CN105267957B - 一种猪用生物止泻剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种猪用生物止泻剂，并涉及该生物止泻剂的制备方法，属于动物保健品技术领域。选用保藏菌种地衣芽孢杆菌CGMCC No.6102、酿酒酵母CGMCC No.11355、枯草芽孢杆菌CGMCC No.6101和从食腐动物肠道分离的地衣芽孢杆菌CGMCC No.11353发酵生产的碱性蛋白酶为主要成分，其中地衣芽孢杆菌DE 150～300亿cfu/g、枯草芽孢杆菌K018 200～400亿cfu/g、酿酒酵母XDN‑1188 50～150亿cfu/g、纳米蒙脱石200～300mg/g、碱性蛋白酶50～150U/g，以葡萄糖为载体配合制成。可用于养猪业日常饲养，也可用作饲料原料，对仔猪腹泻具有快速治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及动物保健产品，具体涉及一种止泻迅速的猪用生物型保健品，并涉及该生物止泻剂的制备方法，属于动物保健品技术领域。
背景技术
仔猪腹泻是集约化养猪模式下的一种典型的多因素疾病。该病是目前最严重的仔猪疾病之一，也是引起仔猪死亡的重要原因，据调查，仔猪因腹泻死亡占仔猪死亡总数的39.8％。近年来，我国仔猪腹泻十分普遍，据报道30kg以下的仔猪，全年平均发病率46.5％，死亡率10.3％。在养猪业较发达的国家如美国，仔猪腹泻在养猪业危害中居首位，严重制约着养猪业的健康发展，导致饲料报酬低、仔猪成活率下降、生长缓慢、生长发育停滞，甚至死亡。当前在生产实践中，预防和治疗仔猪腹泻的主要方式是使用抗生素，
申请号201310650213.4中国发明《防治家禽肠炎的复方药物及制备方法》公开了一种防治家禽肠炎的复方药物，它含有下列按质量百分比计量的组分：抗生素10～40％、止泻剂0.1～1％、肠粘膜保护剂2～12％，余量为辅料。本发明组分中的抗生素为氨基糖甙类、多黏菌素类和盐酸黄连素中的一种或多种组分。所述止泻剂为甲溴东莨菪碱、阿托品、苯乙哌啶、洛哌丁胺、次硝酸铋中的一种或多种组合。所述肠粘膜保护剂为维生素K3、西咪替丁、谷胺酰胺中的一种或多种组合。所述辅料为口服葡萄糖、无水葡萄糖、可溶性淀粉、糊精、环糊精中的一种或多种组合。本发明还包括防治家禽肠炎的复方药物的制备方法。
申请号201180076040.9的国际申请《用于改善胃肠菌群的组合物和方法》公开了通过给予胃肠健康维持或改善量的包含有效量的乳酸的组合物以用于增强有需要的动物的胃肠健康的方法和组合物。所给予的组合物还可包含一种或多种益生元、益生菌、合生素、抗细菌剂或止泻剂。
但抗生素的长期使用和滥用带来的负面作用越来越严重，已引起社会的广泛关注，其危害主要体现在：一是病菌产生耐药性问题，导致预防和治疗效果越来越差；二是引起动物免疫机能下降，死亡增多；三是畜禽产品中的药物残留问题，直接危害人类的健康。鉴于抗生素滥用的危害，世界卫生组织已成立了慎用抗生素联盟。为了保护人类健康，同时也为了减少养猪业由于腹泻带来的经济损失，寻找理想的抗生素替代品已成为当下亟待解决的问题。
中药在这方面的应用逐渐受到重视，但是由于中药存在见效慢等缺点，往往仍需要与抗生素配合使用。申请号为94107032.8的中国发明公开了一种同时含有中草药组分和西药组分的止泻剂，其中中草药组分为补骨脂、诃子、当归、木香、白芍；饮片混合加水煎出液的干燥物粉碎与甲氧苄氨吡啶、甲哨唑、异烟肼、苯呱啶、VB6混合，西药占混合物总重量百分比为1-80％，主要用于治疗各种原因引起的慢性腹泻，其有效率达98％，治愈率达80％以上，副作用小服用方便。
益生菌在调整动物肠道方面的作用也日益受到人们的重视，申请号201310027976.3的中国发明《调整禽畜肠道菌群益生菌微生物菌剂及制备法》公开了一种调整禽畜肠道菌群结构的益生菌及其制备方法，是由产朊假丝酵母、粪链球菌、枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、植物乳杆菌和沼泽红假单胞菌等6种菌组成，经过三级液体发酵，再将扩大培养发酵菌液与饲料麦麸均匀混合，进行固体发酵，低温干燥而制备的调整禽畜肠道菌群结构的益生菌菌剂。该菌剂能调整禽畜肠道菌群结构，促进益生菌生长，抑制有害菌生长，可以取代抗生素，提高饲料利用率，明显降低禽畜排泄物的臭味，改善养殖生态环境和周边环境，高效、无毒、无残留。可广泛应用于禽畜饲料添加剂，预防禽畜肠道疾病和呼吸道疾病。该发明使用益生菌重在利用益生菌调整禽畜肠道菌群结构的作用，保健作用比较突出，但是对于发生腹泻等疾病的治疗作用并未深入研究。
