EP3972620A1 - Nouvelles souches de bactériophages et leurs utilisations - Google Patents

Nouvelles souches de bactériophages et leurs utilisations

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Publication number
EP3972620A1
EP3972620A1 EP20737263.2A EP20737263A EP3972620A1 EP 3972620 A1 EP3972620 A1 EP 3972620A1 EP 20737263 A EP20737263 A EP 20737263A EP 3972620 A1 EP3972620 A1 EP 3972620A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cncm
phages
phage
bacteriophage
strain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP20737263.2A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Mai Huong CHATAIN-LY
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Vetophage
Original Assignee
Vetophage
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR1905329A external-priority patent/FR3096374A1/fr
Priority claimed from FR2005105A external-priority patent/FR3110599A1/fr
Application filed by Vetophage filed Critical Vetophage
Publication of EP3972620A1 publication Critical patent/EP3972620A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10111—Myoviridae
    • C12N2795/10121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10111—Myoviridae
    • C12N2795/10131—Uses of virus other than therapeutic or vaccine, e.g. disinfectant

Definitions

  • the present invention relates to novel strains of bacteriophages (phages) effective against Staphylococcus aureus and compositions thereof, as well as the combination of at least one strain of bacteriophage effective against Staphylococcus aureus with a bacteriocin and / or with lysozyme and / or with an antibiotic.
  • the invention also relates to the use of these bacteriophages as food preservatives, food additives, probiotics, disinfectant solution, biocide or their therapeutic use for treating infections or contaminations by Staphylococcus aureus, in particular for the treatment of mastitis. .
  • phages are considered "intelligent anti-microbials" for their specificity, they infect the target bacteria without any effect on the commensal flora and are eliminated naturally when the host bacteria are completely eliminated.
  • lytic virulent
  • temperate lysogenic phages
  • the first step in phage infection is the adsorption of phages to the bacterial cell wall through specific interactions between viral proteins and host cell receptors. After entering the bacterial cell, virulent phages quickly replicate to synthesize their capsid proteins and genome inside the host cell. Finally, the new phages escape from the host bacteria by breaking the the cell wall which leads to the death of the bacterial cell.
  • temperate phages integrate their genetic material into the host cell's chromosome, which is replicated with the host cell's genome (as a prophage). Only temperate phages can integrate into the bacterial genome and participate in horizontal gene transfers between bacterial populations. For applications in therapy, only lytic phages are selected for their ability to rapidly lyse target bacteria.
  • phage products have been approved and marketed.
  • FDA Food and Drug Administration
  • ListexTM is applied to control Listeria monocytogenes in smoked salmon, in meat and poultry products.
  • ListexTM was also approved for application in the food industry by Food Standards Australia & New Zealand (FSANZ) in 2012.
  • FSANZ Food Standards Australia & New Zealand
  • phage P 100 is a product similar to ListexTM.
  • some studies have encountered failures in the use of phages; in fact, several factors can influence the effectiveness of the treatment.
  • phages For antibacterial applications, phages must be lytic and have a broad spectrum of activity (ability to infect multiple target bacterial strains). They must be stable under the treatment conditions and above all have access to the targeted bacteria. The last factor depends on the composition and structure of the matrix. Staphylococcus anreits is the most common bacterial species in human and veterinary pathology.
  • the inventors have surprisingly discovered that the bacteriophages deposited in the National Collection of Microorganism Cultures (CNCM) under the numbers CNCM I-5408, CNCM I-5409, CNCM I-5410, CNCM I-5491 and CNCM I- 5492 made it possible to infect a broad spectrum of strains of S. aureus and were also capable of effectively inhibiting the development of this bacterium, including in a medium composed of raw milk.
  • CNCM I-5408, CNCM I-5409, CNCM I-5410, CNCM I-5491 and CNCM I- 5492 made it possible to infect a broad spectrum of strains of S. aureus and were also capable of effectively inhibiting the development of this bacterium, including in a medium composed of raw milk.
  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising a bacteriophage strain chosen from the strains as deposited at the CNCM under the numbers CNCM I-5409, CNCM I-5410, CNCM I-5491 and CNCM-5492.
  • said composition further comprises at least one bacteriophage strain chosen from the strains such as deposited at the CNCM under the numbers CNCM I-5408, CNCM I-5409, CNCM I-5410, CNCM I-5491 and CNCM I-5492.
  • said composition comprises three strains of bacteriophage chosen from the strains such as deposited at the CNCM under the numbers CNCM I-5408, CNCM I-5409, CNCM I-5410, CNCM I-5491 and CNCM I-5492 .
  • said composition comprises the three strains of bacteriophage deposited at the CNCM under the numbers:
  • said composition further comprises a bacteriocin, in particular nisin, and / or lysozyme, and / or at least one antibiotic.
  • the present invention also relates to a composition
  • a composition comprising at least one strain of bacteriophage, said composition further comprising a bacteriocin, in particular nisin, and / or lysozyme, and / or at least one antibiotic.
  • said composition further comprises at least one antibiotic chosen in particular from streptomycin, cloxacillin and oxytetracycline,
  • the present invention also relates to a kit of parts comprising said composition described above and at least one other element such as a bacteriocin, in particular nisin, and / or lysozyme, and / or an antibiotic.
  • the present invention also relates to a kit of parts comprising a composition comprising at least one bacteriophage and at least one other element such as a bacteriocin, in particular nisin, and / or lysozyme, and / or an antibiotic.
  • the present invention also relates to a composition as described above or a parts kit as described above, for its use as a medicament.
  • the present invention relates to a composition as described above or a kit of parts as described above, for its use in the treatment or prevention of an infection by Staphylococcus aureus in a mammal such as humans or animals.
  • said infection by Staphylococcus aureus is mastitis in the lactating mammal, in particular the cow, the ewe, the goat, the buffalo or the camel.
  • the present invention relates to the use of a composition as described above as a disinfectant solution, biocide, food additive, food preservative or probiotic.
