CN115721676B - 基于酸梅汤中主要有机酸用于防控鸡大肠杆菌性肠炎 - Google Patents
基于酸梅汤中主要有机酸用于防控鸡大肠杆菌性肠炎 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种改良酸梅汤，主要由乌梅与山楂按重量比1:1至3:1制成，其中含有柠檬酸、奎尼酸、苹果酸。研究表明，与传统酸梅汤相比，改良酸梅汤或其有机酸混合物在体外可抑制大肠杆菌的生长，对大肠杆菌具有较好的抑制作用；同时，经改良酸梅汤或其有机酸混合物处理后，鸡大肠杆菌性肠炎症状明显缓解，生长性能明显提升，降低了血清中炎性因子的含量等。综上，本发明的改良酸梅汤及其有机酸混合物具有较好的抗鸡大肠杆菌性肠炎的作用，可以用于防控大肠杆菌的感染，在制备相关药物中具有广阔的应用前景，可丰富防控大肠杆菌感染的理论，创造更高经济效益并保障人类的食品安全。
Description
技术领域
本发明属于兽药技术领域，尤其涉及基于酸梅汤中主要有机酸用于防控鸡大肠杆菌性肠炎。
背景技术
鸡大肠杆菌病是我国临床最常见、危害最大的细菌病之一，具有发病快、死亡率高、病程长的特点，各日龄的鸡均可感染，包括败血症、肠炎型、眼球炎、生殖系统炎症型等多种类型。大肠杆菌为条件性致病菌，一般通过消化道和呼吸道感染，严重可致病鸡死亡。
鸡大肠杆菌性肠炎的常规治疗方法是添加抗生素，但在养殖过程中不合理地使用抗生素使大肠杆菌的耐药性增强，甚至出现多重耐药菌株；而且抗生素具有一定的毒副作用，还可以通过肉、蛋传给人类，给食品安全带来了潜在的问题。而中草药属于天然药物并具有毒性低、低残留、不易产生耐药性等多种优点，在我国已经积累了丰富的应用和研究经验，是筛选替代抗生素药物的主要资源。
鸡大肠杆菌性肠炎按照中医辨证论治的观点，可辨为湿热证。湿邪入侵使机体脾阳受困、脾失健运，久之化热成为湿热之邪。水湿停滞于肠道形成腹泻，热邪结于肠可见黄绿色稀粪。酸梅汤是中国传统的消暑饮料，其有除热送凉、生津止渴和运化水湿的功效。酸梅汤制作原料与方法不尽相同，但是在众多原材料中乌梅与山楂占比最大，方法也以水煮为主。在传统中医理论中，乌梅酸、涩、平，入肝、脾、肺、大肠经，主治久咳不止及久泻久痢，具有敛肺涩肠、生津安蛔作用；山楂酸、甘、微温，入脾、胃、肝经，用于血瘀经闭、疝痛偏坠等，有助消化的作用。有机酸是一种含有羧基的酸性化合物，多用于食品添加剂和防腐剂等，在动物体内多用于促生长和增强免疫，而对于细菌感染性疾病的保护效果研究较少。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
改良酸梅汤，主要由乌梅与山楂按重量比1:1至3:1制成，其中含有柠檬酸、奎尼酸、苹果酸。
上述改良酸梅汤，主要由乌梅与山楂按重量比1:3制成。
有机酸混合物，主要由柠檬酸、奎尼酸、苹果酸组成。
上述有机酸混合物，主要由柠檬酸、奎尼酸、苹果酸按重量比5：1：0.5组成。
上述改良酸梅汤或有机酸混合物在制备大肠杆菌抑制药物方面的应用。
上述应用中大肠杆菌为大肠杆菌野毒株2062。
上述改良酸梅汤或有机酸混合物在制备预防鸡大肠杆菌性肠炎的药物方面的应用。
上诉应用中鸡大肠杆菌性肠炎由大肠杆菌野毒株2062引起。
在传统酸梅汤的基础上，发明人经深入研究，获得了一种改良酸梅汤，主要由乌梅与山楂按重量比1:1至3:1制成，其中含有柠檬酸、奎尼酸、苹果酸。研究表明，与传统酸梅汤相比，改良酸梅汤或其有机酸混合物在体外可抑制大肠杆菌的生长，对大肠杆菌具有较好的抑制作用；同时，经改良酸梅汤或其有机酸混合物处理后，鸡大肠杆菌性肠炎症状明显缓解，生长性能明显提升，降低了血清中炎性因子的含量等。综上，本发明的改良酸梅汤及其有机酸混合物具有较好的抗鸡大肠杆菌性肠炎的作用，可以用于防控大肠杆菌的感染，在制备相关药物中具有广阔的应用前景，可丰富防控大肠杆菌感染的理论，创造更高经济效益并保障人类的食品安全。