发明内容
避免滥用抗生素造成的危害，并满足养猪业的迫切需要，是本发明所要解决的技术问题。
为解决上述问题，本发明提供一种新型的绿色、安全、高效的猪用生物止泻剂，对各类常见腹泻均有良好的预防治疗效果。
据研究，引起仔猪腹泻的主要因素包括：营养因素、应激因素、病菌感染、病毒感染等。针对以上原因，本发明选用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DE(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6102)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)XDN-1188(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11355)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K018(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6101)和从食腐动物肠道分离的地衣芽孢杆菌XDM－0968(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11353)发酵生产的碱性蛋白酶、纳米蒙脱石为主要有效成分，按照长期试验筛选的有效比例，以葡萄糖为载体配合制成。
所述猪用生物止泻剂包括如下组分：
地衣芽孢杆菌DE 150～300亿cfu/g、枯草芽孢杆菌K018 200～400亿cfu/g、酿酒酵母XDN-1188 50～150亿cfu/g、纳米蒙脱石200～300mg/g、碱性蛋白酶50～150U/g、葡萄糖做载体补至总量1g；
所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)DE，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6102，我公司申请公布号CN 103667128A的在先申请《一种地衣芽孢杆菌及其用途》公开了地衣芽孢杆菌DE能够耐人工胃酸、耐胆盐、耐人工肠液、耐高温，对肠道中致病性金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等有较强抑制作用，产淀粉酶能力和产纤维素酶能力较强，可以降解淀粉和纤维素的特性。其细胞形态和理化特性如下：
| 试验项目 | 结果 | 试验项目 | 结果 |
| 革兰氏染色 | 阳性 | 碳水化合物产酸 | |
| 细胞形状 | 杆状 | 葡萄糖 | + |
| 细胞直径＞1μm | － | 木糖 | + |
| 形成芽孢 | + | L－阿拉伯糖 | + |
| 孢囊膨大 | － | 甘露醇 | + |
| 芽孢圆形 | － | 乳糖 | － |
| 伴孢晶体 | － | 发酵葡萄糖产气 | － |
| 接触酶 | + | 利用柠檬酸盐 | + |
| 氧化酶 | + | 50℃生长 | + |
| 厌氧生长 | + | pH5.7生长 | + |
| VP试验 | + | 7％NaCl生长 | + |
| VP＜pH6 | + | 淀粉水解 | + |
| VP＞pH7 | － | 分解酪素 | + |
| 甲基红试验 | + | 硝酸盐还原 | + |
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K018，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6101；我公司申请公布号CN 103614327A的在先申请《一种枯草芽抱杆菌及其用途》已经公开了枯草芽抱杆菌K018能够耐人工胃酸、耐胆盐、耐人工肠液、耐高温，对肠道中致病性金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌等有较强抑制作用，产淀粉酶能力和产纤维素酶能力较强，可以降解淀粉和纤维素的特性。其细胞形态和理化特性如下：
