FR3110599A1 - Nouvelles souches de bacteriophages et leurs utilisations - Google Patents

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Abstract

NOUVELLES SOUCHES DE BACTERIOPHAGES ET LEURS UTILISATIONS La présente invention concerne une composition comprenant une souche de bactériophage ou un mélange de souches de bactériophages choisies parmi les souches telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5491 et CNCM I-5492. L’invention porte également sur l’utilisation thérapeutique de ces souches chez l’Homme et l’animal pour traiter des infections par S. aureus, en particulier pour traiter la mammite chez l’animal. Figure de l’abrégé   : Fig. 5

Description

NOUVELLES SOUCHES DE BACTERIOPHAGES ET LEURS UTILISATIONS
DOMAINE DE L’INVENTION
La présente invention concerne de nouvelles souches de bactériophages efficaces contreStaphylococcus aureuset des compositions de celles-ci, ainsi que la combinaison d’au moins une souche de bactériophage efficace contreStaphylococcus aureusen combinaison avec une bactériocine, en particulier la nisine, et/ou du lysozyme, et/ou un antibiotique. L’invention concerne également l’utilisation de ces bactériophages en tant que conservateurs alimentaires, additifs alimentaires, probiotiques, solution désinfectante ou encore leur utilisation thérapeutique pour traiter des infections ou les contaminations parStaphylococcus aureus, en particulier pour le traitement de la mammite.
ÉTAT DE LA TECHNIQUE
Au cours des dernières années, avec l’émergence de souches bactériennes multi-résistantes aux antibiotiques, les recherches se tournent vers les phages. L’utilisation de phages pour inactiver les bactéries pathogènes est considérée comme un moyen intéressant de remplacement des antibiotiques en médecine humaine, vétérinaire et pour la conservation des produits alimentaires ainsi que pour l’éradication des biofilms. En effet, les phages sont considérés comme des « anti-microbiens intelligents » pour leur spécificité. Ils infectent les bactéries cibles sans aucun effet sur la flore commensale et sont éliminés naturellement lorsque les bactéries hôtes sont totalement éliminées.
Il est important de noter que deux différents types de phages existent : les phages lytiques (virulents) et tempérés (lysogéniques). Pour les lytiques, la première étape de l’infection du phage est l’adsorption des phages à la paroi de la cellule bactérienne grâce à des interactions spécifiques entre des protéines virales et des récepteurs de la cellule hôte. Après avoir pénétré dans la cellule bactérienne, les phages virulents se répliquent rapidement pour synthétiser leurs protéines de capside et leur génome à l’intérieur de la cellule hôte. Enfin, les nouveaux phages s’échappent de la bactérie hôte par la rupture de la paroi cellulaire qui conduit à la mort de la cellule bactérienne. Alors que les phages tempérés intègrent leur matériel génétique dans le chromosome de la cellule hôte, qui est répliqué avec le génome de la cellule hôte (sous forme de prophage). Seuls les phages tempérés peuvent s’intégrer dans le génome bactérien et participer aux transferts horizontaux de gènes entre les populations bactériennes. Pour des applications en thérapie, uniquement les phages lytiques sont sélectionnés pour leur capacité à lyser rapidement des bactéries ciblées.
En médecine vétérinaire, l’utilisation de l’antibiotique est actuellement réduite en production animale. Les phages sont apparus comme une méthode alternative pour lutter contre les maladies bactériennes chez les animaux et pour contrôler la transmission des agents pathogènes responsables de maladies d’origine alimentaire à l’homme. Par exemple, la réduction deCampylobacteret de toute autre bactérie pathogène par des phages a été étudiée dans plusieurs travaux, y compris pour la destruction des biofilms ou en aquaculture. L’administration des phages est possible par voie orale, intraveineuse, ou par voie topique. Plusieurs études ont montré la diffusion des phages dans le sang, dans les reins ou dans le foie.
Certains produits de phages ont été approuvés et commercialisés. Par exemple, en 2006, la FDA (Food and Drug Administration) a approuvé que l’utilisation et la préparation des bactériophages soient reconnues inoffensives et que les phages soient utilisés comme additifs alimentaires pour le contrôle de bactéries pathogènes. Le produit ListexTM est appliqué pour contrôlerListeria monocytogenesdu saumon fumé, dans la viande et les produits à base de volaille. Le ListexTM a également été approuvé pour l’application en industrie alimentaire par la Food Standards Australia & New Zealand (FSANZ) en 2012. En Europe, le phage P100 est un produit similaire au ListexTM.
Cependant, certaines études ont rencontré des échecs dans l’utilisation de phages. Pour les applications antibactériennes, les phages doivent être lytiques et avoir un large spectre d’activité (capacité d’infecter plusieurs souches bactériennes cibles). Ils doivent être stables dans les conditions du traitement et surtout avoir accès aux bactéries ciblées. Le dernier facteur dépend de la composition et la structure du milieu dans lequel évolue le phage et la bactérie. Certains composés pourraient limiter l’accès des phages aux bactéries.
Staphylococcus aureusest l’espèce bactérienne la plus rencontrée en pathologie humaine et vétérinaire. Plusieurs études ont donc été menées sur les phages anti-Staphylococcus aureuspour développer des applications dans le traitement d’infection bactérienne chez l’homme et chez les animaux, mais aussi pour la conservation des produits alimentaires. Parmi les phages isolés et caractérisés jusqu’à présent, le phage K est le plus intéressant pour sa capacité à infecter plusieurs souches deS. aureus(large spectre d’activité). Cependant, certaines études ont montré que l’infection du phage K est inhibée dans le lait cru.
En élevage d’animaux de ferme allaitants,S. aureusest la responsable majeure de la mammite. Le traitement courant est l’utilisation des antibiotiques ou le tarissement. Cependant, l’émergence de souches multi-résistantes a rendu l’antibiotique inefficace. Les traitements actuels ne permettent pas d’avoir un taux de guérison élevé (20 à 50%) et l’infection des phages est inactive dans le lait cru, ce qui pourrait réduire l’efficacité du traitement par les phages en milieu de lactation.
Dans ce contexte, il est donc nécessaire de trouver un nouveau traitement pour soigner les infections liées àS. aureus.
Les inventeurs ont découvert de manière surprenante que les bactériophages déposés à la Collection Nationale de cultures de micro-organismes (CNCM) sous les numéros CNCM I-5409, CNCM I-5408, CNCM I-5491 et CNCM I-5492 seuls ou en combinaison permettaient d’infecter un large spectre de souches deS. aureuset étaient également capables d’inhiber efficacement le développement de cette bactérie, y compris dans un milieu composé de lait cru.
Par ailleurs, les inventeurs ont également découvert que la combinaison d’au moins une souche de bactériophage anti-S. aureusavec au moins une bactériocine, telle que la nisine, et/ou avec du lysozyme et/ou avec un antibiotique, avait un effet synergique sur l’inhibition du développement deS. aureus, y compris dans un milieu composé de lait cru.