  • the present invention also relates to a kit of parts comprising at least one strain of bacteriophage and another element such as a bacteriocin, in particular nisin, and / or lysozyme, and / or an antibiotic for its use according to one of the claims as a medicament, in particular for its use in the treatment or prevention of infection by Staphylococcus aureus in a mammal such as humans or animals, wherein said strain and said other element are to be administered simultaneously, separately or sequential, preferably simultaneous.
  • bacteriocin in particular nisin, and / or lysozyme
  • an antibiotic for its use according to one of the claims as a medicament, in particular for its use in the treatment or prevention of infection by Staphylococcus aureus in a mammal such as humans or animals, wherein said strain and said other element are to be administered simultaneously, separately or sequential, preferably simultaneous.
  • the present invention relates to a bacteriophage strain deposited at the CNCM under the number CNCM I-5409.
  • the present invention relates to a bacteriophage strain deposited at the CNCM under the number CNCM I-5410.
  • the present invention relates to a bacteriophage strain deposited at the CNCM under the number CNCM I-5491.
  • the present invention relates to a bacteriophage strain deposited at the CNCM under the number CNCM I-5492
  • Food additive concerns a product added to commercial foodstuffs (in particular industrial foods) intended for human and / or animal consumption.
  • Antibiotic refers to a substance, of natural or synthetic origin, used against infections caused by bacteria.
  • Bacteriocin concerns a family of peptides or proteins naturally synthesized by certain bacteria.
  • a bacteriocin generally consists of a protein compound of 20 to 60 amino acids. Bacteriocins are not corn antibiotics they have antibiotic properties.
  • Biocide is a product intended to destroy, repel or render harmless harmful organisms, to prevent their occurrence or to fight them, by chemical or biological action.
  • Disinfectant is a substance capable of destroying or preventing the development of microbes, especially bacteria in inert media (non-living: soils, instruments, etc.)
  • “Food preservative” concerns a product added to prevent the development of microorganisms in foodstuffs and thus prevent possible food poisoning.
  • “Lysozyme” relates to an enzyme found in various body fluids, such as egg white, nasal mucus, tears, milk or cervical mucus. Lysozymes are divided into different types: type-c lysozymes (for "chicken”), type-g lysozymes (for "goose”), type-i lysozymes (for "invertebrate”), type-ch lysozymes ( for Chalaropsis), plant lysozymes, bacterial lysozymes and phage lysozymes.
  • Mammal concerns a class of vertebrate, viviparous animals, which are characterized essentially by the presence of udders, a heart with four cavities, a developed nervous and encephalic system, by a constant internal temperature and a breathing of pulmonary type. Mammals include humans and farm animals such as sheep, cattle and carines.
  • Microstitis relates to a breast infection by a microorganism, in particular a bacterium such as S. aureus.
  • Probiotic refers to living microorganisms which, when consumed in adequate amounts, confer a beneficial effect on the health and immunity of the healthy host.
  • Treatment or “treat” concerns the therapeutic treatment and the prophylactic or preventive measures the object of which is to prevent or slow down the pathology (here an infection).
  • Subjects requiring treatment include subjects already affected by the pathology as well as those at risk of developing the pathology.
  • a subject is effectively treated for the pathology if, after receiving a therapeutically effective dose of a composition according to the present invention, the subject shows an improvement in one or more of the following parameters: reduction in the number of pathogens, decrease in or more symptoms associated with the pathology, decrease in morbidity and mortality, improvement in quality of life.
  • the present invention relates to the bacteriophage strain deposited in the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) under the number CNCM I-5408.
  • the present invention also relates to the bacteriophage strain deposited at the CNCM under the number CNCM I-5409.
  • the present invention also relates to the bacteriophage strain deposited at the CNCM under the number CNCM I-5410.
  • the present invention also relates to the bacteriophage strain deposited at the CNCM under the number CNCM I-5491.
  • the present invention also relates to the bacteriophage strain deposited at the CNCM under the number CNCM I-5492.
  • compositions comprising a strain of bacteriophage
  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising a bacteriophage strain chosen from the strains as deposited in the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) under the numbers CNCM I-5409, CNCM I-5410, CNCM I -5491 and CNCM I-5492.
  • said composition further comprises at least one bacteriophage strain chosen from the strains as deposited under the numbers CNCM I -5408, CNCM I-5409, CNCM I-5410, CNCM I -5491 and CNCM I- 5492.
  • the additional strain (s) further included in the composition are different from the strain chosen first.
  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising at least two strains of bacteriophage chosen from the strains such as deposited at the CNCM under the numbers CNCM I-5408, CNCM I-5409, CNCM I-5410, CNCM I-5491 or CNCM I-5492.
  • said composition comprises the strains CNCM I-5409 and CNCM-5410, the strains CNCM I-5409 and CNCM-5408, the strains CNCM I-5410 and CNCM-5408, the strains CNCM I- 5408 and CNCM I-5491, the CNCM I-5408 and CNCM I-5492 strains, the CNCM I-5409 and CNCM I-5491 strains, the CNCM I-5409 and CNCM I-5492 strains, the CNCM I-5410 strains and CNCM I-5491, the strains CNCM I-5410 and CNCM I-5492, the strains CNCM I-5491 and CNCM I-5492.
  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising three strains of bacteriophage chosen from the strains CNCM I -5410, CNCM I-5409, CNCM-5408, CNCM I-5491, CNCM I-5492.
  • said composition comprises the strains CNCM I-5408, CNCM I-5409 and CNCM I-5410.
  • said composition comprises the strains CNCM I-5491, CNCM I-5492 and CNCM I-5408.
  • said composition comprises the strains CNCM I-5491, CNCM I-5492 and CNCM I-5409.
  • said composition comprises a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • This vehicle can be a saline solution, in particular 15% NaCl or a phosphate buffer solution (PBS) which contains a salt, for example NaCl or CaCl2 or a solution of SM phage storage buffer which contains NaCl, MgSO4, Tris-NaCl, gelatin.
  • PBS phosphate buffer solution
  • said composition comprises a stabilizing agent, for example glycerol and / or sorbitol and / or sucrose or / and an agent for adjusting the viscosity.
