FR3105730A1 - Composition pour le traitement de pathologies des mammifères - Google Patents
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Abstract
L’invention concerne une composition pour son utilisation pour la prévention et/ou le traitement des mammites induites par des microorganismes pathogènes, notamment des bactéries pathogènes, chez les mammifères, notamment chez les ruminants, en particulier les bovins, ladite composition consistant essentiellement en au moins une souche de bactérie du genre Bacillus, notamment Bacillus subtilis, ladite au moins une souche de Bacillus inhibant la capacité d’adhésion desdits microorganismes pathogènes sur les cellules épithéliales mammaires et/ou d’internalisation desdits microorganismes pathogènes dans les cellules épithéliales mammaires. Figure pour l’abrégé : pas de figure
Description
L’invention concerne une composition pour le traitement de pathologies chez les mammifères.
Dans le contexte de l’élevage des animaux destinés notamment à la consommation humaine, il apparaît régulièrement des pathologies qui affectent la santé des animaux interférant ainsi avec le bien-être et la santé des animaux, et leur qualité zootechnique.
En particulier, la mammite est une pathologie qui touche les mammifères, notamment les mammifères d’élevages.
Une mammite est une inflammation de la glande mammaire et une infection du tissu mammaire. Les mammites peuvent revêtir différents aspects : aiguës ou chroniques, visibles ou non visibles (ou subcliniques). Dans tous les cas, elles affectent la mamelle et peuvent avoir des répercussions sur la santé mammaire et donc la santé de l’animal, la production (diminution progressive de la production de lait en fonction de l’augmentation de la sévérité de l’inflammation) ou encore la composition du lait (diminution du taux butyreux, augmentation de la teneur en protéines solubles, réduction du rendement de transformation fromagère).
Au-delà des pertes directes (mortalité, perte de demi-mamelle…) et des frais vétérinaires liés aux traitements des animaux atteints, les mammites représentent un coût non négligeable pour l’éleveur du fait de la perte de production (mise en quarantaine de l’animal infecté) et des pénalités instaurées par les laiteries liées à la qualité cellulaire du lait. Les mammites constituent d’ailleurs la première cause de pertes économiques pour les élevages de grands ruminants laitiers puisque, selon le CNIEL (Centre National Interprofessionnel de l'Economie Laitière), 40% des vaches en production seraient touchées par ce type de pathologie, l’impact économique de telles infections pour la filière française s’élevant à plusieurs millions d’euros par an.
Les mammites ne sont cependant pas limitées aux seuls animaux producteurs de lait pour la consommation humaine mais peuvent également toucher de nombreux autres animaux d’élevage, élevés pour la production de viande (vache allaitante par exemple) ou pour la reproduction (truie reproductrice, chienne de race...)
Au-delà de l’élevage, de nombreux problèmes sanitaires peuvent aussi découler de la survenue de mammites. En particulier, la présence de microorganismes pathogènes dans le lait peut entraîner: une contamination tout au long de la filière laitière, suite à la traite malencontreuse d’animaux infectés, causant notamment des toxi-infections alimentaires chez le consommateur, ou une contamination chez les jeunes animaux tétant leur mère infectée. C’est pourquoi, un animal infecté est mis en quarantaine au plus vite dès qu’il y a détection de mammite.
Aussi, l’on comprend bien qu’il est nécessaire de traiter de telles infections.
Les mammites peuvent avoir des origines diverses, notamment traumatiques (blessures, lésions occasionnées par la machine à traire, lésions créées par les griffes ou dents des petits...)
Dans le cas général, les mammites sont directement occasionnées par la pénétration et la colonisation de la ou des mamelle(s) par des agents infectieux. Ces agents infectieux sont le plus fréquemment des bactéries même si des infections d'origine virale (notamment virus de l'arthrite encéphalite caprine) sont possibles.
Pour les mammites d’origine bactérienne, la principale voie d’entrée dans la mamelle est le canal du trayon. Présentes sur la peau, les muqueuses ou encore dans l'environnement, les bactéries vont franchir le sphincter du trayon, se multiplier dans la citerne de la glande mammaire puis progressivement coloniser le compartiment alvéolaire. Les bactéries vont d’abord adhérer aux cellules épithéliales mammaires, puis seront internalisées dans les cellules. Les bactéries vont alors se multiplier et, pour certaines, sécréter des toxines, jusqu’à induire la lyse des cellules épithéliales, ce qui permettra une dissémination du pathogène au sein de l’organisme de l’animal.
Les mammites des bovins, ainsi que les mammites dans les espèces ovine, caprine et porcine, sont très souvent causées par une infection bactérienne par des souches telles queEscherichia coli(causant des mammites aigües),StaphylococcusdontStaphylococcus aureus(responsable de mammites modérées, souvent chroniques), mais égalementStreptococcusdontStreptococcus uberis,Streptococcus dysgalactiae,Streptocuccus agalactiae et Streptococcus bovis,Pseudomonas aeruginosa, Entérocoques dontEnterococcus hirae , PasteurelladontPasteurella multocidaetPasteurella haemolytica , Salmonella, Corynebacterium pseudotuberculosis , Klebsiella ,ou encoreSerratia.Sont également à l’origine de certaines mammites, les staphylocoques à coagulase négative (SCN) dontStapylococcus caprae,Mycoplasma bovis , Mycoplasma agalactiae , Corynebacterium bovis , Corynebacterium pyogens , Clostridium septicum,Mannheimia haemolytica , Mannheimia glucosida , Archanobacterium pyogenes ,et des levures,Histophilus somni.
Chez les canidés (chiens), les mammites sont fréquemment décrites et sont dues à des infections bactériennes causées parEscherichia coli, Staphylococcus sppdontStaphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes, des streptocoques β-hémolytiques dontStreptococcus canis,Pseudomonas spp,Klebsiella spp , Pasteurella spp , Clostridium spp.
Actuellement, la solution la plus couramment utilisée pour traiter les mammites est l’utilisation d’antibiotiques. Toutefois, les filières d’élevage et les pouvoirs publics encouragent les éleveurs à utiliser des méthodes alternatives viables, limitant les antibiotiques.
La voie de la vaccination a également été envisagée, mais son absence de reproductibilité ne permet pas de trouver une solution généralisable.
D’autres approches telles que des approches utilisant des microorganismes ont également été utilisées. On peut citer par exemple l’utilisation de souches de bactéries lactiques, notammentLactococcus lactisDPC3147, comme traitement intra-mammaire, présenterait une efficacité équivalente à celle d’un cocktail d’antibiotiques classiquement utilisé (Klostermann et al., J Dairy Res . 2008 Aug;75(3):365-7). Toutefois, les effets des bactéries lactiques semblent dépendre des souches utilisées.
D’autres exemples concernent l’utilisation de souches deBacillus, comme par exemple la demande internationale WO/2014/185516 qui enseigne l’utilisation de la soucheBacillus subtilisC-3102 pour le traitement ou la prévention de mammites chez les ruminants. WO/2014/185516 enseigne que cette souche de bactéries est administrée à l’animal par voie orale et a pour effet une modulation du système immunitaire des animaux, permettant de lutter contre l’infection.
