CN109315586A - 一种反刍动物用发酵中草药生物饲料的制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种反刍动物用发酵中草药生物饲料的制备方法与应用，其中，中草药原料配比为黄芪21～29份，茯苓18～32份，党参22～28份，艾草9～18份，甘草10～20份，通过接种米曲霉、纳豆芽孢杆菌和红发夫酵母菌好氧发酵后，再接种屎肠球菌和戊糖片球菌进行厌氧发酵制得发酵中草药生物饲料。本发明的中草药原料配伍合理，通过有益微生物分步发酵，能显著提高中草药的药效，同时产生大量的代谢产物，能改善反刍动物瘤胃环境，提高饲料利用率，减少疾病，降低饲养成本，提高经济效益。

Description

一种反刍动物用发酵中草药生物饲料的制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及了一种反刍动物用发酵中草药生物饲料的制备方法与应用。
背景技术
反刍是指进食经过一段时间以后将在胃中半消化的食物返回嘴里再次咀嚼。反刍动物就是有反刍现象的动物，通常是一些食草动物，因为植物的纤维是比较难消化的。反刍动物采食一般比较匆忙，特别是粗饲料，大部分未经充分咀嚼就吞咽进入瘤胃，经过瘤胃浸泡和软化一段时间后，食物经逆呕重新回到口腔，经过再咀嚼，再次混入唾液并再吞咽进入瘤胃的过程。反刍动物的瘤胃是一种独特的消化发酵罐，其中栖息着各种微生物，包括瘤胃细菌、厌氧真菌和瘤胃原虫，还有少数噬菌体。经过长期的适应和选择，微生物与宿主、微生物与微生物处于一种相互依赖、相互制约、微生物与微生物处于一种相互依赖、相互制约的动态平衡系统中。一方面，宿主动物为微生物提供生长环境，瘤胃中饲料及其代谢产物为微生物提供生长所需的各种养分；另一方面，瘤胃微生物降解宿主不能消化的物质，如纤维素，半纤维素等，为宿主提供能量和养分。所以，反刍动物可以将低质量的饲料转变成高质量的蛋白，并能利用非反刍动物所不能利用的高纤维饲料。通过瘤胃微生物的发酵，反刍动物能消化植物细胞壁的纤维素等多糖物质，其消化是通过瘤胃微生物对纤维物质的粘附和酶类的水解作用来实现的，瘤胃消化系统的正常是反刍动物健康的保证。
目前，反刍动物养殖中常见的疾病有酸中毒、发炎、腹泻；饲料利用率低，乳脂、乳糖含量低；导致饲养成本增加，产品品质低下的主要因素是瘤胃消化系统的不健康。2020年中国养殖行业将进入无抗时代，抗生素等药物监管力度将进一步加强，抗生素等药物不能在反刍养殖过程中进行添加，对反刍养殖具有很大的冲击，因此，寻求绿色、环保养殖的技术方案是反刍养殖行业的必经之路。
近些年，在反刍养殖过程中，有些企业添加有益微生物来调控瘤胃环境，能够提高反刍动物采食量，肉、乳等品质也得到了一定改善，但对疾病的预防和控制几乎没有这方面的报道，因为有益微生物是活体，也需要消耗一定的能量，因此，在一部分反刍养殖企业中，饲养成本没有降低，反而有一定的升高，主要原因是添加有益微生物的种类和数量与饲养环境及瘤胃系统无法精确的控制；又有些饲养企业直接在反刍饲料中添加中草药进行瘤胃系统的调控，但中草药的有效成份如：皂苷、甾醇、黄芪多糖等都在中草药植物细胞内，通过直接饲喂或经过简单的预处理都无法使中草药有效成份迅速从植物细胞中溶出，无法被反刍动物吸收利用发挥功效，因此，超出人们对中草药能预防和控制疾病的预想。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的不足，目的在于提供一种反刍动物用发酵中草药生物饲料的制备方法。本发明通过组配的复合微生物协同的生物特性，在复合微生物生长繁殖过程中将中草药植物组织分解，把较难消化利用的纤维素等物质转化成易于被反刍动物利用的糖类，同时使中草药中营养性和免疫性的有效成份析出，使中草药中所含的营养性和免疫性的有效成份能被反刍动物吸收利用，发挥最大的饲养功效；复合微生物在中草药原料上生长繁殖，通过微生物代谢及分解作用产生大量的营养性和免疫性的有益代谢产物，促进反刍动物对饲料的消化吸收，以及提高反刍动物的免疫力，提升反刍动物的养殖效益。
本发明的另一目的在于提供所述反刍动物用发酵中草药生物饲料的应用方法。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：
一种反刍动物用发酵中草药生物饲料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤（1）：分别将米曲霉、纳豆芽孢杆菌、红发夫酵母菌、屎肠球菌和戊糖片球菌接种于灭菌后的单独培养基中培养，培养结束后分别制得单独的米曲霉菌液、纳豆芽孢杆菌菌液、红发夫酵母菌菌液、屎肠球菌菌液和戊糖片球菌菌液；
