CN108888625B

CN108888625B - 一种水产养殖抑菌剂及其应用

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Publication number: CN108888625B
Application number: CN201810422124.7A
Authority: CN
Inventors: 林玲; 林文雄; 林聪�
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2018-05-04
Filing date: 2018-05-04
Publication date: 2020-12-29
Anticipated expiration: 2038-05-04
Also published as: CN108888625A

Abstract

本发明提供一种水产养殖抑菌剂，属于微生物防治领域，所述抑菌剂含有以下成分：利血平1‑3μg/mL、和土霉素5‑15μg/mL。本发明利用利血平来逆转嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）土霉素耐药菌OXY‑R对土霉素OXY的耐药性，结果表明利血平在1.25μg/mL浓度下，耐药菌OXY‑R对OXY的MIC由40μg/mL降低至5μg/mL，若作用浓度提高至2.5μg/mL，耐药菌OXY‑R对OXY的MIC则降低至1.25μg/mL。而A.hydrophila敏感菌Ah对OXY的MIC为2.5μg/mL。说明利血平逆转A.hydrophila耐药的有效性。

Description

一种水产养殖抑菌剂及其应用

技术领域

本发明属于微生物防治领域，具体涉及一种水产养殖抑菌剂。

背景技术

嗜水气单胞菌（A. hydrophila）是水产养殖业中一种常见的的鱼类致病菌，与很多全球性鱼类的大规模死亡事件相关，造成了巨大的经济损失。因此，对于该菌的防治是国内外学者的研究热点。在过去的几十年，对于细菌性疾病来说属于抗生素时代，抗生素对病原菌具有显著的抑制或杀灭作用，因此抗生素是用来治疗细菌性传染病的首选药物。对于由A.hydrophila引起的疾病来说亦是如此。然而随着大量耐药菌株的产生，这种单纯使用抗生素的方式显然已经不再有效，而且对水体、环境、生态造成不可估量的影响。国内外学者也不断探索新的方法来防治A.hydrophila。

前期研究表明RND外排泵对四环素耐药具有重要作用。若能找到高效抑制该类外排泵的药物，将大大降低该菌的耐药性。目前国内外证实一些化合物如二胺类化合物L-Phe-L-Arg-β-naphthylamine（PAβN）、某些喹啉衍生物、N-甲基吡咯烷酮等能够抑制细菌RND类外排泵。不同菌的RND外排泵的最佳抑制剂也不同。化学药物类抑制剂虽然抑制效果好，但副作用大，限制了其在临床上的应用。已证实多种植物及其成分有抑制细菌产生耐药性和消除耐药性等作用，这使在植物中寻找新的外排泵抑制剂成为可能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水产养殖抑菌剂，解决了目前大量耐药菌株的产生，无法有效进行防治等问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种水产养殖抑菌剂，所述抑菌剂含有以下成分：利血平1-3 μg/mL、土霉素5-15μg/mL。

优选的，所述抑菌剂含有以下成分：利血平2.5 μg/mL、土霉素10μg/mL。

所述的水产养殖抑菌剂在防治嗜水气单胞菌中的应用。

利血平是从植物中提取的生物碱，是现代技术对中草药有效成分提取和作用机理研究的重大成果。利血平最早是从印度萝芙木属蛇根木中分离获得的一种吲哚型生物碱，能降低血压和减慢心率，临床上用于治疗高血压和神经病性狂躁症等。它的作用机制是通过抑制多巴胺进入囊泡，减少交感神经末梢的神经递质耗竭排空，从而交感张力降低，血管扩张，血压降低。

本发明的优点在于：

本发明水产养殖抑菌剂抑制效果好，副作用小，通过抑制AcrA蛋白的表达来抑制AheABC外排泵的外排效率，可以逆转A.hydrophila耐药性，大大降低了嗜水气单胞菌的耐药性，为有效的防治策略提供理论依据。土霉素是目前水产养殖业应用最广泛的抗生素之一，利血平是从印度萝芙木中提取获得的，两者的获取均十分方便且价格低。该联合抑菌剂在使用的过程十分方便，仅需在传统的抗生素使用过程中添加利血平即可。

附图说明

图1 不同药物与土霉素OXY联合作用下细菌存活率测定。

图2 不同药物处理下耐药菌OXY-R对土霉素Oxy的MIC。1为1/4 MIC浓度；2为1/2MIC浓度。

图3 Western Blotting 验证OXY-R菌株在土霉素（10 μg/mL）和利血平（0、5和10μg/mL）的联合作用下RND外排泵相关蛋白的表达情况。