Toutefois, il demeure un besoin de fournir une méthode de prévention et de traitement qui s’attaque directement à l’infection (ou à la prévention de celle-ci) sans avoir besoin de stimuler le système immunitaire.
L’invention a donc pour but de pallier les manques de l’art antérieur.
Un des objets de l’invention est de fournir une composition naturelle visant à prévenir et/ou traiter les mammites, en s’attaquant directement à l’infection, et facile à mettre en œuvre en élevage.
L’invention a également pour objet un kit permettant d’utiliser simplement la composition et prévenir ou traiter les mammites.
Aussi, l’invention concerne-t-elle une composition pour son utilisation pour la prévention et/ou le traitement des mammites induites par des microorganismes pathogènes, notamment des bactéries pathogènes, chez les mammifères, notamment chez les ruminants, en particulier les bovins, ladite composition consistant essentiellement en au moins une souche de bactérie du genreBacillus ,notammentBacillus subtilis ,ladite au moins une souche deBacillusinhibant l’adhésion ou la capacité d’adhésion desdits microorganismes pathogènes sur les cellules épithéliales mammaires et/ou l’internalisation ou la capacité d’internalisation desdits microorganismes pathogènes dans les cellules épithéliales mammaires.
L’invention repose sur la constatation surprenante faite par les inventeurs que des souches de bactériesBacillus, notammentBacillus subtilis ,présentant une capacité d’inhibition de la colonisation des cellules épithéliales mammaires par des pathogènes responsables de mammites sont capables de prévenir et/ou traiter les mammites. Dans l’invention, par «colonisationdes cellules épithéliales mammaires », on entend adhésion sur lesdites cellules et/ou l’internalisation dans lesdites cellules.
La composition selon l’invention est «constituée essentiellement» desdites souches deBacillus, notammentBacillus subtilis, ce qui signifie que la composition ne contient, au titre de substance active, que des souches deBacillussusmentionnées. Cela signifie que la composition est susceptible de contenir d’autres composants, mais ces composants additionnels ne participent pas à l’effet technique: c’est-à-dire que ces composants n’ont pas, seuls, d’influence significative sur le traitement ou la prévention des mammites chez les mammifères.
Dans l’invention, par « mammifères », on entend tous les mammifères y compris d’élevage à savoir les bovins dont les vaches allaitantes, les vaches laitières et les bufflonnes, les caprins dont les chèvres, les ovins dont les brebis, les porcins dont les truies reproductrices, les lagomorphes dont les lapines, les canidés dont les chiennes, les félidés dont les chattes, les équidés dont les pouliches et les ânesses, les camélidés dont les chamelles et les dromadaires, et les femmes humaines.
Les mammifères préférés sont les ruminants dont les vaches laitières, les vaches allaitantes, les chèvres, les brebis, et les monogastriques dont les truies reproductrices et les lapines.
Une mammite est une infection de la mamelle. Elle consiste en une inflammation des tissus mammaires. Comme mentionné précédemment, les mammites sont majoritairement induites par des microorganismes pathogènes qui sont avantageusement des bactéries, qui déclenchent une réaction inflammatoire plus ou moins importante. Cette réaction peut avoir également lieu après infection bactérienne et multiplication des bactéries.
Une mammite peut également être causée par des champignons, des parasites ou par un traumatisme.
Avantageusement, une mammite selon l’invention est induite par les bactéries suivantes:Escherichia coli,lesStaphylococcusdontStaphylococcus aureus,lesStreptococcusdontStreptococcus uberis , Streptococcus dysgalactiae , Streptococcus agalactiae et Streptococcus bovis ,lesEntérocoques,lesPasteurella dont Pasteurella multocida et Pasteurella haemolytica ,lesSalmonella,lesCorynebacterium pseudotuberculosis ,lesKlebsiella ,ou encore lesSerratia.
Encore plus avantageusement, une mammite est induite parStaphylococcus aureus , Streptococcus spp .ouEscherichia coli.
Par « souche de bactérie », on entend dans l’invention l’ensemble des individus (bactéries) issus de repiquages successifs d'une colonie bactérienne, cet ensemble étant essentiellement homogène, c’est-à-dire que la très grande majorité des bactéries qui composent la souche ont le même génotype.
En d’autres termes, une souche est une partie d'une espèce bactérienne différente des autres bactéries de la même espèce par une différence mineure mais identifiable. Une souche est également définie comme une population de bactéries qui descend d'un seul organisme ou de la culture isolat pur. Les souches d'une même espèce peuvent différer légèrement les unes des autres à bien des égards.
Comme mentionné ci-dessus, la composition selon l’invention consiste essentiellement en une ou plusieurs souches de bactéries du genreBacillusréduisant la capacité d’adhésion aux cellules épithéliales mammaires et/ou d’internalisation dans les cellules épithéliales mammaires des microorganismes responsables des mammites.
Par capacité d’adhésion et/ou d’internalisation, on entend dans l’invention la capacité d’adhésion, ou la capacité d’internalisation, ou la capacité d’adhésion et d’internalisation.
La capacité d’inhiber l’adhésion ou l’internalisation peut être mesurée comme cela est exposé ci-après dans les exemples.
Avantageusement, l’invention concerne la composition susmentionnée pour son utilisation telle que définie ci-dessus, où ladite au moins une souche deBacillusréduit
la capacité d’adhésion, ou l’adhésion des microorganismes pathogènes sur les cellules épithéliales mammaires d’au moins 20% par rapport à l’adhésion des mêmes microorganismes pathogènes en l’absence de ladite au moins une souche deBacillus ,
et/ou la capacité d’internalisation des microorganismes pathogènes dans les cellules épithéliales mammaires d’au moins 80%, par rapport à l’internalisation des mêmes microorganismes pathogènes en l’absence de ladite au moins une souche deBacillus .
Les bactéries du genreBacillusselon l’invention sont capables de réduire (inhiber), lorsqu’elles sont présentes, l’adhésion des microorganismes pathogènes sur les cellules épithéliales mammaires de plus de 20% par rapport au taux d’adhésion des microorganismes pathogènes seuls. La réduction d’au moins 20% signifie une réduction de 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de l’adhésion par rapport à l’adhésion en absence des bactéries du genreBacillus.
Les bactéries du genreBacillusselon l’invention sont capables de réduire (inhiber), lorsqu’elles sont présentes, l’internalisation des microorganismes pathogènes dans les cellules épithéliales mammaires de plus de 80% par rapport au taux d’internalisation des microorganismes pathogènes seuls. La réduction d’au moins 80% signifie une réduction de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de l’internalisation par rapport à la l’internalisation en absence des bactéries du genreBacillus.