步骤（2）：按重量份计，分别称取黄芪21～29份，茯苓18～32份，党参22～28份，艾草9～18份，甘草10～20份；
将所称取得到的黄芪、茯苓、党参、艾草、甘草分别粉碎至20目，再将粉碎后得到的黄芪、茯苓、党参、艾草、甘草全部加入混合机中混合均匀，制得中草药混合物；
步骤（3）：将步骤（2）中制得的中草药混合物与清水按照质量比为1:0.2进行均匀混合，制得的混合物经过灭菌处理后，冷却至35～37℃制得待发酵无菌中草药物料；
所述灭菌处理可以采用将待灭菌混合物置于灭菌锅内经115℃湿热高温处理15min；
步骤（4）：将步骤（1）中制得的米曲霉菌液、纳豆芽孢杆菌菌液、红发夫酵母菌菌液按照质量比1：1：0.5混合制得好氧发酵菌液；
将步骤（1）中制得的屎肠球菌菌液和戊糖片球菌菌液按照质量比1:1混合制得厌氧发酵菌液；
步骤（5）：将步骤（3）中制得的所述待发酵无菌中草药物料与步骤（4）中制得的所述好氧发酵菌液按照质量比1：（0.05～0.1），均匀混合，经过好氧发酵36～48小时制得发酵中草药半成品；
步骤（6）：将步骤（5）中制得的所述发酵中草药半成品与步骤（4）中制得的所述厌氧发酵菌液按照按照质量比1：（0.08～0.1），均匀混合，经过厌氧发酵60～72小时制得反刍动物用发酵中草药生物饲料。
优选的，步骤（1）中所述米曲霉、纳豆芽孢杆菌、屎肠球菌和戊糖片球菌的培养温度均为37℃，红发夫酵母菌的培养温度为25-32℃；
所述米曲霉、纳豆芽孢杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌和红发夫酵母菌的培养时间均为10-12小时；
所述米曲霉、纳豆芽孢杆菌和红发夫酵母菌培养时的摇床转速均为200-250r/min；
所述屎肠球菌和戊糖片球菌培养时的摇床转速均为30-50r/min。
优选的，步骤（5）中好氧发酵的参数为：通入无菌空气量为100-200m3/小时/吨物料，控制物料发酵温度35-37℃，每隔5-6h，搅拌一次，使发酵均匀。
待发酵无菌中草药物料与好氧发酵菌液按照质量比混合均匀后得到待好氧发酵混合物料，根据待好氧发酵混合物料的总重量，确定向待好氧发酵混合物料中进行强制通入无菌空气量的大小，例如：待好氧发酵混合物料的总重量为1吨，那需要向待好氧发酵混合物料中进行强制通入无菌空气量为100-200m3/小时。
优选的，步骤（6）中厌氧发酵的方式为密闭固体发酵罐，物料发酵温度37-40℃，每隔8-10h搅拌一次，使发酵均匀。
通过如上技术方案制备得到所述反刍动物用发酵中草药生物饲料的应用，是将制备得到的反刍动物用发酵中草药生物饲料按照5%-10%的重量添加比例加入到反刍动物日粮的精饲料中，饲料混合均匀后饲喂反刍动物。
本发明中采用的的微生物和中草药物料的特殊意义在于：
米曲霉能高产蛋白酶、肽酶、淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶和果胶酶，蛋白酶和肽酶在分解原料的同时，又能在进入动物胃肠道后弥补胃肠道蛋白酶与肽酶的不足，提高动物对蛋白质的吸收与利用；纤维素酶和果胶酶能分解植物组织，使得植物细胞内的营养物质充分暴露出来，中药活性有效成分也充分被释放，动物能容易的吸收暴露出的营养物质，同时，释放出的中药活性有效成分能刺激免疫系统，增强机体免疫力。植酸酶能水解植酸，防止植酸与维生素、微量元素结合使其失去活性。另一方面，米曲霉在生长繁殖中能产生大量的游离氨基酸、维生素D、烟酸和铁离子，能产生特有的鲜味，改善饲料的适口性。
米曲霉的代谢物可以刺激纤维素分解菌的生长，从而提高纤维素酶的产量和饲草中纤维的消化率，同时调节瘤胃产酸含量，影响瘤胃的内环境。同时，还可以减少在养殖过程中营养搭配不合理引起的如反刍动物酮病、瘤胃酸中毒、产后瘫痪、白肌病、铜缺乏症等疾病，还可以显著改善反刍动物对热应激的影响。
纳豆芽孢杆菌可以产酸，调节肠道菌群，增强动物细胞免疫反应，并能生成多种蛋白酶、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶，降解植物性饲料中某些复杂的碳水化合物，从而提高饲料的转化率，能产纳豆激酶和维生素K，可以治疗三高(高血糖，高血压，高血脂)和溶解血栓的作用，而且还能产生出氨基酸的鲜味，改善饲料适口性。
纳豆芽孢杆菌具有广谱抗菌作用，可产生多种抗菌物质，如杆菌肽、多黏菌素和2，6-吡啶二磷酸等，纳豆芽孢杆菌的抗菌作用具有良好的遗传稳定性，且其产生的抗菌物质具有良好的热稳定性和酸碱稳定性。
纳豆芽孢杆菌能够促进肠道厌氧菌群的生长。
纳豆芽孢杆菌的另一个重要作用就是能够增强机体免疫力，包括细胞免疫、器官免疫、黏膜免疫等方面。
纳豆芽孢杆菌作为益生菌还可调节动物胃肠道pH，促进家畜消化道生长发育。
