WO2014185516A1 - 反芻動物の乳房炎の予防または治療剤 - Google Patents

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WO2014185516A1
WO2014185516A1 PCT/JP2014/063055 JP2014063055W WO2014185516A1 WO 2014185516 A1 WO2014185516 A1 WO 2014185516A1 JP 2014063055 W JP2014063055 W JP 2014063055W WO 2014185516 A1 WO2014185516 A1 WO 2014185516A1
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mastitis
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bacillus
therapeutic agent
strain
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PCT/JP2014/063055
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延久 芦田
寛和 今林
久 麻生
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カルピス株式会社
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    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
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    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/14—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for lactation disorders, e.g. galactorrhoea
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]

Definitions

  • the present invention relates to a preventive or therapeutic agent, feed additive, feed or feed for the prevention or treatment of mastitis in ruminants such as cattle, characterized by comprising Bacillus bacteria having specific properties as an active ingredient. It relates to a pharmaceutical composition.
  • Mastitis is inflammation of the mammary gland tissue, and most of it is caused by infection with bacteria such as Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Streptococcus, and Pseudomonas aeruginosa.
  • bacteria such as Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Streptococcus, and Pseudomonas aeruginosa.
  • mastitis in cattle is a serious problem for dairymen as described below.
  • Mastitis is roughly classified into clinical mastitis and latent mastitis (also called non-clinical mastitis).
  • clinical mastitis the breast is red and swollen, fever, painful, and gross abnormalities such as contamination in milk are observed, whereas latent mastitis is similar to clinical mastitis.
  • latent mastitis is similar to clinical mastitis.
  • the mammary gland is inflamed without any abnormalities. The incidence is much higher in latent mastitis, and it is said that about 25-50% of milking cows are affected.
  • Patent Document 1 discloses a composition for the prevention or treatment of bovine mastitis, which contains, as an active ingredient, a culture composition obtained from a culture of microorganisms belonging to the genus Aureobasidium. It is disclosed.
  • Patent Document 2 discloses a composition for the prevention and treatment of livestock mastitis characterized by comprising live baker's yeast or its contents as an active ingredient.
  • Non-patent Document 1 lactic acid bacteria and Bacillus subtilis
  • Table 2 of this document describes that the incidence of mastitis has been reduced by the use of viable bacteria, but does not show what the viable bacteria are.
  • the current administration of viable agents to dairy cows is probably used in Table 2 because 80-90% of “Biosley” is used. It is estimated that the viable fungus is “Biosley”.
  • Non-Patent Document 2 discloses viable preparations containing Biotop (Bacillus subtilis) have drastically reduced the occurrence of bloating, and in addition to the effects of increased appetite and coat gloss, the number of cattle that discharge Salmonella has decreased. Such effects are known (Non-Patent Document 2).
  • Patent Document 3 it is taught by the same applicant as this application to use viable cells of Bacillus subtilis as a feed utilization improving agent for ruminants.
  • the improvement in utilization efficiency in this document is an improvement in digestion and absorption efficiency, thereby improving the milk yield and quality of dairy cows.
  • a feed additive obtained by mixing Bacillus subtilis C-3102 strain with vitamins, minerals, amino acids and the like is also taught by the same applicant as this application (Patent Document 4).
  • Patent Document 5 describes the use of Bacillus subtilis to reduce the growth of pathogenic bacteria in the intestines of animals such as ruminants.
  • Patent Documents 3, 4 and 5 do not describe that Bacillus subtilis is useful for the prevention or treatment of bovine mastitis.
  • an object of the present invention is to provide an agent or a pharmaceutical composition or method for preventing and / or treating bovine mastitis.
  • Bacillus bacteria exhibit a mastitis-preventing effect by feeding (or administration or ingestion) to cattle, particularly dairy cows, and further, therapeutic effects on mastitis after onset. Found to increase.
  • the present invention includes the following features.
  • Bacillus bacterium further has the following property (2).
  • Bifidobacteria growth activity is higher than 0.8 when the Bifidobacterium growth activity of Bacillus subtilis C-3102 strain (International Deposit No. FERM BP-1096) is 1.
  • the Bacillus subtilis bacterium is Bacillus subtilis C-3102 strain (International Deposit No. FERM BP-1096), or the property (1), the properties (1) and (2), the property (1) And (3), the properties (1) to (3), the properties (1) and (4), the properties (1), (3) and (4), or the properties (1) to (4).
  • the preventive or therapeutic agent according to [7] which is a mutant of the C-3102 strain.
  • a feed additive for preventing or treating ruminant mastitis comprising the preventive or therapeutic agent according to any one of [1] to [8] as an active ingredient.
  • [12] It comprises adding an effective amount of the feed additive according to [9] or [10] to prevent or treat ruminant mastitis to the ruminant feed, A method for enhancing the preventive or therapeutic effect of ruminant mastitis in ruminant feed.
  • Property (1) It can increase or maintain CD11c + CD172a + blood dendritic cell gate 2 in cattle, A pharmaceutical composition for preventing or treating ruminant mastitis, comprising a Bacillus bacterium as an active ingredient having a pharmaceutically acceptable carrier together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Bacillus bacterium further has the following property (2).
  • Bifidobacteria growth activity is higher than 0.8 when the Bifidobacterium growth activity of Bacillus subtilis C-3102 strain (International Deposit No. FERM BP-1096) is 1.
  • the Bacillus subtilis bacterium is Bacillus subtilis C-3102 strain (International Deposit No. FERM BP-1096), or the property (1), the properties (1) and (2), the property (1) And (3), the properties (1) to (3), the properties (1) and (4), the properties (1), (3) and (4), or the properties (1) to (4).
  • the pharmaceutical composition according to [20] which is a mutant of the C-3102 strain.
  • the present invention provides a Bacillus bacterium having a specific property that has a high preventive and therapeutic effect in the prevention or treatment of mastitis in ruminants, preferably cattle, more preferably dairy cows. It is known that dairy cows with a history of mastitis have a very high probability of developing mastitis after each subsequent delivery even after symptoms have been improved by antibiotic treatment.
  • the prophylactic or therapeutic agent is effective in suppressing the subsequent onset of mastitis by oral administration or feeding from about one month before parturition, and in many cases it can be made completely free of symptoms. Unexpected effectiveness.
  • FIG. 1 This figure demonstrates the increase in bovine CD11c + CD172a + blood dendritic cell gate 2 showing a correlation with the effect of improving the mastitis by the Bacillus subtilis bacterium used as an active ingredient in the present invention. is there.
  • A shows CD11c-positive CD172a-positive blood dendritic cell gate 2 detected in gate 1 in the first quadrant (upper right) (when mastitis is improved, both the expression intensity of CD172a and CD11c increases) and gate 3
  • the approximate position or range of (the expression intensity of CD172a is lower than that of gate 2 cells) is schematically shown.
  • B shows the results of dual color flow cytometric analysis of CD11c + CD172a + blood dendritic cells of chronic mastitis cattle (control), and C shows the administration of the prophylactic / therapeutic agent of the present invention.
  • C shows the administration of the prophylactic / therapeutic agent of the present invention.
  • D is the two colors of CD11c + CD172a + blood dendritic cells of control dairy cows not treated with Bacillus subtilis bacteria (cow number 94: day 8 of delivery (left) and cow number 902: day of delivery 10 (right))
  • the flow cytometry analysis result is shown.
  • Prophylactic or therapeutic agent for ruminant mastitis comprising, as an active ingredient, a Bacillus bacterium having a specific property described below, preferably a Bacillus subtilis bacterium.
  • mastitis is ruminant, preferably cattle, more preferably dairy cattle mastitis, which includes clinical and subclinical mastitis (nonclinical mastitis). Also called mastitis).
  • clinical mastitis has gross abnormalities such as red swelling of the breast, fever, pain, or contamination of milk.
  • Latent mastitis causes inflammation in the mammary gland without any abnormalities like clinical mastitis. The incidence is much higher in latent mastitis, and it is said that about 25-50% of milking cows are affected.
  • Clinical mastitis is easy to cure with antibiotic medication, whereas latent mastitis is refractory and there is no effective treatment, so there is no choice but to take measures such as isolation of infected animals.
  • dairy cows with the above-mentioned mastitis are not economical because milk production and milk quality are reduced, and milk cannot be shipped if chemotherapy agents such as antibiotics are used. The loss is great.
  • the preventive or therapeutic agent of the present invention is effective not only for clinical mastitis but also for latent mastitis. Since there has been no report on an effective therapy for the prevention and treatment of latent mastitis, the preventive or therapeutic agent of the present invention is important in the dairy industry.
  • ruminant animals include livestock animals such as cattle, goats, and sheep.
  • ruminants that secrete and produce milk such as cows and goats
  • Preferred cows are dairy cows (eg Holstein, Jersey, Guernsey, Ayrshire, Kelly, Dilli Shorthorn, Red Danish, Simmental, etc.), especially normal cows, capable of developing mastitis Sexual dairy cow, dairy cow developing mastitis, or dairy cow with history of mastitis.
  • the preventive agent of the present invention is particularly effective for normal dairy cows, dairy cows with the possibility of developing mastitis or normal dairy cows with a history of mastitis, and can be used as a therapeutic agent in dairy cows with onset of mastitis. .
  • Bacillus bacteria The preventive or therapeutic agent of the present invention has the following properties (1) and, optionally, (2): (1) It can increase or maintain CD11c + CD172a + blood dendritic cell gate 2 in cattle, (2) Bifidobacteria growth activity is higher than 0.8 when the Bifidobacterium growth activity of Bacillus subtilis C-3102 strain (International Deposit No. FERM BP-1096) is 1. An active ingredient is a bacterium belonging to the genus Bacillus.
  • Bacillus bacteria having the properties (1) and (2) as described above can be used as an active ingredient of the preventive or therapeutic agent of the present invention.
  • CD11c + CD172a + blood dendritic cells are antigen-presenting cells that move in the blood and perform local immune regulation, and are CD11c positive and CD172a positive cells. These cells were collected from peripheral blood by specific gravity centrifugation (2300 rpm, 30 minutes) using lympholite-H, and after further separating monocytes, B cells and T cells, magnetic bead-bound anti-CD11c antibody And a magnetic separation cell system (MACS method) using a magnetic bead-bound anti-CD172a antibody and a MACS separation column, and separating as CD11c positive and CD172a positive cells, and further using CD11c + CD172a + blood in a two-color flow cytometry method Dendritic cells can be analyzed.
  • MCS method magnetic separation cell system
  • CD11c + CD172a + blood dendritic cells consist of two distinct cell populations (Gate 2 and Gate 3) shown in Gate 1 in the first quadrant of FIG.
  • CD11c + CD172a was found to be decreased in cattle that developed or did not develop mastitis and increased in cattle that recovered or did not develop by administration of the Bacillus subtilis bacterium of the present invention. + It was first found that blood dendritic cells were correlated with the presence or absence of mastitis.
  • CD11c + CD172a + blood dendritic cell gate 2 is increasing to prevent mastitis. That is, the prophylactic / therapeutic agent of the present invention increases the CD11c + CD172a + blood dendritic cell gate 2 to be administered depending on the environment (for example, contact with bacteria, injury status, etc.). Conversely, for cattle that have developed mastitis, CD11c + CD172a + blood dendritic cell gate 2 cannot be increased during this period.
  • CD11c + CD172a + blood dendritic cell gate 2 can be increased or maintained” which is one of the properties of Bacillus genus bacteria such as Bacillus subtilis in this specification is the blood of the subject animal.
  • the ratio of CD11c + CD172a + dendritic cell gate 2 in the total dendritic cells in the medium is increased or maintained higher than the ratio at the time of onset of mastitis when the risk of developing mastitis is high. It means preparing an immune environment suitable for preventing the development of mastitis.
  • Bacillus subtilis usable in the present invention also has a bifidobacteria growth activity of 1 and a Bifidobacteria growth activity of B. subtilis C-3102 strain (International Deposit No. FERM BP-1096). In this case, it has a feature that it is higher than 0.8, preferably higher than 0.9, and more preferably 1 or more. Bifidobacteria growth activity has an aspect related to immunity enhancement, and its relationship with dendritic cell proliferation activity has not been reported so far. However, the bifidobacteria growth activity of B. subtilis strain C-3102 Thus, it is expected to have a mastitis prevention or treatment effect through dendritic cell proliferation activity.
