CN107586746B - 一株具有防治奶牛乳房炎功效的乳酸菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株具有防治奶牛乳房炎功效的乳酸菌及其应用，该菌株的分类命名为屎肠球菌（Enterococcus Faecium），编号为BLFC‑3‑7，已于2017年9月5日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），地址为：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO:M 2017474。本发明还公开了一种防治奶牛乳房炎的复方中药微生态制剂，是由屎肠球菌BLFC‑3‑7、黄柏、蒲公英和黄芪等组成。本发明筛选得到的屎肠球菌BLFC‑3‑7和复方中药微生态制剂对奶牛乳房炎具有优异的防治效果。

Description

一株具有防治奶牛乳房炎功效的乳酸菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株具有防治奶牛乳房炎功效的乳酸菌及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

奶牛乳房炎是奶牛养殖业最严重的疾病之一，西方国家已研究了一百多年，我国起步较晚，始于20世纪80年代初，虽然取得显著的成绩，但仍未达到彻底解决的目的。尽管有多年的研究，奶牛乳房炎仍然是奶牛养殖中花费最多的疾病之一。我国奶牛乳房炎的发病率很高，袁永隆等调查发现，临床乳房炎发病率平均为33.41％，隐性乳房炎平均阳性率为73.9％，乳池患病率为44.74％。奶牛乳房炎不仅降低产奶量(可降低4％-10％)、影响乳的品质，而且使乳汁中细菌超标、并呈酒精阳性乳等，影响牛奶的营养成分和品质，尤其是大量抗生素的应用，使耐药菌株增加，治疗效果降低，奶中药物残留增加，给奶牛业造成巨大的经济损失，同时严重危害人体健康。故奶牛乳房炎的防治是奶牛养殖中不可忽视的问题。

奶牛乳房炎的发病病因很多，主要因素包括病原微生物入侵、营养因素、自身因素和气候因素等。目前，治疗奶牛乳房炎的主要方法有抗生素疗法、中药疗法、疫苗免疫法和微生态制剂疗法。由于临床上抗生素的长期滥用，导致了耐药菌株和牛奶中抗生素含量超标等诸多食品安全问题，抗生素疗法日益受到限制。

中草药治疗乳房炎，不仅具有体内、体外抑菌的良好效果，而且能提高隐性乳房炎中细胞的免疫功能，达到标本兼治的效果。

微生态制剂防治奶牛乳房炎的研究鲜有报道，王美秀等研制了由酵母菌、乳酸菌、芽孢杆菌、丙酸杆菌等组成的微生态制剂，患隐性乳房炎奶牛试验组SCC比试验前降低53％，但其中的乳酸菌需要与多种其它菌种复配才能达到一定防治隐性乳房炎的效果。邓露芳等研制了由枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、酿酒酵母等组成的复合微生态制剂，来防治奶牛乳房炎，但其中的屎肠球菌是通过维持肠道正常生态平衡来达到一定的防治效果，并且也需要与多种其它菌种进行复配使用才能得到较好的防治效果。综上，目前并没有一种具有直接的、较突出的防治乳房炎效果的乳酸菌-屎肠球菌。

发明内容

针对上述现有技术，目前的乳酸菌-屎肠球菌都是与其他菌种复配使用，才能达到较好的防治奶牛乳房炎效果，本发明中所筛选的屎肠球菌能够单独使用，不仅体外具有很好的抑菌效果，体内也能达到很好的防治奶牛乳房炎效果。为了增强该屎肠球菌对奶牛乳房炎的防治效果，降低饲喂菌剂的用量，本发明也同时通过抑菌试验筛选对奶牛乳房炎致病菌抑制效果较好的中草药复合组方，并将筛选得到的中草药复方组与屎肠球菌复配制成复合微生态制剂与对照品进行应用效果试验对比，确定防治奶牛乳房炎的效果，开发一款防治奶牛乳房炎的口服型产品。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面，提供了一株具有防治奶牛乳房炎功效的屎肠球菌，该菌株的分类命名为屎肠球菌(Enterococcus Faecium)，编号为BLFC-3-7，已于2017年9月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址为：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO:M 2017474。

本发明的屎肠球菌BLFC-3-7的菌体形态及生理生化特征为：该菌株呈椭圆形或球杆状，无芽孢，无鞭毛。菌落为直径0.5～1mm大小的圆形，灰白色、不透明、表面光滑。生长温度为30℃～40℃，适宜pH为5.0～7.5。最适生长温度为35～38℃。革兰氏阳性，属于兼性厌氧的乳酸菌，耐酸性耐高温性等抗逆性能差。

本发明的屎肠球菌BLFC-3-7最适的培养基为，以质量百分比计：葡萄糖2.0％、柠檬酸铵0.2％、乙酸钠0.5％、磷酸氢二钾0.5％、硫酸锰0.02％、硫酸镁0.05％、蛋白胨1％、牛肉膏1％、酵母膏0.5％、吐温-80 0.1％、pH6.0。