  • a stabilizing agent for example glycerol and / or sorbitol and / or sucrose or / and an agent for adjusting the viscosity.
  • the concentration of each bacteriophage strain is between 10 6 / mL and 10 12 / mL, in particular 10 8 / mL, more particularly 10 7 / mL.
  • said composition described above comprising at least one strain of bacteriophage further comprises a bacteriocin, in particular nisin, and / or lysozyme and / or at least one antibiotic.
  • the present invention relates to a combined product or a combined preparation comprising said composition described above comprising at least one strain of bacteriophage, and a bacteriocin, for example nisin, and / or lysozyme and / or an antibiotic.
  • a bacteriocin for example nisin, and / or lysozyme and / or an antibiotic.
  • composition described above comprising at least one strain of bacteriophage, further comprises a bacteriocin.
  • the present invention relates to a combined product or a combined preparation comprising said composition described above comprising at least one strain of bacteriophage, and one bacteriocin.
  • Another aspect of the invention relates to a composition comprising at least one strain of bacteriophage for use in the treatment of infection by
  • composition comprises at least one strain of bacteriophage and one bacteriocin.
  • the bacteriocin is for example chosen from nisin, colicin and natamycin.
  • said bacteriocin is nisin.
  • said bacteriocin is a recombinant bacteriocin, in particular recombinant nisin.
  • the concentration of bacteriocin is between 0.05 mg / mL and 2 mg / mL, more particularly between 0.05 mg / mL and 1 mg / mL, and in particular between 0.05 mg / mL and 0.5 mg / mL, more particularly
  • the bacteriophage strain is a strain capable of inhibiting the development of Staphylococcus aureus.
  • a test for determining whether a bacteriophage inhibits the development of S. aureus is that described in Example 7 of the Examples section below.
  • said bacteriophage strain is chosen from the strains deposited under the numbers CNCM I-5408, CNCM I-5409 and CNCM I-5410.
  • said bacteriophage strain is chosen from the strains deposited under the numbers CNCM I-5491 or CNCM I-5492.
  • said composition comprises two or three strains of bacteriophage such as deposited at the CNCM under the numbers CNCM I-5408, CNCM I-5409 and CNCM I-5410.
  • said composition comprises two or three strains of Operaess bacteriophage deposited at the CNCM under the numbers CNCM I-5408, CNCM I-5491 and CNCM I-5492. In a particular embodiment, said composition comprises two or three strains of bacteriophage such as deposited at the CNCM under the numbers CNCM I-5409, CNCM I-5491 and CNCM I-5492.
  • the composition described above comprising at least one strain of bacteriophage, further comprises a positively charged enzyme having the capacity to hydrolyze the peptidoglycan of the bacterial wall.
  • the enzyme is lysozyme.
  • the present invention relates to a combined product or a combined preparation comprising said composition described above comprising at least one strain of bacteriophage, and lysozyme.
  • the lysozyme is a type-c lysozyme, and more particularly lysozyme from egg yolk.
  • the invention also relates to a composition
  • a composition comprising at least one strain of bacteriophage for its use for the treatment of an infection by S. aureus, characterized in that said composition comprises at least one strain of bacteriophage and lysozyme.
  • the present invention relates to a combined product or a combined preparation comprising a composition comprising at least one strain of bacteriophage, and lysozyme.
  • the bacteriophage strain is one capable of inhibiting the development of Staphylococcus aureus.
  • the lysozyme concentration is greater than 1.25 mg / ml, in particular at least 2.5 mg / mL, more particularly 2.5 mg / mL,
  • the concentration of the bacteriophage strain is between 10 6 / mL and 10 12 / mL, in particular from 10 8 / mL and 10 10 / mL, more particularly 10 7 / mL.
  • composition described above comprising at least one strain of bacteriophage, further comprises a bacteriocin and lysozyme.
  • the present invention relates to a combined product or a combined preparation comprising said composition described above comprising at least one strain of bacteriophage and one bacteriocin, in particular nisin, and lysozyme.
  • the lysozyme is a type-c lysozyme, and more particularly lysozyme from egg yolk
  • a composition comprising at least one strain of bacteriophage in combination with a bacteriocin and lysozyme for its use in the treatment of infection by S. aureus.
  • the present invention relates to a combined product or a combined preparation comprising a composition comprising at least one bacteriophage strain on the one hand, lysozyme and a bacteriocin on the other hand for its use in treatment of infection with S. aureus.
  • the concentration of the bacteriophage strain is between 10 6 / mL and 10 12 / mL, in particular 10 8 / mL, more particularly 10 7 / mL.
  • said bacteriophage strain is chosen from the strains deposited under the numbers CNCM I -5408, CNCM I -5409, CNCM I -5410, CNCM I-5491 or CNCM I-5492.
  • said composition comprises two or three bacteriophages such as deposited at the CNCM under the numbers CNCM I-5408, CNCM I-5409 and CNCM I-5410.
  • said composition comprises two or three bacteriophages such as deposited at the CNCM under the numbers CNCM I-5408, CNCM I-5491 and CNCM I-5492.
  • said composition comprises two or three bacteriophages as deposited at the CNCM under the numbers CNCM I-5409, CNCM I-5491 and CNCM I-5492.
  • said composition comprises at least one strain of bacteriophage in combination with nisin and lysozyme.
  • the nisin concentration is between 0.05 mg / mL and 2 mg / mL, more particularly between 0.05 mg / mL and 1 mg / mL, and in particular between 0.05 mg / mL and 0.5 mg / mL more particularly 0.1 mg / mL to 0.4 mg / mL, more particularly 0.1 mg / mL to 0.3 mg / mL, even more particularly 0.2 mg / mL.
  • the lysozyme concentration is equal to or greater than 0.5 mg / ml. In a particular embodiment, the lysozyme concentration is equal to or greater than 1.25 mg / ml.
  • said composition described above comprising at least one strain of bacteriophage further comprises at least one antibiotic.
  • the composition described above, comprising at least one strain of bacteriophage is used in combination with at least one antibiotic.
  • the present invention relates to a combined product or a combined preparation comprising said composition described above comprising at least one strain of bacteriophage and at least one antibiotic.