  • the Bacillus bacterium usable in the present invention can further have the following properties (3) and / or (4).
  • (3) Protease activity and amylase activity are higher than 0.7 when both protease activity and amylase activity of Bacillus subtilis C-3102 strain (International Deposit No. FERM BP-1096) are 1.
  • (4) 1 ⁇ 10 Can prevent or treat mastitis when given orally to cattle at a dose of 5 or more / day / head
  • the number of Bacillus bacteria that can be used in the present invention is 1 ⁇ 10 6 or more / day / head, preferably 1 ⁇ 10 7 or more / day / head, more preferably 1 ⁇ 10 8.
  • FOB / day / head more preferably 1 ⁇ 10 9 or more / day / head, and most preferably when administered orally to cattle at a dose of 6 ⁇ 10 9 or more / day / head, prevent or ameliorate mastitis It has the feature that it can do.
  • the above dose is the number of viable cells of the genus Bacillus that the animal ingests per day per animal, and the intake to the animal is divided into 1 to multiple times, for example, 2 to 4 times. It can be carried out.
  • Oral administration is usually performed from 1 month before calving to 3 months after calving, and CD11c + CD172a + blood dendritic cells in the peripheral blood, particularly in the gate 2 shown in FIG.
  • the protease activity and amylase activity are higher than 0.7 when the protease activity and amylase activity of the Bacillus subtilis C-3102 strain (International Deposit No. FERM BP-1096) are both 1.
  • it may have a property of higher than 0.8, more preferably higher than 0.9, most preferably 1 or more.
  • Protease activity and amylase activity can be measured, for example, by methods as described in the Examples below.
  • Bacillus subtilis for example, Bacillus subtilis C-3102 strain, has high protease activity and amylase activity (see Table 3 below).
  • Examples of the bacterium belonging to the genus Bacillus having the above property (1) and optionally (2) include Bacillus subtilis bacteria, Bacillus licheniformis bacteria, Bacillus amyloliquefaciens bacteria, and the like.
  • Bacillus subtilis C-3102 strain International deposit number FERM BP-1096
  • Preferred Bacillus bacteria are the Bacillus subtilis C-3102 strain and the mutant strain of the C-3102 strain.
  • Bacillus subtilis C-3102 strain was founded on December 25, 1985 at Tsukuba Center, Chuo 6th, 1-1-1 Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan (at the time of deposit; Tsukuba-gun, Ibaraki, Japan) Deposited domestically at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center, 1-1-1 Yatabe-cho Higashi 1-chome (Postal Code 305), as Deposit No. 851 It was transferred to the International Deposit under the same deposit number FERM BP-1096 (at the time of transfer; Jikoken Jo No. 1096) (Japanese Patent Laid-Open No. 62-232343).
  • the C-3102 strain is also marketed by the applicant under the trade name “Calsporin” ®.
  • Mutants of the Bacillus subtilis C-3102 strain include, for example, culture under irradiation of high energy rays such as ultraviolet rays and X-rays, mutagenic substances such as nitrosoguanidine, N-ethyl-N-nitrosourea and nitrosamine. Mutation is artificially induced by culturing in the presence, and a mutant colony is isolated. Further, for example, the base sequence of the rDNA (usually used for bacterial classification) of the mutant is used as the sequence of the C-3102 strain.
  • Bacillus genus bacteria that can be used in the present invention can be used as it is, but if necessary, after separating or concentrating the cell components by a separation means such as centrifugation or filtration, for example, lyophilization, It can be obtained as a dried product by a drying method such as vacuum heat drying or spray drying.
  • Bacillus subtilis can be cultured under culture conditions customary for those skilled in the art.
  • the medium for culturing Bacillus subtilis contains at least a carbon source, a nitrogen source and an inorganic salt.
  • Examples of the carbon source include saccharides such as sorbitol, glucose, starch, dextrin, cyclodextrin, amylose, amylopectin, pullulan, oligosaccharide, glycerin, and wort. These carbon sources can be used alone or in a mixture of two or more.
  • Nitrogen sources include meat extract, malt extract, yeast extract, peptone, polypeptone, protein hydrolysate, soybean powder, milk casein, amino acids, corn steep liquor and other organic nitrogen compounds, and / or ammonia, ammonium nitrate, ammonium sulfate, Examples thereof include ammonium salts such as ammonium chloride, nitrates such as sodium nitrate, and inorganic nitrogen compounds such as urea.
  • a nitrogen source can also be used individually or in mixture of 2 or more types.
  • phosphates such as magnesium, manganese, calcium, sodium, potassium, copper, iron and zinc, hydrochloride, sulfate, acetate and the like can be used.
  • a commercially available medium or nutrient broth may be used as the medium.
  • Culture can be performed under known culture conditions.
  • the culture temperature is usually 20 to 45 ° C., preferably 35 to 42 ° C.
  • the pH of the medium suitable for culture is usually 6.0 to 9.0, preferably 6.5 to 8.5. Although not limited to these ranges.
  • the preventive or therapeutic agent of the present invention comprises the above property (1), the above properties (1) and (2), the above properties (1) and (3), and the above properties (1).
  • the above properties (1) and (4), the above properties (1), (3) and (4), or the above properties (1) to (4) Cells preferably a Bacillus subtilis bacterium, more preferably a Bacillus subtilis C-3102 strain or a mutant thereof, as an active ingredient.
  • the content of Bacillus bacteria in the prophylactic agent is usually 0.001 to 95.0% by weight, for example 0.1 to 40% by weight, as dry cells, but the prophylactic agent contains the bacterium. For example, 1 ⁇ 10 5 to 6 ⁇ 10 9 or more can be contained.
  • the preventive or therapeutic agent is for oral administration or feeding, and is in the form of a solid, semi-solid or liquid, and in the case of a solid, it is in the form of powder, granule, pill, pellet, tablet, capsule, etc., semi-solid In the case of liquid, it is in the form of a gel, and in the case of liquid, it is in the form of a suspension.
  • the preventive or therapeutic agent can contain, for example, a carrier (for example, an excipient, a diluent, etc.) and optionally an additive for formulation into a dosage form in addition to the microbial cells as an active ingredient.
  • Examples of the carrier include lactose, mannitol, sorbitol, xylitol, microcrystalline cellulose, starch, dicalcium phosphate, purified water, gelatin, agar, sodium alginate, carrageenan and the like.
  • Additives include, but are not limited to, binders, disintegrants, lubricants, fillers, lubricants, surfactants, antioxidants, fungicides, thickeners and the like.
  • binder examples include sodium starch glycosate, tragacanth gum, acacia, polyvinyl pyrrolidone, corn starch, gelatin, powdered cellulose, microcrystalline cellulose, sorbitol, starch, polyvinyl pyrrolidone, vinyl pyrrolidone and vinyl derivative copolymer, hydroxypropyl cellulose, hydroxy Examples thereof include propylmethylcellulose.
  • Disintegrants include, for example, corn starch, potato starch, sodium glycolate starch, sodium carboxymethylcellulose, calcium carboxymethylcellulose, croscarmellose sodium, crospovidone, polyvinylpyrrolidone, methylcellulose, microcrystalline cellulose, hydroxypropyl cellulose substituted with lower alkyl , Pregelatinized starch, sodium alginate and the like.
  • lubricant examples include magnesium stearate, stearic acid, polyethylene glycol, talc, and silica.
  • lubricant examples include silicon dioxide, talc, calcium stearate, zinc stearate, sodium stearyl fumarate, magnesium stearate and the like.
  • surfactant examples include sodium lauryl sulfate and polysorbate 80.
  • Other components include amino acids, vitamins, minerals, pigments (such as astaxanthin, canthaxanthin), enzymes (such as amylase, protease, xylanase, cellulase, ⁇ -glucanase, lipase).
  • amino acids such as astaxanthin, canthaxanthin
  • enzymes such as amylase, protease, xylanase, cellulase, ⁇ -glucanase, lipase.
  • the total content of the carrier and additive in the preventive or therapeutic agent is an amount obtained by subtracting the content (%) of the active ingredient (dry cells) from 100%.
  • the preventive or therapeutic agent of the present invention can be used to prevent and optionally treat mastitis in ruminants, preferably cattle, more preferably dairy cows.
  • a cow such as a dairy cow during conception is treated with 1 ⁇ 10 5 bacteria per day, such as Bacillus subtilis bacteria having the above properties, at least 1 month before delivery to 3 months after delivery.
  • 5-6 ⁇ 10 9 or more can be done by oral administration or feeding to dairy cows.
  • administration or feeding it is divided into 1 to several times a day, for example, twice in the morning and evening, and 1 ⁇ 10 5 to 6 ⁇ 10 9 or more of the bacteria are administered per day as a total amount
  • such a dose of the prophylactic agent can be mixed with feed or beverage and fed.
  • calsporin registered trademark
  • 40 g (1.5 ⁇ 10 8 CFU) of calsporin powder per day for example, 20 g in the morning and 20 g in the evening can be blended in the feed.
  • roughage such as hay or concentrated feed is often fed as feed, and it is preferable to mix with these feeds.
  • the cows to be administered the onset of mastitis in cows that are expected to develop mastitis can be remarkably suppressed by administering or feeding to cattle that have experienced mastitis in the past.
  • Feed additive and feed The present invention further provides a feed additive containing the preventive or therapeutic agent described above.
  • the feed additive of the present invention is feed-added so that the above-mentioned preventive or therapeutic agent contains a Bacillus bacterium such as Bacillus subtilis defined above an effective amount for preventing mastitis in ruminants. It can be manufactured by mixing with any other approved ingredients that make up the product.
  • an effective amount of a Bacillus bacterium such as a Bacillus subtilis bacterium is an amount that an animal can ingest 1 ⁇ 10 5 to 6 ⁇ 10 9 or more of the bacterium per day.
  • a feed additive is generally a substance for imparting a desired function to animal feed, and in the case of the present invention, this function prevents, treats or suppresses mastitis in ruminants, particularly cattle, more preferably dairy cows. To alleviate.
  • the feed additive can further contain antibiotics for the treatment of mastitis.
  • antibiotics for the treatment of mastitis.
  • cepham is effective against antibiotics such as Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Streptococcus, and Pseudomonas aeruginosa that are known to cause mastitis.
  • Antibiotics such as antibiotics, penicillin antibiotics, macrolide antibiotics, such as erythromycin, oxytetracycline hydrochloride, dicloxacillin sodium, cefazoline, cefuroxime sodium, nafcillin sodium, benzylpenicillin procaine, dihydrostreptomycin sulfate, Mention is made of one or more mixtures of antibiotics such as kanamycin sulfate, cefapirin sodium, monoammonium glycyrrhizinate, cephalonium.
  • the feed additive can contain, for example, a carrier (excipient or diluent), an additive and the like for forming the agent.
  • a carrier excipient or diluent
  • the carriers and additives are those exemplified above for use in producing the preventive or therapeutic agent of the present invention.
  • the feed additive may have any form of solid, semi-solid or liquid, and preferably is in solid form, and can be manufactured in the form of powder, granules, pills, pellets, tablets, capsules, etc. .
  • the present invention further relates to the prevention of ruminant mastitis in ruminant feed, comprising adding to the ruminant feed an effective amount of the above feed additive for preventing or treating mastitis.
  • a method for enhancing a therapeutic effect is provided.
  • mastitis treatment agents listed in the “Stock Price Standards for Livestock Mutual Aid Effectiveness” have been used for the treatment of mastitis such as cattle, and antibiotics are the main treatment agents.
  • the substance has been used but has not yet been prevented.
  • the above-mentioned preventive or therapeutic agent of the present invention and a feed additive containing the same can supplement antibiotic treatment.
  • the present invention is also characterized by comprising an effective amount of the above-mentioned feed additive for preventing or treating ruminant mastitis. Also, the present invention relates to a feed having an enhanced effect of preventing or treating ruminant mastitis.
  • the feed of the present invention is characterized by containing an effective amount of a Bacillus bacterium such as the aforementioned Bacillus subtilis bacterium for preventing mastitis in ruminants, unlike known feeds.
  • Bacillus bacteria such as Bacillus subtilis bacteria have an action or effect to prevent (or treat) ruminant mastitis. It was not sold for prevention (or treatment).