| 试验项目 | 结果 | 试验项目 | 结果 |
| 革兰氏染色 | 阳性 | 碳水化合物产酸 | |
| 细胞形状 | 杆状 | 葡萄糖 | + |
| 细胞直径＞1μm | － | 木糖 | + |
| 形成芽孢 | + | L－阿拉伯糖 | + |
| 孢囊膨大 | － | 甘露醇 | + |
| 芽孢圆形 | － | 乳糖 | － |
| 伴孢晶体 | － | 发酵葡萄糖产气 | － |
| 接触酶 | + | 利用柠檬酸盐 | + |
| 氧化酶 | + | 50℃生长 | + |
| 厌氧生长 | － | pH5.7生长 | + |
| VP试验 | + | 7％NaCl生长 | + |
| VP＜pH6 | + | 淀粉水解 | + |
| VP＞pH7 | － | 分解酪素 | + |
| 甲基红试验 | + | 硝酸盐还原 | + |
所述蛋白酶是从食腐动物肠道分离的地衣芽孢杆菌XDM－0968(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11353)发酵生产的碱性蛋白酶。其pH曲线图见附图1：所述蛋白酶是一种独特功能性蛋白酶，具有很强的促蛋白消化活性，而且能够明显抑制有害微生物对动物肠道的危害，其抑菌试验结果见附图2、3。
所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)XDN-1188于2015年09月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11355，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；
所述地衣芽孢杆菌XDM－0968于2015年09月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11353，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；
优选的，所述猪用止泻剂包括如下组分：地衣芽孢杆菌DE200～300亿cfu/g、枯草芽孢杆菌K018300～350亿cfu/g、酿酒酵母XDN-118880～120亿cfu/g、纳米蒙脱石250～300mg/g、碱性蛋白酶100～150U/g、葡萄糖做载体补至总量1g；
本发明同时提供所述猪用生物止泻剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：按照常规活化扩培方法，将斜面保存的地衣芽孢杆菌DE菌种用牛肉膏蛋白胨培养基活化扩大培养，然后按照每吨培养基接种10～15mL的接种量，用压差法无菌接种到发酵罐中，起始pH为6.5,温度控制在33℃～35℃，发酵36～40小时，获得发酵液；将枯草芽孢杆菌K018菌种用牛肉膏蛋白胨培养基活化扩大培养后，按照每吨培养基接种10～15mL的接种量，用压差法无菌接种到发酵罐中，起始pH为6.0,温度控制在32℃～34℃，发酵50～53小时，获得发酵液；将酿酒酵母XDN-1188菌种用YPD培养基培养活化后，按照10～15mL/T的接种量，用压差法无菌接种到发酵罐，在pH5.2～5.6,温度30℃～33℃，搅拌转速150r/min条件下发酵20～24小时，获得发酵液；将斜面保存的地衣芽孢杆菌XDM－0968经菌种活化和逐级扩大培养获得液体种子；将液体种子以6-8％接种量接入发酵罐，起始pH为7.0，培养温度36-38℃，搅拌速度130-180r/m，培养时间10-15h；然后以1-2℃/h降温速率缓慢降温至25-30℃，恒温培养8-10h；继续以1-2℃/h降温速率缓慢降温至15-20℃，此时，将液体种子以1-2％接种量追加接入发酵罐，恒温培养8-10h；再以1-2℃/h升温速率缓慢升温至25-30℃，恒温培养6-8h；继续以1-2℃/h升温速率缓慢升温至36-38℃，恒温培养8-10h，获得发酵液；上述接种量单位为：质量百分比；
步骤二：将地衣芽孢杆菌DE发酵液分别用膜设备和离心设备进行浓缩后，以浓缩后发酵液质量计加6％～8％淀粉载体，在160～170℃下进行压力喷雾干燥，获得4000亿/g的菌粉，枯草芽孢杆菌K018发酵液的处理方式同地衣芽孢杆菌DE。酿酒酵母XDN-1188发酵液经真空转鼓浓缩后，收集菌泥，以浓缩后发酵液质量计加入1％～2％载体吸附后，在36℃～42℃条件下用流化床烘干至含水量8％以下，然后进行低温粉碎，获得原菌粉；地衣芽孢杆菌XDM－0968发酵液经过滤、浓缩、精滤、干燥得固体碱性蛋白酶；
所述干燥优选为：干燥前，向精滤后的浓缩液中加入浓缩液重量1-3％的保护剂，混匀后用酶制剂专用喷雾干燥机干燥，进风温度140-150℃，排风温度75-85℃,干燥时间5-15s，产品水分＜5％既得；
所述保护剂由以下重量份数的原料组成:海藻糖10-20份，NaCl 15-25份，(NH4)2SO410-15份，半胱氨酸15-20份；
步骤三：
将所述猪用生物止泻剂的所有组分原料过60目筛后，按照含量准确计算并称取各种原料，然后将各种原料用混合机充分混合均匀，最终要求成品中各组分的混合变异系数小于5％。
作为发明的一种实施方式，所述生物止泻剂包括如下组分：地衣芽孢杆菌DE 280亿cfu/g、枯草芽孢杆菌K018 300亿cfu/g、酿酒酵母XDN-1188 100亿cfu/g、纳米蒙脱石300mg/g、碱性蛋白酶100U/g、葡萄糖做载体补至总量1g；
作为发明的一种实施方式，所述生物止泻剂包括如下组分：地衣芽孢杆菌DE 300亿cfu/g、枯草芽孢杆菌K018 200亿cfu/g、酿酒酵母XDN-1188 90亿cfu/g、纳米蒙脱石250mg/g、碱性蛋白酶120U/g、葡萄糖做载体补至总量1g；
作为发明的一种实施方式，所述生物止泻剂包括如下组分：地衣芽孢杆菌DE150亿cfu/g、枯草芽孢杆菌K018 350亿cfu/g、酿酒酵母XDN-1188 80亿cfu/g、纳米蒙脱石230mg/g、碱性蛋白酶150U/g、葡萄糖做载体补至总量1g。
本发明同时提供所述猪用生物止泻剂在养猪行业的日常饲养和饲料中的应用。
所述猪用生物止泻剂在养猪行业日常饲养中的应用；用量及用法如下：
母猪产前2周至产后两周，拌料后撒饲，1kg/吨全价配合饲料；仔猪出生当天(越早越好)3g/头，溶解于2mL冷水中，灌服一次；仔猪7日龄5g/头，溶解于3mL冷水中，灌服一次；仔猪断奶当天10g/头，拌料，用料盘集中撒饲；仔猪断奶前7天到断奶后10天，拌料后撒饲，2kg/吨教槽料；断奶后11天至保育结束，拌料后撒饲，每吨保育料中添加生物止泻剂1kg；
所述猪用生物止泻剂也可应用于饲料中，参照日常饲养各阶段用量，与各阶段饲料混合均匀即可。
所述猪用生物止泻剂用于有腹泻症状的生长猪，使用方法如下：
1日龄～7日龄仔猪，3～4g/头，溶解于2mL水中灌服，每天一次，连用1～3天；
8日龄～断奶，4～5g/头，溶解于3mL水中灌服或拌入少量料中给饲，每天一次，连用1～3天；
保育仔猪，8～10g/头，溶解于6mL水中灌服或拌入少量料中给饲，每天一次，连用1～3天；中大猪，20～30g/头，拌入少量料中给饲，每天一次，连用1～3天。
有益效果
本发明中采用的地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母都是我国《饲料添加剂目录》中允许使用的益生菌，总的来说，有益菌具有调节动物肠道微生态平衡、抑制肠道有害菌、维护肠道健康、提高动物免疫力等作用，但其作用具有很强的菌种甚至菌株依赖性，同种益生菌不同菌株的生物作用相差甚大，功效各异，同时，益生菌之间有的具有拮抗作用。本发明采用的益生菌都是按照不同选育目标，经过长期强化选育而成，且经试验证明相互间无拮抗作用，其中，地衣芽孢杆菌DE对大肠杆菌、梭菌等致病细菌具有突出的抑制作用，而酿酒酵母XDN-1188对轮状病毒、梭菌等的抑制作用显著，枯草芽孢杆菌K018产蛋白酶、淀粉酶等消化酶的能力强。同样，选用的碱性蛋白酶也均包含在《饲料添加剂目录》中，其区别于常见蛋白酶的特点是对导致腹泻的常见病菌具有明显抑制效果，但对以上三种及肠道益生菌无抑制作用。通过破坏病原微生物肠道附着受体的蛋白结构，或病原微生物凝集素的结构，使病原菌无法与肠道结合，保护肠道免受病原菌侵害；修复因病原菌侵害导致的肠道细胞渗透性改变；破坏病原菌的细胞壁结构，具有一定杀菌和抑菌作用；还具有刺激免疫系统、促进药物吸收等作用。蒙脱石对消化道内的致病菌以及它们所产生的毒素、气体等有较强的吸附、固定作用，而纳米蒙脱石的吸附表面积更大，吸附能力更强，对各类腹泻具有良好的辅助治疗作用。