本发明的屎肠球菌BLFC-3-7是从山东泰安、潍坊、临沂等地多个奶牛场共同采集的新鲜牛奶中分离出来的，经试验测试表明，其是非常优秀的防治奶牛乳房炎的菌种。该菌株的最终筛选地点为山东泰安的奶牛场。

本发明的第二个方面，提供了一种微生物混合物，其特点是至少包含本发明的菌株；所述微生物混合物还包含其他具有防治奶牛乳房炎的功效并与本发明菌株共生的微生物。

本发明的第三个方面，提供了一种包含本发明菌株或本发明微生物混合物的产品，该产品可以是菌剂的形式，所述菌剂的活性成分为本发明菌株，该活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。

本发明的第四个方面，提供了一种本发明的菌株、本发明的微生物混合物或者本发明的包含本发明菌株或本发明微生物混合物的产品在制备防治奶牛乳房炎微生态制剂中的应用。

本发明的第五个方面，提供了一种防治奶牛乳房炎的复方中药微生态制剂，该复方中药微生态制剂是由中药复方和本发明的菌株复配而成。

其中，所述中药复方是由以下重量份的原料药制成：黄柏35～45份、蒲公英45～55份、紫花地丁5～10份、黄芪5～10份；

在所述的复方中药微生态制剂中，屎肠球菌BLFC-3-7的活菌数为5～10×10⁸cfu/g。

本发明的第六个方面，提供了上述防治奶牛乳房炎的复方中药微生态制剂的制备方法，步骤如下：

(1)按照上述重量份的原料称取，混合，加入10～12重量倍的水，浸泡30～40min，加热至沸腾，第一次煎煮时间为60～65min，过滤，滤渣中再加入10～12重量倍的水进行第二次煎煮，煎煮时间为50～55min；过滤，滤渣中再加入8～10重量倍的水进行第三次煎煮，煎煮时间为30～35min，合并滤液，冷冻干燥，制备得到中药复方粉；

(2)将中药复方粉与屎肠球菌粉进行混合得到复方中药微生态制剂。

与现有技术相比，本发明的技术方案的有益效果如下：

(1)本发明从新鲜牛奶中分离得到一株具有非常优秀防治奶牛乳房炎效果的屎肠球菌菌株BLFC-3-7，该菌种可单独使用用来防治奶牛乳房炎，具有优异的瘤胃液耐受性、耐酸性、胆盐耐受性和肠道粘附性；相比于现有技术中的其他屎肠球菌菌株，不仅体外具有很好的抑菌效果，在体内也能达到很好的防治奶牛乳房炎效果。

(2)本发明还筛选得到与屎肠球菌BLFC-3-7复配效果较好的中草药复合组方，制备得到防治奶牛乳房炎效果较突出的复方中药微生态制剂，该复方中药微生态制剂相比于单独使用同等质量的屎肠球菌BLFC-3-7，防治奶牛乳房炎的效果更加优异，并且成本更低。

附图说明

构成本发明的一部分说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为各乳酸菌的瘤胃液耐受性试验结果。

图2为各菌株0.3％胆盐耐受性试验结果。

图3为各菌株0.4％胆盐耐受性试验结果。

图4为各乳酸菌菌株肠道粘附试验结果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语―包含”和/或―包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，现有技术中防治奶牛乳房炎的微生态制剂存在一定的不足，屎肠球菌都是与其他菌种复配使用才能达到较好的防治奶牛乳房炎效果，其并没有直接防治奶牛乳房炎的效果，为了解决如上的技术问题，本发明提出了一株具有防治奶牛乳房炎功效的屎肠球菌，该菌株的分类命名为屎肠球菌(Enterococcus Faecium)，编号为BLFC-3-7，已于2017年9月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址为：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO:M 2017474。

在本发明的一个具体实施方式中，提供了一种微生物混合物，其特点是至少包含本发明的菌株。所述微生物混合物还可以包含其他具有防治奶牛乳房炎的功效并与本发明菌株共生的微生物。

在本发明的一个具体实施方式中，提供了一种包含本发明菌株或本发明微生物混合物的产品，该产品可以是菌剂的形式，该菌剂包括活性成分和载体。

优选的，所述活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。

优选的，所述载体可以为固体载体或液体载体。所述固体载体或液体载体均为常规的载体材料，其中，固体载体可以选自粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石、玉米粉、豆粉、聚乙烯醇和/或聚二醇；液体载体可以为植物油、矿物油或水。

优选的，所述产品为粉末形式、溶液形式、悬浮剂形式、片剂形式或颗粒形式。

在本发明的一个具体实施方式中，提供了一种本发明的菌株、本发明的微生物混合物或者本发明的包含本发明菌株或本发明微生物混合物的产品在制备防治奶牛乳房炎微生态制剂中的应用。