RÉSUMÉ
La présente invention porte sur une composition comprenant une souche de bactériophage choisie parmi les souches telles que déposées à la CNCM sous les numéros
CNCM I-5491 et CNCM-5492.
Selon un mode de réalisation, ladite composition comprend en outre au moins une souche de bactériophage choisie parmi les souches telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5409, CNCM I-5491 et CNCM I-5492, ladite composition comprenant plus particulièrement les souches CNCM I-5409 et
CNCM I-5492 et CNCM I-5491 et CNCM I-5492.
Selon un mode de réalisation, ladite composition comprend les trois souches de bactériophage déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5491 et CNCM I-5492.
Selon un mode de réalisation, ladite composition comprend les trois souches de bactériophage déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5409, CNCM I-5491 et CNCM I-5492.
Selon un mode de réalisation, ladite composition comprend en outre une bactériocine, en particulier la nisine, et/ou du lysozyme.
Selon un mode de réalisation, ladite composition comprend en outre au moins un antibiotique.
Selon un mode de réalisation, ladite composition comprend en outre au moins un antibiotique choisi parmi la streptomycine, la cloxacilline et l’oxytétracycline.
La présente invention porte également sur un nécessaire de pièces comprenant une composition telle que décrite précédemment et une bactériocine, en particulier la nisine, et/ou du lysozyme, et/ou au moins un antibiotique.
La présente invention concerne également une composition telle que décrite précédemment ou un nécessaire de pièces tel que décrit précédemment pour son utilisation comme médicament.
La présente invention porte sur une composition telle que décrite précédemment ou un nécessaire de pièces tel que décrit précédemment pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d’une infection parStaphylococcus aureuschez un mammifère.
La présente invention porte sur une composition telle que décrite précédemment ou un nécessaire de pièces tel que décrit précédemment, pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d’une infection parStaphylococcus aureuschez le mammifère allaitant, en particulier la vache, la brebis, la chèvre, la bufflonne ou la chamelle.
Selon un mode de réalisation, ladite composition pour son utilisation ou ladite composition dudit nécessaire de pièces pour son utilisation comprend les souches de bactériophage déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5491 et CNCM I-5492 et un antibiotique choisi parmi la streptomycine, la cloxacilline et l’oxytétracycline.
La présente invention concerne l’utilisation d’une composition telle que décrite précédemment comme solution désinfectante, additif alimentaire, conservateurs alimentaires ou probiotique.
La présente invention porte sur une souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro CNCM I-5491.
La présente invention concerne également une souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro CNCM I-5492.
DÉFINITIONS
Dans la présente invention, les termes ci-dessous sont définis de la manière suivante :
  • “Additif alimentaire” concerne un produit ajouté aux denrées alimentaires commerciales (notamment aliments industriels) destinées à l’alimentation humaine et/ou animale.
  • «Antibiotique »concerne une substance, d’origine naturelle ou synthétique, qui détruit ou bloque la croissance des bactéries, utilisée contre les infections causées par les bactéries.
  • «Bactériocine »concerne une famille de peptides ou protéines synthétisés naturellement par certaines bactéries. Une bactériocine consiste généralement en un composé protéique de 20 à 60 acides aminés. Les bactériocines ne sont pas des antibiotiques mais elles possèdent des propriétés antibiotiques.
  • «Conservateur alimentaire »concerne un produit ajouté pour prévenir le développement de micro-organismes dans les denrées alimentaires et ainsi prévenir d’éventuelles intoxications alimentaires.
  • «Biocide »est un produit destiné à détruire, repousser ou rendre inoffensifs les organismes nuisibles, à en prévenir l’action ou à les combattre, par une action chimique ou biologique
  • «Désinfectant »substance capable de détruire ou d'empêcher le développement des microbes notamment les bactéries au niveau des milieux inertes (non vivants : sols, instruments, etc).
  • «Lysozyme »concerne une enzyme présente dans divers liquides biologiques, comme le blanc d’œuf, le mucus nasal, les larmes, le lait ou le mucus cervical. Les lysozymes sont divisés en différents types : lysozymes de type-c (pour « chicken »), lysozymes de type-g (pour « goose »), lysozymes de type-i (pour « invertebrate »), lysozymes de type-ch (pour Chalaropsis), les lysozymes de plantes, les lysozymes bactériens et les lysozymes phagiques.
  • «Mammifère »concerne une classe d’animaux vertébrés, vivipares, qui sont caractérisés essentiellement par la présence de mamelles, d’un cœur à quatre cavités, d’un système nerveux et encéphalique développé, par une température interne constante et une respiration de type pulmonaire. Parmi les mammifères on trouve l’homme et les animaux d’élevage comme les ovins, les bovins et les carins.
  • «Mammite »concerne une infection mammaire par un microorganisme, en particulier une bactérie comme S. aureus
  • «Probiotique »concerne les microorganismes vivants, qui lorsqu’ils y sont consommés en quantités adéquates, confèrent un effet bénéfique sur la santé et l’immunité de l’hôte sain.
  • «Traitement »ou «traiter »concerne le traitement thérapeutique et les mesures prophylactiques ou préventives dont l’objet est de prévenir ou de ralentir la pathologie (ici une infection). Les sujets nécessitant un traitement incluent les sujets déjà affectés par la pathologie ainsi que ceux qui risquent de développer la pathologie. Un sujet est traité efficacement pour la pathologie si, après avoir reçu une dose thérapeutiquement efficace d’une composition selon la présente invention, le sujet montre une amélioration d’un ou de plusieurs paramètres suivants : réduction du nombre de pathogènes, diminution d’un ou plusieurs symptômes associés à la pathologie, diminution de la morbidité et de la mortalité, amélioration de la qualité de vie.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE
Souches de bactériophages
La présente invention concerne la souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro CNCM I-5491.
La présente invention concerne également la souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro CNCM I-5492.
Compositions comprenant une souche de bactériophage
La présente invention concerne une composition comprenant une souche de bactériophage choisie parmi les souches telles que déposées à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous les numéros CNCM I-5491 et
CNCM I-5492.
Dans un mode de réalisation, ladite composition comprend en outre au moins une souche de bactériophage choisie parmi les souches telles que déposées sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5409, CNCM I-5491 et CNCM I-5492. La ou les souches additionnelles comprises en outre dans la composition sont différentes de la souche choisie en premier lieu.
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention porte sur une composition comprenant au moins deux souches de bactériophage choisies parmi les souches telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5491 ou
CNCM I-5492.
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention porte sur une composition comprenant au moins deux souches de bactériophage choisies parmi les souches telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5409, CNCM I-5491 ou
CNCM I-5492.
Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend les souches CNCM I-5491 et CNCM I-5492.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend les souches CNCM I-5492 et CNCM I-5409.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend les trois souches de bactériophage CNCM I-5491, CNCM I-5492 et CNCM I-5409.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend les trois souches de bactériophage CNCM I-5491, CNCM I-5492 et CNCM I-5408.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comporte un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ce véhicule peut être une solution d’eau saline, en particulier à 15% de NaCl ou une solution de tampon phosphate (PBS) qui contient un sel, par exemple NaCl ou CaCl2.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comporte un agent stabilisant, par exemple le glycérol et/ou le sorbitol et/ou le sucrose.
Dans un mode de réalisation particulier, dans ladite composition, la concentration de chaque souche de bactériophage est comprise entre 106/mL et 1010/mL, en particulier de 108/mL, plus particulièrement 107/mL.
Combinaison d’une souche de bactériophage avec une bactériocine
Dans un mode de réalisation particulier, la composition précédemment décrite comprenant une ou plusieurs souche(s) de bactériophage, est utiliséeen combinaison avec une bactériocine.
Autrement dit, selon un mode de réalisation particulier, la présente invention porte sur un produit combiné ou une préparation combinée comprenant ladite composition précédemment décrite comprenant une ou plusieurs souche(s) de bactériophage, et une bactériocine.
Au sens de la présente demande, la bactériocine est par exemple choisie parmi la nisine, la colicine et la natamycine. Dans un mode de réalisation particulier, ladite bactériocine est la nisine. Dans un autre mode de réalisation, ladite bactériocine est une bactériocine recombinante, en particulier de la nisine recombinante.
Dans un cas plus particulier, la concentration en bactériocine, par exemple la nisine, est comprise entre 0.05 mg/mL et 2 mg/mL, notamment, 0.05 mg/mL et 1.5 mg/mL, plus particulièrement entre 0.05 mg/mL et 1 mg/ml et notamment entre 0.05 mg/mL et 0.5 mg/mL, plus particulièrement de 0.1 mg/mL à 0.4 mg/mL, plus particulièrement de 0.1 mg/mL à 0.3 mg/mL, encore plus particulièrement de 0.2 mg/mL.
Combinaison d’une souche de bactériophage avec du lysozyme
Dans un mode de réalisation particulier, la composition précédemment décrite comprenant une ou plusieurs souche(s) de bactériophage, est utiliséeen combinaison avecune enzyme chargée positivement et ayant capacité d’hydrolyser le peptidoglycane de la paroi bactérienne. En particulier, l’enzyme est lelysozyme.
Autrement dit, selon un mode de réalisation particulier, la présente invention porte sur un produit combiné ou une préparation combinée comprenant ladite composition précédemment décrite comprenant une ou plusieurs souche(s) de bactériophage, et du lysozyme.
Dans un mode de réalisation plus particulier, le lysozyme est un lysozyme de type-c, et plus particulièrement du lysozyme de jaune d’œuf.
Dans un mode de réalisation particulier, le lysozyme est utilisé à une concentration supérieure à 1,25 mg/mL.
Dans un autre mode de réalisation particulier, ladite composition précédemment décrite comprenant une ou plusieurs souche(s) de bactériophage, est utilisée encombinaison avec une bactériocine, par exemple la nisine, et du lysozyme.
Dans un mode de réalisation particulier, la concentration en nisine est comprise entre 0.05 mg/mL et 2 mg/mL, notamment entre 0.05 mg/mL et 1.5 mg/mL, plus particulièrement entre 0.05 mg/mL et 1 mg/mL, et notamment entre 0.05 mg/mL et 0.5 mg/mL, plus particulièrement de 0.1 mg/mL à 0.4 mg/mL, plus particulièrement de 0.1 mg/mL à 0.3 mg/mL, encore plus particulièrement de 0.2 mg/mL.
Dans un mode de réalisation particulier, la concentration en lysozyme est égale ou supérieure à 0.5 mg/mL. Dans un mode de réalisation particulier, le lysozyme est utilisé à une concentration supérieure à 1.25 mg/mL.
Combinaison d’une souche de bactériophage avec au moins un antibiotique
Dans un mode de réalisation particulier, la composition précédemment décrite comprenant une ou plusieurs souche(s) de bactériophage, comprend en outreau moins un antibiotique.
Autrement dit, selon un mode de réalisation particulier, la présente invention porte sur un produit combiné, une préparation combinée ou une composition comprenant ladite composition précédemment décrite comprenant au moins une souche de bactériophage, et au moins un antibiotique.
Dans un autre aspect, l’invention porte également sur une composition comprenant au moins une souche de bactériophage pour son utilisation pour le traitement d’une infection parS. aureus, caractérisée en ce que ladite au moins souche de bactériophage est utilisée en combinaison avec au moins un antibiotique.
Typiquement la souche de bactériophage est une souche capable d’inhiber le développement deStaphylococcus aureus.
Dans un mode de réalisation particulier, ledit antibiotique est choisi parmi : la cloxacilline, l’oxytétracycline, la streptomycine, la gentamycine, le chloramphénicol, la tétracycline, l’ampicilline ou l’érythromycine.
Dans un mode de réalisation particulier, l’antibiotique est choisi parmi la streptomycine, la cloxacilline et l’oxytétracycline.
Dans un mode de réalisation particulier, l’antibiotique est utilisé à une concentration comprise entre 5 μg/mL et 200 μg/mL, plus particulièrement entre 10 μg/mL et 100 μg/mL, et notamment entre 25 μg/mL et 100 μg/mL, et plus particulièrement entre 25 μg/mL et 75 μg/mL.
Dans un mode de réalisation particulier, l’antibiotique est utilisé à une concentration de 50 μg/mL.
Dans un mode de réalisation particulier, l’antibiotique, tel que la streptomycine, la cloxacilline et l’oxytétracycline, est utilisé à une concentration comprise entre 5 μg/mL et 200 μg/mL, plus particulièrement entre 10 μg/mL et 100 μg/mL, et notamment entre 25 μg/mL et 100 μg/mL, notamment 25 μg/mL, 75 μg/mL et 100 μg/mL, et en particulier 50 μg/mL.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite souche de bactériophage est choisie parmi les souches déposées sous les numéros CNCM I-5491 ou CNCM I-5492.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend deux ou les trois souches de bactériophage déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5491 et CNCM I-5492.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend deux souches de bactériophage déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5492 et CNCM I-5409.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend les trois souches de bactériophages déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5491, CNCM I-5492 et CNCM I-5409.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend les trois souches de bactériophage telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5491 et CNCM I-5492 et l’antibiotique est choisi parmi la streptomycine, la cloxacilline et l’oxytétracycline.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend les trois souches de bactériophage telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5409, CNCM I-5491 et CNCM I-5492 et l’antibiotique est choisi parmi la streptomycine, la cloxacilline et l’oxytétracycline.