  • the feed includes rough rations that are mainly fiber (eg, green grass, hay, silage rice straw, etc.) and concentrated feed (also called mixed feed) that is rich in starch and protein (eg, corn, soybeans, rice bran, bran, barley). Cereals such as milo, soybean oil residue, rapeseed oil residue, cottonseed oil residue, etc.) and these are appropriately mixed and fed to ruminants such as cattle.
  • vitamins vitamins A, D3, E, B1, B2, B6, B12, C, K3, inositol, biotin, pantothenic acid, niacin, choline, folic acid, etc.
  • amino acids, salt, other minerals, etc. can be added.
  • As the feed component for example, those described in the Japan Standard Feed Component Table (edited by the National Agriculture and Food Research Organization) can be used.
  • the feed preferably contains the above Bacillus subtilis bacteria in an amount that can be ingested by the animal at 1 ⁇ 10 5 to 6 ⁇ 10 9 or more bacteria per day, the amount of such cells should be such.
  • the feed additive of the present invention can be blended in the feed.
  • composition and method for the prevention or treatment of mastitis The present invention further comprises the above properties (1), the above properties (1) and (2), the above properties (1) and (3), Having properties (1) to (3), properties (1) and (4) above, properties (1), (3) and (4) above, or properties (1) to (4) above
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating ruminant mastitis comprising a Bacillus bacterium such as Bacillus subtilis bacterium as an ingredient together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the Bacillus bacterium such as Bacillus subtilis bacterium as the active ingredient is the same as the bacterium that is the active ingredient of the preventive or therapeutic agent described above, and the above property (1) and, optionally, the property (2), that is, As property (1), it is possible to increase CD11c + CD172a + cell gate 2 in blood dendritic cells of cows such as dairy cows, and in some cases, as property (2), Bifidobacterium proliferative activity is When the growth activity of bifidobacteria of subtilis C-3102 strain (international deposit number FERM BP-1096) is 1, it is higher than 0.8, preferably higher than 0.9, more preferably 1 or higher. However, any Bacillus bacterium such as Bacillus subtilis having these properties can be used as the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the Bacillus bacterium such as Bacillus subtilis bacterium as the active ingredient is the same as the bacterium that is the active ingredient of the preventive or therapeutic agent described
  • the Bacillus bacterium such as Bacillus subtilis bacterium further has protease activity and amylase activity as the above property (3).
  • protease activity and amylase activity of Subtilus C-3102 strain International Deposit No. FERM BP-1096
  • both protease activity and amylase activity of Subtilus C-3102 strain International Deposit No. FERM BP-1096
  • Mastitis is most preferred when administered orally to cattle at a dose of 1 ⁇ 10 5 to 6 ⁇ 10 9 or more / day / head as the property of one or more and / or the property (4) above. You may have the property that it can prevent or treat.
  • the cow is, for example, a normal dairy cow, a dairy cow having a possibility of developing mastitis, a dairy cow having a history of developing mastitis, or a dairy cow having mastitis developing.
  • a dairy cow can be prevented or treated by the composition of the present invention.
  • the composition of the present invention can be used for the treatment, suppression, reduction or improvement of mastitis.
  • Bacillus bacterium examples include Bacillus subtilis C-3102 strain (International Deposit No. FERM BP-1096), mutants of the C-3102 strain having the above properties, Bacillus subtilis type strain, and the like.
  • the above properties (1), the above properties (1) and (2), the above properties (1) and (3), the above properties (1) to (3), the above properties (1) and (4) ), The above properties (1), (3) and (4), or the Bacillus strains having the above properties (1) to (4) are all bacteria that can be used in the present invention.
  • the content of Bacillus genus bacteria such as Bacillus subtilis bacteria in the pharmaceutical composition of the present invention can be, for example, 1 ⁇ 10 5 to 6 ⁇ 10 9 bacteria or more. Since it is preferred that the animals be administered or ingested at a dose of 1 ⁇ 10 5 to 6 ⁇ 10 9 or more per day, the composition may be administered from one to several times (eg 2 to 4 times) Can be divided orally or fed separately.
  • the pharmaceutical composition can optionally contain a mastitis therapeutic agent (antibiotics, etc.).
  • a mastitis therapeutic agent antibiotics, etc.
  • the mastitis treatment agent listed in the “Stock Price Standard List for Livestock Mutual Aid Effectiveness” (Japan Veterinary Drug Association) can be used.
  • yellow known as a causative agent of mastitis Antibiotics such as cepham antibiotics, penicillin antibiotics and macrolide antibiotics effective against bacteria such as staphylococci, Escherichia coli, streptococci, and Pseudomonas aeruginosa, for example, the antibiotics exemplified above.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is in the form of solid, semi-solid or liquid, and in the case of solid, it is in the form of powder, granule, pill, pellet, tablet, capsule and the like, and in the case of semi-solid, it is in the form of gel and the like In the case of a liquid, it is in the form of a suspension or the like.
  • the prophylactic agent contains, for example, a pharmaceutically acceptable carrier (eg, excipient, diluent, etc.) and optionally an additive for formulation into a dosage form, in addition to the cells as active ingredients. Can do.
  • Examples of the carrier include lactose, mannitol, sorbitol, xylitol, microcrystalline cellulose, starch, dicalcium phosphate, purified water, gelatin, agar, sodium alginate, carrageenan and the like.
  • Additives are not limited to the following, but may include binders, disintegrants, lubricants, fillers, lubricants, surfactants, antioxidants, fungicides, thickeners, and the like.
  • the additive may be appropriately selected from the following and contained in the composition.
  • binder examples include sodium starch glycosate, tragacanth gum, acacia, polyvinyl pyrrolidone, corn starch, gelatin, powdered cellulose, microcrystalline cellulose, sorbitol, starch, polyvinyl pyrrolidone, vinyl pyrrolidone and vinyl derivative copolymer, hydroxypropyl cellulose, hydroxy Examples thereof include propylmethylcellulose.
  • Disintegrants include, for example, corn starch, potato starch, sodium glycolate starch, sodium carboxymethylcellulose, calcium carboxymethylcellulose, croscarmellose sodium, crospovidone, polyvinylpyrrolidone, methylcellulose, microcrystalline cellulose, hydroxypropyl cellulose substituted with lower alkyl , Pregelatinized starch, sodium alginate and the like.
  • lubricant examples include magnesium stearate, stearic acid, polyethylene glycol, talc, and silica.
  • lubricant examples include silicon dioxide, talc, calcium stearate, zinc stearate, sodium stearyl fumarate, magnesium stearate and the like.
  • surfactant examples include sodium lauryl sulfate and polysorbate 80.
  • Other components include amino acids, vitamins, minerals, pigments (such as astaxanthin, canthaxanthin), enzymes (such as amylase, protease, xylanase, cellulase, ⁇ -glucanase, lipase).
  • amino acids such as astaxanthin, canthaxanthin
  • enzymes such as amylase, protease, xylanase, cellulase, ⁇ -glucanase, lipase.
  • the present invention further prevents or treats mastitis in ruminants, comprising orally administering or feeding the above preventive or therapeutic agent, feed additive, feed or pharmaceutical composition to ruminants in need thereof.
  • ruminants such as dairy cows in conception are treated with 1 ⁇ 10 5 Bacillus bacteria such as Bacillus subtilis per day for at least 1 month before delivery and 3 months after delivery.
  • Bacillus bacteria such as Bacillus subtilis per day for at least 1 month before delivery and 3 months after delivery.
  • ⁇ 1 ⁇ 10 6 or more / day / head preferably 1 ⁇ 10 7 or more / day / head, more preferably 1 ⁇ 10 8 or more / day / head, more preferably 1 ⁇ 10 9 or more / Day / head, most preferably 6 ⁇ 10 9 or more doses are preferred.
  • the dosage form may be divided into 1 to several times a day as described above, and the live bacteria may be administered at the above dose per day as a total amount.
  • the composition can be mixed with a feed such as a feed or a beverage.
  • cows such as dairy cows are often fed with hay and concentrated feed as feed, and are preferably mixed with these feeds.
  • a feed such as a feed or a beverage.
  • cows such as dairy cows are often fed with hay and concentrated feed as feed, and are preferably mixed with these feeds.
  • mastitis onset can be significantly suppressed,
  • mastitis can be treated or reduced for dairy cows with mastitis.
  • the complete cure rate can be increased by combining with antibiotics (above) that can be used for treatment if necessary. It will be possible to shorten the period.
  • Antibiotics effective against causative organisms such as Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Streptococcus, and Pseudomonas aeruginosa are administered to cows with mastitis by intravenous, intramuscular, or oral administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to an animal before, during or after antibiotic administration.
  • the above-mentioned preventive or therapeutic agent, feed additive, or pharmaceutical composition is preferably administered or fed to an animal after being mixed with the animal feed or beverage.
  • 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 6 or more / day / head per day preferably 1 ⁇ 10 7 or more / day / head, more preferably 1 ⁇ 10 8 or more / day. It is preferable to administer or feed the animal at a live cell dose of / head, more preferably 1 ⁇ 10 9 or more / day / head, most preferably 6 ⁇ 10 9 or more.
  • Example 1 ⁇ Treatment of mastitis in dairy cows> Calsporin (registered trademark; Calpis Co., Ltd., Japan) (active ingredient: Bacillus subtilis) for dairy cows (cow number 23 and 15) in the pre-milking period of the test section with a history of mastitis shown in Table 1 below C-3102 strain (FERM BP-1096) 1 ⁇ 10 10 cells / g) is mixed with 6 ⁇ 10 9 or more viable bacteria doses per day in the diet, from 1 month before delivery to 3 after delivery I paid until the month.
  • Calsporin registered trademark; Calpis Co., Ltd., Japan
  • active ingredient Bacillus subtilis
  • the pre-milk period refers to the period from the last delivery to the first month before this delivery, and all of the experiments used in this experiment were the history of mastitis onset 1 to 3 times during the pre-milk period.
  • Table 1 shows the results.
  • Table 1 shows the results.
  • the test plots (cow No. 15 and 23), (1) no mastitis developed, (2) no antibiotics administered, (3) dendritic cell analysis against total dendritic cells during the test period
  • the results showed that the ratio of CD11c + CD172a + blood dendritic cell gate 2 was kept high compared to the control group with little increase and decrease.
  • the ratio of dendritic cell gate 2 tended to be lower than in the test plot.
  • the measurement results of CD11c + CD172a + blood dendritic cell gate 2 are shown in FIG.
  • the individuals (individual Nos. 23 and 15) administered with the Bacillus subtilis C-3102 strain were the individual nos.
  • the ratio of CD11c + CD172a + blood dendritic cell gate 2 before delivery was low, but an increase in the ratio of CD11c + CD172a + blood dendritic cell gate 2 was observed 8 to 10 days after delivery. The onset of mastitis was also suppressed.
  • Example 2 ⁇ Characteristics of Bacillus subtilis effective in preventing or treating mastitis>
  • many live bactericides for cattle are known, but none of them has been specifically shown to be effective in preventing or treating mastitis.
  • Bacillus strain adjusted about a strain, including the difference in the shape of a colony, it shows in B. of Table 3 mentioned later. subtilis 8 strain, licheniformis 1 strain, Bacillus sp. Two strains were prepared.
  • Bifidobacteria growth activity Referring to the method described in the reference (Kouya T. et al., J Biosci. Bioeng. 2007; 103: 464-471), the following procedure was performed. A cellulose mixed ester filter (diameter: 90 mm, pore size: 0.2 ⁇ m (ADVANTEC)) is laid on a TS soft agar medium (agar 0.75%), and a spore suspension (about 1 ⁇ 10 9 CFU / ml) is placed on the filter. 50 ⁇ l was inoculated and cultured at 37 ° C. for 24 hours.
  • a cellulose mixed ester filter (diameter: 90 mm, pore size: 0.2 ⁇ m (ADVANTEC)) is laid on a TS soft agar medium (agar 0.75%), and a spore suspension (about 1 ⁇ 10 9 CFU / ml) is placed on the filter. 50 ⁇ l was inoculated and cultured at
  • Bacillus subtilis C-3102 strain has an average higher activity in all properties than other bacteria. These properties indicate that the survival of cattle in the gastrointestinal tract is increased, and that the bifidobacteria growth in the gastrointestinal tract is increased, contributing to the increase of dendritic cells in the blood. It is inferred. As a result, even if the dairy cow suffers damage to the nipple, etc., it can suppress bacterial infection, and even if it is infected with bacteria, it suppresses infection to the breast milk duct, ducts, and mammary glands. To prevent mastitis. Furthermore, it is presumed that by raising specific dendritic cells, it is also effective in treating dairy cows that have developed mastitis.