在本发明的一个具体实施方式中，提供了一种防治奶牛乳房炎的复方中药微生态制剂，该复方中药微生态制剂是由中药复方和本发明的菌株复配而成；

其中，所述中药复方是由以下重量份的原料药制成：黄柏35～45份、蒲公英45～55份、紫花地丁5～10份、黄芪5～10份；

在所述的复方中药微生态制剂中，屎肠球菌BLFC-3-7的活菌数为5～10×10⁸cfu/g。

优选的，所述中药复方是由以下重量份的原料药制成：黄柏40份、蒲公英50份、紫花地丁5份、黄芪5份；在所述的复方中药微生态制剂中，屎肠球菌BLFC-3-7的活菌数为5×10⁸cfu/g。

在本发明的一个具体实施方式中，还提供了上述防治奶牛乳房炎的复方中药微生态制剂的制备方法，本领域的技术人员知晓，中药成分十分复杂，一种药材既有水溶性成分，又有油溶性或醇溶性成分，本发明通过选择合适的提取方法和提取工艺对黄柏、蒲公英、紫花地丁和黄芪的有效成分进行提取分离，以最大限度地提取出有效成分并保证有效成分的活性，从而保证中药复方的应用效果。该制备方法的步骤如下：

(1)按照上述重量份的原料称取，混合，加入10～12重量倍的水，浸泡30～40分钟，加热至沸腾，第一次煎煮时间为60～65min，过滤，滤渣中再加入10～12重量倍的水进行第二次煎煮，煎煮时间为50～55min；过滤，滤渣中再加入8～10重量倍的水进行第三次煎煮，煎煮时间为30～35min，合并滤液，冷冻干燥，制备得到中药复方粉；

(2)将中药复方粉与屎肠球菌粉进行混合得到复方中药微生态制剂。

优选的，屎肠球菌粉的具体制备方法如下：

(Ⅰ)菌种：选用屎肠球菌BLFC-3-7；

(Ⅱ)斜面培养：将菌种一环接种于固体斜面培养基上，在37℃下培养18～24h；

(Ⅲ)扩大培养：以2％(v/v)的接种量，将一级种子液接于500mL～1000mL种子液体培养基中，在37℃条件下，静置培养6～16h，制得种子液；

(Ⅳ)发酵罐培养：以2％(v/v)的接种量，将种子液接于液体发酵培养基中，于37℃条件下，静置培养14～22h；

(Ⅴ)收集发酵产物：待发酵液黏度达12000～15000cP时，收集发酵液；

(Ⅵ)发酵结束后，立即将发酵液离心并用清水清洗，如此反复2～3遍后冷冻干燥，粉碎，即为菌粉成品；

进一步优选的，所述步骤(Ⅲ)、(Ⅳ)中的种子液体培养基和液体发酵培养基配方均为：葡萄糖2.0％、柠檬酸铵0.2％、乙酸钠0.5％、磷酸氢二钾0.5％、硫酸锰0.02％、硫酸镁0.05％、蛋白胨1％、牛肉膏1％、酵母膏0.5％、吐温-80 0.1％、pH6.0，115℃条件下灭菌20min；所述步骤(Ⅱ)中的固体斜面培养基为上述种子液体培养基中添加其质量1.5～2.0％的琼脂粉。以上均以质量百分比计。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。

实施例1菌株的筛选

1材料方法

1.1牛奶样品采集

选取山东泰安市、潍坊市、临沂等地的各大、中、小型奶牛场作为奶样采集地，用灭菌的10mL离心管无菌接取刚挤出的新鲜牛奶，4℃冷藏保存备用。

1.2筛选用培养基：

屎肠球菌的筛选培养基，以质量百分比计：葡萄糖2.0％、柠檬酸铵0.2％、乙酸钠0.5％、磷酸氢二钾0.5％、硫酸锰0.02％、硫酸镁0.05％、蛋白胨1％、牛肉膏1％、酵母膏0.5％、吐温-80 0.1％、pH6.0。

1.3菌株初筛

1.3.1菌株分离纯化

将采集到的新鲜牛奶样品于无菌条件下采取平板划线的方式接种在MRS琼脂平板上，37℃培养24-48h。挑取单个菌落，做革兰氏染色，镜检观察菌体形态、排列方式、大小及颜色，初步确定样品中微生物的种类，分别挑取疑似乳酸菌的单一菌落接种在MRS琼脂平板上纯培养24-48h。再次镜检确定为纯培养物后，将所需要的菌株斜面保存。

1.3.2菌株发酵液pH值的测定

将各乳酸菌菌株分别以2％接种量接种到MRS液体培养基中，37℃静置培养20h左右，测定发酵液的pH值。

1.3.3菌株抑菌试验

采用牛津杯法测定各乳酸菌菌株发酵液对指示菌(可导致奶牛乳房炎的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)的体外抑菌试验。