Nécessaire de pièces
La présente demande porte également sur un nécessaire de pièces (kit de parties) comprenant une composition comprenant au moins une souche de bactériophage telle que décrite précédemment et une bactériocine, en particulier la nisine, et/ou du lysozyme, et/ou au moins un antibiotique.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition dudit nécessaire de pièces comprend les trois souches de bactériophage telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5491 et CNCM I-5492 et au moins un antibiotique choisi parmi parmi la streptomycine, la cloxacilline et l’oxytétracycline.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition dudit nécessaire de pièces comprend les trois souches de bactériophage telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5409, CNCM I-5491 et CNCM I-5492 et au moins un antibiotique choisi parmi parmi la streptomycine, la cloxacilline et l’oxytétracycline.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition dudit nécessaire de pièces comprend les trois souches de bactériophage telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5491 et CNCM I-5492 et une bactériocine, préférentiellement la nisine.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition dudit nécessaire de pièces comprend les trois souches de bactériophage telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5491 et CNCM I-5492 et du lysozyme.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition dudit nécessaire de pièces comprend les trois souches de bactériophage telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5491 et CNCM I-5492 et une bactériocine telle que la nisine et du lysozyme.
Dans un mode de réalisation particulier, sur un nécessaire de pièces (kit de parties) comprenant une composition comprenant au moins une souche de bactériophage telle que décrite précédemment et une bactériocine, en particulier la nisine, et du lysozyme, et au moins un antibiotique.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition dudit nécessaire de pièces comprend les trois souches de bactériophage telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5491 et CNCM I-5492 et une bactériocine telle que la nisine et du lysozyme et au moins un antibiotique.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition dudit nécessaire de pièces comprend les trois souches de bactériophage telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5409, CNCM I-5491 et CNCM I-5492 et une bactériocine telle que la nisine et du lysozyme et au moins un antibiotique.
Utilisations des compositions et de leurs combinaisons
La présente demande porte également sur l’utilisation des compositions comprenant au moins une souche de bactériophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment.
En particulier, il s’agit d’une utilisation commesolution désinfectante.En particulier, il s’agit d’une utilisation comme solution anti-Staphylocoque doré. Ces solutions peuvent être utilisées sur toutes sortes de surfaces, par exemple sur du matériel médical, des instruments chirurgicaux, des dispositifs médicaux destinés à l’implantation
in vivo(prothèses par exemple).
Elles peuvent également être utilisées sur la peau chez le mammifère, aussi bien chez l’Homme que chez l’animal.
Une utilisation particulière est une utilisation sur le pis des mammifères allaitants, plus particulièrement des mammifères allaitants de ferme.
La présente demande porte également sur l’utilisation des compositions comprenant au moins une souche de bactériophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment,comme biocide.
La présente demande porte également sur l’utilisation des compositions comprenant au moins une souche de bactériophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment,comme additif alimentaire.
En particulier, il s’agit d’additif alimentaire pour l’alimentation animale. Ces additifs ont pour but d’améliorer certaines caractéristiques des aliments, par exemple pour en relever le goût ou pour rendre plus digestes les matières premières des aliments pour animaux.
Plus particulièrement, ladite composition est utilisée comme additif zootechnique.
La présente demande porte également sur l’utilisation des compositions comprenant au moins une souche de bactériophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment,comme conservateurs alimentaires.
La présente demande porte également sur l’utilisation des compositions comprenant au moins une souche de bactériophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment, commeprobiotique.
Utilisations thérapeutiques des compositions et de leurs combinaisons
La présente demande porte également sur les compositions comprenant au moins une souche de bactériophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment, ou un nécessaire de pièces selon la présente invention pour une utilisation comme médicament.
La présente demande porte également sur les compositions comprenant au moins une souche de bactériophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment, pour une utilisation dans l’élimination d’un biofilm ou la prévention de la formation d’un biofilm. Typiquement, il s’agit d’un biofilm formé ou pouvant se former à la surface d’un dispositif médical (par exemple prothèse) après son implantationin vivo.
La présente demande porte également sur les compositions comprenant au moins une souche de bactériophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment, pour une utilisation dans le traitement et/ou la prévention d’une infection parS. aureus.
La caractérisation d’une infection parS. aureusest bien connue de l’Homme du métier. Une infection parS. aureuspeut entrainer, de manière non limitative, les pathologies suivantes :
- des infections cutanées suppuratives c’est-à-dire avec production de pus (formes les plus fréquentes) telles que furoncles, panaris, folliculite, sycosis, cellulite, érysipèle, suppurations de plaies, pemphigus néonatal, impétigo, mammites ;
- des myosites aiguës ;
- des otites et sinusites ;
- des infections de différents viscères : infections de l’appareil respiratoire : pneumonies, endocardite (en particulier chez les patients porteurs de prothèses), infections urinaires, phlébites, certains types d’entérite, méningites ;
- syndrome du choc toxique ;
- intoxication alimentaire ;
- infection des os tel que les ostéomyélites.
En particulier, la présente demande porte sur les compositions comprenant au moins une souche de bactériophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment, leurs combinaisons avec au moins un antibiotique, ou un nécessaire de pièces selon la présente invention pour une utilisation dans le traitement et/ou la prévention d’une infection parS. aureuschez le mammifère.
En particulier, la présente demande porte sur les compositions comprenant au moins une souche de bactériophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment ou un nécessaire de pièces selon la présente invention, pour une utilisation dans le traitement et/ou la prévention d’une infection parS. aureuschez l’Homme.
En particulier, la présente demande porte sur les compositions comprenant au moins une souche de bactériophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment ou un nécessaire de pièces selon la présente invention, pour une utilisation dans le traitement et/ou la prévention d’une infection parS. aureuschez l’animal.
Dans un autre mode de réalisation, la présente invention porte sur l’une des compositions précédemment décrites ou un nécessaire de pièces selon la présente invention pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d’une infection parS. aureus,dans laquelle ladite infection parS. aureusest la mammite chez le mammifère allaitant.
Typiquement, ledit mammifère allaitant est un mammifère allaitant de ferme, plus particulièrement choisi parmi les bovins, les ovins, les caprins et les camélidés. En particulier, le mammifère allaitant de ferme est choisi parmi la vache, la brebis, la chèvre, la bufflonne ou la chamelle.
Dans un mode de réalisation plus particulier, ladite infection parS. aureusest la mammite bovine.
Dans un autre mode de réalisation, la présente invention porte sur l’une des compositions précédemment décrites pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d’une infection parS. aureus,dans laquelle la composition comprend les souches de bactériophage déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5491 et CNCM I-5492 et un antibiotique choisi parmi la streptomycine, la cloxacilline et l’oxytétracycline ou un nécessaire de pièces comprenant une composition telle que décrite et un antibiotique choisi parmi la streptomycine, la cloxacilline et l’oxytétracycline
Dans un autre mode de réalisation, la présente invention porte sur l’une des compositions précédemment décrites pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d’une infection parS. aureus,dans laquelle la composition comprend les souches de bactériophage déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5491 et CNCM I-5492, une bactériocine telle que la nisine et/ou du lysozyme ou un nécessaire de pièces comprenant une composition telle que décrite et une bactériocine telle que la nisine et/ou du lysozyme.