Avantageusement, l’invention concerne la composition susmentionnée pourson utilisation telle que définie ci-dessus, où ladite au moins une souche de bactérie du genreBacillus, notammentBacillus subtilis ,est choisie parmi:
- une souche NOL01 telle que déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur 25-28 rue du Docteur Roux 75724 Paris, France) selon le traité de Budapest le 14 mars 2012 sous le numéro CNCM I – 4606, et
- une souche deBacillus ,notammentBacillus substilis ,appartenant à la même unité taxonomique opérationnelle (OTU) que ladite souche NOL01,
ou un mélange de ces souches.
Avantageusement, l’invention concerne la composition susmentionnée pour son utilisation telle que définie ci-dessus, où ladite au moins une souche de bactérie du genreBacillus, notammentBacillus subtilis, est choisie parmi:
- une souche NOL01 telle que déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur 25-28 rue du Docteur Roux 75724 Paris, France) selon le traité de Budapest le 14 mars 2012 sous le numéro CNCM I – 4606, et
- une souche deBacillus, notammentBacillus subtilis, dont la séquence codant l’ARNr 16S présente au moins 97% d’identité avec la séquence codant l’ARNr 16S de la souche NOL01,
ou un mélange de ces souches.
Les inventeurs ont montré qu’une souche NOL01 ou les souches ayant un génome très similaire à celle-ci, sont capables, par un simple traitement, de prévenir et/ou traiter les mammites. Plus particulièrement, les inventeurs ont pu mettre en évidence que la souche NOL01, et les souches deBacillus ,notamment deBacillus subtilis ,ayant un génome très proche, sont capables d’inhiber l’adhésion des pathogènes responsables des mammites aux cellules épithéliales mammaires, et/ou d’inhiber l’internalisation de ces dits pathogènes dans lesdites cellules.
Dans l’invention, lorsqu’il est fait référence à un dépôt de souche à la CNCM, il est fait référence à un dépôt effectué à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur 25-28 rue du Docteur Roux 75724 Paris, France) selon le traité de Budapest sur la reconnaissance internationale du dépôt des micro-organismes aux fins de la procédure en matière de brevets.
Comme mentionné ci-dessus, la composition selon l’invention consiste essentiellement en une souche NOL01 ou une souche similaire, ou un mélange de celles-ci. Cela signifie que la composition selon l’invention consiste essentiellement en ladite souche NOL01, ou consiste essentiellement en une ou plusieurs souches appartenant à la même unité taxonomique opérationnelle (OTU) que la souche NOL01, ou encore ladite souche NOL01 et une ou plusieurs souches appartenant à la même unité taxonomique opérationnelle (OTU) que la souche NOL01. Des exemples seront donnés ci-après.
Par «une souche deBacillusappartenant à la même unité opérationnelle (OTU) que ladite souche NOL01 » ou par «une souche similaire» à NOL01, ou encore par «les souches ayant un génome très similaire» ou «très proche» à NOL01, on entend dans l’invention toutes les souches deBacillus, notamment deBacillus subtilis ,ayant au moins 97% de séquences génomiques similaires avec la séquence de gènes codant l’ARNr 16S de la souche NOL01.
En biologique, l’OTU est l’unité de base de l'analyse phylogénétique utilisée pour regrouper des individus phylogénétiquement proches. Les séquences d'ADN d'un gène donné, qui sert alors de marqueur taxonomique, sont regroupées par partitionnement de données (clustering) en fonction de leur identité. Un gène principalement utilisé (gène de référence) est l'ARNr 16S pour les bactéries. Ainsi, les OTU sont définies à partir d'un seuil d’identité choisi par l’homme du métier qui est communément de 97%.
Avantageusement, l’invention concerne la composition pour son utilisation telle que définie ci-dessus, où ladite souche deBacillus, notammentBacillus subtilis, appartenant à la même unité taxonomique opérationnelle (OTU) que ladite souche NOL01 est choisie parmi:
- une souche NOL02 telle que déposée à la CNCM le 21 janvier 2016 sous le numéro CNCM I – 5043, et
- une souche NOL03 telle que déposée à la CNCM le 14 mars 2012 sous le numéro CNCM I – 4607.
Les souches NOL02 et NOL03, comme le montre laFigure 1, présentent une très grande proximité phylogénique avec la souche NOL01, dans la mesure où elles font toutes les trois partie du même embranchement de l’arbre.
Avantageusement, l’invention concerne la composition pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ladite composition consistant essentiellement en :
- la souche NOL01, ou
- la souche NOL02, ou
- la souche NOL03, ou
- la souche NOL01 et la souche NOL02, ou
- la souche NOL01 et la souche NOL03, ou
- la souche NOL02 et la souche NOL03, ou
- la souche NOL01, la souche NOL02 et la souche NOL03.
Avantageusement, l’invention concerne la composition pour son utilisation telle que définie ci-dessus, où ladite composition comprend de 104à 1011colonies bactériennes vivantes du ou desditsBacillus, notammentBacillus subtilis,les colonies bactériennes étant par mL ou g de composition.
En d’autres termes, dans ce mode de réalisation avantageux, si la composition selon l’invention est sous forme liquide, ladite composition comprendra de 104à 1011colonies bactériennes deBacillus, notammentBacillus subtilis ,par mL de composition, et cela pour chacune des souches lorsque la composition comprend au moins deux souches.
Si par contre la composition selon l’invention est sous forme déshydratée ou non aqueuse (sous forme solide), ladite composition comprendra de 104à 1011colonies bactériennes deBacillus, notammentBacillus subtilis ,par g de composition, et cela pour chacune des souches lorsque la composition comprend au moins deux souches.
Dans l’invention, «de 104à 1011colonies bactériennes» signifie : environ 104, environ 5.104, environ 105, environ 5.105, environ 106, environ 5.106, environ 107, environ 5.107, environ 108, environ 5.108, environ 109, environ 5.109, environ 1010, environ 5.1010ou environ 1011colonies bactériennes.
Les colonies bactériennes s’entendent par mL (ou gramme) de culture bactérienne. L’homme du métier sait aisément comment déterminer ce nombre de bactéries, notamment par comptage soit manuel (en utilisant une lame de Malassez), ou en utilisant un compteur automatique de cellules, ou par dilution puis ensemencement sur gélose et comptage, notamment visuel, des colonies, ou encore par mesure de la densité optique.
Avantageusement, l’invention concerne la composition pour son utilisation telle que définie ci-dessus, où ladite une ou plusieurs souches de bactéries du genreBacillus, notammentBacillus subtilis, sont sous forme végétative ou sous forme sporulée, ou les deux.
Dans les modes de réalisation avantageux de l’invention où la composition susmentionnée consiste essentiellement en deux souches de bactéries du genreBacillus, notammentBacillus subtilis ,appartenant à la même unité taxonomique opérationnelle (OTU) que ladite souche NOL01, lesditsBacillussont soit tous sous forme végétative, soit tous sous forme sporulée, ou une souche est sous forme sporulée et l’autre souche est sous forme végétative. SI la composition comprend plus de deux souches de bactéries telles que définies ci-dessus, l’homme du métier comprendra quelles combinaisons sont applicables.