红发夫酵母菌能产10多种类胡萝卜素，主要有虾青素、β－胡萝卜素、γ－胡萝卜素等，其中虾青素占60％～85％。红法夫酵母在好氧发酵过程中产酸，释放二氧化碳并同时合成虾青素。虾青素能明显增强机体局部和全身的免疫能力，抵抗机体炎症，免疫调节特性与抗氧化性相结合，在防止疾病的发生与传播中发挥重要作用；虾青素对癌细胞增殖有较强的抑制作用。
屎肠球菌是动物肠道正常菌群中的菌类，能产生乳酸，屎肠球菌是一种益生菌，对维持动物肠道菌群生态平衡起到重要作用，在动物的肠道保健和疾病的防疫和治疗上有突出的表现。
屎肠球菌对一些致病菌和病原微生物还有较强的抑制作用。屎肠球菌在进入动物体消化道后，能够迅速定植，竞争性抑制包括致病性大肠杆菌和沙门氏菌等有害菌的存活，使得失调的肠道菌群恢复到正常状态。
日粮中添加屎肠球菌能够提高围产期奶牛的干物质采食量与产奶量，提高饲料利用率，使奶牛适应高精料日粮，防止奶牛患急性和亚急性瘤胃酸中毒，改善牛体的健康状况。
反刍动物瘤胃内的pH值、NH3-N含量和VFA浓度是反映瘤胃内部环境状况及饲料在瘤胃内的发酵程度和模式的主要内环境指标。添加屎肠球菌可以在不影响瘤胃pH值的情况下，促进VFA的产生，为机体增加能量供应。另外，饲料中添加屎肠球菌还能够显著提高瘤胃液中的NH3-N含量，屎肠球菌能够促进瘤胃微生物对饲料的消化。
戊糖片球菌可改善饲料适口性和营养水平、降解毒素、抑制病原菌生长，利于饲料长期保存。
戊糖片球菌进入动物肠道后，能抑制病原菌增殖，还具有免疫调节功能，可以提高动物抗病能力和健康水平。
日粮中添加戊糖片球菌具有显著降低动物体脂沉积和提高瘦肉率的潜力。
黄芪含有生物碱、叶酸、黄芪多糖等成份，能增强机体免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗应激、降压和较广泛的抗菌作用。
申请人通过试验得到，黄芪经微生物发酵后在增强机体免疫力、抗菌、抗病毒、抗疲劳、降血糖等方面的功能进一步增强。
中草药细胞壁主要是由纤维素、半纤维素、果胶质和木质素等成分构成的致密结构，其有效成分大多包裹在致密细胞壁内，提纯时不易析出。为提高黄芪有效成分的提取率，用纤维素酶预处理能显著提高黄芪甲苷和黄芪多糖的收率。应用可降解纤维素的微生物发酵中药，微生物代谢过程中分泌的纤维素酶可裂解细胞壁纤维，从而有利于中药有效成分向胞外释放，提高中药成分的提取率。
利用微生物的作用破坏黄芪的细胞壁结构，对细胞壁结构成分加以修饰和转化，可显著提高黄芪中活性成分的释放。
茯苓的主要成分为茯苓多糖、茯苓三萜、茯苓素等；茯苓具有免疫调节、利尿、保肝、抗肿瘤、消炎杀菌等多种药理作用，可预防胃溃疡，对肝损伤有防治作用。茯苓多糖能使动物机体的免疫功能增强。
党参党参具有调节胃肠功能、保护胃黏膜、促进胃溃疡的愈合、增强机体免疫功能、提高机体抗应激能力、增加红细胞、白细胞数和血红蛋白含量、抑制血小板聚集、强心、调节血压、抗心肌缺血、抗菌等作用。
党参具有抗溃疡、保护胃黏膜、调整胃肠运动的作用，党参炔苷对胃黏膜损伤有很好的保护作用，具有明显的抗溃疡作用。
艾草含有萜品稀醇、石竹稀、嵩醇、芳樟醇、樟脑、龙脑、桉油素、水芹稀、毕澄茄稀、侧柏醇等，有温经、去湿、散寒、止血、消炎、平喘、止咳、安胎、抗过敏等作用。
艾草具有抑制伤寒杆菌、痢疾杆菌等病菌的生长，软化血管，缓解三叉神经痛，治疗支气管哮喘、慢性支气管炎等呼吸系统疾病，以及治疗关节炎、过敏性皮肤病、慢性肝炎等功效。艾草中的多种成分能够抗多种炎症，艾叶油也能起到镇静的功效。
甘草为豆科多年生草本植物，其茎叶中粗蛋白和粗脂肪含量高，粗纤维含量较低，含有多种氨基酸、常量元素、微量元素，具有较高的营养价值。
甘草有胃黏膜损伤修复作用，甘草治疗胃溃疡效果显著。
甘草含甘草皂苷、甘草多糖和甘草黄酮等多种成分，它们各自具有独特的生理活性。其中甘草皂苷包含甘草酸和甘草次酸等多种三萜类化合物，具有调节免疫和抗菌等效应；甘草黄酮包含甘草素、异甘草素和新异甘草苷等，具有抗菌抗炎抗溃疡等功能；甘草多糖可提高免疫力和抗病毒作用。
甘草能在不改变瘤胃内环境的稳定的前提下，可通过乙酸含量影响甲烷生成。
本发明的工艺路线为：
将制得的中草药混合物先进行灭菌处理，避免杂菌对发酵过程的影响，灭菌物料冷却后再均匀接种米曲霉菌液、纳豆芽孢杆菌菌液和红发夫酵母菌菌液，在控制通氧量和发酵温度的条件下好氧发酵中草药物料，米曲霉和纳豆芽孢杆菌大量繁殖代谢产生蛋白酶、肽酶、纤维素酶和果胶酶等多种生物酶，其中蛋白酶和肽酶将中草药物料中的蛋白质分解成小分子，同时大量蛋白酶、肽酶附着在待发酵物料上，如此能提高瘤胃对所采食饲料的蛋白质分解能力，纤维素酶和果胶酶将中草药物料中的大量纤维素酶解，产生多糖或单糖，使中草药物料中的有效成份析出，提高了中草药的药性，同时大量的纤维素酶、果胶酶附着在发酵底物上，提高了反刍动物对粗饲料的消化能力。