  • Bacillus subtilis C-3102 strain has an effect of preventing or treating mastitis in an actual dairy cow.
  • An active Bacillus subtilis bacterium can be expected to have the ability to increase or maintain the dendritic cell gate 2, and an effect equivalent to that of the C-3102 strain can be expected.
  • Example 3 ⁇ Treatment of dairy cows with mastitis>
  • Calsporin registered trademark; Calpis Co., Ltd.
  • active ingredient Bacillus subtilis C-3102 strain (FERM BP-1096)
  • FEM BP-1096 Bacillus subtilis C-3102 strain
  • the present invention can prevent or treat the development of mastitis in ruminants, especially cows such as dairy cows, the economic loss due to the development of mastitis in dairy cows can be greatly improved in the dairy industry. Can be said to be extremely useful.

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Abstract

　この発明は、反芻動物、特に乳牛、の乳房炎を予防または治療するための物質または方法に関するものであり、具体的には、以下の性質、すなわち、牛においてＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１７２ａ＋血中樹状細胞ゲート２を増加または維持させることができる、を有するバチルス属細菌を有効成分として含むことを特徴とする、反芻動物の乳房炎の予防または治療剤、飼料添加物、飼料、あるいは医薬組成物を提供する。

Description

反芻動物の乳房炎の予防または治療剤
　本発明は、特定の性質を有するバチルス属細菌を有効成分として含むことを特徴とする、牛などの反芻動物の乳房炎の予防または治療のための、予防または治療剤、飼料添加物、飼料あるいは医薬組成物に関する。
　乳房炎は、乳腺組織の炎症であり、その原因の多くが、黄色ブドウ球菌、大腸菌、レンサ球菌、緑膿菌などの細菌の感染によるものである。特に、牛における乳房炎は、以下に述べるように酪農家にとって重大な問題である。
　乳房炎は、臨床型乳房炎と潜在性乳房炎（非臨床型乳房炎ともいう）に大別されている。臨床型乳房炎は、乳房が赤く腫れ、発熱し、痛みを伴う、或いは乳汁中にブツが混入するなど肉眼的な異常が認められるのに対し、潜在性乳房炎は、臨床型乳房炎のような異常が見られずに乳腺に炎症が起きる。発生割合は、潜在性乳房炎がはるかに多く、搾乳牛の約２５～５０％が罹患しているといわれている。
　牛の乳房炎の発症に関しては、発症前に乳房炎を予防することや、乳房炎を発症した牛の治療として十分な対策がとられていないのが現状であり、乳業産業での大きな課題となっている。日本国の２００９年度家畜共済統計に報告されている疾病病類別事故頭数では、約１４１万頭の３０％が泌尿器病であり、この９割程度が乳房炎である。また、死廃病類別事故頭数においても、約１６万頭の９％が泌尿器病であることから、２００９年度だけで、乳房炎発症は約４２万頭、廃棄頭数は１．５万頭に上る。さらに、乳房炎を発症した場合には、乳質や乳量が減少するため、経済的損失は計り知れない。そのため、抗生物質の投与による治療が行われるが、完治しない場合も多くあり、隔離以外の方法がないのが現状である。仮に、抗生物質投薬を行って完治したとしても、投薬中の乳の出荷が行えず、乳房炎による経済的な損失は、日本国では、概算で約１千億円といわれている。また、直接的な経済損失以外にも、乳房炎感染牛の治療にかかわる労働負担や薬代も無視できない。さらに、乳房炎を一度発症した乳牛は、それ以降の出産後の授乳期に乳房炎を発症する確率が非常に高いことや、乳房炎を発症した乳牛は、発情が遅れることなど副次的な悪影響が考えられる。そのため、乳業産業において、乳房炎予防や有効な治療手段が求められていることに加え、乳房炎の予防や再発抑制技術の確立が急務となっている。
　これまで、牛などの反芻動物の乳房炎の予防や治療のために種々の提案がされてきた。それらの提案された予防剤または治療剤のなかで、とりわけ、乳房炎の予防や治療のために微生物を利用する例がいくつか報告されている。
　例えば、特許文献１には、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）に属する微生物の培養物から得られる培養組成物を有効成分として含有することを特徴とする牛の乳房炎の予防または治療用組成物が開示されている。
　特許文献２には、パン酵母生菌またはその含有物を有効成分とすることを特徴とする家畜乳房炎予防治療組成物が開示されている。
　その他の例として、乳牛への生菌剤の使用について、例えばナトキン－Ｌ（乳酸菌および枯草菌）、宮入菌粉末（酪酸菌）、ビオスリー（乳酸菌、糖化菌および酪酸菌）、ボバクチン（乳酸菌および酪酸菌）が単純性下痢予防・治療に用いられている（非特許文献１）。この文献の表２には、乳房炎の発生率が生菌剤使用によって減少したことが記載されているが、その生菌剤が何であるかが示されていない。因みに、この文献の表１に列挙された生菌剤のなかで、現状の乳牛への生菌剤投与は、「ビオスリー」が８０～９０％使用されていることから、おそらく表２で使用された生菌剤は「ビオスリー」であると推定される。また、バイオトップ（枯草菌）を含む生菌剤が、鼓張症の発生が激減し、食欲増進および被毛光沢などの効果のほかに、サルモネラ菌を排出する牛の頭数が減少していることなどの効果が知られている（非特許文献２）。
　さらに、バチルス・ズブチルスの生菌体を反芻動物の飼料利用効率改善剤として使用することが、この出願と同じ出願人によって教示されている（特許文献３）。この文献での利用効率改善は、消化吸収効率の改善であり、これにより、乳牛の乳量や乳質も改善される。また、バチルス・ズブチルスＣ－３１０２株をビタミン、ミネラル、アミノ酸等と混合してなる飼料添加物もまた、この出願と同じ出願人によって教示されている（特許文献４）。さらにまた、バチルス・ズブチルスを、反芻動物等の動物の腸内の病原性細菌の増殖を低下させるために使用することが特許文献５に記載されている。しかし、特許文献３、４および５には、バチルス・ズブチルスが牛の乳房炎の予防や治療のために有用であることは記載されていない。
特開２０１２－１２６６５７号公報 特開２００１－２２４３１７号公報 国際公開２０１１／１１５３０６号 特開昭６４－８６８４２号公報 特表２０１２－５０２９２０号公報
斉藤康倫，　臨床獣医，　２０１０．Ｓｅｐ．，　Ｖｏｌ．２８，　　Ｎｏ．９ ニッサン情報，　第３４号，　平成１８年８月，　日産合成工業株式会社
　上記の背景技術の中で述べたように、牛の乳房炎の予防や有効な治療手段が乳業産業において強く求められている。
　したがって、本発明の目的は、牛の乳房炎を予防および／または治療するための、剤または医薬組成物或いは方法を提供することである。
　本発明者らは、今回、特定のバチルス属細菌が、牛、とりわけ乳牛への給与（あるいは、投与または摂取）により乳房炎予防効果を発揮すること、さらには、発症後の乳房炎の治療効果を高めることを見出した。
　したがって、本発明は、以下の特徴を包含する。
　　［１］下記の（１）の性質：
（１）牛においてＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１７２ａ＋血中樹状細胞ゲート２を増加または維持させることができる、
を有するバチルス属細菌を有効成分として含むことを特徴とする、反芻動物の乳房炎の予防または治療剤。
　［２］前記バチルス属細菌が、下記の（２）の性質をさらに有する、［１］に記載の予防または治療剤。
　（２）ビフィズス菌増殖活性が、バチルス・ズブチルスＣ－３１０２株（国際寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９６）のビフィズス菌増殖活性を１としたとき、０．８より高い
　［３］前記バチルス属細菌が、下記の（３）の性質を有する、［１］または［２］に記載の予防または治療剤。
（３）プロテアーゼ活性およびアミラーゼ活性が、バチルス・ズブチルスＣ－３１０２株（国際寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９６）のプロテアーゼ活性およびアミラーゼ活性をともに１としたとき、０．７より高い
　［４］前記バチルス属細菌が、下記の（４）の性質を有する、［１］～［３］のいずれかに記載の予防または治療剤。
（４）１×１０５個以上／日／頭の用量で牛に経口投与したとき、乳房炎を予防または治療することができる
　［５］前記反芻動物が牛である、［１］～［４］のいずれかに記載の予防または治療剤。
　［６］前記性質（４）における前記経口投与が、牛の分娩１か月前から分娩後３か月までの期間行われる、［４］～［５］のいずれかに記載の予防または治療剤。
　［７］前記バチルス属細菌が、バチルス・ズブチルス細菌である、［１］～［６］のいずれかに記載の予防または治療剤。
　［８］前記バチルス・ズブチルス細菌が、バチルス・ズブチルスＣ－３１０２株（国際寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９６）、あるいは、前記性質（１）、前記性質（１）および（２）、前記性質（１）および（３）、前記性質（１）～（３）、前記性質（１）および（４）、前記性質（１）、（３）および（４）、または前記性質（１）～（４）を有する、Ｃ－３１０２株の変異株である、［７］に記載の予防または治療剤。
　［９］［１］～［８］のいずれかに記載の予防または治療剤を有効成分として含むことを特徴とする、反芻動物の乳房炎を予防または治療するための飼料添加物。
　［１０］乳房炎治療用抗生物質をさらに含む、［９］に記載の飼料添加物。
　［１１］反芻動物の乳房炎を予防または治療するための有効量の［９］または［１０］に記載の飼料添加物を含むことを特徴とする、反芻動物の乳房炎の予防または治療効果が強化された飼料。
　［１２］反芻動物の乳房炎を予防または治療するための有効量の［９］または［１０］に記載の飼料添加物を、反芻動物用の飼料に添加することを含むことを特徴とする、反芻動物用の飼料において、反芻動物の乳房炎の予防または治療効果を強化するための方法。
　［１３］下記の（１）の性質：
（１）牛においてＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１７２ａ＋血中樹状細胞ゲート２を増加または維持させることができる、
を有する、有効成分としてのバチルス属細菌を、製薬上許容可能な担体とともに含むことを特徴とする、反芻動物の乳房炎を予防または治療するための医薬組成物。
　［１４］前記バチルス属細菌が、下記の（２）の性質をさらに有する、[１３]に記載の予防または治療するための医薬組成物。
（２）ビフィズス菌増殖活性が、バチルス・ズブチルスＣ－３１０２株（国際寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９６）のビフィズス菌増殖活性を１としたとき、０．８より高い
　［１５］前記バチルス属細菌が、下記の（３）の性質を有する、［１３］または［１４］に記載の予防または治療するための医薬組成物。
（３）プロテアーゼ活性およびアミラーゼ活性が、バチルス・ズブチルスＣ－３１０２株（国際寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９６）のプロテアーゼ活性およびアミラーゼ活性をともに１としたとき、０．７より高い
　［１６］前記バチルス属細菌が、下記の（４）の性質を有する［１３］～［１５］のいずれかに記載の予防または治療するための医薬組成物。
（４）１×１０５個以上／日／頭の用量で牛に経口投与したとき、乳房炎を予防または治療することができる
　［１７］前記反芻動物が牛である、［１３］～［１６］のいずれかに記載の医薬組成物。
　［１８］前記牛が、正常乳牛、乳房炎発症の可能性のある乳牛、乳房炎発症中の乳牛、または乳房炎発症歴のある乳牛である、［１３］～［１７］のいずれかに記載の医薬組成物。
　［１９］前記性質（４）における前記経口投与が、牛の分娩１か月前から分娩後３か月までの期間行われる、［１６］～［１８］のいずれかに記載の医薬組成物。
　［２０］前記バチルス属細菌が、バチルス・ズブチルス細菌である、［１３］～［１９］のいずれかに記載の医薬組成物。
　［２１］前記バチルス・ズブチルス細菌が、バチルス・ズブチルスＣ－３１０２株（国際寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９６）、あるいは、前記性質（１）、前記性質（１）及び（２）、前記性質（１）および（３）、前記性質（１）～（３）、前記性質（１）および（４）、前記性質（１）、（３）および（４）、または前記性質（１）～（４）を有する、Ｃ－３１０２株の変異株である、［２０］に記載の医薬組成物。
　［２２］乳房炎治療用抗生物質がさらに含まれる、［１３］～［２１］のいずれかに記載の医薬組成物。
　［２３］［１］～［８］のいずれかに記載の予防または治療剤、［９］もしくは［１０］に記載の飼料添加物、［１１］に記載の飼料、あるいは、［１３］～［２２］のいずれかに記載の医薬組成物を、それを必要とする反芻動物に投与または給与することを含む、反芻動物において乳房炎を予防または治療する方法。