En outre, une même souche de bactérie selon l’invention peut être sous la forme végétative, ou sous la forme sporulée, ou former un mélange de bactéries sous forme végétative et sous forme sporulée.
Dans les modes de réalisation avantageux de l’invention où la composition susmentionnée consiste essentiellement en trois souches deBacillus, notammentBacillus subtilis ,appartenant à la même unité taxonomique opérationnelle (OTU) que ladite souche NOL01, soit ces trois souches sont sous forme sporulée, soit ces trois souches sont sous forme végétative, soit une souche est sous forme végétative et les deux autres sous forme sporulée, soit une souche est sous forme sporulée et les deux autres sous forme végétative.
L’homme du métier saura quelle forme est la plus appropriée pour chacun des souches utilisées dans l’invention.
L’invention concerne en outre une composition de combinaison constituée:
- d’une composition telle que définie précédemment, et
- d’une souche de bactérie lactique, ladite souche de bactérie lactique étant une souche NOL11 telle que déposée à la CNCM le 14 mars 2012 sous le numéro CNCM I – 4609,
pour son utilisation pour la prévention et/ou le traitement des mammites induites par des microorganismes pathogènes chez les mammifères, notamment chez les ruminants.
Un autre objet de l’invention concerne une composition susmentionnée constituée d’une ou plusieurs souches deBacillus, notammentBacillus subtilis, telles que définies précédemment en association avec une souche spécifique de bactérie lactique.
De manière avantageuse, la composition de combinaison de l’invention est essentiellement constituée de la composition susmentionnée, et de la souche de bactérie lactique NOL11.
De manière plus avantageuse, les compositions de combinaison de l’invention sont les suivantes:
- la souche NOL01, en association avec la souche NOL11, ou
- la souche NOL02, en association avec la souche NOL11, ou
- la souche NOL03, en association avec la souche NOL11, ou
- la souche NOL01 et la souche NOL02, en association avec la souche NOL11, ou
- la souche NOL01 et la souche NOL03, en association avec la souche NOL11, ou
- la souche NOL02 et la souche NOL03, en association avec la souche NOL11, ou
- la souche NOL01, la souche NOL02 et la souche NOL03, en association avec la souche NOL11.
Avantageusement, l’invention concerne la composition de combinaison pour son utilisation telle que définie ci-dessus, où ladite souche de bactérie lactique NOL11 est présente à raison de 104à 1011colonies par mL ou g de composition de combinaison.
La définition de la quantité de bactérieBacillus, notammentBacillus subtilis, susmentionnée s’appliquemutatis mutandisà la souche de bactérie lactique.
Dans un autre mode de réalisation avantageux, l’invention concerne la composition de combinaison susmentionnée pour son utilisation telle que définie ci-dessus, où ladite composition susmentionnée et ladite souche de bactérie lactique sont utilisées simultanément, séparément ou étalées dans le temps.
Cela signifie que la composition de combinaison peut être:
- sous une forme complète consistant essentiellement en la composition selon l’invention et une souche de bactéries lactiques, dans un même mélange,
- sous une forme séparée, où la composition selon l’invention et la souche de bactérie lactique sont appliquées séparément pour agir ensemble,
- sous une forme séparée et appliquée dans le temps à des moments différents.
Avantageusement, l’invention concerne la composition susmentionnée pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ou la composition de combinaison susmentionnée pour son utilisation telle que définie ci-dessus,
ladite composition ou ladite composition de combinaison étant sous une forme pour être appliquée, ou apte à être appliquée, sur les mamelles des mammifères, notamment sur les trayons, en particulier, à l’intérieur des trayons.
Avantageusement, l’invention concerne la composition susmentionnée pour son utilisation telle que définie ci-dessus, ou la composition de combinaison susmentionnée pour son utilisation susmentionnée telle que définie ci-dessus,
ladite composition ou ladite composition de combinaison étant appliquée sur les mamelles des mammifères, notamment sur les trayons, en particulier, à l’intérieur des trayons.
L’objectif de la composition selon l’invention est de protéger les cellules épithéliales de l’infection par les bactéries pathogènes responsables des mammites, lesdites cellules épithéliales étant celles qui forment le canal mammaire par lequel le lait maternel peut s’écouler.
Aussi, est-il possible d’appliquer la composition selon l’invention, ou la composition de combinaison selon l’invention, directement sur la mamelle ou les mamelles à traire (ou la mamelle ou les mamelles que l’on souhaite protéger contre l’infection) de sorte que les bactéries seront capables de migrer dans les trayons, et de coloniser ceux-ci, accédant ainsi aux cellules épithéliales mammairesà protéger ou traiter.
L’application sur la ou les mamelles de l’animal ou sur un ou plusieurs trayons est réalisée dans des conditions où la totalité ou la quasi-totalité des mamelles ou des trayons est recouverte par la composition selon l’invention. En effet, il n’est pas forcément nécessaire que la partie traitée soit complètement recouverte, l’essentiel est que la quantité de composition soit suffisante pour que les bactériesBacillus, notammentBacillus subtilis ,soient en nombre suffisant pour qu’elles aient un impact sur les bactéries pathogènes potentiellement présentes sur la mamelle ou le trayon et puissent coloniser le canal du trayon et atteindre les cellules épithéliales.
De manière plus précise, et lorsqu’il est souhaitable que le traitement ou la protection soit le plus rapide et le plus efficace, il est possible d’appliquer la composition selon l’invention ou la composition de combinaison selon l’invention directement à l’intérieur des trayons. Par cette application directe, la colonisation des cellules épithéliales mammairessera plus rapide, ce qui accélèrera la protection et le traitement.
L’invention concerne également un kit de prévention et/ou de traitement des mammites chez les mammifères comprenant:
a. une composition ou composition de combinaison telle que définie précédemment, et
b. au moins un moyen d’application de ladite composition sur au moins un trayon ou dans le canal d’au moins un trayon de mamelles de mammifères.
De manière avantageuse, ledit au moins un moyen est choisi parmi les dispositifs permettant une application par pulvérisation, nébulisation, étalement, saupoudrage ou trempage des trayons de mamelles de mammifères.
Il peut donc s’agir de dispositifs permettant de pulvériser, voire nébuliser, étaler, saupoudrer, voire effectuer un trempage des trayons avec la composition selon l’invention. Des dispositifs avantageux sont notamment un gobelet de trempage, un gobelet mousse, un pulvérisateur, un nébulisateur…
Ledit au moins un moyen peut également être choisi parmi les dispositifs permettant une application dans le canal du trayon, notamment par injection.
Il peut donc s’agir de dispositifs présentant une canule ou une seringue permettant une introduction de la composition selon l’invention dans le canal du trayon de sorte à mettre ladite composition en contact direct avec les cellules épithéliales cibles.
D’autres formes que des canules, seringues, gobelets de trempage, gobelets mousse, … peuvent être utilisées pour introduire la composition dans les trayons ou appliquer la composition sur le trayon et l’homme du métier saura quelle forme est la plus appropriée.