Méthode de traitement ou de prévention
La présente demande porte également sur une méthode de traitement et/ou de prévention d’infection parS. aureus, comprenant l’administration d’une dose efficace, de ladite composition comprenant au moins une souche de bactériophage telle que précédemment décrite, ou d’une des combinaisons de cette composition telle que précédemment décrite.
Les modes de réalisations décrits ci-dessus pour les utilisations thérapeutiques sont valables pour une telle méthode de traitement et/ou de prévention d’infection parS. aureus.
Mode d’administration
Dans la présente demande, les compositions comprenant au moins une souche de bactériophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment, peuvent être administrées par voie parentérale, par voie orale ou par voie topique.
Par voie parentérale, on entend une injection intramusculaire, intraveineuse, sous-cutanée, intramammaire ou intradermique.
Par voie orale, on entend une administration par ingestion. Une administration par voie orale peut être, de manière non limitative, sous la forme de comprimé, gélule, suspension buvable, sachet, poudre, sirop ou capsule.
Par voie topique, on entend une application externe sur une surface du sujet telle que la peau ou les muqueuses. Une administration par voie topique peut être, de manière non limitative, sous la forme de sprays, crèmes telles qu’une crème de nettoyage ou de désinfection, de laits, de pommades, de poudres, de tampons imbibés, de solutions, de gels, de sprays, de lotions telles qu’une lotion de nettoyage ou de désinfection, d’émulsions ou de suspensions. Une administration par voie topique peut également être sous la forme d’une préparation solide telle qu’un savon ou un pain de nettoyage.
Dans un mode de réalisation particulier, lorsque ladite composition comprenant au moins une souche de bactériophage est utilisée en combinaison avec au moins un autre élément tel qu’une bactériocine, en particulier la nisine, et/ou du lysozyme, et/ou un antibiotique ou lorsque ledit nécessaire de pièces comprenant au moins une souche de bactériophage et un autre élément tel qu’une bactériocine, en particulier la nisine, et/ou du lysozyme, et/ou un antibiotique, des voies d’administration différentes peuvent être utilisées pour les différents éléments.
Dans la présente demande, lorsque ladite composition comprenant au moins une souche de bactériophage est utilisée en combinaison avec au moins un autre élément tel qu’une bactériocine, en particulier la nisine, et/ou du lysozyme, et/ou un antibiotique ou lorsque ledit nécessaire de pièces comprenant au moins une souche de bactériophage et un autre élément tel qu’une bactériocine, en particulier la nisine, et/ou du lysozyme, et/ou un antibiotique, l’utilisation peut être réalisée de manière simultanée, séparée ou séquentielle.
En particulier, lorsque ladite composition comprenant au moins une souche de bactériophage est utilisée en combinaison avec au moins un autre élément, ou lorsque ledit nécessaire de pièces comprenant au moins une souche de bactériophage et un autre élément, l’administration de ladite composition est séparée dans le temps, et ladite composition étant utilisée en dernier. Dans ce mode de réalisation, le ou les autres éléments du nécessaire de pièces peuvent être utilisés de manière simultanée, ou séparée dans le temps.
En particulier, lorsque la composition comprenant une souche de bactériophage est utilisée sous la forme d’un nécessaire de pièces en combinaison avec une bactériocine, telle que la nisine, l’administration de ladite composition est séparée dans le temps, la bactériocine étant utilisée en premier.
En particulier, lorsque la composition comprenant au moins une souche de bactériophage est utilisée en combinaison avec au moins un antibiotique sous la forme d’un nécessaire de pièces, l’administration de ladite composition est séparée dans le temps, l’antibiotique étant utilisé en premier.
En particulier, lorsque la composition comprenant une souche de bactériophage est utilisée en combinaison avec une bactériocine, telle que la nisine, et un antibiotique (sous la forme d’un nécessaire de pièces), l’administration de ladite composition est séparée dans le temps, la composition comprenant un bactériophage étant utilisée en dernier lieu et la bactériocine et l’antibiotique étant utilisés de manière simultanée ou séparée.
BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURES
est un gel d’électrophorèse montrant le profil de digestion de l’ADN des phages 2, 3, 5, 6, 9 à 14 (notés Phil 2, Phil 3, Phil 5, Phil 6, Phil 9 à Phil 14) par EcoRI.
est une photographie montrant l’appréciation de la lyse des phages :
(-) pas d’activité, activité croissante allant de +, ++, +++, ++++ à +++++.
est un histogramme montrant le suivi du développement des phages 2, 3, 6, 7, 9, 10, 11 ou du mélange des phages 2, 9 et 10 au moment de l’addition des phages (T0), et après 8 h et 24 h d’incubation dans le lait cru. Les phages sont dénombrés par la technique de double couche.
est un histogramme montrant le suivi de la prolifération de S. aureus dans le lait cru en l’absence de phage (Lait sans phage) en fonction de la présence des phages 2, 3, 6, 7, 9, 10, 11 ou du mélange des phages 2, 9 et 10. Les bactéries sont dénombrées sur le milieu Baird Parker au moment de l’addition des phages (T0h), après 8h (T 8h) et 24h (T 24h) d’incubation à 37°C.
est un histogramme montrant le suivi du développement du cocktail de phages 2, 9 et 10 dans le lait cru en fonction du temps en présence de différents antibiotiques : AB6 (Streptamycine à 50 μg/mL), AB9 (Cloxacilline à 50 μg/mL) ou AB10 (Oxytétracycline à 50 μg/mL). Les phages sont dénombrés par la technique de double couche au moment de l’addition des phages (T0), après 8h (T 8h) et 24h (T 24h) d’incubation à 37°C.
est un histogramme montrant le suivi de la prolifération de S. aureus dans le lait cru en l’absence de phage et sans antibiotique (TM bactéries (sans phage, sans AB)) ou en présence du cocktail de phages 2, 9 et 10 en combinaison avec différents antibiotiques : AB6 (Streptamycine à 50 μg/mL), AB9 (Cloxacilline à 50 μg/mL) ou AB10 (Oxytétracycline à 50 μg/mL). Les bactéries sont dénombrées sur le milieu Baird Parker au moment de l’addition des phages (T0), après 8h (T 8h) et 24h (T 24h) d’incubation à 37°C.
est un histogramme montrant le suivi de la prolifération de S. aureus dans le lait cru : en l’absence de phage (TM bactéries (sans phage)), en présence du cocktail de phages 2, 9 et 10, en présence du cocktail de phages 3, 9 et 10, en présence du cocktail de phages 9 et 10, en présence du cocktail de phages 3 et 10 et en présence du phage 10. Les bactéries sont dénombrées sur le milieu Baird Parker au moment de l’addition des phages (T0), après 8h (T 8h) et 24h (T 24h) d’incubation à 37°C.
est un histogramme montrant le suivi de la prolifération de S. aureus dans le lait cru en présence de la nisine et/ou du lysozyme seul(e)(s) ou en combinaison avec le cocktail de phages 2, 9 et 10. Les bactéries sont dénombrées sur le milieu Baird Parker au moment de l’addition des phages (T=0h), après 8h (T=8h) et 24h (T=24h) d’incubation à 37°C.