红发夫酵母菌利用米曲霉和纳豆芽孢杆菌分解物料后产生的小分子，进行繁殖代谢，产生大量的菌体蛋白和类胡萝卜素，丰富了底物的营养价值，物料经好氧发酵处理一段时间后，控制物料发酵温度，再接种屎肠球菌和戊糖片球菌进行厌氧发酵处理，在厌氧发酵中，屎肠球菌和戊糖片球菌利用好氧发酵阶段生成的少量营养物质进行繁殖代谢，产生乳酸、细菌素和其他活性代谢产物，能够抑制有害菌的滋生，防止产品霉变。
本发明的有益效果：
（1）本发明所选用的微生物菌种能产生大量的纤维素酶和果胶酶，能分解中草药的植物组织，使中草药有药效（生物碱、皂苷、甾醇、多糖）的成份大量析出，提高药效，还能将不被利用的纤维素、木质素变成多糖或单糖，为反刍动物供能。
（2）本发明所制得的中草药发酵饲料中含有微生物生长繁殖产生的蛋白酶、肽酶、纤维素酶、果胶酶和糖化酶，能够参与瘤胃生命活动，提高瘤胃对饲料的消化，促进反刍动物的对营养的吸收。
（3）本发明所制得的中草药生物饲料中富含中草药有效成份，进入瘤胃能够被迅速吸收利用，起到保肝、护胃，提高免疫能力，能抵制运输、环境和致病菌等因素的干扰，增强反刍动物机体适应能力，减少药物的使用。
（4）本发明所制得的中草药生物饲料中富含氨基酸、醇类、多糖，其中氨基酸能增加饲料的鲜味，醇类能提高饲料的香味，糖类能增加饲料的甜味，从而大大改善了饲料适口性，能提高反刍动物的采食量。
（5）本发明所制得的中草药生物饲料中含有纤维素酶能有效降解粗饲料中的中性洗涤纤维，减少精饲料的用量，能降低饲养成本。
（6）本发明所述的中草药生物饲料能增加瘤胃NH3-N的生成，能促进瘤胃微生物对NH3-N的利用生成菌体蛋白，为反刍动物提供优质的蛋白源。
（7）本发明所选中草药均具有抑菌作用，通过微生物发酵处理后，微生物代谢产生抑菌素，加强了中草药生物饲料的抑菌功效，能有效抑制瘤胃甲烷菌的活性，减少甲烷的排放造成环境的污染。
（8）本发明所制得的中草药生物饲料能促进挥发性脂肪酸的合成，为反刍动物生命活动提供丰富的供体。
（9）本发明所述的反刍动物用发酵中草药生物饲料通过分步发酵的方式，满足了各类特殊微生物（好氧微生物和厌氧微生物）快速繁殖代谢的条件需要，使得每种微生物能大量快速繁殖代谢，并产生丰富的有益代谢产物附着于物料上，使得饲料的营养价值得到提高。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
本发明所述的微生物菌种均为商品化常规品种，均可以由市场上购进，如米曲霉可购买自《中国微生物菌种保藏中心》（菌株编号BNCC176464），纳豆芽孢杆菌可购买自《中国微生物菌种保藏中心》（菌株编号BNCC184968），红发夫酵母菌可购买自《中国微生物菌种保藏中心》（菌株编号BNCC119738），屎肠球菌可购买自《湖北华大瑞尔科技有限公司》（商品名：优利乐），戊糖片球菌可购买自《中国微生物菌种保藏中心》（菌株编号BNCC184217）。
实施例1
一种反刍动物用发酵中草药生物饲料的制备方法，包括以下步骤：
步骤（1）：分别将米曲霉、纳豆芽孢杆菌、红发夫酵母菌、屎肠球菌和戊糖片球菌接种于灭菌后的单独培养基中培养，培养结束后分别制得单独的米曲霉菌液、纳豆芽孢杆菌菌液、红发夫酵母菌菌液、屎肠球菌菌液和戊糖片球菌菌液；
所述米曲霉和纳豆芽孢杆菌培养基均为LB培养基，所述红发夫酵母菌培养基为PDA培养基，所述屎肠球菌和戊糖片球菌培养基均为MRS培养基。
所述米曲霉、纳豆芽孢杆菌、屎肠球菌和戊糖片球菌菌的培养温度均为37℃，红发夫酵母菌的培养温度为32℃；
所述米曲霉、纳豆芽孢杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌和红发夫酵母菌的培养时间均为10小时；
所述米曲霉、纳豆芽孢杆菌和红发夫酵母菌培养时的摇床转速均为250r/min；
所述屎肠球菌和戊糖片球菌培养时的摇床转速均为40r/min。
步骤（2）：按重量份计，分别称取黄芪25份、茯苓18份、党参28份、艾草9份、甘草20份；
将所称取得到的黄芪、茯苓、党参、艾草、甘草分别粉碎至20目，再将粉碎后得到的黄芪、茯苓、党参、艾草、甘草全部加入混合机中混合均匀，制得中草药混合物；
步骤（3）：将步骤（2）中制得的中草药混合物与清水按照质量比为1:0.2进行均匀混合，制得的混合物经过灭菌处理后，冷却至35℃制得待发酵无菌中草药物料；
所述灭菌处理可以采用将待灭菌混合物置于灭菌锅内经115℃湿热高温处理15min；
步骤（4）：将步骤（1）中制得的米曲霉菌液、纳豆芽孢杆菌菌液、红发夫酵母菌菌液按照质量比1：1：0.5混合制得好氧发酵菌液；
将步骤（1）中制得的屎肠球菌菌液和戊糖片球菌菌液按照质量比1:1混合制得厌氧发酵菌液；