Il est également envisagé une méthode de prévention et/ou de traitement des mammites induites par des microorganismes pathogènes, notamment des bactéries pathogènes, chez les mammifères, notamment chez les ruminants, en particulier les bovins,
ladite méthode comprenant une étape d’application directement sur les mamelles des mammifères dans le besoin, notamment sur les trayons, en particulier, à l’intérieur des trayons, d’une composition,
ladite composition consistant essentiellement en au moins une souche de bactérie du genreBacillus, notammentBacillus subtilis, ladite au moins une souche deBacillusréduisant la capacité d’adhésion desdits microorganismes pathogènes sur les cellules épithéliales mammaires et/ou d’internalisation desdits microorganismes pathogènes dans les cellules épithéliales mammaires.
Avantageusement, cette méthode est telle que ladite au moins une souche de bactérie du genreBacillus, notammentBacillus subtilis, est choisie parmi:
- une souche NOL01 telle que déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur 25-28 rue du Docteur Roux 75724 Paris, France) selon le traité de Budapest le 14 mars 2012 sous le numéro CNCM I – 4606, et
- une souche deBacillusappartenant à la même unité taxonomique opérationnelle (OTU) que ladite souche NOL01,
ou un mélange de ces souches.
Plus avantageusement encore, cette méthode est telle que ladite au moins une souche de bactérie du genreBacillusest choisie parmi :
- une souche NOL01 telle que déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur 25-28 rue du Docteur Roux 75724 Paris, France) selon le traité de Budapest le 14 mars 2012 sous le numéro CNCM I – 4606, et
- une souche deBacillusdont la séquence codant l’ARNr 16S présente au moins 97% de d’identité avec la séquence codant l’ARNr 16S de la souche NOL01,
ou un mélange de ces souches.
De manière encore plus avantageuse, ladite méthode est telle que ladite souche deBacillusappartenant à la même unité taxonomique opérationnelle (OTU) que ladite souche NOL01 est choisie parmi :
- une souche NOL02 telle que déposée à la CNCM le 21 janvier 2016 sous le numéro CNCM I – 5043, et
- une souche NOL03 telle que déposée à la CNCM le 14 mars 2012 sous le numéro CNCM I – 4607.
Encore plus avantageusement, dans le cadre de la méthode susmentionnée, ladite composition consiste essentiellement en :
- la souche NOL01, ou
- la souche NOL02, ou
- la souche NOL03, ou
- la souche NOL01 et la souche NOL02, ou
- la souche NOL01 et la souche NOL03, ou
- la souche NOL02 et la souche NOL03, ou
- la souche NOL01, la souche NOL02 et la souche NOL03.
Dans la méthode susmentionnée, de manière avantageuse, ladite composition comprend de 104à 1011colonies bactériennes vivantes du ou desditsBacillus, les colonies bactériennes étant par mL ou g de composition.
L’invention sera mieux comprise à la lumière des figures et des exemples suivants.
Brève description des figures
Une clusterisation UPGMA (Unnweighted Pair Group Method with Arithmetic mean), à partir des distances de symétrie entre les séquences, a été réalisée pour construire ce dendrogramme. En regard de chaque feuille sont mentionnées les annotations suivantes: A. le nom de la sous-espèce, B. le nom de la souche et C. le nom de la collection de la culture originelle.
Sont ainsi distinguables 6 groupes, à savoir des souches se trouvant dans un même nœud, à partir des résultats de comparaison par synténie.
Exemples
Exemple 1 –Propriétés d’inhibition de l’adhésion et de l’internalisationin vitro
Afin d’évaluer les propriétés des souches NOL utilisées dans la composition de l’invention, les inventeurs ont testé la capacité qu’ont les souches NOL à inhiber la colonisation des cellules épithéliales mammaires par des bactéries pathogènes, c’est-à-dire l’adhésion et l’internalisation desdites cellules par :
-Escherichia coli ,responsable de mammites aigues, et
-Staphylococcus aureus ,responsable de mammites modérées souvent chroniques.
Pour ce faire, des tests ont été réalisés sur une culturein vitrode cellules épithéliales mammaires bovines de lignée MAC-T (Nexia Biotechnologies, Québec, Canada).
Les cellules MAC-T ont été cultivées dans du milieu Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM ; pH 7,4 ; Dutscher, Brumath, France) additionné de 10% de Sérum de Veau Foetal (SVF), 5 μg/mL d’insuline, 10 mg/mL de pénicilline et 5 μg/mL de streptomycine. Les cellules ont été cultivées en flasque de 75 cm² à 37°C en atmosphère humide et à 5% de CO2.
Pour les tests d’adhésion et d’internalisation ci-dessous, les tapis cellulaires obtenus ont été traités avec de la trypsine à 0,05 % (PAN Biotech, Aidenbach, Allemagne). Les cellules ont ensuite été distribuées en plaque 12 puits à raison de 2.105cellules/puits. Après 24h d’incubation à 37°C à 5% de CO2, un tapis cellulaire à confluence a été obtenu (soit 2,5.105cellules/puits) et a subi 3 lavages au Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X.
En ce qui concerne les souches NOL (Bacillus subtilisNOL1 et NOL2, etLacococcus lactisNOL11), des pré-cultures ont été réalisées pour ces souches sur milieu Brain Heart Infusion (BDTM) additionné de 10g/l d’extrait de levure (Biokar) (BHI-YE).
Les pré-cultures de la soucheL. lactis(NOL11) ont été incubées à 37°C pendant 24h sous agitation, tandis que deux pré-cultures successives ont été réalisées pour les souches deBacillus(NOL01 et NOL02).
Pour la préparation des tests d’adhésion et d’internalisation ci-dessous, les pré-cultures bactériennes ont été centrifugées 5 min à 8000 rpm, lavées au PBS 1X, puis re-suspendues dans du DMEM sans antibiotique et sans SVF.
Les souches pathogènes utilisées ont été isolées de mammites bovines. Elles sont fréquemment utilisées dans le cadre d’infections expérimentales pour reproduire des mammites. Il s’agissait des:
- Staphylococcus aureusNewbould 305 (S. aureusNb305) 22,23
- Escherichia coli P4(E. coliP4) 24
Les pré-cultures de ces souches pathogènes ont été réalisées sur milieu Brain Heart Infusion (BHI ; pH 7.4 ; Becton Dickinson, Le Pont de Claix, France) à 37°C, sous agitation, pendant 16 à 20 h.
Les numérations bactériennes des bactéries pathogènes et des bactéries lactiques NOL11 ont été réalisées par microméthode, selon le protocole établi par Baronet al., (Baron et al. Lait 86, 2006 , 251-257). Les populations deE. coliont été dénombrées sur milieu McConkey (Torrejon de Ardoz, Madrid, Spain) tandis que les populations deL. lactis(NOL11) sur milieu BHI agar (BHI ; pH 7.4 ; Becton Dickinson, Le Pont de Claix, France). Les dénombrements deS. aureusont été réalisés sur Mannitol Salt Agar (MSA ; pH 7,4 ; Conda Pronadisa, Madrid, Espagne) dans le cas des co-infections avecL. lactis(NOL11) et dans le cas des infections àStaphylococcusseul, ou sur milieu BHI additionné de spectinomycine à 15μg/mL dans le cas des co-infections avecB. subtilis(NOL01 et NOL02).