  • the invention also relates to a composition
  • a composition comprising at least one strain of bacteriophage in combination with at least one antibiotic for its use for the treatment of infection by S. aureus.
  • the bacteriophage strain is one capable of inhibiting the development of Staphylococcus aureus.
  • said antibiotic is chosen from: cloxacillin, oxytetracycline, streptomycin, gentamycin, chloramphenicol, tetracycline, ampicillin or erythromycin.
  • said composition described above comprising at least one strain of bacteriophage, is used in combination with cloxacillin.
  • said composition described above comprising at least one strain of bacteriophage, is used in combination with oxytetracycline.
  • said composition described above comprising at least one strain of bacteriophage is used in combination with streptomycin.
  • the antibiotic is used at a concentration of between 5 mg / mL and 200 mg / mL, in particular between 10 mg / mL and 100 mg / mL, and in particular between 25 mg / mL and 100 mg / mL, in particular between 25 mg / mL and 75 mg / mL, more particularly 50 mg / mL.
  • the antibiotic is used at a concentration of between 0.125 mg / mL and 5 mg / mL, in particular between 0.625 mg / mL and 2.5 mg / mL, more particularly 1.25 mg / mL
  • the antibiotic such as streptomycin, cloxacillin and Poxytetracycline
  • the antibiotic is used at a concentration between 5 mg / mL and 200 mg / mL, in particular between 10 mg / mL and 100 mg / mL , and in particular between 25 mg / mL and 75 mg / mL, in particular 50 mg / mL.
  • the antibiotic such as streptomycin, cloxacillin and Poxytetracycline, is used at a concentration of between 0.625 mg / mL and 2.5 mg / mL, in particular 1.25 mg / mL.
  • said bacteriophage strain is chosen from the strains such as deposited under the numbers CNCM I-5408, CNCM I-5409, CNCM I-5410, CNCM I-5491 or CNCM I-5492 and the antibiotic selected from streptomycin, cloxacillin and Poxytetracycline.
  • the composition comprises the strains deposited at the CNCM under the numbers CNCM I -5408, CNCM I -5409 and CNCM I -5410 and streptomycin.
  • the composition comprises the strains deposited at the CNCM under the numbers CNCM I -5408, CNCM I -5409 and CNCM I -5410 and cloxacillin.
  • the composition comprises the strains deposited with the CNCM under the numbers CNCM I-5408, CNCM I-5409 and CNCM I-5410 and oxytetracycline. In a particular embodiment, the composition comprises the strains deposited at the CNCM under the numbers CNCM I -5408, CNCM I -5491 and CNCM I -5492 and cloxacillin.
  • the composition comprises the strains deposited at the CNCM under the numbers CNCM I -5408, CNCM I -5491 and CNCM I-5492 and streptomycin.
  • the composition comprises the strains deposited with the CNCM under the numbers CNCM I-5408, CNCM I-5491 and CNCM I-5492 and oxytetracycline.
  • the invention relates to a composition
  • a composition comprising at least one strain of bacteriophage in combination with a bacteriocin, for example nisin, and lysozyme and / or an antibiotic.
  • a bacteriocin for example nisin, and lysozyme and / or an antibiotic.
  • the invention relates to a composition
  • a composition comprising at least one strain of bacteriophage, said bacteriophage being capable of inhibiting the development of Staphylococcus aurais, in combination with a bacteriocin, for example nisin, and lysozyme and / or an antibiotic.
  • a bacteriocin for example nisin, and lysozyme and / or an antibiotic.
  • kit of parts comprising a composition comprising at least one strain of bacteriophage as described above and at least one other element such as a bacteriocin, in particular nisin, and / or lysozyme, and / or an antibiotic,
  • kit of parts comprising a composition comprising at least one strain of bacteriophage and at least one other element such as a bacteriocin, in particular nisin, and / or lysozyme, and / or an antibiotic.
  • the present application relates to a kit of parts (kit of parts) comprising a composition comprising at least one bacteriophage as described above and at least one antibiotic.
  • said composition of said kit of parts comprises at least one bacteriophage strain chosen from the bacteriophage strains such as deposited at the CNCM under the numbers CNCM I-5408, CNCM I-5409, CNCM I-5410, CNCM I-5491 and CNCM I-5492.
  • said composition of said kit of parts comprises two or three strains of bacteriophage such as deposited at the CNCM under the numbers CNCM I-5408, CNCM I-5409, CNCM I-5410, CNCM I-5491 and CNCM I-5492.
  • said composition of said kit of parts comprises two or three strains of bacteriophage such as deposited at the CNCM under the numbers CNCM I-5408, CNCM I-5409 and CNCM I-5410
  • said composition of said kit of parts comprises two or three strains of bacteriophages such as deposited at the CNCM under the numbers CNCM I-5408, CNCM I-5491 and CNCM I-5492. In a particular embodiment, said composition of said kit of parts comprises two or three strains of bacteriophage such as deposited at the CNCM under the numbers CNCM I-5409, CNCM I-5491 and CNCM I-5492.
  • said composition of said kit of parts comprises the three strains of bacteriophage as deposited at the CNCM under the numbers CNCM I -5408, CNCM I -5491 and CNCM I -5492 and at least one antibiotic chosen from among the following. streptomycin, cloxacillin and oxytetracycline.
  • said composition of said parts kit comprises the three strains of bacteriophage as deposited at the CNCM under the numbers CNCM I-5408, CNCM I-5491 and CNCM I-5492 and a bacteriocin, preferably nisin.
  • said composition of said kit of parts comprises the three strains of bacteriophage as deposited at the CNCM under the numbers CNCM I-5408, CNCM I-5491 and CNCM I-5492 and lysozyme.
  • said composition of said kit of parts comprises your three strains of bacteriophage as deposited at the CNCM under the numbers CNCM I-5408, CNCM I-5491 and CNCM I-5492 and a bacteriocin such as nisin and lysozyme.
  • kit of parts comprising a composition comprising at least one strain of bacteriophage as described above and a bacteriocin, in particular nisin, and lysozyme, and at least one antibiotic.