附图说明
图1为大肠杆菌2062生长曲线，图中：E.coli为空白对照组(有机酸浓度为0mg/ml)；1*MIC为4mg/ml有机酸组，1/2*MIC为2mg/ml有机酸组，1/4为1mg/ml有机酸组。
图2为大肠杆菌生物被膜形成能力的检测结果图，图中：Control为肉汤对照组，E.coli为空白对照组(组合药物浓度为0mg/ml)，1*MIC为4mg/ml混合有机酸组，1/2*MIC为2m g/ml混合有机酸组，1/4*MIC为1mg/ml混合有机酸组。
图3是酸梅汤对雏鸡生长性能的比较图，图中：A ADFI，B FCR，C ADG；Control是空白对照组，E.coli是感染组，SPB+1％是低剂量治疗组，SPB+2％是中剂量治疗组，SPB+4％是高剂量治疗组。
图4是酸梅汤中有机酸对雏鸡生长性能的比较图，图中：A ADFI，B FCR，C ADG；Control是空白对照组，E.coli是感染组，Amoxicillin Soluble Powder是阿莫西林治疗组，OA+2.2‰是低剂量治疗组，OA+3.3‰是中剂量治疗组，OA+4.4‰是高剂量治疗组。
图5是酸梅汤及其有机酸对盲肠内大肠杆菌的影响结果，图中：A酸梅汤影响图，Control是空白对照组，E.coli是感染组，SPB1％是低剂量治疗组，SPB2％是中剂量治疗组，SPB4％是高剂量治疗组；B酸梅汤中有机酸影响图，Control是空白对照组，E.coli是感染组，Amoxicillin Soluble Powder是阿莫西林治疗组，OA+2.2‰是低剂量治疗组，OA+3.3‰是中剂量治疗组，OA+4.4‰是高剂量治疗组。
图6是酸梅汤中有机酸对雏鸡感染模型的肠道病理切片图，图中：A空白对照组的回肠切片，B感染组的回肠切片，C阿莫西林治疗组的回肠切片，D低剂量治疗组的回肠切片，E中剂量治疗组的回肠切片，F高剂量治疗组的回肠切片。
图7是雏鸡血清中各类细胞因子影响图，图中：A IgY，B IgA，C IL-1β，D IL-6，ETNF-α，F SOD，G CAT，H LPS，I ALT；Control是空白对照组，E.coli是感染组，AmoxicillinSoluble Powder是阿莫西林治疗组，OA+2.2‰是低剂量治疗组，OA+3.3‰是中剂量治疗组，OA+4.4‰是高剂量治疗组。
具体实施方式
一、酸梅汤的体外抑菌活性探究及药物比例的确定
取去核乌梅和净山楂以重量比1:1、1:2、1:3、2:1、3:1分别置于超纯水中制备改良酸梅汤；此外，按照传统配方(乌梅、山楂和甘草重量比为3：2：1)制备酸梅汤；同时，以乌梅、山楂和甘草分别水煮制备单独药液，使所有药液浓度均为0.5g/ml，放入4℃冰箱保存备用。其中，
改良酸梅汤制法：以去核乌梅和净山楂重量比1:1、1:2、1:3、2:1、3:1共称取10g药物，置于200ml超纯水中，浸泡过夜后超声(200W，70℃)提取60min，随后将药物浓缩至0.5g/ml，后放置4℃冰箱保存备用。
传统酸梅汤制法：以乌梅、山楂和甘草重量比3：2：1共称取10g药物，制备方法同改良酸梅汤制法。
取实验室保存的大肠杆菌野毒株2062的冻存管于LB肉汤培养基中37℃过夜培养，再将培养物在麦康凯培养基上划线分离培养12h，挑取红色大小适中的单菌落于LB培养基中培养至对数生长期保存备用。在96孔板上，以微量肉汤稀释法测定各组药液对大肠杆菌的MIC值，37℃恒温培养16h后读取MIC值(表1、表2)。
表1各试验组大肠杆菌MIC
表2不同配比改良酸梅汤大肠杆菌MIC