1.4乳酸菌菌株的复筛——性质研究筛选试验

将1.3.3中初筛得到的对奶牛乳房炎致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌抑制效果较好的6株乳酸菌菌株分别以2％接种量接种到MRS培养基中，37℃静置培养20h左右，取发酵液进行性质研究。

1.4.1瘤胃液耐受性试验

将前面筛选出的6株乳酸菌，液体发酵后的发酵液各取1mL离心，加入奶牛瘤胃液中，5h后测活菌数，计算存活率；

瘤胃液耐受力(％)＝瘤胃液中处理5h后活菌数/初始活菌数*100

1.4.2耐酸性试验

取发酵24h的乳酸菌发酵液10mL，3000r/min离心15min，弃上清，将菌体用生理盐水洗涤3次，先加入生理盐水5mL，10mol/L的盐酸调节乳酸菌的菌悬液的pH值分别为2.0、3.0、4.0，然后用生理盐水定容至10mL，于37℃处理0、1h、2h、3h。取菌悬液，在平皿上作菌落计数，从而计算出菌的存活率，以pH5.5～6.0的菌液为对照。

耐酸性存活率(％)＝待测pH的菌液活菌数/pH5.5～6.0的菌液活菌数*100

1.4.3耐胆盐试验

取1mL乳酸菌分别加入含牛胆盐0.3％、0.4％的MRS液体培养基各6mL，取1mL乳酸菌加入6mL MRS液体培养基作为对照，39℃分别处理2h、4h，计活菌数。

胆盐耐受力(％)＝各处理水平活菌数/对照组活菌数*100

1.4.4肠道粘附试验

1.4.4.1试验材料

鸡空肠、回肠

培养基：菌株培养所需的固、液体培养基；

1.4.4.2试验方法

粘液制备：打开动物腹腔，无菌取空肠回肠，分别用1mL无菌NSS液冲洗肠腔3次，剪开，每部分取1～2g粘液，-20℃保存备用。

菌株的黏附：取12孔或24孔细胞培养板，试验组各加0.5mL或0.25mL粘液，每种粘液平行3孔，4℃过夜固定。然后每孔加1.0mL或0.5mL NSS液洗涤两次，除去未粘附的粘液，每孔加等量0.5mL或0.25mL标记菌悬液。另以0.5mL或0.25mL标记菌悬液作阳性对照，28℃孵育2h。除阳性对照外，再用1.0mL或0.5mLNSS洗去未粘附细菌。

计数：将吸出悬液和每次洗涤液都装入小离心管中，以备计数，菌体计数采用梯度稀释的方法，计算出未粘附的总菌量，最后计算出该菌粘附的百分率。

1.4.5各株乳酸菌在防治奶牛乳房炎上的应用效果试验

经预试验证明这六株乳酸菌均为有益乳酸菌。试验在泰安市范镇鑫源奶牛场进行，在该牛场的2-3胎的经产西杂奶牛(西门塔尔×本地黄牛)中，随机选取年龄、泌乳期相近的隐性型乳房炎(+++或++)的杂交奶牛540头，奶牛平均体重约为800-1000kg，随机分为6组，每组3个平行，每个平行30头，。各组每头牛每天分别饲喂100g乳酸菌(本实施例1.3.3抑菌效果较好的6株乳酸菌)菌粉，使用方法为拌料饲喂，饲喂前及饲喂两周后取奶样进行CMT检测，试验期间每天记录产奶量。

隐性型乳房炎疗效判定标准

治愈：强阳性(+++)或阳性(++)(+)转为阴性(–)。

有效(减轻)：强阳性(+++)转为阳性(++)(+)或阴性(–)，阳性(++)转为弱阳性(+)或阴性(–)。

无效：两个疗程无明显效果。

2试验结果

2.1初筛结果

本研究共分离疑似乳酸杆菌多株，部分见表1，其中乳酸菌对引起奶牛乳房炎的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌达到药物敏感高敏等级的分别有78株和86株。其中对奶牛乳房炎致病菌抑制效果较好的为6株乳酸菌见表2。

表1 部分乳酸菌抑菌试验结果(抑菌圈直径Φ：mm)

表2 对奶牛乳房炎致病菌抑制效果较好的6株乳酸菌

2.2菌株复筛结果

2.2.1瘤胃液耐受性试验

由图1可以看出，初筛得到的抑菌效果较好的6株乳酸菌瘤胃液耐受性顺序为：5＞3＞2＞4＞6＞1。

2.2.2酸碱耐受性试验

表3 初筛得到的抑菌效果较好的6株乳酸菌酸碱耐受性试验

由表3中数据可以看出，各菌株在pH＝3.0,4.0,5.0,8.0,9.0,10.0，其2h存活率基本在80％以上，且各菌株之间差距不大，故选择参考pH＝2.0的存活率对菌株进行耐酸性试验筛选。