  • the present application also relates to the use of compositions comprising at least one strain of bacteriophage and their combinations as described above.
  • it is a use as a disinfectant solution.
  • it is for use as an anti-Staphylococcus aureus solution.
  • These solutions can be used on all kinds of surfaces, for example on medical equipment, surgical instruments, medical devices intended for in vivo implantation (prostheses for example).
  • They can also be used on the skin in mammals, both in humans and in animals.
  • One particular use is a use on the udder of lactating mammals, more particularly lactating farm mammals.
  • the present application also relates to the use of compositions comprising at least one strain of bacteriophage and their combinations as described above, as a food additive.
  • composition is used as a zootechnical additive.
  • compositions comprising at least one strain of bacteriophage and their combinations as described above, as a biocide.
  • the present application also relates to the use of compositions comprising at least one strain of bacteriophage and their combinations as described above, as food preservatives.
  • compositions comprising at least one strain of bacteriophage and their combinations as described above, as a probiotic, Therapeutic uses of the compositions and their combinations
  • the present application also relates to compositions comprising at least one strain of bacteriophage and their combinations as described above or a kit of parts according to the present invention, for use as a medicament.
  • the present application also relates to the compositions as described above comprising at least one strain of bacteriophage and / or one bacteriocin and / or lysozyme for use as a medicament.
  • compositions comprising at least one strain of bacteriophage and their combinations as described above, for use in the removal of a biofilm or the prevention of the formation of a biofilm.
  • a biofilm formed or capable of forming on the surface of a medical device (for example prosthesis) after its implantation in vivo,
  • the present application also relates to compositions comprising at least one strain of bacteriophage and their combinations as described above or a kit of parts according to the present invention, for use in the treatment or prevention of an infection by S. aureus. .
  • An infection by S. aureus can cause, without limitation, the following pathologies: - suppurative skin infections, that is to say with production of pus (the most frequent forms) such as boils, panaris, folliculitis, sycosis, cellulitis, erysipelas, wound suppurations, neonatal pemphigus, impetigo, mastitis;
  • infections of different viscera infections of the respiratory system: pneumonia, endocarditis (in particular in patients with prostheses), urinary tract infections, phlebitis, certain types of enteritis, meningitis;
  • compositions comprising at least one strain of bacteriophage and their combinations as described above or a kit of parts according to the present invention, for use in the treatment or prevention of an infection by S. aureus in mammals.
  • compositions comprising at least one bacteriophage strain and their combinations as described above or a kit of parts according to the present invention, for use in the treatment or prevention of an infection by S. aureus in humans.
  • compositions comprising at least one bacteriophage strain and their combinations as described above or a kit of parts according to the present invention, for use in the treatment or prevention of an infection by S. aureus in animals.
  • the present invention relates to one of the previously described compositions or a parts kit according to the present invention for its use in the treatment or prevention of an infection by S. aureus, in which said infection by S. aureus is mastitis in lactating mammals.
  • said lactating mammal is a farm lactating mammal, more particularly chosen from among cattle, sheep, goats and camelids.
  • the lactating farm mammal is chosen from among the cow, sheep, goat, buffalo or camel.
  • said infection by S. aureus is bovine mastitis.
  • the present application also relates to a method of treating and / or preventing infection by a bacterium, comprising the administration of an effective dose, of a composition comprising at least one strain of bacteriophage.
  • the present application also relates to a method of treatment and / or prevention of infection by S. aureus, comprising the administration of an effective dose, of said composition comprising at least one strain of bacteriophage as described above, or d one of the combinations of this composition as previously described.
  • the present application also relates to a method of treatment and / or prevention of infection by a bacterium, comprising the administration of an effective dose, of a composition comprising at least one strain of bacteriophage, of said composition comprising at least a strain of bacteriophage and / or a bacteriocin and / or lysozyme.
  • the present application also relates to a method of treating and / or preventing infection by a bacterium, comprising the administration of an effective dose, of a part kit comprising a composition comprising at least one strain of bacteriophage. , of said composition comprising at least one strain of bacteriophage and / or one bacteriocin and / or lysozyme.
  • the present application also relates to a method of treatment and / or prevention of infection by S. aureus comprising the administration of an effective dose of said composition comprising at least one strain of bacteriophage and / or one bacteriocin and / or lysozyme.
  • the embodiments described above for the therapeutic uses are valid for such a method of treatment and / or prevention of infection by a bacterium, more particularly S. aureus.
  • the present application also relates to a method of treatment and / or prevention of infection comprising the administration of an effective dose of a kit of parts comprising at least one strain of bacteriophage and another element such as a bacteriocin, in particular nisin, and / or lysozyme, and / or an antibiotic, in which said strain and said other element are to be administered simultaneously, separately or sequentially, preferably simultaneously.
  • a kit of parts comprising at least one strain of bacteriophage and another element such as a bacteriocin, in particular nisin, and / or lysozyme, and / or an antibiotic, in which said strain and said other element are to be administered simultaneously, separately or sequentially, preferably simultaneously.
  • compositions comprising at least one strain of bacteriophage and their combinations as described above can be administered parenterally, orally or by topical route.
  • parenteral route is meant an intramuscular, intravenous, subcutaneous, intramammary or intradermal injection.
  • Oral administration by ingestion.
  • Oral administration can be, without limitation, in the form of a tablet, capsule, oral suspension, sachet, powder, syrup or capsule.
  • Topical route is meant an external application to a surface of the subject such as the skin or the mucous membranes.
  • Topical administration can be, without limitation, in the form of sprays, creams such as a cleaning or disinfection cream, milks, ointments, powders, soaked swabs, solutions, gels, sprays, lotions such as a cleaning or disinfecting lotion, emulsions or suspensions.
  • Topical administration can also be in the form of a solid preparation such as a soap or a cleaning bar.
  • composition comprising at least one strain of bacteriophage is used in combination with at least one other element such as a bacteriocin, in particular nisin, and / or lysozyme, and / or an antibiotic
  • kit of parts comprising at least one strain of bacteriophage and another element such as a bacteriocin, in particular nisin, and / or lysozyme, and / or an antibiotic
  • different routes of administration can be used for them. different elements.
