
CN115725446A (zh) | 一种抗结直肠肿瘤的屎肠球菌及其应用 | |
CN116731929A (zh) | 一株发酵粘液乳杆菌zs40及其应用 | |
CN115708824B (zh) | 7,8-二羟基黄酮作为铁稳态扰动剂在制备多粘菌素增效剂中的应用 | |
Du et al. | Marine fungal metabolites as a source of drug leads against aquatic pathogens | |
CN109602779A (zh) | 一种中药组合物及其在制备防治石斑鱼虹彩病毒病药物中的应用 | |
CN115300521B (zh) | 芸香柚皮苷在制备SortaseA分选酶和PLY溶血素抑制剂中的应用 | |
Li et al. | Therapeutic effect of demethylated hydroxylated phillygenin derivative on Helicobacter pylori infection | |
Yang et al. | Identification of Vibrio cholerae as a bacterial pathogen of bluegill sunfish | |
CN104274454A (zh) | 一种抗药耐药金黄色葡萄球菌组合药物及用途 | |
CN115806881A (zh) | 一种青霉属真菌及其在制备抗菌药物中的应用 | |
US11491135B2 (en) | Medical use of tectorigenin in treatment of chicken necrotic enteritis | |
CN112961170B (zh) | 一株海绵来源放线菌及所产含硫生物碱的制备方法和应用 | |
CN108888625B (zh) | 一种水产养殖抑菌剂及其应用 | |
CN108186617A (zh) | 香叶醇及其衍生物在制备mrsa感染性疾病药物中的新用途 | |
CN115813890B (zh) | 石斛酚及作为多粘菌素佐剂在制备治疗细菌感染性疾病药物中的应用 | |
CN104887678B (zh) | 苯甲酰多羟基环己烯在制备药物组合物中的用途 | |
CN113679703B (zh) | 甘草查尔酮a在抗水产养殖动物嗜水气单胞菌感染中的应用 | |
CN113082013B (zh) | Napabucasin的制药用途 | |
CN108186618A (zh) | 柠檬醛及其衍生物在制备mrsa感染性疾病药物中的新用途 | |
CN113440521B (zh) | 广藿香酮在制备mcr-1酶抑制剂中的应用 | |
CN112569282B (zh) | 一种含有海巴戟提取物与黄葵提取物的抑菌组合物 | |
CN109803656B (zh) | 一种抗白色念珠菌的化合物及其制备方法和应用 | |
CN108002998B (zh) | 一种萘类化合物及其制备方法和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |