CN101253934A - 奶牛饲料用复合微生物添加剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种奶牛饲料用复合微生物添加剂，该微生物添加剂含有纳豆枯草芽孢杆菌、屎肠球菌和酿酒酵母菌的发酵产物混合物，细菌总数为10⁹cfu/g以上。本发明所述的复合微生物制剂，三种微生物产生协同作用，经过长期反复的动物实验显示，可以显著提高饲喂奶牛的产奶量，且产奶中乳脂率有显著提高，乳蛋白产量也显著增高，奶牛泌乳期体细胞数明显下降，可以使奶牛患乳房炎和隐形乳房炎的发病几率减少，奶牛机体的自身免疫能力明显增强。本发明成本低廉，效果显著，具有很好的市场应用前景。

Description

奶牛饲料用复合微生物添加剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种微生物制剂，具体地说是一种奶牛用微生物制剂及其制备方法，属于微生物领域。

背景技术

乳酸菌是一类以分解糖类产生乳酸的菌的总称、此类制剂应用最早、最广泛，种类繁多。通常为厌氧或者兼性氧生长，缺点是不耐高温，经80℃处理5min，损失70％～80％。在颗粒饲料制备过程中损失率较大。但耐酸，在pH值为3.0～4.5时仍可生长，对胃中的酸性环境有一定的耐受性。在动物体内通过生物拮抗、降低pH值阻止和抑制致病菌的侵入和定植，降解亚硝氨、氨、吲哚、粪臭素等有害物质，维持肠道中正常的生态平衡。活菌体内和代谢产物中含有较高的超氧化物歧化酶(SOD)，能增强动物的体液免疫和细胞免疫。也能够产生氨基酸、淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶等消化酶。乳酸菌在动物肠道的定植具有特异性。研究发现乳酸菌在在哺乳和断乳期动物中使用能够防治腹泻，维持肠道正常生态平衡。目前，主要应用的乳酸菌主要是来源于乳酸杆菌属、乳酸链球菌属和双歧杆菌属的近30种的微生物。

饲用酵的种类丰富，主要有热带假丝酵母、产朊假丝酵母、啤酒酵母、红色酵母等。饲用酵母对动物体的作用分为以下几点：1)促生长特性..酵母细胞富含蛋白质、核酸、维生素和多种酶。具有提供养分、增加饲料适口性，加强消化吸收等功能，并可提高动物饲料的利用率。由于酵母丰富的营养组成，因此饲用酵母可以部分或者全部替代饲料中的鱼粉；2)改善肠道微生态环境。酵母菌是肠道有益微生物，研究发现饲料中添加酵母可促进瘤胃微生物的生长和活性，使厌氧菌总数上升、纤维素发酵菌数量明显上升；3)促进动物体免疫功能.增强抗病力。酵母细胞壁的主要成分是甘露聚糖、葡聚糖，研究发现甘露聚糖可增强吞噬细胞的活性。在火鸡口粮中添加甘露聚糖可使血清中IgG和肝脏的lgA浓度提高25％；4)可直接和肠道病原体结合，中和肠道中毒素。酵母中的甘露聚糖可以和肠道病原菌的纤毛结合，阻止病原菌在肠道粘膜中的定植。试验还发现甘露聚糖可以降低畜禽动物粪便中沙门氏菌、大肠杆菌的含量。

芽抱杆菌是一类好氧菌，在一定条件下产生芽孢，和常用的乳酸菌等益生菌相比，芽孢杆菌具有以下优点和特点：1)具有耐高温、耐酸碱、耐压等特点，能够耐受颗粘饲科加工的影响；2)在贮藏过程以孢子形式存在，不消耗饲料的营养成分，可以保持饲料的质量：3)进入肠道后，在肠道上部迅速复活.复活率接近100％；4)芽孢杆菌能够产生蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等多种氨基酸；5)芽孢杆菌可以消耗大量的氧，维持肠道厌氧环境，抑制致病菌的生长，维持肠道正常生态平衡；6)具有平衡和稳定乳酸杆菌的作用。目前使用的菌株有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、东洋芽孢杆菌(Bacillus toyol)等。

目前，微生态制剂在推广应用方面的主要问题是产品加工处理后稳定性差，细菌易失活，功效降低。其原因除了和产品的质量有关外，还应考虑该产品是否能平衡肠道的生态系统。现有微生物制剂多针对禽畜类，如鸡、猪等，其种群肠道菌群的生成是长期进化的结果。现有微生物饲料添加剂并没有专门针对奶牛的，由于一种适于某类动物的活菌制剂不一定适于另一类动物，因此，禽畜类微生物添加剂对奶牛饲养并不能起到理想的效用。目前针对奶牛的微生物添加剂大部分为单一微生物添加剂，虽然对于奶牛的消化系统和吸收有一定益处，但是功效单

一，效果不理想。

目前急需一种可以增强奶牛胃肠功能，同时可以保证饲料用微生物添加剂稳定性，提高奶牛产奶量和奶质的奶牛饲料用微生物添加剂。

发明内容

本发明人经过长期反复试验发现，动物生产饲喂饲料中采用复合微生物添加剂比单一微生物添加剂具有更好的作用效果，原因在于复合微生物制剂具有协同作用，不同微生物在动物胃肠道的作用机理不同，能起到互补长短，互相促进的作用，其应用效果比单一菌剂更显著，更稳定高产，绝对适用于奶牛应用。

本发明的目的在于提供一种能够有效提高奶牛产奶量，对奶成分中的乳脂率和乳蛋白等成分有显著提高的奶牛饲料用微生物添加剂。

本发明的另一目的在于提供一种上述奶牛饲料用微生物添加剂的制备方法。

本发明用于制备纳豆枯草芽孢杆菌的菌种为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，其保藏编号为CGMCC No.2420，分离自纳豆；屎肠球菌菌种为屎肠球菌(Enterococcus faecium)，其保藏编号为CGMCC No.2419；所述酿酒酵母菌菌种为酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，其保藏编号为CGMCC No.2418。上述三株菌种均已于2008年3月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。

为实现上述目的，本发明采用如下具体技术方案：

一种奶牛饲料用复合微生物添加剂，其中，该微生物添加剂含有纳豆枯草芽孢杆菌、屎肠球菌和酿酒酵母菌的发酵产物的混合物。

上述的一种奶牛饲料用复合微生物添加剂，其中，所述微生物添加剂还含有载体，所述载体为豆粕、玉米粉和红薯淀粉中的一种或几种，优选豆粕，高压熟化为佳。

上述发酵产物混合物为含有纳豆枯草芽孢杆菌活菌的发酵菌液、含有屎肠球菌活菌的发酵菌液和含有酿酒酵母菌活菌的发酵菌液的混合菌液，各发酵菌液之间的体积比为0.5～1.5∶1～2∶1～2；最佳为1∶1∶1。

上述混合菌液与载体的体积重量(v/w)比为0.2～4，最佳比例为1∶1。

上述纳豆枯草芽孢杆菌、屎肠球菌和酿酒酵母菌的发酵菌液菌液浓度分别为＞10⁹cell/mL、＞10⁸cell/mL和＞10⁹cell/mL。

上述复合微生物添加剂中细菌总数为10⁹cfu/g以上，所述复合微生物制剂为混合发酵菌液和载体按比例配制后的成品。

一种上述奶牛饲料用复合微生物添加剂的制备方法，其具体制备步骤如下：

(1)发酵菌液的制备：

纳豆菌液的制备：从PDA斜面培养基上取两环活化纳豆枯草芽孢杆菌菌种，接入装有30mL种子培养基的100mL锥形瓶，30℃、180r/min培养24h；所述种子培养基成分：蔗糖1％，大豆蛋白胨1％，NaCl 0.5％，Na₂HPO₄0.6％，NaH₂PO₄0.1％，CaCl₂0.02％，MgSO₄0.05％，pH值调至7；取2％(v/v)种子液加入装有30mL发酵培养基的100mL锥形瓶中，37℃、180r/min培养24h，所述发酵培养基成分：葡萄糖1％，蔗糖1％，大豆蛋白胨6％，胰蛋白胨4％，Na₂HPO₄0.6％，NaH₂PO₄0.1％，CaCl₂0.02％，MgSO₄0.05％，pH值调至7；培养后的发酵菌液稀释后进行显微镜血球计数板计数；菌液浓度＞10⁹cell/mL，置于4℃保存备用；

PDA斜面培养基成分：葡萄糖2％，蛋白胨1％，酵母膏0.5％，琼脂1.5～2.0％。

屎肠球菌菌液的制备：从MRS琼脂培养基中取两环活化屎肠球菌菌种，接种入装有30mL MRS液体培养基的100mL锥形瓶，37℃、厌氧培养24h制得种子液，取2％(V/V)种子液加入装有30mL MRS液体培养基的100mL锥形瓶，37℃、厌氧培养24h制得屎肠球菌发酵菌液；该发酵液稀释后进行显微镜血球计数板计数，菌液浓度＞10⁸cell/mL，置于4℃保存备用；

MRS琼脂培养基成分：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，K2HPO42g，乙酸钠5g，MgSO40.2g，MnSO40.05g，吐温-801g，柠檬酸二铵2g，琼脂20g，pH 6.2～6.4，121℃灭菌15min。

酿酒酵母菌菌液的制备：从YPD琼脂培养基中取两环活化酿酒酵母菌菌种，接种入装有30mL YPD液体培养基的100mL锥形瓶，37℃培养24h制得种子液，取2％(V/V)种子液加入装有30mL YPD液体培养基的100mL锥形瓶，37℃培养24h制得屎肠球菌发酵菌液，该发酵菌液稀释后进行显微镜血球计数板计数，菌液浓度＞10⁹cell/mL，置于4℃保存备用；

YPD琼脂培养基成分：葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏5g，琼脂15～20g，水1000mL，pH自然，121℃灭菌，15min。

(2)将上述制备的纳豆枯草芽孢杆菌、屎肠球菌和酿酒酵母菌的发酵菌液按体积比为0.5～1.5∶1～2∶1～2的比例，最佳为1∶1∶1的比例混合均匀制成混合菌液。

上述的一种奶牛饲料用复合微生物添加剂的制备方法，其还包括下述步骤：

(3)高压灭菌熟化载体，121℃，30min；

(4)以比例为0.2～4(v/w)，最佳为1∶1(v/w)的比例将步骤(2)制备的混合菌液添加到熟化后的载体中混合均匀。

上述的一种奶牛饲料用复合微生物添加剂的制备方法，其中，步骤(1)中所述纳豆枯草芽孢杆菌菌种可为商业购买菌种，最佳为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，其保藏编号为CGMCC No.2420，分离自纳豆；所述屎肠球菌菌种可为商业购买菌种，最佳为屎肠球菌(Enterococcus faecium)，其保藏编号为CGMCCNo.2419；所述酿酒酵母菌菌种可为商业购买菌种，最佳为酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，其保藏编号为CGMCC No.2418。

上述的一种奶牛饲料用复合微生物添加剂的制备方法，其中，所述载体为豆粕、玉米粉和红薯淀粉中的一种或几种。

经上述方法制备得出的奶牛饲料用微生物添加剂中的细菌总数为10⁹cfu/g以上。

上述奶牛饲用微生物添加剂的使用方法为按照奶牛日粮的0.05％～0.1％(wt％)添加饲喂，每天饲喂1次。

本发明所用的术语“发酵菌液”、“活菌”、“发酵产物”具有本领域技术人员熟知且承认的含义。所述发酵菌液是通过适合的环境培养本发明所述的纳豆枯草芽孢杆菌、屎肠球菌和酿酒酵母菌，使其生长至一定细菌浓度获得的。所述活菌是指通过生物法培养纳豆枯草芽孢杆菌、屎肠球菌和酿酒酵母菌得到的具有生活能力的菌体。所述发酵产物为微生物经一定环境发酵后所得的菌体、酶及其代谢产物。

只要按照本发明公开的制备方法的具体步骤制备各发酵菌液，并保证最终菌液中活菌浓度即可以达到本发明所述有益效果，并无任何随机性，所述各菌种均可通过购买获得，使用本发明保藏菌种效果更佳。

本发明的优点与效益：

本发明所述的复合微生物制剂，其活性成分是纳豆枯草芽孢杆菌、屎肠球菌和酿酒酵母菌，三种微生物产生协同作用，经过长期反复的动物实验显示，在奶牛饲料中添加本发明所述的复合微生物添加剂后可以显著提高饲喂奶牛的产奶量。在对饲喂奶牛牛奶乳品质指标的观察中发现，饲料中添加本发明所述复合微生物添加剂后，饲喂奶牛产奶中乳脂率有显著提高，乳蛋白产量也显著增高。此外，饲喂奶牛饲料中添加本发明复合微生物添加剂后，奶牛泌乳期体细胞数明显下降。体细胞数是乳房健康程度的指示，乳中体细胞增多是机体的一种抵御反应，乳房的感染越严重，体细胞数也就越高。因此，本发明奶牛饲料用复合微生物添加剂可以使奶牛患乳房炎和隐形乳房炎的发病几率减少，奶牛机体的自身免疫能力明显增强。同时，奶牛日粮中添加本发明所述复合微生物添加剂后，可以有效地提高机体谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量，对清除机体脂类氢过氧化物、有机氢过氧化物、H₂O₂，协同维生素E保护细胞免受脂质过氧化损害有一定的作用，脂质过氧化代谢产物丙二醛(MDA)显著降低。

具体实施方式

实施例1

一、材料及来源：

1、纳豆枯草芽孢杆菌菌种为保藏编号为CGMCC No.2420的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)；

2、屎肠球菌菌种为保藏编号为CGMCC No.2419的屎肠球菌(Enterococcus faecium)；

3、酿酒酵母菌菌种为保藏编号为CGMCC No.2418的酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)；

4、豆粕来源：中畜阳光饲料公司。

二、奶牛饲料用复合微生物添加剂的制备

(1)发酵菌液的制备：

纳豆枯草芽孢杆菌菌液的制备：从PDA斜面培养基上取两环活化纳豆枯草芽孢杆菌菌种，其保藏编号为CGMCC No.2420，接人装有30mL种子培养基(蔗糖1％，大豆蛋白胨1％，NaCl 0.5％，Na₂HPO₄0.6％，NaH₂PO₄0.1％，CaCl₂ 0.02％，MgSO₄0.05％，pH值调至7)的100mL锥形瓶，30℃、180r/min培养24h。取2％(v/v)种子液加入装有30mL发酵培养基(葡萄糖1％，蔗糖1％，大豆蛋白胨6％，胰蛋白胨4％，Na₂HPO₄ 0.6％，NaH₂PO₄ 0.1％，CaCl₂ 0.02％，MgSO₄ 0.05％，pH值调至7)的100mL锥形瓶中，37℃、180r/min培养24h。稀释一定倍数后进行显微镜血球计数板计数。菌液浓度＞10⁹·mL^-1，置于4℃保存备用。

PDA斜面培养基成分：葡萄糖2％，蛋白胨1％，酵母膏0.5％，琼脂1.5～2.0％。

屎肠球菌菌液的制备：从MRS琼脂培养基中取两环活化屎肠球菌菌种其保藏编号为CGMCC No.2419，接种入装有30mL MRS液体培养基的100mL锥形瓶，37℃、厌氧培养24h制得种子液，取2％(V/V)种子液加入装有30mLMRS液体培养基的100mL锥形瓶，37℃、厌氧培养24h制得屎肠球菌发酵菌液，即为试验用菌液。该发酵液稀释一定倍数后进行显微镜血球计数板计数，菌液浓度＞10⁸·mL^-1，置于4℃保存备用。

MRS琼脂培养基成分：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，K2HPO42g，乙酸钠5g，MgSO40.2g，MnSO40.05g，吐温-801g，柠檬酸二铵2g，琼脂20g。pH 6.2～6.4，121℃灭菌15min。

酿酒酵母菌菌液的制备：从YPD琼脂培养基中取两环活化酿酒酵母菌菌种其保藏编号为CGMCC No.2418，接种入装有30mL YPD液体培养基的100mL锥形瓶，37℃培养24h制得种子液，取2％(V/V)种子液加入装有30mLYPD液体培养基的100mL锥形瓶，37℃培养24h制得屎肠球菌发酵菌液，即为试验用菌液。该发酵液稀释一定倍数后进行显微镜血球计数板计数，菌液浓度稀释＞10⁹·mL^-1，置于4℃保存备用。

YPD琼脂培养基成分：葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏5g，琼脂15～20g，水1000mL，pH自然，121℃灭菌，15min。

(2)纳豆枯草芽孢杆菌、屎肠球菌和酿酒酵母菌的发酵菌液按体积比为1∶1∶1的比例混合均匀制成混合菌液。经实验证实，在0.5～1.5∶1～2∶1～2的比例范围内配制混合菌液均可达到上述有益效果，实施例仅给出最佳配比，其他值不一一赘述。

(3)高压灭菌熟化载体，如豆粕、玉米粉或红薯淀粉，121℃，30min。

(4)以1∶1(v/w)的比例将所述混合菌液添加到豆粕载体中混合均匀，65℃烘烤16h，即制备出奶牛饲料用微生物添加剂。经实验证实混合菌液和豆粕载体的体积重量比在0.2～4范围内均有很好的效果，最佳实施例仅给出最佳配比，其他配比不一一赘述。

经上述方法制备得出的奶牛饲料用微生物添加剂中的细菌总数为10⁹cfu/g以上。

三、奶牛饲料用复合微生物添加剂在奶牛饲喂中的应用

1、奶牛来源：北京安定棚沨奶牛养殖场选择奶牛胎次1～4胎次、泌乳阶段为泌乳前期和中期、产奶量20～30kg、体重平均值为550kg泌乳奶牛70头。

2、分组：将上述奶牛随机分成5组，分别为：试验I、试验II、试验III、试验IV和对照组。

3、饲喂方式：试验奶牛每天分别饲喂精粗比1∶1混合日粮20kg，日粮组成见表1，早晚两次饲喂，自由饮水。试验I、试验II、试验III和试验IV组中分别添加有本发明实施例制备的奶牛饲料用复合微生物添加剂10g、20g、30g和40g，占饲喂日粮干物质的0.05％、0.1％、0.15％和2％，一次饲喂。试验周期为67天。所应用的基础日粮成分及营养水平见表1。

表1基础日粮的组成及其营养水平

原料Ingredients	含量Content(％DM)	营养成分Nutrient	营养水平Level
				苜蓿草粉Alfalfa hay	13.516	干物质/(kg·d-1)Dry matter	20.01
羊草Chinese wild rye	35.845	总可消化养分/％(w/w)TDN	68.09
				玉米Corn	27.844	粗料比例/％(w/w)The proportion of forage	50.00
小麦麸Wheat bran	11.202	精料比例/％(w/w)The proportion of concentrate	50.00
				大豆粕Soybean meal	9.69	产奶净能/(MJ·kg-1)NEL	6.19
石粉Calcium carbonate	0.732	日粮粗蛋白质/(g·kg-1)CP	1.415
				磷酸氢钙Calcium phosphate dibasic	0.229	Ca/(g·kg-1)	0.063
食盐Sodium chloride	0.229	P/(g·kg-1)	0.038
				小苏打Saleratus，	0.457	NDF/(g·kg-1)	4.225
维生素预混料1Premix of vitamine	0.009	Na/(g·kg-1)	0.033
				微量元素预混料2Premix of microelement	0.046	Cl/(g·kg-1)	0.047

注：1.每千克维生素预混料所提供成分：维生素A 200KIU，维生素D3 5000IU，维生素B3 10000mg。

2.每千克微量元素预混料所提供成分：铜(Cu)1600mg，铁(Fe)2500mg，锌(Zn)8000mg，锰(Mn)2500mg，碘(I)100mg，硒(Se)20mg。

3、观察内容：试验奶牛的奶产量、乳品质指标、奶牛泌乳期体细胞数和血液指标。

5、实验结果及分析：

(1)复合微生物制剂对奶牛产奶量的影响见表2

在本试验中，由表2可以看出，与对照组相比，给早期泌乳奶牛饲喂不同水平的复合微生物制剂后，试验I、II产奶量明显提高，差异显著(P＜0.05)，试验III(25.49kg)、试验IV(25.84kg)与对照组(24.19kg)相比，分别提高了5.37％、6.28％，但差异不显著(P＞0.05)，试验组之间差异不显著(P＞0.05)。

饲喂复合微生物制剂的奶牛4％校正乳产量与对照组相比分别提高了16.56％(试验I)、11.39％(试验II)、11.30％(试验III)、18.31％(试验IV)，差异显著(P＜0.05)，试验IV与对照比差异极显著(P＜0.01)，但试验组各处里之间无差异显著性。

表2复合微生物添加剂剂对奶牛产奶量、乳成分的影响

注：同行肩标相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，相邻字母表示差异显著(P＜0.05)，相间字母表示差异极显著(P＜0.01)。

(2)奶牛饲料用复合微生物添加剂对奶成分的影响见表2

从上述表2可以看出，在早期泌乳奶牛日粮中添加复合微生物制剂对牛奶中乳脂率均有不同程度的提高，试验I、II、III与对照组相比虽有一定的提高，但差异不显著(P＞0.05)，试验IV提高最为明显(19.34％)，显著高于对照组(P＜0.05)；对乳脂产量而言，与对照组相比试验I、II、III均有提高，差异显著(P＜0.05)，试验IV最为明显(P＜0.01)，但试验组之间无差异显著性。在整个试验过程中，牛乳中乳蛋白含量相对比较稳定，试验组与对照组相比有很小幅度的下降，差异不显著(P＞0.05)，但试验组乳蛋白产量均高于对照组，试验I、II最为明显，差异显著(P＜0.05)，试验组处理之间差异不显著(P＞0.05)。在整个试验期，牛乳中乳糖含量也相对比较稳定，与对照组相比，试验组分别提高了0.09、0.01、0.08、0.09个百分点，差异不显著(P＞0.05)。乳中总固形物除试验III组低于对照组外，其余各组均高于对照组，但各处理组之间差异都不显著(P＞0.05)。试验结果表明，在早期泌乳奶牛日粮中添加复合微生物制剂可提高乳脂率，对乳脂产量和乳蛋白产量的提高也有明显的作用。

(3)奶牛饲料用复合微生物添加剂对奶牛泌乳期体细胞数的影响见表2

由上述表2可知，与对照组相比试验组牛乳中体细胞数(SCC)明显下降，差异显著(P＜0.05)，但试验组处理之间无显著性差异(P＞0.05)。体细胞数是乳房健康程度的指示，乳中体细胞增多是机体的一种抵御反应，乳房的感染越严重，体细胞数也就越高。饲喂复合微生物制剂对奶牛泌乳期体细胞的降低有明显的作用。体细胞数降低，奶牛患乳房炎和隐形乳房炎的发病几率减少，且奶牛机体的自身免疫能力明显增强。

(4)添加复合微生物制剂对血液生化指标的影响见表3

表3复合微生物添加剂对奶牛血液生化指标的影响

注：同行肩标相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，相邻字母表示差异显著(P＜0.05)，相间字母表示差异极显著(P＜0.01)。

由表3可以看出，奶牛日粮中添加不同水平复合微生物制剂引起血液中超氧化物歧化酶(SOD)含量的变化，试验I、II血液中SOD的含量与对照组相比分别提高了4.42％、5.39％，差异不显著(P＞0.05)，试验III与对照组相比提高了11.55％，差异显著(P＜0.05)，试验IV提高了11.98％，差异极显著(P＜0.01)。试验组比对照组血液中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量分别提高了9.72％、5.94％、4.88％、5.43％，差异不显著(P＞0.05)。血液中丙二醛(MDA)的含量随着复合微生物制剂添加量的增加呈递减趋势，显著低于对照组(P＜0.05)。血液中SOD、GSH-Px、MDA的含量在试验组各处理之间均无差异显著性。结果表明，饲喂复合微生物制剂，可以有效地提高机体谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量，对清除机体脂类氢过氧化物、有机氢过氧化物、H2O2，协同维生素E保护细胞免受脂质过氧化损害有一定的作用，脂质过氧化代谢产物丙二醛(MDA)显著降低。

本发明奶牛饲料用复合微生物添加剂与单一微生物添加剂效果比较：

复合微生物制剂由多种菌复合配制而成，能适应多种条件和宿主，具有促进生长、提高饲料转化率、调整正常菌群平衡、提高免疫力等多种功效。相对于单一微生物添加剂而言，复合微生物制剂对奶牛生产性能的促进作用效果更佳。据刘飞等(2006)报道，饲喂添加乳酸茵的玉米青贮饲料对奶牛的产奶量没有显著影响，虽然牛乳中蛋白质和非脂乳固体的含量有小幅提高，而对乳脂肪的含量没有影响。Wallace等(1993)综合18个研究结果后报道，饲喂酵母培养物平均产奶量提高7.8％；本领域实验人员在泌乳牛日粮中添加酵母菌培养物，产奶量平均提高7.8％。从瑞士进口的“环保乐”Biogreen，每克含活菌约2×10⁹(乳杆菌7×10⁹/g、枯草杆菌7×10⁹/g、链球菌6×10⁹/g)。实验人员用上述环保乐制剂，通过对泌乳前期60头奶牛饲喂50天的试验，结果表明，试验组比对照组每头奶牛增奶量为1.76％，而乳脂率没有下降反而略有升高。本发明产品在奶牛上的实际应用效果显示，本发明复合微生物添加剂可显著提高标准奶量最高达18.31％，提高乳脂率最高达19.34％，在提高奶量和乳脂率的同时可降低奶牛的体细胞数，证明了本发明奶牛饲料用复合微生物添加剂比较现有单一制剂的应用效果更为显著，并不是简单的叠加的效果，且明显优于现有复合微生物添加剂。

Claims (10)

1、一种奶牛饲料用复合微生物添加剂，其特征在于，该微生物添加剂含有纳豆枯草芽孢杆菌、屎肠球菌和酿酒酵母菌的发酵产物混合物，细菌总数为10⁹cfu/g以上。

2、根据权利要求1所述的一种奶牛饲料用复合微生物添加剂，其特征在于，所述微生物添加剂还含有载体，所述载体为豆粕、玉米粉和红薯淀粉中的一种或几种。

3、根据权利要求2所述的一种奶牛饲料用复合微生物添加剂，其特征在于，所述载体为豆粕。

4、根据权利要求1所述的一种奶牛饲料用复合微生物添加剂，其特征在于，所述发酵产物混合物为含有纳豆枯草芽孢杆菌活菌的发酵菌液、含有屎肠球菌活菌的发酵菌液和含有酿酒酵母菌活菌的发酵菌液的混合菌液，各发酵菌液之间的体积比为0.5～1.5∶1～2∶1～2。

5、根据权利要求4所述的一种奶牛饲料用复合微生物添加剂，其特征在于，所述混合菌液与载体的体积重量比为0.2～4。

6、根据权利要求4或5所述的一种奶牛饲料用复合微生物添加剂，其特征在于，所述纳豆枯草芽孢杆菌、屎肠球菌和酿酒酵母菌的发酵菌液菌液浓度分别为＞10⁹cell/mL、＞10⁸cell/mL和＞10⁹cell/mL。

7、一种奶牛饲料用复合微生物添加剂的制备方法，其特征在于，其制备步骤如下：

(1)发酵菌液的制备：

纳豆枯草芽孢杆菌菌液的制备：从PDA斜面培养基上取两环活化纳豆枯草芽孢杆菌菌种，接入装有30mL种子培养基的100mL锥形瓶，30℃、180r/min培养24h；所述种子培养基成分：蔗糖1％，大豆蛋白胨1％，NaCl 0.5％，Na₂HPO₄0.6％，NaH₂PO₄0.1％，CaCl₂0.02％，MgSO₄0.05％，pH值调至7；取2％v/v种子液加入装有30mL发酵培养基的100mL锥形瓶中，37℃、180r/min培养24h，所述发酵培养基成分：葡萄糖1％，蔗糖1％，大豆蛋白胨6％，胰蛋白胨4％，Na₂HPO₄0.6％，NaH₂PO₄0.1％，CaCl₂0.02％，MgSO₄0.05％，pH值调至7；培养后的发酵菌液稀释至菌液浓度＞10⁹cell/mL，置于4℃保存备用；

屎肠球菌菌液的制备：从MRS琼脂培养基中取两环活化屎肠球菌菌种，接种入装有30mL MRS液体培养基的100mL锥形瓶，37℃、厌氧培养24h制得种子液，取2％V/V种子液加入装有30mL MRS液体培养基的100mL锥形瓶，37℃、厌氧培养24h制得屎肠球菌发酵菌液；该发酵液稀释至菌液浓度＞10⁸cell/mL，置于4℃保存备用；

酿酒酵母菌菌液的制备：从YPD琼脂培养基中取两环活化酿酒酵母菌菌种，接种入装有30mL YPD液体培养基的100mL锥形瓶，37℃培养24h制得种子液，取2％V/V种子液加入装有30mL YPD液体培养基的100mL锥形瓶，37℃培养24h制得屎肠球菌发酵菌液，该发酵菌液稀释至菌液浓度＞10⁹cell/mL，置于4℃保存备用；

(2)将上述制备的纳豆枯草芽孢杆菌、屎肠球菌和酿酒酵母菌的发酵菌液按体积比为0.5～1.5∶1～2∶1～2的比例混合均匀制成混合菌液。

8、根据权利要求7所述的一种奶牛饲料用复合微生物添加剂的制备方法，其特征在于，还包括下述步骤：

(3)高压灭菌熟化载体，121℃，30min；

(4)以1∶1v/w的比例将步骤(2)制备的混合菌液添加到熟化后的载体中混合均匀。

9、根据权利要求8所述的一种奶牛饲料用复合微生物添加剂的制备方法，其特征在于，所述载体为豆粕、玉米粉和红薯淀粉中的一种或几种。

10、根据权利要求7所述的一种奶牛饲料用复合微生物添加剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述纳豆枯草芽孢杆菌菌种为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，其保藏编号为CGMCC No.2420，分离自纳豆；所述屎肠球菌菌种为屎肠球菌(Enterococcus faecium)，其保藏编号为CGMCC No.2419；所述酿酒酵母菌菌种为酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，其保藏编号为CGMCC No.2418。