CN112569282B - 一种含有海巴戟提取物与黄葵提取物的抑菌组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种含有海巴戟提取物与黄葵提取物的抑菌组合物，所述的组合物在制备用于治疗以舒伯特气单胞菌为病原的类结节病中的应用。本发明所述含有海巴戟提取物与黄葵提取物的抑菌组合物对舒伯特气单胞菌有明显的抑制作用，特别是对鳢科鱼类有明显的、长效的抑制作用，能有效的治疗鳢科鱼类的类结节病，该组合物可用于制备药剂与饲料添加剂。
Description
技术领域
本发明属于水产领域，尤其是涉及一种含有海巴戟提取物与黄葵提取物的抑菌组合物。
背景技术
我国是水产养殖大国，水产品的养殖密度和产量均较高，但由于养殖技术和设施落后，常导致鱼类细菌性疾病的频繁发生。目前以抗生素为主的药物防治是仍然是养殖生产中最有效、最直接的方法，对于防治鱼类细菌病发挥着非常重要的作用。但生产实践中长期使用抗生素，会导致短时间内耐药菌株层出不穷，研究发现从2009年到2017年八年间，鳢源舒伯特气单胞菌对四环素和氨基糖苷类(如卡那霉素和壮观霉素)等药物耐药性明显增强。因而，我们建议在具体养殖管理模式下，根据病原的药物敏感性选择药物，用药时应严格按照药物用量及用药程序进行，并配合保肝药和维生素等保健品，实现科学用药。
鱼类内脏类结节病病原多样，且有些鱼类又同时是几种病原的感染宿主，如鱼类诺卡氏菌、舒伯特气单胞菌和分枝杆菌都是鳢科鱼类的主要病原菌，美人鱼发光杆菌病、假单胞菌病和哈维氏弧菌病都是大黄鱼的主要疾病，它们发病症状相似，在养殖生产过程中常常容易引起误诊，耽误治疗。另外，鱼类内脏类结节病前期体表症状不明显，诊断十分困难，鱼体一旦出现异常症状，病情已经扩散，即使采取治疗措施，花费往往很高而未必得到理想的效果，为养殖户带来严重的损失。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种含有海巴戟提取物与黄葵提取物的抑菌组合物。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种抑制舒伯特气单胞菌的组合物在制备用于治疗以舒伯特气单胞菌为病原的类结节病中的应用。
进一步，所述的组合物含有新霉素、海巴戟提取物与黄葵提取物。
进一步，所述的组合物包含质量比为1：220-1000：480-2000的新霉素、海巴戟提取物与黄葵提取物。
优选的，所述的新霉素、海巴戟提取物与黄葵提取物的质量比为1：220-850：480-1640；优选的，所述的新霉素、海巴戟提取物与黄葵提取物的质量比为1：220-300：800-1240。
进一步，所述的海巴戟提取物由包括如下步骤的方法制成：将海巴戟打碎后加入10-50倍量的缓冲溶液，然后加入复合植物水解酶，在40-60℃下酶解2-3小时，然后水浴灭菌、抽滤，收集酶解滤液，然后在滤渣中加入浓度为50-60％的乙醇，在45-60℃浸提2-3小时，抽滤后收集浸提滤液，将所述的酶解滤液与浸提滤液混合后浓缩，得到所述的海巴戟提取物。
优选的，所述的海巴戟提取物由包括如下步骤的方法制成：将海巴戟打碎后加入30-50倍量的缓冲溶液，然后加入复合植物水解酶，在45-55℃下酶解2-3小时，然后水浴灭菌、抽滤，收集酶解滤液，然后在滤渣中加入浓度为50-60％的乙醇，在55-60℃浸提2-3小时，抽滤后收集浸提滤液，将所述的酶解滤液与浸提滤液混合后浓缩，得到所述的海巴戟提取物。