  • composition comprising at least one strain of bacteriophage
  • at least one other element such as a bacteriocin, in particular nisin, and / or lysozyme, and / or an antibiotic
  • kit of parts comprising at least one strain of bacteriophage and another element such as a bacteriocin, in particular nisin, and / or lysozyme, and / or an antibiotic
  • the use can be carried out simultaneously, separately or sequentially.
  • composition comprising at least one strain of bacteriophage
  • kit of parts comprising at least one strain of bacteriophage and another element
  • the administration of said composition is separate over time, and said composition being used last.
  • the other element (s) of the parts kit can be used simultaneously, or separately in time.
  • composition comprising a strain of bacteriophage
  • a bacteriocin such as nisin
  • the administration of said composition is separated in time, the bacteriocin being used in first.
  • composition comprising at least one strain of bacteriophage
  • at least one antibiotic in the form of a kit of parts
  • the administration of said composition is separated in time, the antibiotic being used in first.
  • composition comprising a strain of bacteriophage
  • a bacteriocin such as nisin
  • an antibiotic in the form of a kit of parts
  • the administration of said composition is separated in time.
  • the composition comprising a bacteriophage being used last and the bacteriocin and the antibiotic being used simultaneously or separately.
  • Figure 1 is an electrophoresis gel showing the DNA digestion profile of phages 2 to 7 (noted P2 to P7) and P14 (noted P 14) by EcoRI,
  • Figure 2 is an electrophoresis gel showing the DNA digestion profile of phages 2, 3, 5, 6, 9 to 14 (denoted Phil 2, Phil 3, Phil 5, Phil 6, Phil 9 to Phil 14) by EcoRI.
  • Figure 3 is a photograph showing the appreciation of phage lysis: (-) no activity, increasing activity: +, ++, ++, ++++ and +++++.
  • Figure 4 is a photograph showing the difference in lysis plaque size between K-fold (phage 1) and phage 2 (CNCM I-5408) on S. aureus 81 bacterial strain.
  • Figure 5 is a photograph showing the difference the size of the lysis plaque between phage K (phage 1) and phage 2 (CNCM I-5408) on the bacterial strain S. aureus U1 la.
  • Figure 6 is a photograph showing the difference in lysis plaque size between phage K (phage 1) and phage 2 (CNCM I-5408) on the bacterial strain S. aureus E2V-A.
  • Figure 7 is a set of electron microcopy photographs showing phage K (phage 1) and phage 2 (CNCM I-5408).
  • Figure 10 is a graph showing the monitoring of the development of phages 1 to 7 in BHI medium as a function of time.
  • Figure 11 is a graph showing the monitoring of the proliferation of S. aureus (OD at 600 nm as a function of time) in BITI medium as a function of the presence of phages 1, 2, 3, 5, 7 or of the mixture of phages 2, 3 and 7.
  • Figure 12 is a histogram showing the monitoring of the development of phages 1 to 7 or the mixture of phages 2, 3 and 7 in raw milk as a function of time.
  • Figure 13 is a histogram showing the monitoring of the development of phages 2, 3, 6, 7, 9, 10, 11 or of the mixture of phages 2, 9 and 10 in raw milk as a function of time.
  • Figure 14 is a histogram showing the monitoring of the proliferation of S. aureus in raw milk as a function of the presence of phages 1 to 7 or of the mixture of phages 2, 3 and 7, TM being the control without phage.
  • the bacteria are counted on Baird Parker medium (T0) (addition of phages), and after 8h (T8h) and 24h (T24h) of incubation at 37 ° C.
  • Figure 15 is a histogram showing the monitoring of the proliferation of S. aureus in raw milk as a function of the presence of phages 2, 3, 6, 7, 9, 10, 11 or of the mixture of phages 2, 9 and 10 or in the absence of phage (Milk without phages).
  • the bacteria are counted on Baird Parker medium after addition of the phages (T0), and after, 8h (T8h) and 24h (T24h) of incubation at 37 ° C.
  • Figure 17 is a histogram showing the monitoring of the proliferation of S. aureus in raw milk in the absence of nisin (compound A) (TM (contaminated milk without phage and without compound A), of a mixture of phages 2, 3 and 7, in the presence of nisin (compound A) alone and of a mixture of phages 2, 3 and 7 and of nisin (compound A).
  • TM contaminated milk without phage and without compound A
  • the bacteria are enumerated on Baird Parker medium after addition of the phages (T0), and after, 8h (T8h) and 24h (T24h) of incubation at 37 ° C.
  • Figure 19 is a histogram showing the monitoring of the proliferation of S. aureus in raw milk in the presence of bacteria, in the presence of nisin at 0.2 mg / mL (compound A) and / or lysozyme at 0.5 mg / mL (compound B) and bacteria.
  • the bacteria are counted on Baird Parker medium after addition of the phages (T0), and after, 8h (T8h) and 24h (T24h) of incubation at 37 ° C.
  • Figure 20 is a histogram showing the monitoring of the proliferation of S. aureus in raw milk in the presence of bacteria, in the presence of the mixture of phages 2, 3 and 7, as well as of nisin at 0.2 mg / mL (compound A) and / or 0.5 mg / mL lysozyme (compound B) and bacteria.
  • the bacteria are counted on Baird Parker medium after addition of the phages (T0), and after, 8h (T8h) and 24h (T24h) of incubation at 37 ° C.
  • Figure 21 is a photograph of Petri dishes showing the size of the lysis plaque obtained with phage 2 (CNCM I-5408) in combination with AB9 (Cloxacillin at 1.25 mg / mL), (left) or AB 10 (Oxytetracycline at 1.25 mg / mL) (right), and in the center a box comprising phage 2 without antibiotic.
  • Figure 22 is a photograph of Petri dishes showing the size of the lysis plaque obtained with phage 6 in combination with AB9 (Cloxacillin at 1.25 mg / mL) (in the middle) compared to the lysis plaque obtained with phage 6 alone (left) or AB9 alone (right).