EXEMPLES
La présente invention se comprendra mieux à la lecture des exemples suivants qui illustrent non-limitativement l’invention.
Ex e mple 1 : . Isolement et caractérisation des phages
  1. Isolement des phages
Les phages spécifiques auxS.aureusont été isolés à partir de 286 échantillons provenant des milieux d’élevage de toute la France. Ces échantillons comprenaient 117 échantillons de laits crus, 45 échantillons de la peau de vache, 59 échantillons d’eau et 65 échantillons de fèces. Seuls les phages lytiques et naturels ont été recherchés. La présence des phages a été détectée par la méthode des spots en boîtes de Pétri. Il s’agit de déposer une goutte d’un échantillon sur la gélose de culture inondée préalablement avec une culture de la bactérie hôte en phase exponentielle. La présence de phages se traduit par l’apparition d’une zone de lyse autour du spot déposé. Ensuite, les échantillons à l’origine d’une lyse seront testés par la technique de la double couche. La culture de bactéries hôtes est mélangée avec l’échantillon dans un volume de gélose molle en surfusion puis additionnée de CaCl2ou/et de MgCl2(10mM). Ce mélange est versé à la surface d’une boîte de Pétri contenant une couche de gélose. La présence d’un phage est matérialisée par l’apparition d’une plage de lyse. Un repiquage des plages de lyse est ensuite effectué pour obtenir un seul phage isolé. L’étape de multiplication a été effectuée afin d’augmenter la concentration en phages en vue de leur caractérisation.
Résultats
184 isolats de phages ont été isolés à partir de l’ensemble des échantillons.
Les phages isolés ont été mis dans la culture pour multiplication en vue de leur caractérisation. Après chaque cycle de multiplication, la présence de phage a été vérifiée par la méthode de spot. La concentration des phages isolés après la multiplication a été vérifiée par la technique de double couche.
  1. Caractérisation des phages par les enzymes de restriction
Après extraction et purification de l’ADN phagique, celui-ci a subi une digestion enzymatique par EcoRI. La séparation est effectuée par électrophorèse en gel d’agarose. Les fragments de digestion sont révélés par une coloration au GelRed comme agent intercalant de l’ADN.
Résultats
L’ADN de différents phages isolés a été digéré par l’enzyme de restriction EcoRI (Figure 1).
Les résultats de migration sur gel des fragments de digestion ont montré des profils de digestion différents selon les différents isolats. Cela démontre qu’il s’agit de phages différents. Les phages ayant le même profil ont été regroupés. Au total, quatorze profils ont été identifiés. La montre le profil de digestion de l’ADN des phages suivants : phage 2, phage 3, phage 5, phage 6, phage 9, phage 10, phage 11, phage 12 et phage 13, phage 14. Pour la suite, pour chaque profil, un phage a été sélectionné pour la suite des tests afin d’étudier leur activité.
Pour confirmer que ces phages sont différents de ceux publiés, le séquençage du génome a été réalisé.
Pour cela, les phages ont été cultivés avec une bactérie hôte deStaphyloco c cus aureus. Cette culture de phage a été centrifugée à 10 000g pendant 10 min. Le surnageant a été récupéré et filtré sur une membrane 0,22 µm. Le surnageant a ensuite été traité par l’ADNase, ARNase (1 µg/mL) avant de faire l’extraction d’ADN des phages par un protocole du laboratoire en utilisant du phénol/chloroforme et de l’isopropanol.
L’ADN de phage a ensuite été séquencé par la technologie NGS en PE 2 x 300 bp sur MiSeq system.
Exemple 2 : Activité et stabilité des phages
1. Détermination du spectre d’activité des phages isolés
Selon les profils de digestion, huit phages ont finalement été sélectionnés pour tester leur activité sur différentes souches deS. aureusisolées à partir des échantillons d’élevage.
Résultats
Le spectre d’activité a été testé sur 25 souches bactériennes dont 19 souches de S. aureus et 6 souches non S. aureus (Tableau 1) par la méthode de spot. L’intensité de lyse de ces phages sur chacune des souches bactériennes est détaillée dans le tableau 1. Le tableau 1 représente le spectre d’activité des phages isolés sur différentes souches bactériennes. La lyse obtenue par la méthode de spot est notée de (-) = pas d’activité à (+++++) = très active ( ). La notation « C » signifie que quelques colonies sont observées dans la plage de lyse.
Phage/
Souche 		Souches bactériennes/Phages Phage 6 Phage 3 Phage 8 Phage 9 Phage10 Phage 2 Phage 5 Phage 7 Mix 1 (2/3/7) Mix 2 (2/9/10)
79 1 S.aureus ++++ ++++ ++++ +++++ +++++ +++++ - ++++ ++++ ++++
81 2 S.aureus +++ +++ +++++ +++++ +++++ +++++ ++ ++ ++++ ++++
C24.b 3 S.aureus - +++ ++ ++ +++ +++++ + ++ ++++ ++++
F1.a 4 S.aureus - +++ ++ ++ +++ +++++ ++ - ++++ ++++
L5.a 5 S.aureus - - - - - ++++ +++ +++++ ++++ ++++
Q12.b 6 S.aureus - ++ ++ ++ +++ +++++ + +++++ ++++ ++++
Q14.b 7 S.aureus - - - - - - + ++ + ++
U5a.a 8 S.aureus ++ +++ +++++ +++++ ++++ +++++ ++ ++++ ++++ ++++
F2.a 9 S.aureus - +++ ++ ++ +++ +++++ + - +++ ++++
L1.a 10 S.aureus ++ ++ - ++ ++ +++++ ++ ++++ ++++ ++++
G6.b 11 S.aureus - - - - - +++ ++ ++ ++ +++
a 12 S.aureus - ++++ ++ ++ +++ +++++ + - +++ ++++
3 13 S.aureus ++ - - - - +++++ - +++ ++++ ++++
R8c2 14 S.aureus - ++ ++ ++ +++ +++++ + - ++++ ++++
1Da2 15 S.aureus - - - + ++ - + - + ++
Z12c2b 16 S.aureus ++ ++ ++++ +++++ ++++ +++++ + +++++ +++ +++
5S.d 17 S.aureus - - ++ +++ ++ ++++ - ++ +++ +++
9L.a 18 S.aureus - +++ ++ ++ ++++ +++++ ++ ++ +++ ++++
Moqueuse 19 S.aureus - - ++ ++ +++ +++++ ++ - ++++ ++++
31,50% 63,00% 68,40% 79% 79% 89% 68,40% 100% 100%
Ces résultats montrent que :
- Le bactériophage déposé à la CNCM sous le numéro CNCM I-5408 (phage 2) infecte 17 souches sur les 19 souchesS. aureustestées, soit 89 % (Tableau 1) ;
- Le bactériophage 8 infecte 14 souches sur 19 souchesS. aureus,soit 68.4% (Tableau 1)
- Le bactériophage déposé à la CNCM sous le numéro CNCM I-5491 (phage 9) infecte 15 souches sur 19 souchesS.aureussoit 79% (Tableau 1) ;
- Le bactériophage déposé à la CNCM sous le numéro CNCM I-5492 (phage 10) infecte 15 souches sur 19 souchesS.aureussoit 79% (Tableau 1) ;
Le cocktail des trois phages (2, 3 et 7) infecte 19 souches sur 19 souchesS. aureussoit 100% des souchesS. aureustestées (Tableau 1).