进一步，所述的复合植物水解酶的用量为100-150μL/g；所述的滤渣与乙醇的固液比为1:20-30；所述的缓冲溶液为柠檬酸钠溶液。
进一步，所述的黄葵提取物由包括如下步骤的方法制成：将黄葵晒干后粉碎、过筛，在得到的黄葵粉末中加入浓度为50-80％的乙醇，超声0.2-2.5小时，重复提取1次后，将提取液混合即得；所述的黄葵与所述的乙醇的固液比为1:10-30。
一种含有海巴戟提取物与黄葵提取物的抑菌组合物，所述的组合物包含质量比为1：220-1000：480-2000的新霉素、海巴戟提取物与黄葵提取物。
所述的含有海巴戟提取物与黄葵提取物的抑菌组合物的制备方法，包括如下步骤：将海巴戟提取物与黄葵提取物混合均匀，然后向其中加入新霉素，混合均匀后即成。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
本发明所述的含有海巴戟提取物与黄葵提取物的抑菌组合物对舒伯特气单胞菌有明显的抑制作用，特别是对鳢科鱼类有明显的、长效的抑制作用，能有效的治疗鳢科鱼类的类结节病，该组合物可用于制备药剂与饲料添加剂。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例中所述的复合植物水解酶ViscozymeL(非淀粉复合糖酶，含果胶酶和各种碳水化合物酶，包括阿拉伯聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶和木聚糖酶等)诺维信中国生物技术有限公司。
本发明实施例中所述的新霉素来自河南新经典生物科技有限公司。
本发明实施例中所述的标准菌株ATCC43700购自美国模式培养集存库，舒伯特气单胞菌菌株HYL2由中国水产科学研究院珠江水产研究所水产病害与免疫研究室馈赠。
下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例1海巴戟提取物的制备
准确称量海巴戟1000g，打碎后加入30倍量的柠檬酸钠缓冲溶液，然后加125μL/g入复合植物水解酶，在50℃下酶解2小时，然后水浴灭菌、抽滤，收集酶解滤液，然后在滤渣中加入20倍量浓度为60％的乙醇，在55℃下浸提2小时，抽滤后收集浸提滤液，将所述的酶解滤液与浸提滤液混合后浓缩，得到海巴戟提取物A。
准确称量海巴戟1000g，打碎后加入30倍量的柠檬酸钠缓冲溶液，然后加125μL/g入复合植物水解酶，在50℃下酶解2小时，然后水浴灭菌、抽滤，收集酶解滤液，然后在滤渣中加入20倍量浓度为60％的乙醇，浸提2小时，抽滤后收集浸提滤液，将所述的酶解滤液与浸提滤液混合后浓缩，得到海巴戟提取物B。
准确称量海巴戟1000g，打碎后加入30倍量的柠檬酸钠缓冲溶液，然后加125μL/g入复合植物水解酶，在50℃下酶解2小时，然后水浴灭菌、抽滤，收集酶解滤液，然后在滤渣中加入20倍量浓度为70％的乙醇，在55℃下浸提2小时，抽滤后收集浸提滤液，将所述的酶解滤液与浸提滤液混合后浓缩，得到海巴戟提取物C。
准确称量黄葵1000g晒干后粉碎、过筛，在得到的黄葵粉末中加入20倍量的浓度为70％的乙醇，超声1.5小时，重复提取1次后，将提取液混合后得到黄葵提取物。
准确称量新霉素100mg、海巴戟提取物A 26g、黄葵提取物112g，分别将海巴戟提取物A与黄葵提取物混合均匀，然后向其中加入新霉素，混合均匀后得到组合物A。