表4 初筛得到的抑菌效果较好的6株乳酸菌pH值2.0溶液中活菌数(cfu/mL)

由表4中结果显示，菌株耐酸性顺序为：5＞3＞1＞4＞6＞2。

2.2.3胆盐耐受性试验

各取1mL乳酸菌发酵液分别加入含牛胆盐0.3％、0.4％的MRS液体培养基各6mL，同时取1mL乳酸菌发酵液加入6mLMRS液体培养基作为对照，39℃分别处理2h、4h，计活菌数。

胆盐耐受力(％)＝各处理水平活菌数/对照组活菌数*100

由图2和图3可以看出，在0.3％和0.4％胆盐条件下，菌株5的胆盐耐受性较好。

2.2.4肠道黏附试验

由图4可以看出，菌株5的肠道粘附性优于其他菌株。

2.2.5初筛得到的抑菌效果较好的6株乳酸菌在防治奶牛乳房炎上的应用效果试验

表5 两周后乳酸菌在奶牛乳房炎上的效果验证试验

注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同小写字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)，下同。

由表5试验结果显示，饲喂两周后，饲喂乳酸菌1、2、5的隐性乳房炎奶牛+++有效率分别为70.00％、68.22％、69.12％(P>0.05)，差异不显著，但均优于乳酸菌3、4、6，差异显著(P<0.05)；饲喂乳酸菌5的隐性乳房炎奶牛++有效率为75.4％，优于其余各株乳酸菌差异显著(P<0.05)；饲喂乳酸菌5的隐性乳房炎奶牛+有效率为77.29％，优于其余各株乳酸菌，差异显著(P<0.05)；饲喂乳酸菌5的隐性乳房炎奶牛治愈率为80.02％，显著优于其余各株乳酸菌(P<0.05)。饲喂乳酸菌5的奶牛产奶量较试验前提高5.7％，优于其余各组。

3小结

综合以上几方面指标，各性能相对都比较突出的菌株为5号菌株，该菌株编号为BLFC-3-7。

实施例2菌种的鉴定与安全试验

1材料与方法

1.1菌种：从鲜奶样品中分离得到的微生物经初筛、复筛后，共筛选出1株对奶牛乳房炎防治效果最好的乳酸菌BLFC-3-7。

1.2细菌的常规生化鉴定：除特别说明外，一般形态、生理生化性状试验均参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第9版)和《微生物学实验手册》进行。

1.3 16S rDNA的扩增与序列分析

目的菌株接种于新鲜的乳酸菌培养基中培养20h，采用tiangen公司的试剂盒提取菌体DNA，并对其进行16S rDNA序列扩增。所用引物为通用引物：27F 5’-3’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，如SEQ ID NO:1所示；1492R 5’-3’GGTTACCTTGTTACGACTT，如SEQ ID NO:2所示；PCR反应体系(50μL)为：上下游引物各1μL，MIX 25μL，模板2μL，超纯水21μL。PCR扩增程序为95℃预变性5min，94℃变性1min，59℃退火15s，72℃延伸45s，30个循环，72℃延伸10min。PCR产物送北京博尚生物技术有限公司进行序列测定。

1.4安全性试验：

健康昆明种小鼠36只，雌雄各半，体重20g左右，随机分为3个组，分别为生理盐水对照组、低剂量组、高剂量组，每组12只，雌雄各半。各试验组小鼠均饲喂基础日粮；采用灌胃法给予受试菌液及生理盐水，灌胃量为0.2mL/只，每天1次。每3d称1次体重。其中对照组小鼠灌喂灭菌生理盐水，试验组小鼠灌喂菌株BLFC-3-7的稀释液，其中低剂量组活菌数为每日有效摄入剂量的10倍、高剂量组活菌数为每日有效摄入剂量的1250倍，试验设计见表6。试验期间实验小鼠自由采食，饲喂环境相同。连续给予受试菌液7天。试验中每天观察小鼠的各项指标(精神状态、被毛、粪便、进食、饮水、活动、以及中毒和死亡情况等)，并做好记录。计算小鼠体重变化；解剖观察心脏、肝脏、脾脏、肺脏及肾脏有无病变并计算脏器指数。

表6 小鼠安全性试验设计

2结果

2.1菌种形态鉴定

菌种形态及特性：椭圆形或球杆状，无芽孢，无鞭毛。菌落为直径0.5～1mm大小的圆形，灰白色、不透明、表面光滑。生长温度为30℃～40℃，适宜pH为5.0～7.5。最适生长温度为35～38℃。革兰氏阳性，屎肠球菌是兼性厌氧的乳酸菌，其耐酸性耐高温性等抗逆性能差。