实践证明，上述益生菌、碱性蛋白酶和纳米蒙脱石单独使用都不能获得理想效果，因为仔猪腹泻的发生通常是多种因素共同作用的结果，但随意将上述酶制剂和益生菌混合使用治疗效果也不佳，因为上述各有效成分的协同治疗作用不但依赖于菌株或酶品种本身，还依赖于它们之间的比例关系，试验表明，按照本发明的有效成分组成及配比制成的生物止泻剂，对消化不良、细菌、病毒和应激等因素导致的仔猪腹泻具有快速治疗效果，其创新之处就是起效快，一天见效，90％以上两天治愈，愈后不反弹，而类似产品需7天以上，且效果不确定。改变本发明的有效成分种类或超出本发明的配比范围，止泻效果均有明显下降。将本发明中的任一有效成分换为其他同类成分，效果不明显甚至无效。因此，本发明中猪用生物止泻剂的各有效成分和配比是特定范围的，是一个有机结合体，具有不可分割性。
附图说明
图1为本发明猪用生物止泻剂原料碱性蛋白酶在不同pH值下的酶活力示意图；
图2为本发明猪用生物止泻剂原料碱性蛋白酶抑菌试验结果照片；
图3为本发明猪用生物止泻剂原料碱性蛋白酶抑菌试验结果示意图。
具体实施方式
实施例1
地衣芽孢杆菌DE、枯草芽孢杆菌K018和酿酒酵母XDN-1188原菌粉的制备：
按照微生物发酵工艺，先将斜面保存的地衣芽孢杆菌DE菌种用牛肉膏蛋白胨培养基进行活化扩大培养，然后按照15mL/T的接种量，用压差法无菌接种到发酵罐中，起始pH为6.5,温度控制在34℃，发酵38小时，获得发酵液；同样将枯草芽孢杆菌K018菌种也用牛肉膏蛋白胨培养基活化扩大培养后，按照13mL/T的接种量，用压差法无菌接种到发酵罐中，起始pH为6.0,温度控制在33℃，发酵51小时，获得发酵液。将酿酒酵母XDN-1188菌种用YPD培养基培养活化后，按照12mL/T的接种量，用压差法无菌接种到发酵罐，在pH5.4,温度32℃，搅拌转速150r/min条件下发酵22小时，获得发酵液。
将地衣芽孢杆菌DE发酵液分别用膜设备和离心设备进行浓缩后，加7％质量百分比的淀粉载体，在160～170℃下进行压力喷雾干燥，获得4000亿/g的菌粉，枯草芽孢杆菌K018发酵液的处理方式同地衣芽孢杆菌DE。酿酒酵母XDN-1188发酵液经真空转鼓浓缩后，收集菌泥，加入适量载体吸附后，在36℃～42℃条件下用流化床烘干至含水量8％以下，然后进行低温粉碎，获得原菌粉。
碱性蛋白酶的制备：
将斜面保存的地衣芽孢杆菌XDM－0968经菌种活化和逐级扩大培养获得液体种子；将液体种子以7％接种量接入发酵罐，起始pH为7.0，培养温度37℃，搅拌速度150r/m，培养时间12h；然后以1-2℃/h降温速率缓慢降温至27℃，恒温培养8h；继续以1-2℃/h降温速率缓慢降温至18℃，此时，将液体种子以2％接种量追加接入发酵罐，恒温培养10h；再以1-2℃/h升温速率缓慢升温至25℃，恒温培养6h；继续以1-2℃/h升温速率缓慢升温至37℃，恒温培养10h，获得发酵液；发酵液经过滤、浓缩、精滤、干燥得固体碱性蛋白酶；
所述干燥具体为：向浓缩液中加入浓缩液重量2％的保护剂，混匀后用酶制剂专用喷雾干燥机干燥，进风温度145℃，排风温度80℃,干燥时间10s，产品水分＜5％既得；
所述保护剂由以下重量份数的原料组成:海藻糖15份，NaCl 20份，(NH4)2SO412份，半胱氨酸18份；
生物止泻剂的制备：
所述生物止泻剂包括如下组分：地衣芽孢杆菌DE 280亿cfu/g、枯草芽孢杆菌K018300亿cfu/g、酿酒酵母XDN-1188100亿cfu/g、纳米蒙脱石300mg/g、碱性蛋白酶100U/g、葡萄糖做载体补至总量1g；
将上述组分过60目筛后，按照含量准确计算并称取各种原料，然后将各种原料用混合机充分混合均匀，最终要求成品中各组分的混合变异系数小于5％。其中，益生菌原料要求符合《微生物饲料添加剂技术通则》NY/T 1444-2007，酶制剂原料要求符合《饲料用酶制剂通则》NY/T 722-2003，纳米蒙脱石为饲料级，葡萄糖为食品级。
实施例2
地衣芽孢杆菌DE、枯草芽孢杆菌K018和酿酒酵母XDN-1188原菌粉的制备：
按照微生物发酵工艺，先将斜面保存的地衣芽孢杆菌DE菌种用牛肉膏蛋白胨培养基进行活化扩大培养，然后按照13mL/T的接种量，用压差法无菌接种到发酵罐中，起始pH为6.5,温度控制在33℃，发酵40小时，获得发酵液；同样将枯草芽孢杆菌K018菌种也用牛肉膏蛋白胨培养基活化扩大培养后，按照10mL/T的接种量，用压差法无菌接种到发酵罐中，起始pH为6.0,温度控制在34℃，发酵50小时，获得发酵液。将酿酒酵母XDN-1188菌种用YPD培养基培养活化后，按照15mL/T的接种量，用压差法无菌接种到发酵罐，在pH5.2,温度33℃，搅拌转速150r/min条件下发酵24小时，获得发酵液。