步骤（5）：将步骤（3）中制得的所述待发酵无菌中草药物料与步骤（4）中制得的所述好氧发酵菌液按照质量比1：0.05，均匀混合，经过好氧发酵48小时制得发酵中草药半成品；
所述好氧发酵的参数为：通入无菌空气量为150m3/小时/吨物料，向发酵物料中强制通入一定的无菌空气保障好氧发酵的充分进行，控制物料发酵温度37℃，每隔5h，搅拌一次，使发酵均匀。
步骤（6）：将步骤（5）中制得的所述发酵中草药半成品与步骤（4）中制得的所述厌氧发酵菌液按照按照质量比1：0.1，均匀混合，经过厌氧发酵60小时制得反刍动物用发酵中草药生物饲料。
所述厌氧发酵的方式为密闭固体发酵罐，物料发酵温度40℃，每隔8h搅拌一次，使发酵均匀。
通过如上技术方案制备得到所述反刍动物用发酵中草药生物饲料的应用，是将制备得到的反刍动物用发酵中草药生物饲料按照5%的重量添加比例加入到反刍动物日粮的精饲料中，饲料混合均匀后饲喂反刍动物。例如：将本发明制备得到的反刍动物用发酵中草药生物饲料5kg加入到95kg反刍动物日粮的精饲料中制成混合饲料，然后饲喂反刍动物。
将步骤（6）中制得的反刍动物用发酵中草药生物饲料进行木质素、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和酶活等检测，并通过HPLC检测中草药物料发酵前后有效成份的变化。
检测结果显示：采用本发明的制备方法能有效降解中草药中粗纤维、木质素、中性洗涤纤维的含量，并富含纤维素酶、果胶酶和蛋白酶，同时能提高中草药的有效成份。其中：木质素、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维分别降解了16.45%、22.11%和12.58%；纤维素酶、果胶酶和蛋白酶活性分别为1312.1U/g、1178U/g和3121U/g；中草药有效成份提高了2.3倍；说明中草药通过混合微生物两步发酵后，其营养价值和药效得到了提升的同时还富含多种消化酶等有益代谢产物。
实施例2
一种反刍动物用发酵中草药生物饲料的制备方法，包括以下步骤：
步骤（1）：分别将米曲霉、纳豆芽孢杆菌、红发夫酵母菌、屎肠球菌和戊糖片球菌接种于灭菌后的单独培养基中培养，培养结束后分别制得单独的米曲霉菌液、纳豆芽孢杆菌菌液、红发夫酵母菌菌液、屎肠球菌菌液和戊糖片球菌菌液；
所述米曲霉和纳豆芽孢杆菌培养基均为LB培养基，所述红发夫酵母菌培养基为PDA培养基，所述屎肠球菌和戊糖片球菌培养基均为MRS培养基。
所述米曲霉、纳豆芽孢杆菌、屎肠球菌和戊糖片球菌菌的培养温度均为37℃，红发夫酵母菌的培养温度为25℃；
所述米曲霉、纳豆芽孢杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌和红发夫酵母菌的培养时间均为11小时；
所述米曲霉、纳豆芽孢杆菌和红发夫酵母菌培养时的摇床转速均为230r/min；
所述屎肠球菌和戊糖片球菌培养时的摇床转速均为30r/min。
步骤（2）：按重量份计，分别称取黄芪21份、茯苓32份、党参25份、艾草18份、甘草10份；
将所称取得到的黄芪、茯苓、党参、艾草、甘草分别粉碎至20目，再将粉碎后得到的黄芪、茯苓、党参、艾草、甘草全部加入混合机中混合均匀，制得中草药混合物；
步骤（3）：将步骤（2）中制得的中草药混合物与清水按照质量比为1:0.2进行均匀混合，制得的混合物经过灭菌处理后，冷却至36℃制得待发酵无菌中草药物料；
所述灭菌处理可以采用将待灭菌混合物置于灭菌锅内经115℃湿热高温处理15min；
步骤（4）：将步骤（1）中制得的米曲霉菌液、纳豆芽孢杆菌菌液、红发夫酵母菌菌液按照质量比1：1：0.5混合制得好氧发酵菌液；
将步骤（1）中制得的屎肠球菌菌液和戊糖片球菌菌液按照质量比1:1混合制得厌氧发酵菌液；
步骤（5）：将步骤（3）中制得的所述待发酵无菌中草药物料与步骤（4）中制得的所述好氧发酵菌液按照质量比1：0.1，均匀混合，经过好氧发酵42小时制得发酵中草药半成品；
所述好氧发酵的参数为：通入无菌空气量为200m3/小时/吨物料，向发酵物料中强制通入一定的无菌空气保障好氧发酵的充分进行，控制物料发酵温度36℃，每隔5.5h，搅拌一次，使发酵均匀。
步骤（6）：将步骤（5）中制得的所述发酵中草药半成品与步骤（4）中制得的所述厌氧发酵菌液按照按照质量比1：0.09，均匀混合，经过厌氧发酵66小时制得反刍动物用发酵中草药生物饲料。
所述厌氧发酵的方式为密闭固体发酵罐，物料发酵温度38.5℃，每隔9h搅拌一次，使发酵均匀。
通过如上技术方案制备得到所述反刍动物用发酵中草药生物饲料的应用，是将制备得到的反刍动物用发酵中草药生物饲料按照7.5%的重量添加比例加入到反刍动物日粮的精饲料中，饲料混合均匀后饲喂反刍动物。例如：将本发明制备得到的反刍动物用发酵中草药生物饲料7.5kg加入到92.5kg反刍动物日粮的精饲料中制成混合饲料，然后饲喂反刍动物。