具体实施方式

实施例1

1.1 材料与方法

1.1.1 试验材料

菌株：A.hydrophilaATCC 7966 （以下简称Ah）由大连入境免疫局曹际娟教授惠赠。

黄芪、黄连、板蓝根、连翘购自国医堂。

利血平标准品、N-甲基吡咯烷酮购于索莱宝公司。

1.1.2 主要仪器设备

1.2方法

1.2.1 耐药菌株OXY-R的诱导

将A.hydrophilaATCC 7966（Ah）以10⁵ CFU/mL的数量在抗生素OXY的1/2MIC中连续培养10代，测得OXY对诱导后的菌株的最次抑菌浓度MIC为40 μg/mL，是出发菌株的2.5μg/mL的16倍（图2）。根据文献报道，当两者MIC的比值≥4倍时，即为具有稳定的差异耐药菌株。因此我们将该耐药菌命名为OXY-R。同时对该耐药菌在5 μg/mL和10 μg/mL OXY浓度下的生长曲线进行测定，与野生型Ah相比，该抗生素浓度对其生长影响很小，显示其耐药特性。

1.2.2中药的处理和最小抑菌浓度（MIC）的测定

50 g中药加8倍蒸馏水煎至沸腾后用中火煎1 h，用纱布过滤药液；药渣加6倍水煎1 h，用纱布过滤；合并滤液，文火浓缩至50 mL，使药液浓度为1 g/mL。

挑取平板上的OXY-R和Ah菌株分别接种于5 mL LB液体培养基中，37℃，200 rpm振荡培养过夜；过夜菌按1：100比例转接，继续培养2 hr后，将菌液稀释100倍，吸取10 μL菌液使其以终浓度10⁵ CFU/mL的数量加入到96孔平板中，每个细菌做3个重复，并设空白对照及阳性对照。配制倍比稀释的不同浓度中药、利血平、N-甲基吡咯烷酮加入菌液平板置于37℃培养箱培养16小时后，以肉眼无法看到菌体生长的最小浓度为最次抑菌浓度，同时用用E.coliATCC25922 为质控菌株。

1.2.2 耐药菌OXY-R在不同药物和OXY联合作用下生存率的测定

为了研究不同药物和OXY联合作用的效果，在OXY-R对数生长期按1:20转接到96孔板中，同时加入OXY（浓度分别为0、5、10、20、40和80 μg/mL）和不同的药物。利用细菌计数法来测定细菌存活率。利用Excel软件分析结果，用颜色分级来区别联合作用效果。

1.2.3 Western blotting 验证RND外排泵相关蛋白表达

挑取平板上的OXY-R菌株接种于5 mL LB液体培养基中，37℃，200 rpm振荡培养过夜；过夜菌按1：100比例转接至100 mL LB，继续培养2 hr后，加入不同浓度的利血平（0、 5、10 μg/mL）和OXY（10 μg/mL）培养6个小时后收集菌体，用PBS洗一次。加入5 mL PBS破碎细胞后收集上清液并跑SDS-PAGE验证。

1.3 结果与分析

1.3.1药物最小抑菌浓度（MIC）的测定

先将菌液的浓度调为10⁵，每孔300 μL。然后采用倍比稀释方法测定不同药物对A.hydrophila耐药菌OXY-R的MIC。中药水提物的母液浓度为1 g/mL，倍比稀释后按1:10（v/v）加入菌液。中药终浓度为100 mg/mL、50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL和6.25 mg/mL。利血平的配置则先用少量冰醋酸溶解后加水定容，母液浓度为1 mg/mL，倍比稀释后按1:100（v/v）加入菌液，终浓度为10 μg/mL、5 μg/mL、2.5 μg/mL、1.25 μg/mL和0.625 μg/mL。NMP为液体，浓度为10 mg/mL，按1:10（v/v）加入菌液，终浓度为1000 μg/mL、500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL和62.5 μg/mL。