将地衣芽孢杆菌DE发酵液分别用膜设备和离心设备进行浓缩后，加6％淀粉载体，在160～170℃下进行压力喷雾干燥，获得4000亿/g的菌粉，枯草芽孢杆菌K018发酵液的处理方式同地衣芽孢杆菌DE。酿酒酵母XDN-1188发酵液经真空转鼓浓缩后，收集菌泥，加入适量载体吸附后，在36℃～42℃条件下用流化床烘干至含水量8％以下，然后进行低温粉碎，获得原菌粉。
碱性蛋白酶的制备：
将斜面保存的地衣芽孢杆菌XDM－0968经菌种活化和逐级扩大培养获得液体种子；将液体种子以6％接种量接入发酵罐，起始pH为7.0，培养温度36℃，搅拌速度130r/m，培养时间15h；然后以1-2℃/h降温速率缓慢降温至25℃，恒温培养10h；继续以1-2℃/h降温速率缓慢降温至15℃，此时，将液体种子以1％接种量追加接入发酵罐，恒温培养10h；再以1-2℃/h升温速率缓慢升温至25℃，恒温培养6h；继续以1-2℃/h升温速率缓慢升温至36℃，恒温培养10h，获得发酵液；发酵液经过滤、浓缩、精滤、干燥得固体碱性蛋白酶；
所述干燥具体为：向浓缩液中加入浓缩液重量1％的保护剂，混匀后用酶制剂专用喷雾干燥机干燥，进风温度140℃，排风温度75℃,干燥时间15s，产品水分＜5％既得；
所述保护剂由以下重量份数的原料组成:海藻糖10份，NaCl 15份，(NH4)2SO415份，半胱氨酸20份；
生物止泻剂的制备：
所述生物止泻剂包括如下组分：地衣芽孢杆菌DE 300亿cfu/g、枯草芽孢杆菌K018200亿cfu/g、酿酒酵母XDN-118890亿cfu/g、纳米蒙脱石250mg/g、碱性蛋白酶120U/g、葡萄糖做载体补至总量1g；
将上述组分过60目筛后，按照含量准确计算并称取各种原料，然后将各种原料用混合机充分混合均匀，最终要求成品中各组分的混合变异系数小于5％。其中，益生菌原料要求符合《微生物饲料添加剂技术通则》NY/T 1444-2007，酶制剂原料要求符合《饲料用酶制剂通则》NY/T 722-2003，纳米蒙脱石为饲料级，葡萄糖为食品级。
实施例3
地衣芽孢杆菌DE、枯草芽孢杆菌K018和酿酒酵母XDN-1188原菌粉的制备：
按照微生物发酵工艺，先将斜面保存的地衣芽孢杆菌DE菌种用牛肉膏蛋白胨培养基进行活化扩大培养，然后按照10mL/T的接种量，用压差法无菌接种到发酵罐中，起始pH为6.5,温度控制在35℃，发酵36小时，获得发酵液；同样将枯草芽孢杆菌K018菌种也用牛肉膏蛋白胨培养基活化扩大培养后，按照15mL/T的接种量，用压差法无菌接种到发酵罐中，起始pH为6.0,温度控制在32℃，发酵53小时，获得发酵液。将酿酒酵母XDN-1188菌种用YPD培养基培养活化后，按照10mL/T的接种量，用压差法无菌接种到发酵罐，在pH5.6,温度33℃，搅拌转速150r/min条件下发酵24小时，获得发酵液。
将地衣芽孢杆菌DE发酵液分别用膜设备和离心设备进行浓缩后，加8％淀粉载体，在160～170℃下进行压力喷雾干燥，获得4000亿/g的菌粉，枯草芽孢杆菌K018发酵液的处理方式同地衣芽孢杆菌DE。酿酒酵母XDN-1188发酵液经真空转鼓浓缩后，收集菌泥，加入适量载体吸附后，在36℃～42℃条件下用流化床烘干至含水量8％以下，然后进行低温粉碎，获得原菌粉。
碱性蛋白酶的制备：
将斜面保存的地衣芽孢杆菌XDM－0968经菌种活化和逐级扩大培养获得液体种子；将液体种子以8％接种量接入发酵罐，起始pH为7.0，培养温度38℃，搅拌速度180r/m，培养时间10h；然后以1-2℃/h降温速率缓慢降温至30℃，恒温培养10h；继续以1-2℃/h降温速率缓慢降温至15℃，此时，将液体种子以1％接种量追加接入发酵罐，恒温培养8h；再以1-2℃/h升温速率缓慢升温至25℃，恒温培养8h；继续以1-2℃/h升温速率缓慢升温至38℃，恒温培养10h，获得发酵液；发酵液经过滤、浓缩、精滤、干燥得固体碱性蛋白酶；
所述干燥具体为：向浓缩液中加入浓缩液重量3％的保护剂，混匀后用酶制剂专用喷雾干燥机干燥，进风温度150℃，排风温度85℃,干燥时间5s，产品水分＜5％既得；