将步骤（6）中制得的反刍动物用发酵中草药生物饲料进行木质素、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和酶活等检测，并通过HPLC检测中草药物料发酵前后有效成份的变化。
检测结果显示：采用本发明的制备方法能有效降解中草药中粗纤维、木质素、中性洗涤纤维的含量，并富含纤维素酶、果胶酶和蛋白酶，同时能提高中草药的有效成份。其中：木质素、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维分别降解了17.45%、22.37%和14.58%；纤维素酶、果胶酶和蛋白酶活性分别为1412.1U/g、1198U/g和3021U/g；中草药有效成份提高了2.2倍；说明中草药通过混合微生物两步发酵后，其营养价值和药效得到了提升的同时还富含多种消化酶等有益代谢产物。
实施例3
一种反刍动物用发酵中草药生物饲料的制备方法，包括以下步骤：
步骤（1）：分别将米曲霉、纳豆芽孢杆菌、红发夫酵母菌、屎肠球菌和戊糖片球菌接种于灭菌后的单独培养基中培养，培养结束后分别制得单独的米曲霉菌液、纳豆芽孢杆菌菌液、红发夫酵母菌菌液、屎肠球菌菌液和戊糖片球菌菌液；
所述米曲霉和纳豆芽孢杆菌培养基均为LB培养基，所述红发夫酵母菌培养基为PDA培养基，所述屎肠球菌和戊糖片球菌培养基均为MRS培养基。
所述米曲霉、纳豆芽孢杆菌、屎肠球菌和戊糖片球菌菌的培养温度均为37℃，红发夫酵母菌的培养温度为27℃；
所述米曲霉、纳豆芽孢杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌和红发夫酵母菌的培养时间均为12小时；
所述米曲霉、纳豆芽孢杆菌和红发夫酵母菌培养时的摇床转速均为200r/min；
所述屎肠球菌和戊糖片球菌培养时的摇床转速均为50r/min。
步骤（2）：按重量份计，分别称取黄芪29份、茯苓25份、党参22份、艾草13份、甘草15份；
将所称取得到的黄芪、茯苓、党参、艾草、甘草分别粉碎至20目，再将粉碎后得到的黄芪、茯苓、党参、艾草、甘草全部加入混合机中混合均匀，制得中草药混合物；
步骤（3）：将步骤（2）中制得的中草药混合物与清水按照质量比为1:0.2进行均匀混合，制得的混合物经过灭菌处理后，冷却至37℃制得待发酵无菌中草药物料；
所述灭菌处理可以采用将待灭菌混合物置于灭菌锅内经115℃湿热高温处理15min；
步骤（4）：将步骤（1）中制得的米曲霉菌液、纳豆芽孢杆菌菌液、红发夫酵母菌菌液按照质量比1：1：0.5混合制得好氧发酵菌液；
将步骤（1）中制得的屎肠球菌菌液和戊糖片球菌菌液按照质量比1:1混合制得厌氧发酵菌液；
步骤（5）：将步骤（3）中制得的所述待发酵无菌中草药物料与步骤（4）中制得的所述好氧发酵菌液按照质量比1：0.07，均匀混合，经过好氧发酵36小时制得发酵中草药半成品；
所述好氧发酵的参数为：通入无菌空气量为100m3/小时/吨物料，向发酵物料中强制通入一定的无菌空气保障好氧发酵的充分进行，控制物料发酵温度35℃，每隔6h，搅拌一次，使发酵均匀。
步骤（6）：将步骤（5）中制得的所述发酵中草药半成品与步骤（4）中制得的所述厌氧发酵菌液按照按照质量比1：0.08，均匀混合，经过厌氧发酵72小时制得反刍动物用发酵中草药生物饲料。
所述厌氧发酵的方式为密闭固体发酵罐，物料发酵温度37℃，每隔10h搅拌一次，使发酵均匀。
通过如上技术方案制备得到所述反刍动物用发酵中草药生物饲料的应用，是将制备得到的反刍动物用发酵中草药生物饲料按照10%的重量添加比例加入到反刍动物日粮的精饲料中，饲料混合均匀后饲喂反刍动物。例如：将本发明制备得到的反刍动物用发酵中草药生物饲料10kg加入到90kg反刍动物日粮的精饲料中制成混合饲料，然后饲喂反刍动物。
将步骤（6）中制得的反刍动物用发酵中草药生物饲料进行木质素、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和酶活等检测，并通过HPLC检测中草药物料发酵前后有效成份的变化。
检测结果显示：采用本发明的制备方法能有效降解中草药中粗纤维、木质素、中性洗涤纤维的含量，并富含纤维素酶、果胶酶和蛋白酶，同时能提高中草药的有效成份。其中：木质素、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维分别降解了16.75%、22.81%和13.58%；纤维素酶、果胶酶和蛋白酶活性分别为1212.1U/g、1210U/g和3041U/g；中草药有效成份提高了2.5倍；说明中草药通过混合微生物两步发酵后，其营养价值和药效得到了提升的同时还富含多种消化酶等有益代谢产物。