　［２４］乳房炎治療用抗生物質を必要に応じて投与することをさらに含む、［２３］に記載の方法。
　本発明は、反芻動物、好ましくは牛、より好ましくは乳牛、における乳房炎の予防または治療において予防および治療効果の高い特定の性質をもつバチルス属細菌を提供する。乳房炎既往歴のある乳牛は、抗生物質治療により症状が改善した後であっても、その後の出産を経るごとに乳房炎を発症する確率が非常に高いことが知られているが、本発明の予防または治療剤は、分娩約１か月前から経口投与または給与することによって、その後の乳房炎の発症を有効に抑制し、多くの場合、完全に発症のない状態にすることができるという、予想外の有効性を発揮する。
この図は、本発明で有効成分として使用するバチスル・ズブチルス細菌が乳房炎を改善する効果との相関性を示す、牛のＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１７２ａ＋血中樹状細胞ゲート２の増加を立証する図である。Ａは、第１象限（右上）のゲート１内に検出されるＣＤ１１ｃ陽性ＣＤ１７２ａ陽性の血中樹状細胞ゲート２（乳房炎改善の場合、ＣＤ１７２ａおよびＣＤ１１ｃの発現強度がともに高くなる）およびゲート３（ゲート２細胞と比べてＣＤ１７２ａの発現強度が低い）のおおよその位置または範囲を模式的に示す。Ｂは、慢性乳房炎牛（対照）のＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１７２ａ＋血中樹状細胞の二色フローサイトメトリー解析（ｄｕａｌ　ｃｏｌｏｒ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ）結果を示し、Ｃは、本発明の予防・治療剤が投与された、試験区の乳牛（牛番号２３：分娩９日目（左）および牛番号１５：分娩８日目（右））のＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１７２ａ＋血中樹状細胞の二色フローサイトメトリー分析結果を示す。Ｄは、バチスル・ズブチルス細菌非投与の対照乳牛（牛番号９４：分娩８日目（左）および牛番号９０２：分娩１０日目（右））のＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１７２ａ＋血中樹状細胞の二色フローサイトメトリー分析結果を示す。
　以下において、本発明をさらに詳細に説明する。
１．予防または治療剤
　本発明は、以下で説明する特定の性質を有するバチルス属細菌、好ましくはバチルス・ズブチルス細菌を有効成分として含む、反芻動物の乳房炎の予防または治療剤を提供する。
　以下に、乳房炎、バチルス属細菌および予防剤について説明する。
［１］　乳房炎
　本明細書で使用する乳房炎は、反芻動物、好ましくは牛、さらに好ましくは乳牛の乳房炎であり、この疾患には、臨床型乳房炎と潜在性乳房炎（非臨床型乳房炎ともいう）が含まれる。上記の背景技術の項で説明したように、臨床型乳房炎は、乳房が赤く腫れ、発熱し、痛みを伴う、或いは乳汁中にブツが混入するなど、肉眼的な異常が認められるのに対し、潜在性乳房炎は、臨床型乳房炎のような異常が見られずに乳腺に炎症が起きる。発生割合は、潜在性乳房炎がはるかに多く、搾乳牛の約２５～５０％が罹患しているといわれている。臨床型乳房炎は、抗生物質による投薬治療で完治しやすいが、一方、潜在性乳房炎は難治性であって有効な治療法がないため感染動物の隔離などの対策を講じるしか手段がない。
　特に上記の乳房炎、とりわけ潜在性乳房炎を発症した乳牛は、乳泌量や乳質の低下を起こし、また抗生物質などの化学療法剤を使用した場合には乳を出荷できないため、経済的な損失が大きい。
　本発明の予防または治療剤は、臨床型乳房炎だけでなく潜在性乳房炎にも有効である。潜在性乳房炎の予防および治療のために有効な療法は、これまで報告がないため、本発明の予防または治療剤等は酪農（乳業）産業上重要である。
　本明細書で使用される「反芻動物」には、牛、山羊、羊などの家畜動物が含まれる。特に乳汁を分泌生産する反芻動物、例えば牛、山羊などが好ましい。好ましい牛は、乳牛（例えば、ホルスタイン種、ジャージー種、ガーンジー種、エアーシャー種、ケリー種、ディリー・ショートホーン種、レッド・デーニシュ種、シンメンタール種など）、とりわけ正常乳牛、乳房炎発症の可能性のある乳牛、乳房炎発症中の乳牛、または乳房炎発症歴のある乳牛である。本発明の予防剤は、とりわけ正常乳牛、乳房炎発症の可能性のある乳牛または乳房炎発症歴のある正常乳牛に有効であり、乳房炎発症中の乳牛においては治療剤として使用することができる。
［２］　バチルス属細菌
　本発明の予防または治療剤は、下記の性質（１）および、場合により、（２）：
　（１）牛においてＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１７２ａ＋血中樹状細胞ゲート２を増加または維持させることができる、
　（２）ビフィズス菌増殖活性が、バチルス・ズブチルスＣ－３１０２株（国際寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９６）のビフィズス菌増殖活性を１としたとき、０．８より高い、
を有するバチルス属細菌を有効成分とする。
　上記の（１）および、場合により、（２）の性質を有するバチルス属細菌はいずれであっても本発明の予防または治療剤の有効成分として使用可能である。
　上記の性質（１）について、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１７２ａ＋血中樹状細胞は、抗原提示細胞であり血液中を移動し局所免疫調節を行う、ＣＤ１１ｃ陽性およびＣＤ１７２ａ陽性の細胞である。この細胞は、末梢血から、リンホライト－Ｈを使用する比重遠心（２３００ｒｐｍ，　３０分）によりリンパ球集団を回収し、さらに単球、Ｂ細胞およびＴ細胞を分離したのち、磁気ビーズ結合抗ＣＤ１１ｃ抗体および磁気ビーズ結合抗ＣＤ１７２ａ抗体と、ＭＡＣＳ分離カラムとを使用する磁気分離細胞システム（ＭＡＣＳ法）によってＣＤ１１ｃ陽性およびＣＤ１７２ａ陽性の細胞として分離し、さらに二色フローサイトメトリー法でＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１７２ａ＋血中樹状細胞を解析することができる。ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１７２ａ＋血中樹状細胞は、図１Ａの第１象限のゲート１内に示される２つの特徴的な細胞集団（ゲート２およびゲート３）からなり、これらの細胞集団のうち特にゲート２が、本発明のバチルス・ズブチルス細菌の投与によって、乳房炎を発症するまたは回復していない牛では減少し、回復したまたは発症のない牛では増加するという知見が認められたことから、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１７２ａ＋血中樹状細胞が乳房炎の発症の有無または回復の有無と相関性があることが初めて見出された。
　上記の知見から、乳房炎の発症リスクが高い時期（分娩後３か月以内の時期、とりわけ、分娩後約１か月以内）に、乳房炎の原因となる細菌などに曝された場合に、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１７２ａ＋血中樹状細胞ゲート２が、増加することで乳房炎を予防していることが考えられる。すなわち、本発明の予防・治療剤により、投与対象のＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１７２ａ＋血中樹状細胞ゲート２は、環境（例えば、細菌への接触、傷害の状況など）によって高められる。逆に言えば、乳房炎を発症している牛については、この期間のＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１７２ａ＋血中樹状細胞ゲート２を高めることができていない。つまり、本明細書中のバチルス・ズブチルスなどのバチルス属細菌の性質の１つである「ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１７２ａ＋血中樹状細胞ゲート２を増加または維持させることができる」とは、対象動物の血中の総樹状細胞におけるＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１７２ａ＋樹状細胞ゲート２の割合を、上記の乳房炎の発症リスクが高い時期における乳房炎発症時の割合より、増加させる、または、高く維持させる、それによって乳房炎の発症を予防するのに適した免疫環境を整えることを意味する。
　上記の性質（２）について、本発明で使用可能なバチルス・ズブチルスはまた、ビフィズス菌増殖活性が、バチルス・ズブチルスＣ－３１０２株（国際寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９６）のビフィズス菌増殖活性を１としたとき、０．８より高い、好ましくは０．９より高い、さらに好ましくは１以上であるという特徴を有している。ビフィズス菌増殖活性は免疫力増強に関連する側面を有しており、樹状細胞増殖活性との関連は今までに報告されていないが、バチルス・ズブチルスＣ－３１０２株のビフィズス菌増殖活性に対して同等（８０％程度）以上の能力を有していれば、樹状細胞増殖活性を通じて乳房炎予防または治療効果を有することが期待される。
　本発明で使用可能なバチルス属細菌はさらに、以下の（３）および／または（４）の性質を有することができる。
　　（３）　プロテアーゼ活性およびアミラーゼ活性が、バチルス・ズブチルスＣ－３１０２株（国際寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９６）のプロテアーゼ活性およびアミラーゼ活性をともに１としたとき、０．７より高い
　　（４）　１×１０５個以上／日／頭の用量で牛に経口投与したとき、乳房炎を予防または治療することができる
　上記の性質（３）について、本発明で使用可能なバチルス属細菌は、１×１０６個以上／日／頭、好ましくは１×１０７個以上／日／頭、より好ましくは１×１０８個以上／日／頭、さらに好ましくは１×１０９個以上／日／頭、最も好ましくは６×１０９個以上／日／頭の用量で牛に経口投与した場合、乳房炎を予防または改善することができるという特徴を有する。ここで、上記の用量は、１頭あたり１日に動物が摂取するバチルス属細菌の生菌細胞数であり、動物への摂取は、１回～複数回、例えば２～４回、に分けて行うことができる。また、経口投与は、通常、牛の分娩１か月前から分娩後３か月までの期間行われ、末梢血中のＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１７２ａ＋血中樹状細胞、特に図１に示されるゲート２の増加を指標とすることで、或いは獣医師による診断所見に基づく判定によって、乳房炎からの回復、改善の有無を確認することができる。
　上記の性質（４）について、プロテアーゼ活性およびアミラーゼ活性が、バチルス・ズブチルスＣ－３１０２株（国際寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９６）のプロテアーゼ活性およびアミラーゼ活性をともに１としたとき、０．７より高い、好ましくは０．８より高い、さらに好ましくは０．９より高い、最も好ましくは１以上という性質を有することができる。プロテアーゼ活性およびアミラーゼ活性は、例えば後述の実施例に記載のような方法によって測定しうる。生菌剤として知られるバチルス属細菌のなかでも、バチルス・ズブチルス、例えばバチルス・ズブチルスＣ－３１０２株は高いプロテアーゼ活性およびアミラーゼ活性を有している（後述表３参照）。
　上記の性質（１）および、場合により、（２）を有するバチルス属細菌として、バチルス・ズブチルス細菌、バチルス・リケニフォルミス細菌、バチルス・アミロリキファシエンス細菌などを挙げることができ、具体的には、例えば、バチルス・ズブチルスＣ－３１０２株（国際寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９６）、上記の性質（１）、上記の性質（１）および（２）、上記の性質（１）および（３）、上記の性質（１）～（３）、上記の性質（１）および（４）、上記の性質（１）、（３）および（４）、または上記の性質（１）～（４）を有する該Ｃ－３１０２株の変異株、バチルス・ズブチルスタイプストレインなどを例示することができる。好ましいバチルス属細菌は、上記のバチルス・ズブチルスＣ－３１０２株および上記の該Ｃ－３１０２株の変異株である。
　バチルス・ズブチルスＣ－３１０２菌株は、１９８５年１２月２５日に、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１つくばセンター中央第６（郵便番号３０５－８５６６）［寄託時；日本国茨城県筑波郡谷田部町東１丁目１番地３（郵便番号３０５）］の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号微工研菌寄第８５８４号として国内寄託し、１９８６年６月　２８日に、同機関にて寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９６（移管時；微工研条寄第１０９６号）として国際寄託に移管された（特開昭６２－２３２３４３号公報）。該Ｃ－３１０２菌株はまた、「カルスポリン」（登録商標）の商品名で、本出願人によって市販されている。
　バチルス・ズブチルスＣ－３１０２株の変異株は、例えば、紫外線、Ｘ線などの高エネルギー線の照射下での培養、ニトロソグアニジン、Ｎ－エチル－Ｎ－ニトロソウレア、ニトロソアミンなどの変異原性物質の存在下での培養により突然変異を人工的に誘導し、変異株コロニー単離し、さらに、例えば該変異株のｒＤＮＡ（通常、菌分類に使用される。）の塩基配列をＣ－３１０２株の配列と比較することによって突然変異株であることの検定を行い、ならびに、上記の性質（１）、上記の性質（１）および（２）、上記の性質（１）および（３）、上記の性質（１）～（３）、上記の性質（１）および（４）、上記の性質（１）、（３）および（４）、または上記の性質（１）～（４）を有することを確認することによって得ることができる。