加入不同浓度药物后菌液培养16 h，由于中药颜色较深，采用细菌计数法来测定细菌存活率，结果如下表。由于板蓝根在水煎的过程中水量不断减少，加入蒸馏水维持水量，但药液已被稀释，按1:1浓度加入菌液仍有菌液生长，因此MIC无法测定。由于国内尚无统一的中药抑菌效果MIC标准，参考相关文献，将MIC＞250 mg/mL为耐药；MIC＜7.81 mg/mL为高度敏感；介于7.8-250 mg/mL为中度敏感。而化学药物的敏感度参考NCCSI标准规定。按照以上标准认定，利血平为高度敏感，黄连、黄芪、连翘为中介，而NMP和板蓝根为耐药。

表1 OXY-R菌株对不同药物的MIC

1.3.2耐药菌OXY-R在不同药物和OXY联合作用下生存率的测定

根据OXY-R对不同药物的MIC，选用利血平、黄连、黄芪和连翘四种药物与土霉素OXY进行联合用药，分别在一系列浓度梯度药物浓度下测定细菌存活率。以不加药物和OXY处理的细菌存活率为100，其他处理经换算后进行量化，利用颜色分级来显示细菌存活率。绿色表示存活率较高，红色表达存活率较低。结果表明，随着药物浓度的增加，A.hydrophilaOXY-R菌株的存活率下降。以存活率为1-2临界值选择联合用药的浓度，利血平和OXY浓度分别为2.5 μg/mL和10 μg/mL或是5.0 μg/mL和2.5 μg/mL；黄连和OXY浓度分别为8 mg/mL和5 μg/mL；黄芪和OXY浓度分别为40 mg/mL和20 μg/mL；连翘和OXY的浓度为20 mg/mL和20 μg/mL。

为了进一步确定这四种药物对耐药菌OXY-R的耐药具有逆转作用，测定了在相同浓度药物处理下该菌株对OXY的MIC。结果表明，利血平在1/4 MIC浓度左右处理下，耐药菌对OXY的MIC下降了7倍，为5 μg/mL，若用1/2 MIC浓度处理，则下降至1.25 μg/mL ；3种中药提取物在其1/4 MIC浓度处理下，耐药菌对OXY的MIC均下降1倍，若用1/2 MIC浓度处理，黄连使得耐药菌OXY-R的MIC下降7倍，黄芪和连翘则使得耐药菌OXY-R的MIC下降3倍。利血平对逆转耐药菌的耐药效果最佳，而中药提取液中效果最好的为黄连，黄芪和连翘效果次之。

1.1.3 Western blotting 验证利血平对RND外排泵的抑制

为了验证利血平的逆转效果是由于抑制RND外排泵相关蛋白的表达而引起的，我们提取了OXY-R菌株在10 μg/mL土霉素和利血平（0、5和10 μg/mL）联合作用下的全蛋白，将RND外排泵相关蛋白AcrA、A0KLP3（ABC exporter outer membrane component）和A0KLQ6（http://www.uniprot.org/uniprot/A0KLQ6）的多抗血清作为一抗验证AcrA、A0KLP3和A0KLQ6的表达情况。Western blotting结果显示（图3），在加入5和10 μg/mL利血平与不加利血平比较下，AcrA的表达逐渐下降，Res-10/Res-CK的比值约为0.3， AcrA为膜融合蛋白，是嗜水气单胞菌AheABC外排泵的组成成分，连接AcrB（外排转运蛋白）和OprM（外膜通道蛋白）。而A0KLP3和A0KLQ6均为TolC家族成员，可能参与了其他RND外排泵的组成。Westernblotting结果显示，A0KLP3的表达量在加入利血平后有所上调，A0KLQ6的表达量在加入利血平后有所下调，但两种蛋白的变化均不大。因此我们推测利血平是通过抑制AcrA的表达而减少AheABC外排泵系统对土霉素的排出，提高了土霉素在细胞内的浓度而达到了逆转耐药的效果。

综上，本发明选用了利血平、N-甲基吡咯烷酮、板蓝根、黄芪、连翘、黄连等中药作为抑制A. hydrophila耐药性的候选药物，结果表明利血平的抑菌效果和抑制耐药性的效果最显著，黄连次之。联合药物作用实验结果显示，利血平和OXY在2.5 μg/mL和10 μg/mL的作用下抑菌效果显著。Western blotting结果显示，AcrA蛋白的表达量随着利血平浓度的上升而下降，推测说明利血平可能是通过抑制AcrA蛋白的表达来抑制AcrAB外排泵的外排效率。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种水产养殖抑菌剂在制备防治嗜水气单胞菌药物中的应用，其特征在于：所述抑菌剂含有以下成分：利血平2.5 μg/mL、土霉素10μg/mL。