Les numérations bactériennes des souches deB. subtilis(NOL01 et NOL02) ont été réalisées à partir de dilutions successives au 1/10e dans de l’eau tryptonnée sur milieu LB (lysogeny broth) par ensemencement, par inclusion en double couche (afin d’éviter l’étalement des colonies en surface).
Les dénombrements ont été réalisées après 24h d’incubation à 37°C.
1/ Capacité de colonisation des cellules épithéliales
mammaires
.
Dans une première approche, les inventeurs ont testé la capacité des souches NOL à adhérer aux cellules épithéliales mammaires selon différentes multiplicités d’infection (nombre de bactéries pour une cellule, abrégé MOI).
Sur une culture cellulaire de cellules MAC-T, des souches NOL01 ou NOL02 ont été ajoutées à des multiplicités d’infections de 50 bactéries pour une cellule MAC-T 50: 1ou 200:1 pour NOL01 et de 50:1, 200:1 ou 1000:1 pour NOL02. L’ensemble a ensuite été incubé à 37°C et à 5% de CO2.
Au bout d’une heure d’incubation, les suspensions bactériennes ont été récupérées pour être dénombrées. Les tapis cellulaires ont été lavés 4 fois au PBS 1X afin d’éliminer les bactéries non adhérées aux cellules. Les cellules ont ensuite été décollées à la trypsine, centrifugées à 830g 5 min à 4°C, puis lysées au Triton à 0,01%. Les bactéries présentes dans le lysat, correspondant aux bactéries adhérées, ont été dénombrées comme expliqué ci-dessus.
Les résultats sont montrés à lafigure 2pour la souche NOL01 et à lafigure 3pour la souche NOL02.
On constate que les deux souches NOL01 et NOL02 ont, toutes deux, la capacité d’adhérer aux cellules épithéliales mammaires et que les taux d’adhésion augmentent de façon linéaire avec la MOI.
On constate également qu’à une même multiplicité d’infection (200: 1), les bactéries NOL02 ont une capacité d’adhésion aux cellules MAC-T 3,6 fois plus importante que les bactéries NOL01.
Dans un second temps, les inventeurs ont testé la capacité d’internalisation des souches NOL01 et NOL02 dans des cellules MAC-T.
Pour ce faire, les bactéries NOL01 et NOL02 ont été incubées avec les cellules épithéliales mammaires pendant 2 heures aux mêmes MOI que précédemment.
Après les deux heures d’infection, les plaques de tapis cellulaires servant à mesurer l’internalisation ont été lavées 4 fois au PBS 1X afin d’éliminer les bactéries non adhérées aux cellules, puis les cellules MAC-T ont été incubées à nouveau pendant 2 h en milieu DMEM additionné de gentamycine à 100 μg/mL afin d’éliminer les bactéries adhérées. Les cellules ont ensuite été décollées à la trypsine, centrifugées à 830g 5 min à 4°C, puis lysées au Triton à 0,01%. Les bactéries vivantes présentes dans le lysat, correspondant aux bactéries internalisées, ont été dénombrées.
Les numérations bactériennes des souches deB. subtilis(NOL01 et NOL02) ont été réalisées comme décrit précédemment.
Les résultats sont montrés à lafigure 4pour la souche NOL01 et à lafigure 5pour la souche NOL02.
On constate qu’à une même multiplicité d’infection (200: 1), les bactéries NOL01 ont une capacité d’internalisation dans les cellules MAC-T bien plus faible que les bactéries NOL02. Cette particularité de NOL01 pourrait être un avantage en limitant considérablement les risques d’invasion des tissus mammaires par lesdites bactéries.
2
/ inhibition
des infections à
E. coli
et
S. aureus
Dans un premier temps, les inventeurs ont testé la capacité des souches NOL01 et NOL02 à inhiber l’adhésion des bactériesS. aureusetE. coliaux cellules épithéliales mammaires MAC-T.
Pour ce faire, les souches NOL ont été testées aux multiplicités d’infection suivantes : 200:1 pour NOL1 et 1000:1 pour NOL02.
Les souches pathogènesS. aureusetE.coliont été utilisées à une multiplicité d’infection de 100:1.
Les protocoles utilisés pour la préparation des pré-cultures cellulaires, pour la préparation des suspensions bactériennes (NOL et pathogènes) et pour les dénombrements sont ceux présentés ci-dessus.
Les cellules épithéliales MAC-T ont ainsi été co-incubées avec chacune des suspensions de bactéries NOL01, NOL02 et bactéries pathogènes.
L’ensemble a été incubé à 37°C et à 5% de CO2, pendant 1h.
Au bout d’une heure d’incubation, les suspensions bactériennes ont été récupérées pour être dénombrées. Les tapis cellulaires ont été lavés 4 fois au PBS 1X afin d’éliminer les bactéries non adhérées aux cellules. Les cellules ont ensuite été décollées à la trypsine, centrifugées à 830g 5 min à 4°C, puis lysées au Triton à 0,01%. Les bactéries présentes dans le lysat, correspondant aux bactéries adhérées, ont été dénombrées comme expliqué ci-dessus.
Les résultats sont montrés à lafigure 6pour les infections àS. aureuset à lafigure 7pour les infections àE. coli.
Ces résultats montrent une réduction significative, d’environ 50% ou plus, de l’adhésion deS. aureusNb305 etE. coliP4 sur les cellules épithéliales mammaires MAC-T en présence de chacune des souchesBacillus subtilistestées.
Ces résultats montrent également que, malgré l’application d’une MOI de seulement 200 :1, le taux d’adhésion deS. aureusest largement réduit de 90% environ en présence de NOL01. Cette souche présente toutefois un potentiel d’inhibition de l’adhésion deE. colimoins important que NOL02, avec seulement 30% d’inhibition contre 50% pour NOL02.
Dans un second temps, les inventeurs ont testé la capacité des souches NOL01 et NOL02 à inhiber l’internalisation des bactériesS. aureusetE. colidans des cellules épithéliales mammaires MAC-T, en comparaison à la capacité d’inhibition de la souche de bactéries lactiques NOL11. La souche de bactérie lactique est utilisée au vu des données de l’art antérieur qui semblent démontrer un avantage de telles souches sur le traitement des mammites.
Pour ce faire, les souches NOL ont été testées aux MOI suivantes: 200:1 pour NOL1, 1000:1 pour NOL02 et 2000:1 pour NOL11.
Les souches pathogènesS. aureusetE.coliont été utilisées à une multiplicité d’infection de 100:1.
Les protocoles utilisés pour la préparation des pré-cultures cellulaires, pour la préparation des suspensions bactériennes (NOL et pathogènes) et pour les dénombrements sont ceux présentés ci-dessus.