　本発明で使用可能なバチルス属細菌は、その培養物をそのまま用いることができるが、必要に応じて、遠心分離、濾過等の分離手段により菌体成分を分離または濃縮した後、例えば凍結乾燥、真空熱乾燥、噴霧乾燥などの乾燥法によって乾燥体として得ることができる。バチルス・ズブチルスは、当業者に慣用的な培養条件で培養することができる。
　バチルス・ズブチルスの培養のための培地には、少なくとも炭素源、窒素源および無機塩が含まれる。
　炭素源は、例えば、ソルビトール、グルコース、デンプン、デキストリン、シクロデキストリン、アミロース、アミロペクチン、プルラン、オリゴ糖、グリセリン、麦芽汁等の糖類が挙げられる。これらの炭素源は、１種または２種以上の混合物で使用できる。
　窒素源は、肉エキス、麦芽エキス、酵母エキス、ペプトン、ポリペプトン、タンパク質加水分解物、大豆粉末、乳カゼイン、アミノ酸類、コーンスティープリカー等の有機窒素化合物、並びに／或いは、アンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、尿素等の無機窒素化合物等が挙げられる。窒素源も、単独あるいは２種以上の混合物で使用できる。
　無機塩は、例えば、マグネシウム、マンガン、カルシウム、ナトリウム、カリウム、銅、鉄および亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩および酢酸塩等を使用することができる。
　培地として、市販の培地または栄養ブロスを使用してもよい。
　培養は、公知の培養条件で行うことができる。培養温度は、通常２０～４５℃、好ましくは３５～４２℃であり、また、培養に適当な培地の　ｐＨは、通常、６．０～９．０、好ましくは６．５～８．５であるが、これらの範囲に限定されない。
［３］　予防または治療剤
　本発明の予防または治療剤は、上記の性質（１）、上記の性質（１）および（２）、上記の性質（１）および（３）、上記の性質（１）～（３）、上記の性質（１）および（４）、上記の性質（１）、（３）および（４）、または上記の性質（１）～（４）を有するバチルス属細菌（生菌体）、好ましくはバチルス・ズブチルス細菌、より好ましくはバチルス・ズブチルスＣ－３１０２株またはその変異株を有効成分として含有する。
　上記予防剤中のバチルス属細菌の含有量は、乾燥菌体として、通常、０．００１～９５．０重量％、例えば０．１～４０重量％であるが、予防剤には、該細菌が、例えば１×１０５～６×１０９個またはそれ以上含有することができる。
　予防または治療剤は、経口投与または給与用であり、また固体、半固体または液体の形態であり、固体の場合、粉末、顆粒、丸剤、ペレット、タブレット、カプセルなどの形態であり、半固体の場合、ゲルなどの形態であり、液体の場合、懸濁液などの形態である。該予防または治療剤には、有効成分としての菌体の他に、剤型に処方するための、例えば担体（例えば賦形剤、希釈剤など）、場合により添加剤を含有することができる。
　担体として、例えば、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、微結晶セルロース、デンプン、リン酸二カルシウム、精製水、ゼラチン、寒天、アルギン酸ナトリウム、カラギーナンなどを挙げることができる。
　添加剤には、以下のものに限定されないが、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、充填剤、滑剤、界面活性剤、抗酸化剤、防カビ剤、増粘剤などが含まれる。
　結合剤としては、例えばナトリウムデンプングリコセート、トラガカントゴム、アカシア、ポリビニルピロリドン、コーンスターチ、ゼラチン、粉末セルロース、微結晶セルロース、ソルビトール、デンプン、ポリビニルピロリドン、ビニルピロリドンとビニル誘導体との　コポリマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどが挙げられる。
　崩壊剤としては、例えばコーンスターチ、馬鈴薯デンプン、グリコール酸ナトリウムスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルシウムカルボキシメチルセルロース、クロスカルメロース　ナトリウム、クロスポビドン、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、微結晶セルロース、低級アルキルで置換されたヒドロキシプロピルセルロース、アルファ化スターチ、アルギン酸ナトリウムなどが挙げられる。
　滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ポリエチレングリコール、タルク、シリカなどが挙げられる。
　滑剤としては、例えば二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリルフマル酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウムなどが挙げられる。
　界面活性剤としては、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベート８０などが挙げられる。
　その他の成分として、アミノ酸類、ビタミン類、ミネラル、色素（アスタキサンチン、カンタキサンチンなど）、酵素類（例えばアミラーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ、β－グルカナーゼ、リパーゼなど）などが挙げられる。
　予防または治療剤中の担体および添加剤の合計含有量は、１００％から有効成分（乾燥菌体）の含有率（％）を差し引いた量である。
　本発明の予防または治療剤は、反芻動物、好ましくは牛、より好ましくは乳牛において、乳房炎を予防するために、また場合により治療するために、使用されうる。
　乳房炎予防については、例えば受胎中の乳牛などの牛に、少なくとも分娩前１か月前から分娩後３か月まで、上記性質を有するバチルス・ズブチルス細菌などのバチルス属細菌を１日当り１×１０５～６×１０９個またはそれ以上を、乳牛に経口投与または給与させることによって行うことができる。投与または給与する場合、１日に１～数回に分けて、例えば朝と晩の２回に分けて、全量として該菌を１日当り１×１０５～６×１０９個またはそれ以上を投与することができ、或いは、そのような用量の該予防剤を飼料や飲料などに混合して給与することができる。例えばカルスポリン（登録商標）を給与するのであれば、１日あたりカルスポリン粉末４０ｇ（１．５×１０８　ＣＦＵ）を、例えば朝２０ｇと晩２０ｇを、飼料に配合して給与することができる。乳牛などの牛については、特に、餌として乾草などの粗飼料や濃厚飼料が給与されることが多く、これらの餌に混ぜることが好ましい。投与対象の牛については、過去に乳房炎発症経験のある牛に投与または給与することで、乳房炎発症が予想される牛の乳房炎発症を顕著に抑制できる。
２．飼料添加物および飼料
　本発明はさらに、上記の予防または治療剤を含有する飼料添加物を提供する。
　本発明の飼料添加物は、上記の予防または治療剤を、反芻動物の乳房炎を予防するための有効量の上に定義したバチルス・ズブチルス細菌などのバチルス属細菌を含有するように、飼料添加物を構成する認可された他の任意の成分と混合することによって製造することができる。ここで、バチルス・ズブチルス細菌などのバチルス属細菌の有効量は、１日当り１×１０５～６×１０９個またはそれ以上の該細菌を、動物が摂取可能な量である。
　飼料添加物は、一般に、動物飼料に所望の機能を付与するための物質であり、本発明の場合、該機能は、反芻動物、特に牛、さらに好ましくは乳牛の乳房炎を予防または治療もしくは抑制、軽減するものである。
　飼料添加物にはさらに、乳房炎治療用の抗生物質を含有させることができる。例えば、「家畜共済薬効別薬価基準表　平成２３年度版」には、抗生物質として、乳房炎の原因菌として知られる黄色ブドウ球菌、大腸菌、レンサ球菌、緑膿菌などの菌に有効なセファム系抗生物質、ペニシリン系抗生物質、マクロライド系抗生物質などの抗生物質、例えば、エリスロマイシン、オキシテトラサイクリン塩酸塩、ジクロキサシリンナトリウム、セファゾリン、セフロキシムナトリウム、ナフシリンナトリウム、ベンジルペニシリンプロカイン、硫酸ジヒドロストレプトマイシン、硫酸カナマイシン、セファピリンナトリウム、グリチルリチン酸モノアンモニウム、セファロニウムなどの抗生物質の１種または複数種の混合物が挙げられている。
　飼料添加物には、有効成分の他に、剤を形成するための、例えば、担体（賦形剤または希釈剤）、添加剤などを含有させることができる。担体や添加剤は、本発明の上記予防または治療剤を製造するために使用される上記例示のものである。飼料添加物は、固体、半固体または液体のいずれの形態を有していてもよく、好ましくは固体形態であり、例えば粉末、顆粒、丸剤、ペレット、タブレット、カプセルなどの形状に製造しうる。
　本発明はさらに、乳房炎を予防または治療するための有効量の上記の飼料添加物を、反芻動物用の飼料に添加することを含む、反芻動物用の飼料において、反芻動物の乳房炎の予防または治療効果を強化するための方法を提供する。
　従来、牛などの乳房炎の治療のために、「家畜共済薬効別薬価基準表」（日本動物用医薬品協会）に掲載されている乳房炎治療剤が使用されており、主な治療剤として抗生物質が用いられているが、再発を防止するまでに至っていない。本発明の上記予防または治療剤や、それを含有する飼料添加物は、抗生物質治療を補完することができるものである。
　本発明の予防・治療剤の上記のような特異な特徴のために、本発明はまた、反芻動物の乳房炎を予防または治療するための有効量の上記飼料添加物を含むことを特徴とする、反芻動物の乳房炎の予防または治療効果が強化された飼料にも関する。
　本発明の飼料は、公知の飼料と異なり、反芻動物の乳房炎を予防するための有効量の上記バチルス・ズブチルス細菌などのバチルス属細菌を含有することを特徴とする。本願出願前の公知の飼料では、バチルス・ズブチルス細菌などのバチルス属細菌に反芻動物の乳房炎を予防する（または、治療する）作用もしくは効果があるということは認識されていないため、乳房炎の予防用（または、治療用）として販売されていなかった。
　飼料には、繊維質中心の粗飼料（例えば、青草、乾牧草、サイレージ稲わら、など）と、澱粉、蛋白質を多く含む濃厚飼料（配合飼料ともいう）（例えばトウモロコシ、大豆、米ぬか、ふすま、大麦、マイロなどの穀類、大豆油かす、菜種油かす、綿実油かすなどの植物油かす、など）が含まれ、これらを適当に配合して、牛などの反芻動物に給与される。その他、ビタミン類（ビタミンＡ，　Ｄ３，　Ｅ，　Ｂ１，　Ｂ２，　Ｂ６，　Ｂ１２，　Ｃ，　Ｋ３，イノシトール、ビオチン、パントテン酸、ナイアシン、コリン、葉酸など）、アミノ酸類、食塩、他のミネラル類、などが添加されうる。飼料成分については、例えば、日本標準飼料成分表（独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構編）に記載されているものも使用できる。
　飼料は、上記バチルス・ズブチルス細菌を、１日当り１×１０５～６×１０９個またはそれ以上の細菌を動物が摂取可能な量で含むことが好ましいため、そのような菌体量となるように、本発明の飼料添加物を飼料に配合しうる。
３．乳房炎の予防または治療のための医薬組成物および方法
　本発明はさらに、上記の性質（１）、上記の性質（１）および（２）、上記の性質（１）および（３）、上記の性質（１）～（３）、上記の性質（１）および（４）、上記の性質（１）、（３）および（４）、または上記の性質（１）～（４）を有する、有効成分としてのバチルス・ズブチルス細菌などのバチルス属細菌を、製薬上許容可能な担体とともに含む、反芻動物の乳房炎を予防または治療するための医薬組成物を提供する。
　有効成分としてのバチルス・ズブチルス細菌などのバチルス属細菌は、上記の予防または治療剤の有効成分である細菌と同じであり、上記の性質（１）および、場合により、性質（２）、すなわち、性質（１）として、乳牛などの牛の血中樹状細胞中のＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１７２ａ＋細胞ゲート２を増加させることができる、ならびに、場合により、性質（２）として、ビフィズス菌増殖活性が、バチルス・ズブチルスＣ－３１０２株（国際寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９６）のビフィズス菌増殖活性を１としたとき、０．８より高い、好ましくは０．９より高い、より好ましくは１以上である、を有し、これらの性質を有する、バチルス・ズブチルス細菌などのバチルス属細菌であれば、本発明の医薬組成物の有効成分として使用可能である。
　バチルス・ズブチルス細菌などのバチルス属細菌はさらに、上記の性質（１）および、場合により、上記の性質（２）に加えて、上記の性質（３）として、プロテアーゼ活性およびアミラーゼ活性が、バチルス・ズブチルスＣ－３１０２株（国際寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９６）のプロテアーゼ活性およびアミラーゼ活性をともに１としたとき、０．７より高い、好ましくは０．８より高い、より好ましくは０．９より高い、最も好ましくは１以上という性質、および／または、上記の性質（４）として、１×１０５～６×１０９個またはそれ以上／日／頭の用量で牛に経口投与したとき、乳房炎を予防または治療することができるという性質、を有していてもよい。
　本発明では、牛は、例えば、正常乳牛、乳房炎発症の可能性のある乳牛、乳房炎発症歴のある乳牛、または乳房炎発症中の乳牛である。このような乳牛であれば、本発明の組成物により予防または治療が可能になる。さらにまた、実際に乳房炎を発症している牛であれば乳房炎の治療、あるいは、抑制、軽減もしくは改善のために、本発明の組成物を使用することができる。