结果：与传统酸梅汤相比，改良后的酸梅汤有更好的抑菌效果；且不同配比改良酸梅汤中乌梅与山楂的重量比为1：3效果最佳。
二、酸梅汤有效成分及含量的测定
以一中最佳药物比例(乌梅和山楂重量比为1:3)熬制的改良酸梅汤，采用QExactive Orbitrap高分辨质谱进行质谱数据采集，检测模式为Full MS-ddMS2，正离子和负离子模式分别扫描，扫描范围为m/z 100-1200，MS1分辨率设置为70000，MS2分辨率设置为17500，离子源电压为3.2kV，毛细管离子传输管温度(Capillary temp)为320℃，辅助气加热温度(Aux gas heater temp)为350℃，鞘气流速(Sheath gas flow rate)为40L/min，辅助气流速(Aux gas flow rate)为15L/min，AGC Target设置为1e6，TopN设置为5，触发MS2扫描的碰撞能量采用阶梯式破裂电压NCE，设置为30，40，50。采用Thermo QE plus液相色谱串联高分辨质谱仪和Compound discover数据处理软件分析样品的中药化学成分，分析确定混合药液中主要化合物，结果见表3。
表3改良酸梅汤(乌梅和山楂重量比为1:3)中主要化合物
结果：经检测改良酸梅汤(乌梅和山楂重量比为1:3)中的主要有机酸为柠檬酸、奎尼酸和苹果酸，三种有机酸的占比分别为53.799％、10.866％和5.205％。
三、混合有机酸对大肠杆菌MIC值和生长曲线的影响
按照一中方法制备对数生长期的菌液，以1：10000稀释至LB肉汤培养基中使得瓶中菌液浓度为1*105CFU/ml。按柠檬酸、奎尼酸和苹果酸重量比为5：1：0.5制备混合有机酸药液，在96孔板中以微量肉汤稀释法测定对大肠杆菌的MIC值(表4)。取配置好的药液加入锥形瓶中，分别使锥形瓶中混合有机酸浓度为4、2、1和0mg/ml，37℃、220r/min振荡培养，每间隔2h测定其在600nm波长处的光吸收值，连续测量24h，以OD值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制生长曲线(图1)。
表4改良酸梅汤中混合有机酸大肠杆菌MIC
结果：按柠檬酸、奎尼酸和苹果酸重量比为5：1：0.5制备的有机酸混合药液与改良酸梅汤相比有更好的抑菌效果，在1/2*MIC和1*MIC条件下均明显抑制了大肠杆菌的生长，同时证明了三种有机酸为改良酸梅汤的主要抑菌活性物质。
四、混合有机酸对大肠杆菌生物被膜形成的影响
取一中制备好的菌液，以1：10000稀释至LB培养基中使得菌液浓度为1*105CFU/ml，将稀释好的菌液加入到24孔细胞培养板中，随后加入有机酸混合液(柠檬酸、奎尼酸和苹果酸重量比为5：1：0.5)浓度为4、2、1和0mg/ml，另取2ml LB肉汤培养基为阴性对照，放置在37℃静止培养36h。培养完成后，弃掉培养基，用无菌PBS冲洗3次，自然风干后用1％结晶紫1ml染色30min，弃掉结晶紫，用无菌PBS冲洗3次，自然风干。向每孔中加入1ml 95％乙醇溶液溶解30min，后每孔中吸取300μl分别加入96孔板的三个孔中，每孔100μl，置于酶标仪595nm处检测吸光度，根据吸光度判断生物被膜形成率(图2)。
结果：有机酸混合液在1*MIC条件下显著抑制大肠杆菌生物膜的形成。
五、酸梅汤对雏鸡大肠杆菌性肠炎模型的防控效果
取10日龄黄羽肉鸡连续4天灌服1ml浓度为1*109CFU/ml的大肠杆菌2062肉汤培养物，以建立雏鸡感染大肠杆菌性肠炎模型。