2.2 16S rDNA的鉴定结果：

测序结果如SEQ ID NO:3所示。将测序结果与GenBank中已登录的菌株的16S rDNA序列进行比对，发现BLFC-3-7菌株与屎肠球菌的同源性高达99.99％，BLFC-3-7菌株被鉴定为屎肠球菌(Enterococcus Faecium)。

上述屎肠球菌(Enterococcus Faecium)BLFC-3-7，已于2017年9月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址为：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO:M 2017474。

2.3安全性试验

表7 小鼠平均日增重结果(g/d·只)

试验期间，各组小鼠采食、行为、排便、体态行为均无异常变化，各组日增重均无显著性差异，说明试验组对小鼠的日增重没有影响。

表8 小鼠脏器指数试验结果(％)

由表8可以看出，各组小鼠脏器指数均无显著性差异，试验小鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肺脏均无肉眼可见病变，这说明在试验浓度范围的受试菌株对小鼠是安全的。

实施例3中药组方的筛选

1材料与方法

1.1中药抑菌试验筛选

分别选取王不留行、黄柏、红花、连翘、蒲公英、金银花、紫花地丁、黄芪8味中药，分别按重量份称取，加入10重量倍的水，浸泡30分钟，加热至沸腾，第一次煎煮时间为60min，过滤，滤渣中再加入10重量倍的水进行第二次煎煮，煎煮时间为50min；过滤，滤渣中再加入8重量倍的水进行第三次煎煮，煎煮时间为30min，合并滤液。以分离到的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌为指示菌，采用牛津杯检测其对致病菌的抑菌效果，试验设4个平行。

1.2中药复方筛选

利用正交试验设计试验组方分组。按重量份(见表9)称取黄柏、蒲公英、紫花地丁、黄芪，混合，加入10重量倍的水(水的加入量为混合药材重量的10倍)，浸泡30分钟，加热至沸腾，第一次煎煮时间为60min，过滤，滤渣中再加入10重量倍的水进行第二次煎煮，煎煮时间为50min；过滤，滤渣中再加入8重量倍的水进行第三次煎煮，煎煮时间为30min，合并滤液，以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌为指示菌，采用牛津杯检测其对致病菌的抑菌效果。

表9 中药复方设计表(单位：g)

2结果与分析

2.1中药筛选抑菌试验结果

表10 中药对致病菌的抑菌效果(抑菌圈直径：mm)

由表10结果可知，对大肠杆菌抑菌效果较好的中药为黄柏、蒲公英、紫花地丁、黄芪，对金黄色葡萄球菌抑菌效果较好的中药为黄柏、金银花、紫花地丁、黄芪，综合来看，确定选取黄柏、蒲公英、紫花地丁、黄芪作为复合中药组方。

2.2中药复方筛选结果

表11 不同中草药复方抑菌效果(抑菌圈直径Φ：mm)

由表11结果可知，组方Ⅷ黄柏40份、蒲公英50份、紫花地丁5份、黄芪5份水煎提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌抑菌效果显著优于其他各组方(P<0.05)。

对比例1复合中药Ⅰ的制备

配方：黄柏40份、蒲公英50份、紫花地丁5份、黄芪5份、赤芍10份、连翘10份。

制备方法：按重量份称取黄柏、蒲公英、紫花地丁、黄芪、赤芍、连翘，混合，加入10重量倍的水(水的加入量为混合药材重量的10倍)，浸泡30分钟，加热至沸腾，第一次煎煮时间为60min，过滤，滤渣中再加入10重量倍的水进行第二次煎煮，煎煮时间为50min；过滤，滤渣中再加入8重量倍的水进行第三次煎煮，煎煮时间为30min，合并滤液，冷冻干燥。

对比例2复合中药Ⅱ的制备

配方：黄柏40份、蒲公英50份、紫花地丁5份、当归5份。

制备方法：按重量份称取黄柏、蒲公英、紫花地丁、当归，混合，加入10重量倍的水(水的加入量为混合药材重量的10倍)，浸泡30分钟，加热至沸腾，第一次煎煮时间为60min，过滤，滤渣中再加入10重量倍的水进行第二次煎煮，煎煮时间为50min；过滤，滤渣中再加入8重量倍的水进行第三次煎煮，煎煮时间为30min，合并滤液，冷冻干燥。

对比例3复合中药Ⅲ的制备

配方：黄柏40份、蒲公英50份、黄芪5份。

制备方法：按重量份称取黄柏、蒲公英、黄芪，混合，加入10重量倍的水(水的加入量为混合药材重量的10倍)，浸泡30分钟，加热至沸腾，第一次煎煮时间为60min，过滤，滤渣中再加入10重量倍的水进行第二次煎煮，煎煮时间为50min；过滤，滤渣中再加入8重量倍的水进行第三次煎煮，煎煮时间为30min，合并滤液，冷冻干燥。