准确称量新霉素100mg、海巴戟提取物B 26g、黄葵提取物112g，分别将海巴戟提取物B与黄葵提取物混合均匀，然后向其中加入新霉素，混合均匀后得到组合物B。
准确称量新霉素100mg、海巴戟提取物C 26g、黄葵提取物112g，分别将海巴戟提取物C与黄葵提取物混合均匀，然后向其中加入新霉素，混合均匀后得到组合物C。
准确称量新霉素100mg、黄葵提取物112g，在黄葵提取物中加入新霉素，混合均匀后得到组合物D。
实施例2海巴戟提取物对舒伯特气单胞菌的抑菌效果
1、培养基的制备
BHI培养基购自美国BD公司；5％绵羊血琼脂平板、细菌生化微量鉴定管等购自广州环凯微生物有限公司。
2、菌悬液的制备
试验菌培养：将菌株活化，用接种针在固体培养基上划线，再28℃培养24h后，挑取单个菌落，接种到营养肉汤培养基上震荡培养24h。采用平板计数法将菌液稀释到合适浓度，菌液浓度为1×103CFU/mL。
3、药物敏感性试验
药敏试验采用琼脂扩散法，将培养至对数生长期的菌悬液稀释至浓度约为1×103CFU/mL，使用无菌棉签蘸取菌液均匀涂抹在培养基上，涂抹均匀后，在平板上均匀打孔，每个平板上打4个孔，做好标记。每孔加入100μl(1g/mL)组合物，然后将之放入28℃培养箱中培养24h；平板取出后，观察孔周围是否有抑菌圈，若有，则用游标卡尺测量抑菌圈直径。每种药物做三个重复，同时以无菌水做空白对照。结果判断标准按《中药药理学》介绍的标准：抑菌圈≥20mm，属于极敏；抑菌圈15-19mm属于高敏；抑菌圈10-14mm属于中敏；抑菌圈小于10mm，属于低敏；没有抑菌圈，属于不敏(无抑菌效果)。
4、二次筛选试验
用营养肉汤培养基以二倍稀释法对提取物进行梯度稀释，在每个试管中加入细菌悬液，使细菌浓度达到105CFU/mL，在不同的试管中加入组合物A、组合物B、组合物C、组合物E，不加组合物作为空白对照，不加细菌作为阴性对照，每个重复3次。置28℃摇床中震荡(180r/min)培养24h，然后取出与对照管对比观察，抑菌圈直径及抑菌等级如表1所示。
表1抑菌圈直径及抑菌等级
| 项目 | 抑菌圈直径(mm) | 抑菌等级 |
| 组合物A | 24.12±0.34 | +++ |
| 组合物B | 16.61±0.58 | ++ |
| 组合物C | 19.36±0.26 | ++ |
| 组合物D | 10.64±0.63 | + |
| 空白对照 | — | — |
| 阴性对照 | — | — |
上述表中，“+++”表示极敏，“++”表示高敏，“+”表示中敏或低敏，“－”表示不敏(无抑菌效果)。
由表1可知，组合物A、组合物B、组合物C、组合物D均对舒伯特气单胞菌有抑菌效果，其中组合物A的抑菌等级为极敏，组合物B和组合物C等级为高敏，组合物D(不含海巴戟提取物)等级为中敏或低敏，由此可见，含有海巴戟提取物与黄葵提取物的组合物对于舒伯特气单胞菌具有显著的抑菌效果，其中组合物A的抑菌效果尤其显著，而对于组合物B，在制备海巴戟提取物时，采用常温进行浸提，无法对其中的抑菌成分充分的提取出，使其效果与组合物A相比有一定的差距，对于组合物C，采用浓度为70％的乙醇进行浸提，效果与稍低浓度的乙醇相比，也存在差距，由此表明，在组合物A中，海巴戟提取物与黄葵提取物、新霉素的结合，对舒伯特气单胞菌具有显著的抑菌效果，改变浸提的温度对于组合物对舒伯特气单胞菌的抑菌效果也具有一定的影响。
实施例3海巴戟提取物与黄葵提取物的配比对抑菌效果的影响