于第一次攻毒前24h，以乌梅山楂重量比为1：3熬制酸梅汤，分别以低剂量组1％，中剂量组2％，高剂量组4％添加至饮用水中，同时设置感染对照组和空白对照组。其中空白对照组每天灌服相同体积的无菌LB肉汤培养基。在9日龄和14日龄对雏鸡称重、记录采食量，计算平均日增重、平均日采食量和饲料转化率(图3)。在14日龄时脱颈椎处死后快速取出左侧盲肠，无菌取0.1g盲肠内容物，对内容物中大肠杆菌进行计数(图5-A)。
结果：改良酸梅汤可以在大肠杆菌性肠炎中保护雏鸡，提高其生长性能，并能减少盲肠中大肠杆菌的数量。其中中剂量组2％与其他组相比明显改善了雏鸡的均日增重、平均日采食量和饲料转化率，同时降低了盲肠中大肠杆菌的数量。
六、酸梅汤中有机酸对雏鸡大肠杆菌性肠炎模型的防控效果
建立雏鸡大肠杆菌性肠炎模型如五中所述，于第一次攻毒前24h，以有机酸混合物(柠檬酸、奎尼酸和苹果酸重量比为5：1：0.5)分别以低剂量组2.2‰，中剂量组3.3‰，高剂量组4.4‰添加至饮用水中，其中，中剂量组3.3‰与五中的中剂量组2％改良酸梅汤中有机酸浓度一致，同时设置阿莫西林阳性药物对照组、感染对照组和空白对照组。空白对照组每天灌服相同体积的无菌LB肉汤培养基。
在9日龄和14日龄时对雏鸡称重、记录采食量，计算平均日增重、平均日采食量和饲料转化率(图4)。在14日龄时颈静脉采血后脱颈椎处死，快速取出左侧盲肠，无菌取0.1g盲肠内容物，对内容物中大肠杆菌进行计数(图5-B)，后取回肠固定在4％甲醛中，HE染色制作病理切片，显微镜下观察肠道病理组织学变化(图6)。
取得的血液离心得到血清，用ELISA检测试剂盒检测鸡免疫球蛋白Y(IgY)、鸡免疫球蛋白A(IgA)、鸡白细胞介素1β(IL-1β)、鸡白细胞介素6(IL-6)、鸡肿瘤坏死因子(TNF-α)、鸡超氧化物歧化酶(SOD)、鸡过氧化氢酶(CAT)、鸡脂多糖(LPS)、鸡谷丙转氨酶(ALT)，以上试剂盒均购自南京博研生物科技有限公司(图7)。
结果：有机酸混合物对鸡大肠杆菌性肠炎有良好的保护作用。其中，3.3‰有机酸混合物添加量的保护作用最好；且添加2％改良酸梅汤与添加3.3‰有机酸混合物(总有机酸含量相同)相比在生长性能和盲肠大肠杆菌计数方面差距不大。
七、研究结论及分析
本发明中所述的改良酸梅汤与传统酸梅汤相比，操作简单，成分明确，对于大肠杆菌有更良好的抑制作用，对于雏鸡感染大肠杆菌模型也有很好的防控效果，易于推广应用。其中，乌梅与山楂的最佳重量比为1:3，有机酸混合物的最小抑菌浓度为4mg/ml；在0.5倍MIC值的作用下对大肠杆菌的生长有显著的抑制作用，在1倍MIC值的作用下对大肠杆菌生物膜的形成有明显的抑制作用。
在体内攻毒实验中，雏鸡感染大肠杆菌后生长性能显著下降，肠道形态明显改变，血清中抗体和抗氧化酶含量显著降低，血清中的炎性因子、脂多糖含量显著上升，肝脏部分损伤。
酸梅汤中有机酸各个治疗组均改善了大肠杆菌感染所带来的影响，在平均日增重和饲料转化率方面阿莫西林组和中剂量组的作用突出，而低剂量和高剂量组效果较差。这种结果可能时由于添加高剂量的混合有机酸之后，水味道过酸，影响了雏鸡正常饮水，以致药物摄入不足，预防效果下降。中剂量组和阿莫西林组均可明显减轻肠道的病理变化。在血清检测中，西药组、中剂量组和高剂量增强了机体的抗氧化能力，降低了由于大肠杆菌引起的炎性因子及肝脏指标的变化。
Claims (4)
1.一种有机酸混合物，其特征在于由柠檬酸、奎尼酸、苹果酸按重量比5：1：0.5组成。
2.权利要求1所述有机酸混合物在制备大肠杆菌抑制药物方面的应用。
3.如权利要求1所述有机酸混合物在制备预防鸡大肠杆菌性肠炎的药物方面的应用。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述大肠杆菌为大肠杆菌野毒株2062。
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