对比例4复合中药Ⅳ的制备

配方：黄柏30份、蒲公英40份、紫花地丁10份、黄芪10份。

制备方法：按重量份称取黄柏、蒲公英、紫花地丁、黄芪，混合，加入10重量倍的水(水的加入量为混合药材重量的10倍)，浸泡30分钟，加热至沸腾，第一次煎煮时间为60min，过滤，滤渣中再加入10重量倍的水进行第二次煎煮，煎煮时间为50min；过滤，滤渣中再加入8重量倍的水进行第三次煎煮，煎煮时间为30min，合并滤液，冷冻干燥。

实施例4复合中药对奶牛乳房炎致病菌的抑菌效果试验

选取本发明实施例3确定的组方Ⅶ的复合中药浸提液冻干粉(组方：黄柏40份、蒲公英50份、紫花地丁5份、黄芪5份)和各个对比例组方制得的冻干粉Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，以分离到的奶牛乳房炎致病菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌为指示菌，用牛津杯法检测其对致病菌的抑菌效果。

表12 不同中草药组方抑菌效果(抑菌圈直径Φ：mm)

由表12抑菌效果显示，针对奶牛乳房炎致病菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌效果上，其中本发明实施例3确定的组方Ⅶ的抑菌效果最好。

实施例5防治奶牛乳房炎制剂在奶牛上的应用效果试验

1材料与方法

1.1试验动物的选择及分组

试验在泰安市范镇鑫源奶牛场进行，在该牛场的2-3胎的经产西杂奶牛(西门塔尔×本地黄牛)中，随机选取年龄、泌乳期相近的隐性型乳房炎(+++或++)的杂交奶牛720头，奶牛平均体重约为800-1000kg，随机分为6组，设对照组(组方Ⅶ+常规市售的屎肠球菌，对比例的复合中药+常规市售的屎肠球菌，该屎肠球菌可购自山东向日葵生物科技有限公司)和产品组(复方中药微生态制剂：中药组方Ⅶ和屎肠球菌BLFC-3-7，其中中药复方为黄柏40份、蒲公英50份、紫花地丁5份、黄芪5份；在所述的复方中药微生态制剂中，屎肠球菌的活菌数为5×10⁸cfu/g)，每组3个重复，每个重复40头。试验组和对照组每头牛每天饲喂100g样品(对照组和产品组中每克屎肠球菌活菌数相同)，使用方法为拌料饲喂，饲喂前及饲喂一周、两周后取奶样进行CMT检测，试验期间每天记录产奶量。

1.2隐性型乳房炎疗效判定标准

治愈:强阳性(+++)或阳性(++)(+)转为阴性(–)。

有效(减轻):强阳性(+++)转为阳性(++)(+)或阴性(–)，阳性(++)转为弱阳性(+)或阴性(–)。

无效:两个疗程无明显效果。

2试验结果

表13 一周后效果验证试验

表14 两周后效果验证试验

由表13试验结果显示，饲喂一周后，饲喂本产品的隐性乳房炎奶牛+++、++、+的奶牛有效率分别为70.00％、80.00％、90.67％，对照组隐性乳房炎奶牛+++、++、+的奶牛有效率均低于本产品组。就产奶量指标来看，本产品组饲喂一周后较试验前增产4.14％，对照组饲喂一周后较试验前增产分别为3.04％、2.62％、0.68％、0.71％、2.04％。由表14试验结果显示，饲喂两周后，饲喂本产品的隐性乳房炎奶牛+++、++、+的奶牛有效率分别为80.00％、92.00％、96.67％，对照组隐性乳房炎奶牛+++、++、+的奶牛有效率均低于本产品组；治愈率指标本产品组在饲喂一周和两周后分别达到86.67％和90.67％，也明显好于对照组。就产奶量指标来看，本产品组饲喂两周后较试验前增产4.78％，高于对照组饲喂两周后的增产率，说明随着隐性乳房炎的好转，产奶量有较大的提升，并且本产品组产奶量提高效果好于对照组。

综合来看，本产品的隐性乳房炎防治及产奶量等指标均显著优于对照组。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东宝来利来生物工程股份有限公司