所述保护剂由以下重量份数的原料组成:海藻糖20份，NaCl 15份，(NH4)2SO415份，半胱氨酸20份；
生物止泻剂的制备：
所述生物止泻剂包括如下组分：地衣芽孢杆菌DE 150亿cfu/g、枯草芽孢杆菌K018350亿cfu/g、酿酒酵母XDN-118880亿cfu/g、纳米蒙脱石230mg/g、碱性蛋白酶150U/g、葡萄糖做载体补至总量1g；
将上述组分过60目筛后，按照含量准确计算并称取各种原料，然后将各种原料用混合机充分混合均匀，最终要求成品中各组分的混合变异系数小于5％。其中，益生菌原料要求符合《微生物饲料添加剂技术通则》NY/T 1444-2007，酶制剂原料要求符合《饲料用酶制剂通则》NY/T 722-2003，纳米蒙脱石为饲料级，葡萄糖为食品级。
试验例1
碱性蛋白酶的抑菌试验
1.碱性蛋白酶液的准备
用0.85％灭菌生理盐水将地衣芽孢杆菌XDM－0968发酵生产的碱性蛋白酶溶解稀释成1000U/mL的酶液备用；
2.指示菌的准备
将大肠杆菌O157接种至LB液体培养基中，37℃培养至对数生长期，如果菌液浓度高，用无菌生理盐水调整菌液浓度为1×108CFU/mL(菌液OD660＝0.1)，混匀，备用。
3.抑菌试验
将活化好的指示菌菌悬液分别取100μL均匀涂布到LB固体平板上，均匀放置牛津杯2个，每个牛津杯分别加入250μL碱性蛋白酶液样品。平板置于37℃培养12h，取出平板，用游标卡尺测量抑菌圈直径。
试验结果：碱性蛋白酶对大肠杆菌O157的抑菌圈直径大于22mm。
试验例2
河北涿州大农生猪饲养场，存栏500头，2014年8月出现15公斤左右腹泻仔猪38头，长期粪便不成形，严重影响生长速度，用中药调理及西药治疗均无效果，按照每头猪8g/天，用25mL温水将实施例1猪用生物止泻剂溶解摇匀，一次性灌服，一天后见效，连续使用2天痊愈，均没反复且长势明显提高。
试验例3
山东菏泽猪场存栏200头母猪，2014年9月份出现保育猪不明原因腹泻，水样灰黑色，共计24头，平均体重约35斤，用240g实施例2猪用生物止泻剂集中拌料治疗，一天一次，使用第2天98％停止腹泻，第3天全部停止腹泻，仔猪明显变干净。
试验例4
山东夏津鑫盈猪场存栏300头母猪，2014年10月断奶仔猪出现黄色粪便腹泻，平均体重8公斤，共计40头，按照每头猪10g/天，用30mL温水将实施例3猪用生物止泻剂溶解摇匀，一次性灌服，一天后见效，连续使用2天96％痊愈，连续使用3天100％痊愈无反复。
Claims (9)
1.一种猪用生物止泻剂，原料组成包括如下组分：地衣芽孢杆菌DE 150～300亿cfu/g、枯草芽孢杆菌K018 200～400亿cfu/g、酿酒酵母XDN-1188 50～150亿cfu/g、纳米蒙脱石200～300mg/g、碱性蛋白酶50～150U/g、葡萄糖做载体补至总量1g；
所述地衣芽孢杆菌DE保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6102；
所述枯草芽孢杆菌K018保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6101；
所述酿酒酵母XDN-1188保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11355；
所述碱性蛋白酶由地衣芽孢杆菌XDM－0968发酵制备；所述地衣芽孢杆菌XDM－0968保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11353。
2.根据权利要求1所述猪用生物止泻剂，其特征在于，原料组成包括如下组分：地衣芽孢杆菌DE 200～300亿cfu/g、枯草芽孢杆菌K018 300～350亿cfu/g、酿酒酵母XDN-1188 80～120亿cfu/g、纳米蒙脱石250～300mg/g、碱性蛋白酶100～150U/g、葡萄糖做载体补至总量1g。
3.根据权利要求1所述猪用生物止泻剂，其特征在于，原料组成包括如下组分：地衣芽孢杆菌DE 280亿cfu/g、枯草芽孢杆菌K018 300亿cfu/g、酿酒酵母XDN-1188 100亿cfu/g、纳米蒙脱石300mg/g、碱性蛋白酶100U/g、葡萄糖做载体补至总量1g。