应用例1：
将按本发明实施例1制备得到的反刍动物用发酵中草药生物饲料应用于肉牛饲养，进行肉牛生产性能饲喂试验：
肉牛生产性能实验结果见表1。
表1
生产指标 对照组 试验组 改善幅度
初始均重/（kg/头） 275.2±23.2<sup>a</sup> 278.24±23.4<sup>a</sup>
结束均重（kg/头） 340.3±24.3<sup>a</sup> 354.9±24.7<sup>b</sup> 4.29%
日增重/（kg/头） 1.08±0.01<sup>a</sup> 1.27±0.02<sup>b</sup> 17.59%
料肉比 9.13±0.14<sup>a</sup> 8.29±0.15<sup>b</sup> -9.2%
瘤胃菌体蛋白BCP/（mg/dL） 16.2±1.21<sup>a</sup> 18.12±1.23<sup>b</sup> 11.85%
血液淋巴细胞/% 35.2±5.2<sup>a</sup> 44.1±5.6<sup>b</sup> 25.28%
血清球蛋白GLOB/（g/L） 36.54±0.18<sup>a</sup> 37.79±0.2<sup>b</sup> 3.42%
瘤胃甲烷菌（10<sup>8</sup>/L） 4.3±.02<sup>a</sup> 1.9±0.03<sup>b</sup> -54.76%
粗蛋白消化率（%） 52.8±3.02<sup>a</sup> 59.43±3.01<sup>b</sup> 12.56%
粗纤维消化率（%） 59.24±4.08<sup>a</sup> 67.83±3.69<sup>b</sup> 14.5%
注：（1）数据以平均数±SD表示；同列肩标小写字母相同者表示差异不显著（P&gt;0.05）；同列肩标小写字母不同者表示差异显著（P&lt;0.05）
（2）饲喂60天
试验结果显示：肉牛均重比对照组提高了4.29%，日增重比对照组提高了17.59%，料肉比比对照组降低了9.2%，瘤胃菌体蛋白比对照组提高了11.85%，淋巴细胞和血清球蛋白比对照组分别提高了25.28%和3.42%，瘤胃甲烷菌比对照组较低了54.76%，粗蛋白消化率和粗纤维消化率比对照组分别提高了12.56%和14.5%。
通过上述应用例说明：本发明制得的中草药发酵生物饲料能提高肉牛对饲料的消化能力，促进生长，降低瘤胃甲烷菌的含量，从而减少甲烷菌气体的排放造成环境的污染，同时能提高免疫细胞的含量，增强肉牛的抗应激性，减少药物费用。
应用例2：
将按本发明实施例2制备得到的反刍动物用发酵中草药生物饲料应用于奶牛饲养，进行奶牛生产性能饲喂试验：
奶牛生产性能实验结果见表2。
表2
生产指标 对照组 试验组 改善幅度
日均产奶量（kg） 21.21±3.12<sup>a</sup> 27.41±2.17<sup>b</sup> 29.23%
乳脂率（%） 3.94±0.34<sup>a</sup> 5.53±0.22<sup>b</sup> 40.35%
乳蛋白率（%） 5.43±1.03<sup>a</sup> 7.12±1.05<sup>b</sup> 31.12%
乳糖率（%） 8.65±0.74<sup>a</sup> 10.41±0.55<sup>b</sup> 20.34%
TgG 31.23±2.2<sup>a</sup> 38.8±1.23<sup>b</sup> 24.23%
乳房炎（%） 20±5.2<sup>a</sup> 0<sup>b</sup> 20%
注：（1）数据以平均数±SD表示；同列肩标小写字母相同者表示差异不显著（P&gt;0.05）；同列肩标小写字母不同者表示差异显著（P&lt;0.05）
（2）饲喂周期42天
试验结果显示：奶牛日产奶量比对照组提高了29.23%，牛奶中的乳脂、乳蛋白、乳糖和抗原球蛋白含量比对照组牛奶中分别提高了40.35%，31.12%，20.34%和24.23%，试验组奶牛乳房炎症消失。
通过上述应用例说明：本发明制得的中草药发酵生物饲料能提高奶牛产奶量的同时，能提高奶品的品质，降低奶牛乳房炎症，减少药物的使用，使奶制品中无药物残留，是一种绿色健康的饲料。
应用例3：
将按本发明实施例3制备得到的反刍动物用发酵中草药生物饲料应用于肉羊饲养，进行肉羊生产性能饲喂试验：
肉羊生产性能实验结果见表3。
表3
生产指标 对照组 试验组 改善幅度
初始均重/（kg/头） 26.93±2.23<sup>a</sup> 26.74±2.25<sup>a</sup>
结束均重（kg/头） 38.64±1.56<sup>a</sup> 41.98±1.26<sup>b</sup> 8.64%