<120> 一株具有防治奶牛乳房炎功效的乳酸菌及其应用

<130> 2017

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 1425

<212> DNA

<213> 屎肠球菌FC-3-7

<400> 3

tgcagtcgta cgcttctttt tccaccggag cttgctccac cggaaaaaga ggagtggcga 60

acgggtgagt aacacgtggg taacctgccc atcagaaggg gataacactt ggaaacaggt 120

gctaataccg tataacaatc gaaaccgcat ggttttgatt tgaaaggcgc tttcgggtgt 180

cgctgatgga tggacccgcg gtgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggcc 240

acgatgcata gccgacctga gagggtgatc ggccacattg ggactgagac acggcccaaa 300

ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt cggcaatgga cgaaagtctg accgagcaac 360

gccgcgtgag tgaagaaggt tttcggatcg taaaactctg ttgttagaga agaacaagga 420

tgagagtaac tgttcatccc ttgacggtat ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc 480

cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg atttattggg cgtaaagcga 540

gcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg 600

gaaactggga gacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccatgtgtag cggtgaaatg 660

cgtagatata tggaggaaca ccagtggcga aggcggctct ctggtctgta actgacgctg 720

aggctcgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg 780

atgagtgcta agtgttggag ggtttccgcc cttcagtgct gcagctaacg cattaagcac 840

tccgcctggg gagtacgacc gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca 900

agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat 960

cctttgacca ctctagagat agagcttccc cttcgggggc aaagtgacag gtggtgcatg 1020

gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta 1080

ttgttagttg ccatcattca gttgggcact ctagcaagac tgccggtgac aaaccggagg 1140

aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca 1200

atgggaagta caacgagttg cgaagtcgcg aggctaagct aatctcttaa agcttctctc 1260

agttcggatt gcaggctgca actcgcctgc atgaagccgg aatcgctagt aatcgcggat 1320

cagcacgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga 1380

gtttgtaaca cccgaagtcg gtgaggtaac ctttttgagc cagcc 1425

Claims (10)

1. 一株具有防治奶牛乳房炎功效的屎肠球菌，该菌株的分类命名为屎肠球菌（Enterococcus Faecium），编号为BLFC-3-7，已于2017年9月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO: M 2017474。

2.一种微生物混合物，其特征是：至少包含权利要求1所述的屎肠球菌。

3.包含权利要求1所述的屎肠球菌或权利要求2所述的微生物混合物的产品。

4.如权利要求3所述的产品，其特征是：所述产品为粉末形式、溶液形式、悬浮剂形式、片剂形式或颗粒形式。

5.权利要求1所述的屎肠球菌或权利要求2所述的微生物混合物或权利要求3所述的产品在制备防治奶牛乳房炎微生态制剂中的应用。

6.一种防治奶牛乳房炎的复方中药微生态制剂，其特征是：该复方中药微生态制剂是由中药复方和权利要求1所述的菌株复配而成；

其中，所述中药复方是由以下重量份的原料药制成：黄柏35~45份、蒲公英45~55份、紫花地丁5~10份、黄芪5~10份；

在所述的复方中药微生态制剂中，屎肠球菌的活菌数为5~10×10⁸cfu/g。

7.如权利要求6所述的复方中药微生态制剂，其特征是：所述中药复方是由以下重量份的原料药制成：黄柏40份、蒲公英50份、紫花地丁5份、黄芪5份。

8.权利要求6或7所述的防治奶牛乳房炎的复方中药微生态制剂的制备方法，其特征是，步骤如下：

（1）按照上述重量份的原料称取，混合，加入10~12重量倍的水，浸泡30~40分钟，加热至沸腾，第一次煎煮时间为60~65min，过滤，滤渣中再加入10~12重量倍的水进行第二次煎煮，煎煮时间为50~55min；过滤，滤渣中再加入8~10重量倍的水进行第三次煎煮，煎煮时间为30~35min，合并滤液，冷冻干燥，制备得到中药复方粉；

（2）将中药复方粉与屎肠球菌粉进行混合得到复方中药微生态制剂。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征是：所述屎肠球菌粉的制备包括以下步骤：

（Ⅰ）菌种：选用乳酸菌BLFC-3-7；

（Ⅱ）斜面培养：将菌种一环接种于固体斜面培养基上，在37℃下培养18～24h；

（Ⅲ）扩大培养：以2%（v/v）的接种量，将一级种子液接于500mL～1000mL种子液体培养基中，在37℃条件下，静置培养6～16h，制得种子液；

（Ⅳ）发酵罐培养：以2%（v/v）的接种量，将种子液接于液体发酵培养基中，于37℃条件下，静置培养14～22h；

（Ⅴ）收集发酵产物：待发酵液黏度达12000～15000cP时，收集发酵液；

（Ⅵ）发酵结束后，立即将发酵液离心后冷冻干燥，粉碎，过筛即为菌粉成品。

10. 如权利要求9所述的制备方法，其特征是：以质量百分比计，所述步骤（Ⅲ）、（Ⅳ）中的种子液体培养基和液体发酵培养基配方均为：葡萄糖2.0%、柠檬酸铵0.2%、乙酸钠0.5%、磷酸氢二钾0.5%、硫酸锰0.02%、硫酸镁0.05%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、吐温-800.1%、pH6.0，115 ℃条件下灭菌20 min；所述步骤（Ⅱ）中的固体斜面培养基为上述种子液体培养基中添加1.5～2.0%的琼脂粉。