  • Figure 23 is a histogram showing the monitoring of the development of the cocktail of phages 2, 9 and 10 (cocktail 2) in raw milk as a function of time in the absence or in the presence of different antibiotics: AB6 (Streptamycin at 50 mg / mL ), AB9 (Cloxacillin 50 mg / mL) or AB 10 (Oxytetracycline 50 mg / mL).
  • AB6 Streptamycin at 50 mg / mL
  • AB9 Cloxacillin 50 mg / mL
  • AB 10 Olytetracycline 50 mg / mL
  • Figure 24 is a histogram showing the reduction in the number of S. aureus bacteria by a phage 3 / streptomycin combination. (AB6-Streptomycin). The bacteria are counted on Baird Parker medium after addition of the phages (T0), and after 24 h (T24h) and 48h (T48h) of incubation at 37 ° C.
  • Figure 25 is a histogram showing the monitoring of the proliferation of S. aureus in raw milk in the absence of phage and antibiotics (TM bacteria (without phages)), in the presence of the cocktail of phages 2, 3 and 7 (cocktail 1 phage) in combination with different antibiotics: AB6 (Streptamycin 50 mg / mL), AB9 (Cloxacillin 50 mg / mL) or AB 10 (Oxytetracycline 50 mg / mL).
  • the bacteria are counted on Baird Parker medium after addition of the phages (T0), and after, 8h (T8h) and 24h (T24h) of incubation at 37 ° C.
  • Figure 26 is a histogram showing the monitoring of the proliferation of S. aureus in raw milk in the absence of phage and antibiotics, in the presence of different antibiotics: AB6 (Streptamycin 50 mg / mL), AB9 (Cloxacillin 50 mg / mL) or AB10 (Oxytetracycline 50 mg / mL), in the presence of the phage cocktail 2, 9 and 10 (phage cocktail 2) in combination with different antibiotics: AB6 (Streptamycin 50 mg / mL), AB9 (Cloxacillin at 50 mg / mL) or AB 10 (Oxytetracycline 50 mg / mL).
  • the bacteria are counted on Baird Parker medium after addition of the phages (T0), and after, 8h (T8h) and 24h (T24h) of incubation at 37 ° C.
  • Figure 27 is a histogram showing the monitoring of the proliferation of S. aureus in raw milk in the absence of phage (TM bacteria), in the presence of the cocktail of phages 2, 9 and 10; 3, 9 and 10; 9 and 10; 3 and 10 and phage 10 alone.
  • the bacteria are counted on Baird Parker medium after addition of the phages (T0), and after, 8h (T8h) and 24h (T24h) of incubation at 37 ° C.
  • the phages specific to s. aureus were isolated from 286 samples from breeding environments across France. These samples included 1,17 raw milk samples, 45 cow skin samples, 59 water samples and 65 faeces samples. Only lytic and natural phages were sought. The presence of phages was detected by the spot method in Petri dishes. This involves placing a drop of a sample on the culture agar previously flooded with a culture of the host bacterium in the exponential phase. The presence of phages results in the appearance of a zone of lysis around the deposited spot.
  • the culture of host bacteria is mixed with the sample in a volume of supercooled soft agar then added with CaCl2 or / and MgCl2 (10mM). This mixture is poured onto the surface of a Petri dish containing a layer of agar. The presence of a phage is materialized by the appearance of a lysis plaque. Subculture of the lysis plaques is then carried out to obtain a single isolated phage. The multiplication step was carried out in order to increase the concentration of phages with a view to their characterization. Results
  • the isolated phages were cultured for multiplication for characterization. After each multiplication cycle, the presence of phage was checked by the spot method. The concentration of phages isolated after multiplication was checked by the double layer technique.
  • DNA from various isolated phages was digested with the restriction enzyme EcoRI ( Figure 1 and Figure 2).
  • phage morphology is observed by electron microcopy and genome sequencing is performed.
  • the phages were cultured with a host bacterium of Staphylococcus aureus (S. aureus). This phage culture was centrifuged at 10,000g for 10 min. The supernatant was collected and filtered through a 0.22 mm membrane. The supernatant then was treated with DNase, RNase (1 mg / mL) before extracting phage DNA by laboratory protocol using phenol / chloroform and isopropanol.
  • S. aureus Staphylococcus aureus
  • the phage DNA was then sequenced by NGS technology in 2 x 300 bp PE on the MiSeq System.
  • Example 2 Activity and stability of phages
  • phages 2 to 7 the activity of the isolated phages is compared to that of the reference phage which is phage K (phage 1).
  • Table 1 The spectrum of activity was tested on all 30 strains of S. aureus (Table 1) or on 25 bacterial strains including 19 strains of S. aureus and 6 non-S. aureus strains (Table 2) by the spot method.
  • Table 2 The lysis intensity of these phages on each of the bacterial strains is detailed in Table 1 and Table 2.
  • Table 1 therefore represents the activity spectrum of the phages isolated on the strains of bovine S. aureus and Table 2 represents the spectrum of activity of phages isolated on different bacterial strains.
  • the phage K (ATCC 19685-B1) (phage 1) infects 28 strains out of the 30 strains tested, ie 93% (Table 1).
  • the cocktail of three phages (2, 3 and 7) infects 30 strains out of the 30 strains tested, i.e.
  • phage 2 The activity spectrum of phage 2 (CNCM I -5408) is the broadest and comparable to phage K (reference phage). However, phage K cannot infect all strains tested. On the other hand, certain mixtures of bacteriophages according to the invention make it possible to infect more strains of S. aureus than phage K, or even 100% of the strains of S. aureus tested.
  • the phages according to the invention have a broad spectrum of activity on the infection of S. aureus strains and were also selected for their speed of elimination of S. aureus (after 3 h of incubation at 37 ° C in BHI).
  • Phage K (noted phage 1 in the figures) is used as reference phage. Phage 2 and phage K have their similar spectrum of activity except for their infection with strain Q14b. Phage 2 infects this strain of bacteria and not phage K.