准确称量海巴戟1000g，打碎后加入30倍量的柠檬酸钠缓冲溶液，然后加125μL/g入复合植物水解酶，在50℃下酶解2小时，然后水浴灭菌、抽滤，收集酶解滤液，然后在滤渣中加入20倍量浓度为60％的乙醇，在55℃下浸提2小时，抽滤后收集浸提滤液，将所述的酶解滤液与浸提滤液混合后浓缩，得到海巴戟提取物。
准确称量黄葵1000g晒干后粉碎、过筛，在得到的黄葵粉末中加入20倍量的浓度为70％的乙醇，超声1.5小时，重复提取1次后，将提取液混合后得到黄葵提取物。
准确称量新霉素100mg、海巴戟提取物26g、黄葵提取物112g，分别将海巴戟提取物与黄葵提取物混合均匀，然后向其中加入新霉素，混合均匀后得到组合物A。
准确称量新霉素100mg、海巴戟提取物16g、黄葵提取物112g，分别将海巴戟提取物与黄葵提取物混合均匀，然后向其中加入新霉素，混合均匀后得到组合物B。
准确称量新霉素100mg、海巴戟提取物26g、黄葵提取物240g，分别将海巴戟提取物与黄葵提取物混合均匀，然后向其中加入新霉素，混合均匀后得到组合物C。
准确称量新霉素100mg、海巴戟提取物26g，在海巴戟提取物中加入新霉素，混合均匀后得到组合物D。
准确称量新霉素100mg、黄葵提取物112g，在黄葵提取物中加入新霉素，混合均匀后得到组合物E。
准确称量新霉素100mg均匀的溶于10倍量的浓度为60％的乙醇中，得到组合物F。
在每个试管中加入细菌悬液，使细菌浓度达到102CFU/mL，在不同的试管中加入组合物A、组合物B、组合物C、组合物E、组合物F，不加组合物作为空白对照，不加细菌作为阴性对照，每个重复3次。置28℃摇床中震荡(180r/min)培养24h，然后取出与对照管对比观察，抑菌圈直径及抑菌等级如表2所示。
表2抑菌圈直径及抑菌等级
| 项目 | 抑菌圈直径(mm) | 抑菌等级 |
| 组合物A | 23.94±0.26 | +++ |
| 组合物B | 16.12±0.45 | ++ |
| 组合物C | 18.85±0.32 | ++ |
| 组合物D | 11.02±0.41 | + |
| 组合物E | 10.32±0.25 | + |
| 组合物F | 7.93±0.17 | + |
| 空白对照 | — | — |
| 阴性对照 | — | — |
上述表中，“+++”表示极敏，“++”表示高敏，“+”表示中敏或低敏，“－”表示不敏(无抑菌效果)。
由表2可知，组合物A、组合物B、组合物C、组合物D、组合物E、组合物F均对舒伯特气单胞菌有抑菌效果，其中组合物A的抑菌等级为极敏，组合物B和组合物C等级为高敏，组合物D(不含黄葵提取物)、组合物E(不含海巴戟提取物)和组合物F(新霉素)等级为中敏或低敏。由此可见，含有海巴戟提取物与黄葵提取物的组合物对于舒伯特气单胞菌具有显著的抑菌效果，其中组合物A的抑菌效果尤其显著，而组合物B的抑菌效果与组合物A相比，有明显的差距，组合物B与组合物A的区别在于，海巴戟提取物的添加量为16g，由此可见，过低的海巴戟提取物的添加量会降低组合物的抑菌效果；组合物C的抑菌效果与组合物A相比，有明显的差距，但效果明显优于组合物B，组合物C与组合物A的区别在于，黄葵提取物的添加量为240g，由此可见，过高的黄葵提取物的添加量会降低组合物的抑菌效果，但黄葵提取物对组合物的抑菌效果的影响小于海巴戟提取物。对于组合物E与组合物D，分别添加黄葵提取物或海巴戟提取物的组合物，对舒伯特气单胞菌具有一定的抑菌效果，但抑菌效果与包含黄葵提取物与海巴戟提取物的组合物的抑菌效果差距显著，而对于组合物F，单独的新霉素对于舒伯特气单胞菌的抑菌效果低于分别添加黄葵提取物或海巴戟提取物的组合物。