　上記バチルス属細菌の例として、バチルス・ズブチルスＣ－３１０２株（国際寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９６）、上記性質を有する該Ｃ－３１０２株の変異体、バチルス・ズブチルスタイプストレインなどが挙げられるが、上記の性質（１）、上記の性質（１）および（２）、上記の性質（１）および（３）、上記の性質（１）～（３）、上記の性質（１）および（４）、上記の性質（１）、（３）および（４）、または上記の性質（１）～（４）を有するバチルス属株であればいずれも、本発明で使用可能な細菌である。
　本発明の医薬組成物中のバチルス・ズブチルス細菌などのバチルス属細菌の含有量は、該細菌として例えば１×１０５～６×１０９個またはそれ以上含有することができる。動物に、１日あたり１×１０５～６×１０９個またはそれ以上の用量で投与または摂取させることが好ましいため、該組成物を、１回から複数回（例えば２回～４回）に分けて経口投与または給与させることができる。
　医薬組成物には、場合により、乳房炎治療剤（抗生物質など）を含有させることができる。乳房炎治療剤としては、「家畜共済薬効別薬価基準表」（日本動物用医薬品協会）に掲載されている乳房炎治療剤を用いることができるが、特に、乳房炎の原因菌として知られる黄色ブドウ球菌、大腸菌、レンサ球菌、緑膿菌などの菌に有効なセファム系抗生物質、ペニシリン系抗生物質、マクロライド系抗生物質などの抗生物質、例えば、上記例示の抗生物質が挙げられる。
　本発明の医薬組成物は、固体、半固体または液体の形態であり、固体の場合、粉末、顆粒、丸剤、ペレット、タブレット、カプセルなどの形態であり、半固体の場合、ゲルなどの形態であり、液体の場合、懸濁液などの形態である。該予防剤には、有効成分としての菌体の他に、剤型に処方するための、例えば製薬上許容可能な担体（例えば賦形剤、希釈剤など）、場合により添加剤を含有することができる。
　担体として、例えば、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、微結晶セルロース、デンプン、リン酸二カルシウム、精製水、ゼラチン、寒天、アルギン酸ナトリウム、カラギーナンなどを挙げることができる。
　添加剤には、以下のものに限定されないが、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、充填剤、滑剤、界面活性剤、抗酸化剤、防カビ剤、増粘剤などが含まれうる。添加剤は、以下のものから適宜選択して、組成物に含有されうる。
　結合剤としては、例えばナトリウムデンプングリコセート、トラガカントゴム、アカシア、ポリビニルピロリドン、コーンスターチ、ゼラチン、粉末セルロース、微結晶セルロース、ソルビトール、デンプン、ポリビニルピロリドン、ビニルピロリドンとビニル誘導体との　コポリマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどが挙げられる。
　崩壊剤としては、例えばコーンスターチ、馬鈴薯デンプン、グリコール酸ナトリウムスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルシウムカルボキシメチルセルロース、クロスカルメロース　ナトリウム、クロスポビドン、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、微結晶セルロース、低級アルキルで置換されたヒドロキシプロピルセルロース、アルファ化スターチ、アルギン酸ナトリウムなどが挙げられる。
　滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ポリエチレングリコール、タルク、シリカなどが挙げられる。
　滑剤としては、例えば二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリルフマル酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウムなどが挙げられる。
　界面活性剤としては、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベート８０などが挙げられる。
　その他の成分として、アミノ酸類、ビタミン類、ミネラル、色素（アスタキサンチン、カンタキサンチンなど）、酵素類（例えばアミラーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ、β－グルカナーゼ、リパーゼなど）などが挙げられる。
　本発明はさらに、上記の予防または治療剤、飼料添加物、飼料あるいは医薬組成物を、それを必要とする反芻動物に経口投与または給与することを含む、反芻動物において乳房炎を予防または治療する方法を提供する。
　乳房炎予防または治療については、受胎中の乳牛などの反芻動物に、少なくとも分娩前１か月前から分娩後３か月まで、バチルス・ズブチルス細菌などのバチルス属細菌を１日あたり１×１０５～１×１０６個もしくはそれ以上／日／頭、好ましくは１×１０７個以上／日／頭、より好ましくは１×１０８個以上／日／頭、さらに好ましくは１×１０９個以上／日／頭、最も好ましくは６×１０９個以上の用量で投与することが好ましい。投与形態については、上記のとおり１日に１～数回に分けて、全量として該生菌を１日当りの上記用量を投与すればよい。医薬組成物の投与に際しては、該組成物を飼料、飲料などの食餌に混合して給与することができる。乳牛などの牛については、特に、餌として乾草や濃厚飼料が給与されることが多く、これらの餌に混ぜることが好ましい。投与対象の牛、特に乳牛については、正常乳牛、乳房炎発症の可能性のある乳牛、または乳房炎発症歴のある乳牛であり、このような乳牛において、乳房炎発症が顕著に抑制できるし、また、乳房炎発症中の乳牛に対して乳房炎を治療もしくは軽減することができる。
　また、乳房炎の発症が確認された牛においては、必要であれば従来から治療に用いることができる抗生物質（上記）との併用により、完治率を高めることができるし、また、完治までの期間を短縮することができるだろう。黄色ブドウ球菌、大腸菌、レンサ球菌、緑膿菌などの原因菌に有効な抗生物質を、乳房炎を発症した牛に、静脈内投与、筋肉内投与、経口投与などの方法で投与し、一方で、抗生物質の投与の前、中または後に、本発明の医薬組成物を動物に投与することができる。
　上記の予防または治療剤、飼料添加物、または医薬組成物は、動物の飼料または飲料等に混ぜて、動物に投与または給与することが好ましい。
　また、用量について、１日あたり１×１０５～１×１０６個もしくはそれ以上／日／頭、好ましくは１×１０７個以上／日／頭、より好ましくは１×１０８個以上／日／頭、さらに好ましくは１×１０９個以上／日／頭、最も好ましくは６×１０９個以上の生菌用量となるように、動物に投与または給与することが好ましい。
　以下に実施例を挙げ、それを参照しながら本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって制限されないものとする。
［実施例１］
＜乳牛での乳房炎の処置＞
　下記の表１に示した乳房炎発症歴のある試験区の前乳期の乳牛（牛番号２３および１５）に対し、カルスポリン（登録商標；カルピス（株）、日本）（有効成分：バチルス・ズブチルスＣ－３１０２株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９６）１×１０１０個／ｇ）を、１日あたり６×１０９個以上の生菌用量を餌に混合し、分娩前１か月前から分娩後３か月まで給与した。えさは、泌乳期は酪農家族マックス（北日本くみあい飼料、日本）・アストロライナー（ビタミン剤：雪印、日本）・圧片トウモロコシ・粗飼料（チモシー、オーツ、デントコーンサイレージ、アルファルファヘイキューブ）、乾乳期は乾乳期用飼料（トランスプロ：雪印、日本）および粗飼料（チモシー、オーツ）を給与させた。一方、同じ表１に示した乳房炎発症歴のある対照区（牛番号９４および９０２）については、飼料にカルスポリンを添加しなかった。
　前乳期に乳房炎発症履歴のある乳牛は、今期においても乳房炎発症リスクが高いことが知られている。前乳期とは、前回の分娩後から今期の分娩前１か月までの期間を指しており、本実験に用いたのは、いずれも前乳期に１～３回の乳房炎発症履歴のある乳牛であり、抗生物質による投薬を６～２３回受けてきた牛である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に結果を示す。試験区（牛番号１５および２３）ではいずれも、（１）　乳房炎の発症がない、（２）　抗生物質の投薬がない、（３）　樹状細胞分析において試験期間中に総樹状細胞に対するＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１７２ａ＋血中樹状細胞ゲート２の割合が、増減が少なく、対照区と比べて高く維持された、という結果を示した。これに対して、対照区（牛番号９４および９０２）ではいずれも、乳房炎が発症し、抗生物質による治療を受け、また樹状細胞分析においても一時的または慢性的にＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１７２ａ＋血中樹状細胞ゲート２の割合が試験区と比べて低い傾向となった。ここで、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１７２ａ＋血中樹状細胞ゲート２の測定結果を図１（Ｃ，　Ｄ）および表２に示す。試験区では、対照区と比べて、総樹状細胞に対するＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１７２ａ＋血中樹状細胞ゲート２の割合が、分娩後８～１０日において明確に増大している。これは、分娩後の乳房炎のリスクが高い時期（特に、分娩後８～１０日）に、乳房炎の原因となる細菌などに曝された場合に、細菌に対抗し得る免疫能を試験区が有していることを示している。すなわち、総樹状細胞に対するＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１７２ａ＋血中樹状細胞ゲート２の増減が少なく、かつ、必要に応じて高くなることは、バチルス・ズブチルスＣ－３１０２株の投与により乳房炎の発症を防御する血液中の免疫力が増加または維持されていると考えられる。試験期間中、試験区では乳房炎の発症がみられなかったのに対し、対照区では乳房炎を１回または２回発症し抗生物質治療が施された。分娩後７日前後（最も乳房炎を起こしやすい時期）の試験区でのＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１７２ａ＋血中樹状細胞ゲート２の増大は、本発明の予防・治療剤（有効成分：バチルス・ズブチルスＣ－３１０２株）が乳房炎予防のために効果的に作用したことを示す指標となっている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２では、個体Ｎｏ．９４は、血液採取期間１と２の間及び２と３の間で各１回ずつの２回の乳房炎を発症した。また、個体Ｎｏ．９０２は、期間２と３の間で１回乳房炎を発症した。本結果では、個体Ｎｏ．９０２は、分娩後８～１０日にストレスなどの影響で、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１７２ａ＋血中樹状細胞ゲート２の割合が減る減少が見られ、乳房炎を発症したものと考えられる。また、個体Ｎｏ．９４は、分娩前からＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１７２ａ＋血中樹状細胞ゲート２の割合は低く、その後、（細菌に曝されても）ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１７２ａ＋血中樹状細胞ゲート２の割合は十分に上がらず、乳房炎を発症したものと考えられる。一方、バチルス・ズブチルスＣ－３１０２株投与をした個体（個体Ｎｏ．２３及び１５）は、個体Ｎｏ．９４と同様に分娩前のＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１７２ａ＋血中樹状細胞ゲート２の割合は低かったものの、分娩後８～１０日でＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１７２ａ＋血中樹状細胞ゲート２の割合の上昇が見られ、乳房炎の発症も抑制された。
［実施例２］
＜乳房炎の予防または治療に有効なバチルス・ズブチルスの特徴付け＞
　現在、多くの牛用の生菌剤が知られているが、乳房炎予防または治療効果が具体的に示されているものは知られていない。今回、実際に販売されている生菌剤中の各菌株と本発明の対象菌であるバチルス・ズブチルスＣ－３１０２株菌のビフィズス菌増殖活性、プロテアーゼ活性およびアミラーゼ活性を比較した。
（１）菌株について
調整したバチルス菌株については、コロニーの形状の違いを含め、後述の表３に示すＢ．　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　　８菌株、Ｂ．　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ　１菌株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．　２菌株について調製した。
（２）各菌体の芽胞懸濁液の調製
　各々菌株について、ＴＳ寒天培地に塗布し３７℃で一晩培養した。培地上に形成したコロニーを全てスパーテルでかきとり、８０℃に加温した滅菌水に懸濁した。これを３，０００ｒｐｍ室温で１０分間遠心分離し、上清を除去した後に８０℃に加温した滅菌水に再懸濁した。この操作を２回行った後、５　ｍｌの滅菌水に懸濁したものを各菌株の芽胞懸濁液とした。
（３）分泌プロテアーゼ活性の測定
　１％カゼインナトリウムＴＳ寒天培地（１％カゼインナトリウム（和光純薬工業、日本）、３％ＢＢＬ　Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ　ＳｏｙＢｒｏｔｈ、　２％ａｇａｒ）を用い、この培地に各菌株の芽胞懸濁液（約１×１０４　ＣＦＵ／ｍｌ）１μｌをスポットした。その後、３７℃で４８時間培養を行い、コロニー周辺のカゼインの分解により生じるハロの大きさを測定した。ハロの大きさは、コロニーの縁からハロの縁までの距離を測定した。実験は３回行い、３回の測定値の平均値と各回のＣ－３１０２株I型に対する比活性値の平均値をそれぞれの菌株について算出した。