- Le cocktail des trois phages (2, 9 et 10) infecte 19 souches sur 19 souchesS. aureussoit 100% des souchesS. aureustestées (Tableau 1).
En particulier, il a été montré que le mélange des phages n°CNCM I-5408 (phage 2), n°CNCM I-5491 (phage 9), et n°CNCM I-5492 (phage 10) permettait d’infecter la totalité des 19 souchesS aureus, soit 100 % des souchesS. aureustestées (Tableau 1).
Les phages selon l’invention ont un large spectre d’activité sur l’infection de souches deS. aureuset ont aussi été sélectionnées pour leur vitesse d’élimination deS. aureus(après 3 h d’incubation à 37°C en milieu BHI (Brain Heart Infusion)).
2. Activité des phages dans le lait cru
L’activité des phages 2 (CNCM I-5408), 3 (CNCM I-5409), 6, 7 (CNCM I-5410), 9 (CNCM I-5491), 10 (CNCM I-5492), 11 ainsi que celle de cocktails de phages a été étudiée dans le lait cru afin d’évaluer leur efficacité dans le milieu de la lactation.
Le lait cru a été tout d’abord contaminé artificiellement par les bactéries deS. aureusà une concentration d’environ 106UFC/mL. Les phages ont été ajouté à 107UFP/mL (M.O.I=10).
La concentration en phages a été évaluée au cours du temps par la méthode de double couche à T0, 8h et 24h ( ).
Les bactéries ont été dénombrées sur milieu Baird Parker à T=0, 8h et 24h (Figures4et7).
Prolifération des phages dans le lait cru
Par rapport au milieu BHI, la prolifération des phages est plus limitée dans le lait cru. La concentration des phages est stable pendant les 8 premières heures, puis diminue légèrement pour certains phages après 24h d’incubation ( ). Toutefois, une différence entre les phages a été observée. Les phages 3 (CNCM I-5409), 6,
9 (CNCM I-5491) et 10 (CNCM I-5492) sont les plus stables dans le lait cru. En effet, seuls ces 4 phages peuvent se répliquer dans le lait cru. Après 24h d’incubation, la concentration la plus élevée est observée pour les phages 3, 9 et 10. Une concentration tout aussi élevée après 24h d’incubation est également observée pour le mélange de phages 2 (CNCM I-5409), 9 (CNCM I-5491) et 10 (CNCM I-5492) ( ).
Réduction des bactéries par des phages dans le lait cru
En milieu BHI, l’ajout des phages permet de réduire complétement les bactéries. L’ajout du phage 10 (CNCM I-5492) seul, et dans une moindre mesure l’ajout du
phage 9 (CNCM I-5491) seul, permettent de réduire la concentration bactérienne dans le lait cru (environ 2 log pour le phage 9 et 3 log pour le phage 10). L’ajout du cocktail de phages 2 (CNCM I-5408), 9 (CNCM I-5491) et 10 (CNCM I-5492) permet également de réduire le nombre de bactéries d’environ 3 log après 24h ( ).
Après 24h , l’ajout du phage 10 (CNCM I-5492) seul, du cocktail de
phages 2 (CNCM I-5408), 9 (CNCM I-5491) et 10 (CNCM I-5492), du cocktail de phages 3 (CNCM I-5409), 9 (CNCM I-5491) et 10 (CNCM I-5492), du cocktail de phages 3 (CNCM I-5409), et 10 (CNCM I-5492) permettent de réduire la concentration bactérienne dans le lait cru d’environ 4 log, tandis que l’ajout du cocktail de
phages 9 (CNCM I-5491) et 10 (CNCM I-5492) permet de réduire la concentration bactérienne dans le lait cru d’environ 3 log ( ).
Ex e mple 3 : Combinaison des phages avec de la nisine et/ou du lysozyme
Le lait cru a été tout d’abord contaminé artificiellement par des bactéries deS. aureusà une concentration d’environ 106UFC/mL. Ensuite, la nisine (composé A) a été ajoutée dans le lait cru à une concentration de 0.2 mg/mL, et/ou le lysozyme (composé B) à une concentration de 0.5 mg/mL, et/ou le cocktail de phages 2, 9 et 10 à une concentration de 107UFP/mL (ratio des phages dans le cocktail 1 :1 :1) (ratio phage/bactérie (M.O.I) =10).
Les bactéries ont été dénombrées sur milieu Baird Parker à T=0h, 8h et 24h d’incubation à 37°C.
La représente l’effet de la nisine et/ou du lysozyme seul(e)(s) ou en présence du cocktail de phages 2, 9 et 10 sur la concentration de bactérie S. aureus dans le lait cru.
La présence de nisine (composé A) seule à 0.2 mg/mL permet d’obtenir une inhibition du développement deS. a ureusdans le lait cru équivalente à celle en présence du cocktail de phages 2, 9 et 10 seul (réduction de 3 log environ). Cette inhibition est accrue lorsque la nisine est combinée au cocktail de phages 2, 9 et 10 (réduction de 5 log environ).
La présence du lysozyme (Composé B) seul à 0,5 mg/mL a montré un faible effet sur le développement de la souche de S.aureustestée. Le fait de combiner le lysozyme avec le cocktail de phages 2, 3 et 7 a un peu amélioré l’inhibition du développement des bactéries dans le lait cru.
Cependant, un effet antibactérien très surprenant a été observé lorsque les phages étaient combinés avec la nisine (composé A) et le lysozyme (composé B). En effet, avec cette combinaison, la population deS. aureusest drastiquement diminuée. Cet effet sur le développement deS. aureusest supérieur à l’effet obtenu séparément avec la nisine, le lysozyme et le cocktail de phages, et les combinaisons nisine/phages, lysozyme/phages et lysozyme/nisine. Ainsi, en combinant le cocktail de phages 2, 9 et 10 avec la nisine et le lysozyme, une très faible quantité de bactéries est détectée.