Les cellules épithéliales MAC-T ont ainsi été co-incubées avec chacune des suspensions de bactéries NOL01, NOL02, NOL11 et bactéries pathogènes.
L’ensemble a ensuite été incubé à 37°C et à 5% de CO2, pendant 2h.
Après les deux heures d’incubation, les plaques de tapis cellulaires servant à mesurer l’internalisation ont été lavées 4 fois au PBS 1X afin d’éliminer les bactéries non adhérées aux cellules, puis les cellules MAC-T ont été incubées à nouveau pendant 2 h en milieu DMEM additionné de gentamycine à 100 μg/mL afin d’éliminer les bactéries adhérées. Les cellules ont ensuite été décollées à la trypsine, centrifugées à 830g 5 min à 4°C, puis lysées au Triton à 0,01%. Les bactéries vivantes présentes dans le lysat, correspondant aux bactéries internalisées, ont été dénombrées comme expliqué ci-dessus.
Les résultats sont montrés à lafigure 8pour les infections àS. aureuset à lafigure 9pour les infections àE. coli.
Ces résultats montrent une réduction significative de l’internalisation dans les cellules épithéliales mammaires des pathogènesS. aureusetE.colien présence de chacune des souchesNOL testées.
Ces résultats montrent également que les deux souches deB. subtilisNOL01 et NOL02 montrent de très fortes capacités d’inhibition de l’internalisation des deux pathogènes, avec environ 90% d’inhibition et plus selon les bactéries pathogènes considérées. Cette inhibition est significativement plus importante que l’inhibition exercée par des bactéries lactiques, comme le montre les résultats obtenus avec la souche NOL11 (75% max).
L’ensemble de ces résultats obtenusin vitrodémontrent la grande efficacité des bactériesBacillus subtilisselon l’invention sur l’inhibition de la colonisation (adhésion/internalisation) des bactéries pathogènes responsables de mammites sur les cellules épithéliales mammaires, et donc leur grande efficacité pour la prévention et/ou le traitement des mammites.
Exemple 2 – Test in vivo
Les inventeurs ont également testéin vivoune composition selon l’invention au sein de 3 élevages bovins:
Elevage 2 - 80 vaches de race Holstein à 90% et de race Jersiaise à 10 %,
Elevage 3 - 42 vaches de race Holstein, et
Elevage 4 - 50 vaches de race Holstein.
Pour ces essais, les inventeurs ont utilisé une composition constituée d’un mélange de NOL01, NOL02 et NOL03 comprenant 109colonies bactériennes par mL de composition.
La composition selon l’invention, conditionnée en flacon, est apportée congelée en élevage et est conservée au congélateur après réception.
La procédure de mise en œuvre de la composition selon l’inventionest la suivante :
- Le jour de l’application: décongeler la ou les doses à utiliser, à raison d’une 1 dose de composition selon l’invention pour une application sur les mamelles de 50 vaches laitières (1h à température ambiante ou 5 minutes dans de l’eau froide).
- Mettre du thiosulfate dans le réservoir d’un pulvérisateur, afin de neutraliser d’éventuelles traces de chlore laissées par le traitement de l’eau, qui pourraient impacter les bactéries positives de la composition selon l’invention.
- Ajouter la quantité nécessaire d’eau du réseau, soit 5L d’eau pour 1 dose de composition selon l’invention.
- Mélanger pour dissoudre complètement le thiosulfate.
- Bien agiter la ou les doses de la composition selon l’invention puis la ou les verser dans le réservoir du pulvérisateur.
- Mélanger pour bien homogénéiser la solution obtenue.
La composition selon l’invention telle que mise en œuvre ci-dessus a été appliquée sur les mamelles des vaches des 3 élevages 2, 3 et 4 de fin mars 2019 à mi-juin 2019 (soit environ 3 mois).
La solution a été appliquée sur la mamelle des vaches laitières et taries en insistant sur les trayons, les plaies, les gerçures, où les bactéries ont le plus de risque de s’infiltrer et ce, une fois par semaine par animal.
1/ évaluation de la qualité du lait
Dans un premier temps, les inventeurs ont comparé le nombre de cellules pathogènes responsables de mammites dans le lait au cours des années 2018 et 2019 sur une période de janvier à juillet.
Les résultats sont présentés enfigure 10pour les élevages 3 et 4.
Quel que soit l’élevage considéré, on constate que le nombre de cellules dans le lait des vaches est, en fin de période de traitement en 2019, significativement réduit par rapport à la même période en 2018. Ceci montre que la composition selon l’invention est capable de réduire le taux cellulaire, cette réduction étant un indicateur de la bonne santé des mamelles du troupeau.
Toujours dans un souhait d’évaluer la qualité du lait, les inventeurs ont mesuré la quantité deBacillusNOL dans le lait avant essai (c’est-à-dire avant traitement avec la composition selon l’invention) puis à 1,5 mois du début de l’essai (mi-essai) et à 3 mois (fin de l’essai).
Les résultats sont compilés dans leT ableau 1suivant:
| T0 | T+1,5 mois | T+ 3 mois | |
| Elevage 2 | 1 log de CFU/mL | 1 log de CFU/mL | 1,5 log de CFU/mL |
| Elevage 3 | 1 log de CFU/mL | 2 log de CFU/mL | 2,05 log de CFU/mL |
| Elevage 4 | 1,2 log de CFU/mL | 1,2 log de CFU/mL | 1,8 log de CFU/mL |
Ces données montrent qu’il n’y a pas modification significative de la proportion deBacillusdans le lait entre le début et la fin de l’essai. Ainsi, les inventeurs montrent que l’application de flores sur les mamelles n’augmente pas la proportion deBacillusdans le lait du tank.
2/ Fréquence des mammites
Dans un second temps, les inventeurs ont mesuré l’effet de la composition selon l’invention sur la fréquence des mammites chez les vaches traitées.
Cette fréquence est mesurée en % de nouveaux cas de mammites apparus sur la période donnée, sur le nombre de vaches saines en début de période considérée. Une vache est considérée comme saine si le résultat du comptage cellulaire (CC) est inférieur à 300 000 cellules / mL de lait.
Sont comparées les périodes de janvier à juillet des années 2018 (témoin) et 2019 (essai).
Les résultats sont compilés dans leT ableau 2suivant:
| 2018 (janvier-juin) | 2019 ( janvier-juin, période essai ) | |
| Elevage 2 | 21,62 % | 10,2 % |
| Elevage 3 | 18,18% | 6,6 % |
| Elevage 4 | 46,15 % | 30,43 % |
Ces résultats montrent que, comparé à l’année témoin (2018) où aucune application de la composition selon l’invention n’a été réalisée, le nombre de vaches atteintes de mammites après l’application de la composition selon l’invention en 2019 (essai) est significativement réduit dans les 3 élevages.
Ces résultats témoignent de l’efficacité de la composition selon l’invention sur la prévention et le traitement des mammites.