（４）アミラーゼ活性の測定
　１％スターチＴＳ寒天培地（１％でんぷん（和光純薬工業、日本）、３％ＢＢＬ　Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ　ＳｏｙＢｒｏｔｈ，　２％ａｇａｒ）を用い、この培地に各菌株の芽胞懸濁液（約１×１０４　ＣＦＵ／ｍｌ）１μｌをスポットした。３７℃で４８時間培養を行ったのちに、培地上にルゴール液（Ｌｕｇｏｌ’ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ（Ｍｅｒｃｋ））２　ｍｌを滴下し未分解のスターチを染色することによりコロニー周辺に生じるハロの大きさを測定した。ハロの大きさは、コロニーの縁からハロの縁までの距離を測定した。実験は３回行い、３回の測定値の平均値と各回のＣ－３１０２株I型に対する比活性値の平均値をそれぞれの菌株について算出した。
（５）ビフィズス菌増殖活性
　参考文献（Ｋｏｕｙａ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｅｎｇ．　２００７；　１０３：　４６４－４７１）に記載されている方法を参考に、以下のとおり行った。ＴＳ軟寒天培地（ａｇａｒ　０．７５％）上にセルロース混合エステルフィルター（直径９０　ｍｍ孔径０．２　μｍ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ））を敷き、フィルター上に芽胞懸濁液（約１×１０９　ＣＦＵ／ｍｌ）５０μｌを接種し３７℃で２４時間培養を行った。培養後、フィルターをはがして培地を回収し、５０　ｍｌの遠心管に移して８，０００　ｒｐｍ　１５分遠心分離を行った。得られた上清を０．２２μｍのセルロース混合エステルフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）でろ過し、ろ液６０μｌをＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ　ＣＰ２２３８を混釈したＴＰＹ寒天培地（３％ｇｌｕｃｏｓｅ，　０．４％　Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ　ｐｅｐｔｏｎｅ，　０．１５％Ｐｒｏｔｅｏｓｅ　ｐｅｐｔｏｎｅ　Ｎｏ．３，　０．２５％Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ，　０．２％　Ｋ２ＨＰＯ４，　０．３％ＫＨ２ＰＯ４，　０．０２５％ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，　０．０２５％Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎ，　０．０００５％ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，　１．５％　ａｇａｒ）上に置いたペーパーディスク（直径１０　ｍｍ　厚手（ＡＤＶＡＮＴＥＣ））に染み込ませた。これをアネロパック（三菱ガス化学）３枚を入れた嫌気ジャー内で３７℃１８時間嫌気培養を行い、ペーパーディスク周辺に生じたビフィズス菌増殖円の直径を測定した。実験は２回行い、２回の測定値の平均値と各回のＣ－３１０２株I型に対する比活性値の平均値をそれぞれの菌株について算出した。
（６）結果
　表３に、試験した菌の測定結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３から、バチルス・ズブチルスＣ－３１０２株が、他の菌に比べて全ての性質において平均して高い活性があることが確認された。これらの性質は、牛の消化管内での生残性を高めていることを示し、さらに、消化管内のビフィズス菌増殖を高くすることで、血中の樹状細胞を高めることに貢献していることが推察される。その結果、乳牛が乳頭などに傷害を負った場合であっても、細菌感染を抑制することができ、また、細菌に感染したとしても、乳房乳槽部、乳管、乳腺への感染を抑制することで、乳房炎を予防する。さらに、特定の樹状細胞を高めることで乳房炎を発症した乳牛の治療にも有効に働いているものと推察される。
　実際、バチルス・ズブチルスＣ－３１０２株では、実施例１に示すように、実際の乳牛において、乳房炎予防または治療効果が得られており、本菌株を基準に、それに類似するまたは同等の高い上記活性を有しているバチルス・ズブチルス菌であれば、樹状細胞ゲート２の増加または維持させる能力を有することが期待でき、Ｃ－３１０２株と同等の効果が期待できる。
［実施例３］
＜乳房炎発症乳牛の治療＞
　乳房炎発症歴のある泌乳期の乳牛に対し、泌乳期間中に乳房炎が発症した時に、カルスポリン（登録商標；カルピス（株））（有効成分：バチルス・ズブチルスＣ－３１０２株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９６）１×１０１０個／ｇ）を、１日あたり６×１０９個以上の生菌用量を餌に混合し、発症後一定期間（数日～１週間）給与した。えさは、泌乳期は酪農家族マックス（北日本くみあい飼料、日本）・アストロライナー（ビタミン剤：雪印）・圧片トウモロコシ・粗飼料（チモシー、オーツ、デントコーンサイレージ、アルファルファヘイキューブ）、乾乳期は乾乳期用飼料（トランスプロ：雪印、日本）および粗飼料（チモシー、オーツ）を給与させた。
　本発明によって反芻動物、とりわけ乳牛などの牛の乳房炎の発症を予防または治療することができるため、乳業産業において乳牛の乳房炎発症に起因した経済的損失を大幅に改善することができ産業上の有用性が極めて高いといえる。
寄託菌
　「バチルス・ズブチルスＣ－３１０２菌株」は、１９８５年１２月２５日に、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１つくばセンター中央第６（郵便番号３０５－８５６６）［寄託時；日本国茨城県筑波郡谷田部町東１丁目１番地３（郵便番号３０５）］の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号微工研菌寄第８５８４号として国内寄託し、１９８６年６月　２８日に、同機関にて寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９６（移管時；微工研条寄第１０９６号）として国際寄託に移管された。この寄託菌株は、現在、独立行政法人製品評価技術基盤機構のＮＩＴＥ特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ－ＩＰＯＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２０号室（郵便番号２９２－０８１８）にて保管されている。

Claims (24)

  1. 　下記の（１）の性質：
    （１）牛においてＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１７２ａ＋血中樹状細胞ゲート２を増加または維持させることができる、
    を有するバチルス属細菌を有効成分として含むことを特徴とする、反芻動物の乳房炎の予防または治療剤。
  2. 　前記バチルス属細菌が、下記の（２）の性質をさらに有する、請求項１に記載の予防または治療剤。
    　（２）ビフィズス菌増殖活性が、バチルス・ズブチルスＣ－３１０２株（国際寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９６）のビフィズス菌増殖活性を１としたとき、０．８より高い
  3. 　前記バチルス属細菌が、下記の（３）の性質を有する、請求項１または２に記載の予防または治療剤。
    （３）プロテアーゼ活性およびアミラーゼ活性が、バチルス・ズブチルスＣ－３１０２株（国際寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９６）のプロテアーゼ活性およびアミラーゼ活性をともに１としたとき、０．７より高い
  4. 　前記バチルス属細菌が、下記の（４）の性質を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の予防または治療剤。
    （４）１×１０５個以上／日／頭の用量で牛に経口投与したとき、乳房炎を予防または治療することができる
  5. 　前記反芻動物が牛である、請求項１～４のいずれか１項に記載の予防または治療剤。
  6. 　前記性質（４）における前記経口投与が、牛の分娩１か月前から分娩後３か月までの期間行われる、請求項４～５のいずれか１項に記載の予防または治療剤。
  7. 　前記バチルス属細菌が、バチルス・ズブチルス細菌である、請求項１～６のいずれか１項に記載の予防または治療剤。
  8. 　前記バチルス・ズブチルス細菌が、バチルス・ズブチルスＣ－３１０２株（国際寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９６）、あるいは、前記性質（１）、前記性質（１）および（２）、前記性質（１）および（３）、前記性質（１）～（３）、前記性質（１）および（４）、前記性質（１）、（３）および（４）、または前記性質（１）～（４）を有する、Ｃ－３１０２株の変異株である、請求項７に記載の予防または治療剤。
  9. 　請求項１～８のいずれか１項に記載の予防または治療剤を有効成分として含むことを特徴とする、反芻動物の乳房炎を予防または治療するための飼料添加物。
  10. 　乳房炎治療用抗生物質をさらに含む、請求項９に記載の飼料添加物。
  11. 　反芻動物の乳房炎を予防または治療するための有効量の請求項９または１０に記載の飼料添加物を含むことを特徴とする、反芻動物の乳房炎の予防または治療効果が強化された飼料。
  12. 　反芻動物の乳房炎を予防または治療するための有効量の請求項９または１０に記載の飼料添加物を、反芻動物用の飼料に添加することを含むことを特徴とする、反芻動物用の飼料において、反芻動物の乳房炎の予防または治療効果を強化するための方法。
  13. 　下記の（１）の性質：
    （１）牛においてＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１７２ａ＋血中樹状細胞ゲート２を増加または維持させることができる、
    を有する、有効成分としてのバチルス属細菌を、製薬上許容可能な担体とともに含むことを特徴とする、反芻動物の乳房炎を予防または治療するための医薬組成物。
  14. 　前記バチルス属細菌が、下記の（２）の性質をさらに有する、請求項１３に記載の予防または治療するための医薬組成物。
    （２）ビフィズス菌増殖活性が、バチルス・ズブチルスＣ－３１０２株（国際寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９６）のビフィズス菌増殖活性を１としたとき、０．８より高い
  15. 　前記バチルス属細菌が、下記の（３）の性質を有する、請求項１３または１４に記載の予防または治療するための医薬組成物。
    （３）プロテアーゼ活性およびアミラーゼ活性が、バチルス・ズブチルスＣ－３１０２株（国際寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９６）のプロテアーゼ活性およびアミラーゼ活性をともに１としたとき、０．７より高い
  16. 　前記バチルス属細菌が、下記の（４）の性質を有する請求項１３～１５のいずれか１項に記載の予防または治療するための医薬組成物。
    （４）１×１０５個以上／日／頭の用量で牛に経口投与したとき、乳房炎を予防または治療することができる
  17. 　前記反芻動物が牛である、請求項１３～１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  18. 　前記牛が、正常乳牛、乳房炎発症の可能性のある乳牛、乳房炎発症中の乳牛、または乳房炎発症歴のある乳牛である、請求項１３～１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  19. 　前記性質（４）における前記経口投与が、牛の分娩１か月前から分娩後３か月までの期間行われる、請求項１６～１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  20. 　前記バチルス属細菌が、バチルス・ズブチルス細菌である、請求項１３～１９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  21. 　前記バチルス・ズブチルス細菌が、バチルス・ズブチルスＣ－３１０２株（国際寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９６）、あるいは、前記性質（１）、前記性質（１）及び（２）、前記性質（１）および（３）、前記性質（１）～（３）、前記性質（１）および（４）、前記性質（１）、（３）および（４）、または前記性質（１）～（４）を有する、Ｃ－３１０２株の変異株である、請求項２０に記載の医薬組成物。
  22. 　乳房炎治療用抗生物質がさらに含まれる、請求項１３～２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  23. 　請求項１～８のいずれか１項に記載の予防または治療剤、請求項９もしくは１０に記載の飼料添加物、請求項１１に記載の飼料、あるいは、請求項１３～２２のいずれか１項に記載の医薬組成物を、それを必要とする反芻動物に投与または給与することを含む、反芻動物において乳房炎を予防または治療する方法。
  24. 　乳房炎治療用抗生物質を必要に応じて投与することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
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