Ex e mple 4 : Combinaison des phages avec des antibiotiques
1. Prolifération des phages dans le lait cru en présence d’antibiotiques
Pour étudier l’effet des antibiotiques sur la prolifération des phages dans le lait cru, le titre du mélange des phages 2 (CNCM I-5408), 9 (CNCM I-5491) et 10 (CNCM I-5492) a été mesuré à t=0h, t=8h et t=24h en présence de différents antibiotiques : AB9 (Cloxaciline), AB6 (Streptomycine) et AB10 (Oxytétracycline).
Le lait cru a été tout d’abord contaminé artificiellement par les bactéries de S.aureus à une concentration d’environ 106UFC/mL. L’antibiotique a été ensuite ajouté dans le lait à 50 μg/mL. Les phages ont été ajoutés à 107UFP/mL (M.O.I=10). La représente la concentration des phages en présence des antibiotiques.
La montre que le titre du mélange de phages 2 (CNCM I-5408),
9 (CNCM I-5491) et 10 (CNCM I-5492) est affecté par l’ajout des antibiotiques, que ce soit AB9, AB6 ou AB10.
2. Réduction du nombre de bactéries S. aureus dans le lait cru par une combinaison phages/antibiotiques
20 mL de lait cru ont tout d’abord été contaminé artificiellement par des bactéries deS. aureusà une concentration de 106UFC/mL. Les phages (ou cocktail de phages) sont ensuite ajoutés à une concentration de 107UFP/mL. L’AB est ajouté à la concentration de 50 μg/mL.
La concentration des bactéries est mesurée en début d’expérience à T0, 8h et 24h d’incubation à 37°C pour le cocktail de phages 2, 9 et 10 ( ). Le nombre de bactéries est évalué par la méthode d’étalement sur boite de gélose Baird Parker.
La montre l’effet du mélange des phages 2 (CNCM I-5408), 9 (CNCM I-5491) et 10 (CNCM I-5492) en présence de différents antibiotiques : AB9 (Cloxaciline), AB6 (Streptomycine) et AB10 (Oxytétracycline).
Dans le témoin contenant les bactéries seules (TM bactéries (sans phages, sans AB)), les bactéries se développent pendant 24h et la concentration de bactéries est de 8 log environ après 8h et 24h.
L’ajout du cocktail de phages seul (cocktail de phages 2, 9 et 10) permet de réduire le nombre de bactéries de 3 log après 24h d’incubation.
Lorsque l’antibiotique est ajouté seul dans le lait, l’effet inhibiteur sur la bactérie dans le lait cru est observé à la concentration de 50 μg/mL. Une réduction de 3 à 4 log est observée pour AB6 et AB9, et de 2 log environ pour AB10.
Lorsque le cocktail de phages 2, 9 et 10 est ajouté dans le lait cru avec l’antibiotique AB6 ou AB9, une synergie est observée. En effet, une réduction d’environ 6 log après 24 h est observée lorsque le cocktail de phages 2, 9 et 10 est combiné avec AB6 ou AB9.
Ainsi, ces données démontrent une synergie de la combinaison d’un cocktail de phages avec des antibiotiques, en particulier AB6 et AB9, sur la réduction deS. aureusdans le lait cru.
Références à du matériel biologique déposé
Dans la présente demande, il est fait référence aux souches de bactériophages suivantes, déposées à la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes - Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 Paris cedex 15) le 21 Mars 2019:
- phage 2, référence d’identification auprès de la CNCM « Vetophage – phi 2 », dont le numéro d’enregistrement est « CNCM I-5408 » ;
- phage 3, référence d’identification auprès de la CNCM « Vetophage – phi 3 », dont le numéro d’enregistrement est « CNCM I-5409 »
Dans la présente demande, il est fait référence aux souches de bactériophages suivantes, déposées à la CNCM le 12 février 2020;
- phage 9, référence d’identification auprès de la CNCM « Vetophage – phi 9 », dont le numéro d’enregistrement est « CNCM I-5491 » ;
- phage 10, référence d’identification auprès de la CNCM « Vetophage – phi 10 », dont le numéro d’enregistrement est « CNCM I-5492 ».

Claims (19)

  1. Composition comprenant une souche de bactériophage choisie parmi les souches telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5491 et CNCM-5492.
  2. Composition selon la revendication1, comprenant en outre au moins une souche de bactériophage choisie parmi les souches telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5409, CNCM I-5491 et CNCM I-5492, ladite composition comprenant plus particulièrement les souches CNCM I-5409 et CNCM I-5492 et CNCM I-5491 et CNCM I-5492.
  3. Composition selon l’une quelconque des revendications1à2, comprenant les trois souches de bactériophage déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5491 et CNCM I-5492.
  4. Composition selon l’une quelconque des revendications1à2, comprenant les trois souches de bactériophage déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5409, CNCM I-5491 et CNCM I-5492.
  5. Composition selon l’une des revendications1à4, dans laquelle ladite composition comprend en outre une bactériocine, en particulier la nisine, et/ou du lysozyme.
  6. Composition selon l’une des revendications1à5comprenant en outre au moins un antibiotique.
  7. Composition selon l’une des revendications1à6comprenant en outre au moins un antibiotique choisi parmi la streptomycine, la cloxacilline et l’oxytétracycline.
  8. Nécessaire de pièces comprenant une composition selon l’une des revendications1à4et une bactériocine, en particulier la nisine, et/ou du lysozyme, et/ou au moins un antibiotique.
  9. Composition selon l’une des revendications1à7ou nécessaire de pièces selon la revendication8, pour son utilisation comme médicament.
  10. Composition selon l’une des revendications1à7ou nécessaire de pièces selon la revendication8pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d’une infection parStaphylococcus aureuschez un mammifère.
  11. Composition selon l’une des revendications1à7ou nécessaire de pièces selon la revendication8, pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d’une infection parStaphylococcus aureuschez le mammifère allaitant, en particulier la vache, la brebis, la chèvre, la bufflonne ou la chamelle.
  12. Composition ou nécessaire de pièces pour son utilisation selon l’une des revendications9à11, ladite composition comprenant les souches de bactériophage déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5491 et
    CNCM I-5492 et un antibiotique choisi parmi la streptomycine, la cloxacilline et l’oxytétracycline.
  13. Solution désinfectante comprenant une composition selon l’une des revendications1à7.
  14. Biocide comprenant une composition selon l’une des revendications1à7.
  15. Additif alimentaire comprenant une composition selon l’une des revendications1à7.
  16. Conservateurs alimentaires comprenant une composition selon l’une des revendications1à7.
  17. Probiotique comprenant une composition selon l’une des revendications1à7.
  18. Souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro CNCM I-5491.
  19. Souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro CNCM I-5492.
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