3/ effet sur le microbiote
Dans un troisième temps, les inventeurs ont voulu mesurer l’effet de la composition selon l’invention sur le microbiote de la mamelle bovine, avant traitement avec la composition selon l’invention et après 1,5 mois de traitement.
Les données, exprimées en % de chacun des genres bactériens dans le microbiote total, concernant l’élevage 2 sont présentées dans leTableau 3, et celles concernant l’élevage 3 sont présentées dans leTableau 4.
| Vaches n° | ||||||
| 1 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 | |
| T en jours | 0 | 0 | 0 | 1,5 | 1,5 | 1,5 |
| Staphylococcus | 0,25 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Bacillus | 0,11 | 0,15 | 0,13 | 1,4 | 2,48 | 0,57 |
| Vaches n° | ||||||
| 1 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 | |
| T en jours | 0 | 0 | 0 | 1,5 | 1,5 | 1,5 |
| Staphylococcus | 6,49 | 7,16 | 0 | 5,5 | 3,3 | 0 |
| Bacillus | 0,49 | 0,68 | 0,25 | 4 | 0,98 | 0,84 |
Ces données montrent que dans l’élevage 2, après le traitement, la population deBacillusaugmente. Pour l’élevage 4, les profils sont à peu près similaires.
Mais, de manière significative, on constate que la population deStaphylococcusdiminue significativement dans les deux élevages après application de la composition selon l’invention.
Les inventeurs ont également voulu mesurer l’effet immédiat de l’application de la composition selon l’invention sur le microbiote de la mamelle bovine et pour ce faire, des prélèvements ont été réalisés sur la mamelle de 3 vaches de l’élevage 4 à J0: avant application, J+0,5: 12h après application, et J+3: 3 jours après application.
Les données, exprimées en % de chacune des espèces bactériennes par rapport à la flore totale, sont présentées dans leTableau 5.
| Vaches n° | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 | |
| T en jours | 0 | 0 | 0 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 3 | 3 | 3 |
| Streptococcus | 1,97 | 0 | 1,74 | 0.19 | 0 | 0.08 | 0 | 0 | 0 |
| Bacillus | 0.31 | 0 | 1.67 | 0.95 | 4.85 | 0.83 | 0 | 0.72 | 0 |
On constate que la population deStreptococcusdiminue significativement après application, pour devenir nulle 3 jours après l’application de la composition selon l’invention.
En parallèle, juste après le traitement, la population deBacillusaugmente pour les vaches 1 et 2, mais retombe au bout de 3 jours pour les 3 animaux.
Ainsi, une seule application de la composition selon l’invention ne semble pas suffisante pour permettre l’installation d’une floreBacillusdurable dans le temps sur la mamelle, mais semble déjà avoir un impact positif sur la réduction de la floreStreptococcus.
L’ensemble de ces résultats sur des élevages (essaisin vivo) montrent que la composition deBacillusselon l’invention est capable de réduire significativement la survenue des mammites, et ce, en agissant notamment sur la population deStaphylococcusetStreptococcus.
Claims (10)
- Composition pour son utilisation pour la prévention et/ou le traitement des mammites induites par des microorganismes pathogènes, notamment des bactéries pathogènes, chez les mammifères, notamment chez les ruminants, en particulier les bovins,
ladite composition consistant essentiellement en au moins une souche de bactérie du genreBacillus, notammentBacillus subtilis, ladite au moins une souche deBacillusinhibant la capacité d’adhésion desdits microorganismes pathogènes sur les cellules épithéliales mammaires et/ou d’internalisation desdits microorganismes pathogènes dans les cellules épithéliales mammaires. - Composition pour son utilisation selon la revendication 1, où ladite au moins une souche de bactérie du genreBacillusest choisie parmi :
- une souche NOL01 telle que déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur 25-28 rue du Docteur Roux 75724 Paris, France) selon le traité de Budapest le 14 mars 2012 sous le numéro CNCM I – 4606, et
- une souche deBacillusappartenant à la même unité taxonomique opérationnelle (OTU) que ladite souche NOL01,
ou un mélange de ces souches. - Composition pour son utilisation selon la revendication 2, où ladite souche deBacillusappartenant à la même OTU que ladite souche NOL01 est choisie parmi :
- une souche NOL02 telle que déposée à la CNCM le 21 janvier 2016 sous le numéro CNCM I – 5043, et
- une souche NOL03 telle que déposée à la CNCM le 14 mars 2012 sous le numéro CNCM I – 4607. - Composition pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 2 à 3, ladite composition consistant essentiellement en :
- la souche NOL01, ou
- la souche NOL02, ou
- la souche NOL03, ou
- la souche NOL01 et la souche NOL02, ou
- la souche NOL01 et la souche NOL03, ou
- la souche NOL02 et la souche NOL03, ou
- la souche NOL01, la souche NOL02 et la souche NOL03. - Composition pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, où ladite composition comprend de 104à 1011colonies bactériennes vivantes du ou desditsBacillus ,les colonies bactériennes étant par mL ou g de composition.
- Composition pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, où ladite une ou plusieurs souches de bactéries du genreBacillussont sous forme végétative ou sous forme sporulée, ou les deux.
- Composition de combinaison constituée:
- d’une composition telle que définie dans l’une quelconque des revendications 1 à 6, et
- d’une souche de bactérie lactique, ladite souche de bactérie lactique étant une souche NOL11 telle que déposée à la CNCM le 14 mars 2012 sous le numéro CNCM I – 4609,
pour son utilisation pour la prévention et/ou le traitement des mammites induites par des microorganismes pathogènes chez les mammifères, notamment chez les ruminants. - Composition de combinaison pour son utilisation selon la revendication 7, où ladite souche de bactérie lactique NOL11 est présente à raison de 104à 1011colonies par mL ou g de composition de combinaison.
- Composition pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, ou composition de combinaison pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 7 ou 8,
ladite composition ou ladite composition de combinaison étant sous une forme apte à être appliquée sur les mamelles des mammifères, notamment sur les trayons, en particulier, à l’intérieur des trayons. - Kit de traitement et/ou de prévention des mammites chez les mammifères comprenant:
a- une composition telle que définie dans l’une quelconque des revendications 1 à 9, et
b- au moins un moyen d’application de ladite composition sur au moins un trayon ou dans le canal d’au moins un trayon de mamelles de mammifères.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR1915789A FR3105730B1 (fr) | 2019-12-31 | 2019-12-31 | Composition pour le traitement de pathologies des mammifères |
Applications Claiming Priority (2)
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Citations (4)
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-
2019
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Patent Citations (5)
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| US20160120919A1 (en) * | 2013-05-17 | 2016-05-05 | Calpis Co., Ltd. | Preventive or therapeutic agent for ruminant animal mastitis |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BARON ET AL., LAIT, vol. 86, 2006, pages 251 - 257 |
| KLOSTERMANN ET AL., J DAIRY RES, vol. 75, no. 3, August 2008 (2008-08-01), pages 365 - 7 |
Also Published As
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