4.根据权利要求1所述猪用生物止泻剂，其特征在于，原料组成包括如下组分：地衣芽孢杆菌DE 300亿cfu/g、枯草芽孢杆菌K018 200亿cfu/g、酿酒酵母XDN-1188 90亿cfu/g、纳米蒙脱石250mg/g、碱性蛋白酶120U/g、葡萄糖做载体补至总量1g。
5.根据权利要求1所述猪用生物止泻剂，其特征在于，原料组成包括如下组分：地衣芽孢杆菌DE150亿cfu/g、枯草芽孢杆菌K018 350亿cfu/g、酿酒酵母XDN-1188 80亿cfu/g、纳米蒙脱石230mg/g、碱性蛋白酶150U/g、葡萄糖做载体补至总量1g。
6.根据权利要求1所述猪用生物止泻剂，其特征在于，所述碱性蛋白酶制备方法包括如下步骤：将斜面保存的地衣芽孢杆菌XDM－0968经菌种活化和逐级扩大培养获得液体种子；将液体种子以6-8％接种量接入发酵罐，起始pH为7.0，培养温度36-38℃，搅拌速度130-180r/m，培养时间10-15h；然后以1-2℃/h降温速率缓慢降温至25-30℃，恒温培养8-10h；继续以1-2℃/h降温速率缓慢降温至15-20℃，此时，将液体种子以1-2％接种量追加接入发酵罐，恒温培养8-10h；再以1-2℃/h升温速率缓慢升温至25-30℃，恒温培养6-8h；继续以1-2℃/h升温速率缓慢升温至36-38℃，恒温培养8-10h，获得发酵液；上述接种量单位为：质量百分比；地衣芽孢杆菌XDM－0968发酵液经过滤、浓缩、精滤、干燥得固体碱性蛋白酶。
7.根据权利要求6所述猪用生物止泻剂，其特征在于，所述干燥为：干燥前，向精滤后的浓缩液中加入浓缩液重量1-3％的保护剂，混匀后用酶制剂专用喷雾干燥机干燥，进风温度140-150℃，排风温度75-85℃,干燥时间5-15s，产品水分＜5％即得；
所述保护剂由以下重量份数的原料组成:海藻糖10-20份，NaCl 15-25份，(NH4)2SO410-15份，半胱氨酸15-20份。
8.权利要求1-7任一所述猪用生物止泻剂的制备方法，将所述猪用生物止泻剂的所有组分原料过60目筛后，按照含量准确计算并称取各种原料，然后将各种原料用混合机充分混合均匀，使所述猪用生物止泻剂中各组分的混合变异系数小于5％。
9.根据权利要求8所述猪用生物止泻剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：按照常规活化扩培方法，将斜面保存的地衣芽孢杆菌DE菌种用牛肉膏蛋白胨培养基活化扩大培养，然后按照10～15mL/T培养基的接种量，用压差法无菌接种到发酵罐中，起始pH为6.5,温度控制在33℃～35℃，发酵36～40小时，获得发酵液；将枯草芽孢杆菌K018菌种用牛肉膏蛋白胨培养基活化扩大培养后，按照10～15mL/T培养基的接种量，用压差法无菌接种到发酵罐中，起始pH为6.0,温度控制在32℃～34℃，发酵50～53小时，获得发酵液；将酿酒酵母XDN-1188菌种用YPD培养基培养活化后，按照10～15mL/T培养基的接种量，用压差法无菌接种到发酵罐，在pH5.2～5.6,温度30℃～33℃，搅拌转速150r/min条件下发酵20～24小时，获得发酵液；
将斜面保存的地衣芽孢杆菌XDM－0968经菌种活化和逐级扩大培养获得液体种子；将液体种子以6-8％接种量接入发酵罐，起始pH为7.0，培养温度36-38℃，搅拌速度130-180r/m，培养时间10-15h；然后以1-2℃/h降温速率缓慢降温至25-30℃，恒温培养8-10h；继续以1-2℃/h降温速率缓慢降温至15-20℃，此时，将液体种子以1-2％接种量追加接入发酵罐，恒温培养8-10h；再以1-2℃/h升温速率缓慢升温至25-30℃，恒温培养6-8h；继续以1-2℃/h升温速率缓慢升温至36-38℃，恒温培养8-10h，获得发酵液；上述接种量单位为：质量百分比；
步骤二：将地衣芽孢杆菌DE发酵液分别用膜设备和离心设备进行浓缩后，以浓缩后发酵液质量计加6％～8％淀粉载体，在160～170℃下进行压力喷雾干燥，获得4000亿/g的菌粉，枯草芽孢杆菌K018发酵液的处理方式同地衣芽孢杆菌DE；酿酒酵母XDN-1188发酵液经真空转鼓浓缩后，收集菌泥，以浓缩后发酵液质量计加入1％～2％载体吸附后，在36℃～42℃条件下用流化床烘干至含水量8％以下，然后进行低温粉碎，获得原菌粉；地衣芽孢杆菌XDM－0968发酵液经过滤、浓缩、精滤、干燥得固体碱性蛋白酶。
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