日增重/（g/头） 195±20.21<sup>a</sup> 254±20.31<sup>b</sup> 30.25%
料肉比 9.12±0.02<sup>a</sup> 8.51±0.03<sup>b</sup> -6.69%
抗氧化能力（U/ml） 8.9±1.01<sup>a</sup> 10.4±1.03<sup>b</sup> 16.85%
淋巴细胞（%） 32.81±5.4<sup>a</sup> 49.02±5.5<sup>b</sup> 49.41%
血小板（10<sup>9</sup>/L） 302±55.7<sup>a</sup> 355.05±52.3<sup>b</sup> 17.57%
注：（1）数据以平均数±SD表示；同列肩标小写字母相同者表示差异不显著（P&gt;0.05）；同列肩标小写字母不同者表示差异显著（P&lt;0.05）
（2）饲喂周期60天
试验结果显示：肉羊均重比对照组提高了8.64%，日增重比对照组提高了30.25%，料肉比比对照组下降了6.69%，血液中抗氧化能力、淋巴细胞和血小板含量比对照组分别提高了16.85%，49.41%，17.57%。
通过上述应用例说明：本发明制得的中草药发酵生物饲料能提高肉羊对饲料的消化能力，促进生长，减少饲养周期，能提高免疫细胞的含量，增强肉羊的抗应激性，减少药物费用，降低养殖成本。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种反刍动物用发酵中草药生物饲料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤（1）：分别将米曲霉、纳豆芽孢杆菌、红发夫酵母菌、屎肠球菌和戊糖片球菌接种于灭菌后的单独培养基中培养，培养结束后分别制得单独的米曲霉菌液、纳豆芽孢杆菌菌液、红发夫酵母菌菌液、屎肠球菌菌液和戊糖片球菌菌液；
步骤（2）：按重量份计，分别称取黄芪21～29份，茯苓18～32份，党参22～28份，艾草9～18份，甘草10～20份；
将所称取得到的黄芪、茯苓、党参、艾草、甘草分别粉碎至20目，再将粉碎后得到的黄芪、茯苓、党参、艾草、甘草全部加入混合机中混合均匀，制得中草药混合物；
步骤（3）：将步骤（2）中制得的中草药混合物与清水按照质量比为1:0.2进行均匀混合，制得的混合物经过灭菌处理后，冷却至35～37℃制得待发酵无菌中草药物料；
步骤（4）：将步骤（1）中制得的米曲霉菌液、纳豆芽孢杆菌菌液、红发夫酵母菌菌液按照质量比1：1：0.5混合制得好氧发酵菌液；
将步骤（1）中制得的屎肠球菌菌液和戊糖片球菌菌液按照质量比1:1混合制得厌氧发酵菌液；
步骤（5）：将步骤（3）中制得的所述待发酵无菌中草药物料与步骤（4）中制得的所述好氧发酵菌液按照质量比1：（0.05～0.1），均匀混合，经过好氧发酵36～48小时制得发酵中草药半成品；
步骤（6）：将步骤（5）中制得的所述发酵中草药半成品与步骤（4）中制得的所述厌氧发酵菌液按照按照质量比1：（0.08～0.1），均匀混合，经过厌氧发酵60～72小时制得反刍动物用发酵中草药生物饲料。
2.根据权利要求1所述的一种反刍动物用发酵中草药生物饲料的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述米曲霉、纳豆芽孢杆菌、屎肠球菌和戊糖片球菌的培养温度均为37℃，红发夫酵母菌的培养温度为25-32℃；
所述米曲霉、纳豆芽孢杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌和红发夫酵母菌的培养时间均为10-12小时；
所述米曲霉、纳豆芽孢杆菌和红发夫酵母菌培养时的摇床转速均为200-250r/min；
所述屎肠球菌和戊糖片球菌培养时的摇床转速均为30-50r/min。
3.根据权利要求1所述的一种反刍动物用发酵中草药生物饲料的制备方法，其特征在于，
步骤（5）中好氧发酵的参数为：通入无菌空气量为100-200m3/小时/吨物料，控制物料发酵温度35-37℃，每隔5-6h，搅拌一次，使发酵均匀。
4.根据权利要求1所述的一种反刍动物用发酵中草药生物饲料的制备方法，其特征在于，步骤（6）中厌氧发酵的方式为密闭固体发酵罐，物料发酵温度37-40℃，每隔8-10h搅拌一次，使发酵均匀。
5.权利要求1-4任一项所述的反刍动物用发酵中草药生物饲料的应用，其特征在于：将制备得到的反刍动物用发酵中草药生物饲料按照5%-10%的重量添加比例加入到反刍动物日粮的精饲料中，饲料混合均匀后饲喂反刍动物。
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