实施例4含有海巴戟提取物与黄葵提取物的组合物对于水产动物中以舒伯特气单胞菌为病原的类结节病的治疗效果
准确称量海巴戟1000g，打碎后加入30倍量的柠檬酸钠缓冲溶液，然后加125μL/g入复合植物水解酶，在50℃下酶解2小时，然后水浴灭菌、抽滤，收集酶解滤液，然后在滤渣中加入20倍量浓度为60％的乙醇，在55℃下浸提2小时，抽滤后收集浸提滤液，将所述的酶解滤液与浸提滤液混合后浓缩，得到海巴戟提取物。
准确称量黄葵1000g晒干后粉碎、过筛，在得到的黄葵粉末中加入20倍量的浓度为70％的乙醇，超声1.5小时，重复提取1次后，将提取液混合后得到黄葵提取物。
准确称量新霉素100mg、海巴戟提取物A 26g、黄葵提取物112g，分别将海巴戟提取物A与黄葵提取物混合均匀，然后向其中加入新霉素，混合均匀后得到组合物。
实验鱼：健康的杂交鳢(80-100克)购自广州市国联鱼苗发展有限公司，试验前曝气水缸中暂养2周，每天早晚投食。
试验分别设置注射舒伯特气单胞菌给药、不给药注射舒伯特气单胞菌阳性对照组以及不给药不注射舒伯特气单胞菌对照组，每个试验组各放养杂交鳢100条。攻毒后用饵料中添加0.5％-1％组合物饲喂给药组，其余试验组普通饲料喂养，观察1周，统各组的死亡率。每组三个重复。
注射舒伯特气单胞菌后，试验鱼第2天出现急性死亡，死亡鱼类出现腹水，肝、脾、肾肿大等败血症症状，内脏无类结节，第3天死亡的鱼类，内脏开始出现自然发病鱼相似的类结节症状，第7天未死亡鱼剖检也出现内脏类结节症状。
治疗结果：试验鱼阳性对照组死亡率为42％，给药的试验组死亡率为8％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种由新霉素、海巴戟提取物与黄葵提取物制成的抑菌组合物在制备用于治疗以舒伯特气单胞菌为病原的类结节病的药物中的应用，其特征在于：所述的新霉素、海巴戟提取物与黄葵提取物的质量比为1：220-300：800-1240；
所述的海巴戟提取物由包括如下步骤的方法制成：将海巴戟打碎后加入30-50倍量的缓冲溶液，然后加入复合植物水解酶，在45-55℃下酶解2-3小时，然后水浴灭菌、抽滤，收集酶解滤液，然后在滤渣中加入浓度为50-60％的乙醇，在55-60℃浸提2-3小时，抽滤后收集浸提滤液，将所述的酶解滤液与浸提滤液混合后浓缩，得到所述的海巴戟提取物；
所述的复合植物水解酶的用量为100-150μL/g；所述的滤渣与乙醇的固液比为1:20-30；所述的缓冲溶液为柠檬酸钠溶液；
所述的黄葵提取物由包括如下步骤的方法制成：将黄葵晒干后粉碎、过筛，在得到的黄葵粉末中加入浓度为50-80％的乙醇，超声0.2-2.5小时，重复提取1次后，将提取液混合即得；所述的黄葵与所述的乙醇的固液比为1:10-30。
2.根据权利要求1所述的由新霉素、海巴戟提取物与黄葵提取物制成的抑菌组合物在制备用于治疗以舒伯特气单胞菌为病原的类结节病的药物中的应用，其特征在于：所述的抑菌组合物由如下步骤的方法制成：将海巴戟提取物与黄葵提取物混合均匀，然后向其中加入新霉素，混合均匀后即成。
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