  • Phage 2 and phage K also differ with respect to their morphology observed by electron microscopy as shown in Figure 7.
  • the bacteria grow at 37 ° C in BH1 broth (Brain Heart Infusion) composed of brain heart extract (17.5 g / L), pancreatic gelatin peptone (10 g / L), sodium chloride (5 g / L). L), disodium phosphate (2.5 g / L), glucose (2 g / L).
  • the bacteria are stored at -80 ° C in BHI containing 15% (volume / volume) of glycerol.
  • the concentration of phages is evaluated by the double layer method. This method makes it possible to observe the areas of lyses revealing the presence of phages. For this, 100 mL of the host bacterial strain at the start of the stationary phase, 100 mL of the test sample containing for example the phage (s) to be tested, as well as 20 mM of MgSO4 are added in 3 mL of semi-solid BHI ( 0.4% agar) stored at 46 ° C. This mixture is then spread uniformly on a plate of solid BHI 1% agar agar. After an incubation of 18 h at 37 ° C., the number of phage is estimated by the number of PFU plaques (Plate formation unit) / mL on the dish. The samples are diluted in MS buffer composed of NaCl (100 mM), MgSO4 (7H 2 0) (8 mM), Tris HCl pH 7.5 (50 mM), gelatin 0.002%.
  • the anti-bacterial activity of a phage or of a mixture (cocktail) of phages can be evaluated by monitoring the optical density (OD) over time at 600 nm.
  • a culture of host bacteria (S. aureus) at the exponential phase is incubated with the phages.
  • the concentration of bacteria is 10 6 CFU / ml and the phages were added at 10 7 PFU / ml.
  • the ratio of phage s / bacteria is: 1/10.
  • Monitoring of the OD at 600 nm is carried out with the aid of a spectrometer for 24 h at 37 ° C. (temperature for S. aureus bacteria). If the OD of the culture of bacteria incubated with the phages is reduced compared to a control culture comprising only the bacteria, this means that the phage or mixture of phages can inhibit the bacterial growth of S. aureus.
  • the antibacterial activity of a phage or of a mixture (cocktail) of phages can also be evaluated by the enumeration of bacteria on a specific medium, the Baird Parker agar (medium at pH 6.8 ⁇ 0.2 composed of tryptone (10 g / L), beef extract (5 g / L), yeast extract (lg / L), sodium pyruvate (10 g / L), glycine (12 g / L), lithium chloride (5 g / L), agar (20 g / L)).
  • the Baird Parker agar medium at pH 6.8 ⁇ 0.2 composed of tryptone (10 g / L), beef extract (5 g / L), yeast extract (lg / L), sodium pyruvate (10 g / L), glycine (12 g / L), lithium chloride (5 g / L), agar (20 g / L)
  • 1 mL of experimental medium is taken.
  • a 1/10 dilution series is performed
  • the 6 phage phage 2 (n ° CNCM I-5408), phage 3 (n ° CNCM I-5409), phage 7 (n ° CNCM I -5410), phage 4, phage 5 and phage 6, were selected for testing. their stability at different pH. The results are compared with phage K (phage 1).
  • the phages at an initial concentration of 10 7 PFU / ml were incubated for 1 hour at 37 ° C, at different pH: 3; 3.5, 4, 4.5, 5, 7, 8 and 9.
  • phages 2 (CNCM I -5408) and 3 (CNCM I -5409) retain good stability unlike the reference phage K. Since the pH of the stomach is between 2 and 5, in the context of oral administration, it is important that the phages are stable at acidic pH.
  • the 6 phage phage 2 (n ° CNCM I-5408), phage 3 (n ° CNCM I-5409), phage 7 (n ° CNCM I -5410), phage 4, phage 5 and phage 6, were selected for testing. their stability at different temperatures. The results are compared with phage K (phage I).
  • the phages at an initial concentration of 10 7 PFU / ml, were incubated for 1 hour at different temperatures: 30 ° C; 37 ° C, 45 ° C, 55 ° C > 60 ° C, 65 ° C, 75 ° C and 85 ° C.
  • the concentration of phages was then evaluated by the double layer technique to evaluate the effect of temperature on the activity of phages (FIG. 9).
  • Figure 9 also shows that the optimum phage temperatures are 30-45 ° C.
  • Phages 1, 2 (CNCM I -5408) and 3 (CNCM I-5409) are resistant up to a temperature of 60 ° C, unlike phages 4 and 5.
  • Phage 2 (CNCM I -5408) and phage 3 (CNCM I -5409) are the most stable at high temperatures.
  • the body temperature of mammals being very variable, for example 37 ° C for humans, 39 ° C for sheep and cattle, it is important that the folds are stable over a wide temperature range.
  • the phage proliferation (initial concentration of 10 7 PFU / ml) was studied over time at 37 ° C.
  • the concentration of phages was evaluated by the double layer technique at T ⁇ Oh, 2h, 4h, 8h and 24h. The goal is to find the phage (s) with the highest concentration over time.
  • Figure 10 shows that after 24 h of incubation, the concentration of phage 3 (CNCM I-5409) and phage 5 is higher than that of other phages (10 10 PFU / mL) compared with phage 1 and phage 2 (CNCM I-5408) (approximately 10 9 PFU / mL).
  • the reduction of bacteria (initial concentration 10 6 UFC / ml) by phages in BHI medium (initial concentration of 10 7 UFP / ml) was studied by monitoring the optical density of the bacterial culture at 600 nm ( Figure 1 1) .
  • the concentration of bacteria is proportional to the optical density over a range of concentrations.
  • the reduction in optical density reflects the ability to inhibit bacterial growth.
  • FIG. 11 shows a significant difference in BHI medium between the control (culture without phages) and the culture in the presence of phages.
  • the bacteria in the control culture develop rapidly from the first hours and reach a stationary phase after 8 hours of incubation (OD around 2.2).
  • the development of bacteria is inhibited by all phages.
  • Phage 1, phage 2 (CNCM I-5408) and the mix of phages 2, 3 and 7 completely inhibit bacterial growth during the first hours.
  • the activity of phage 3 is similar to that of phage 6 (result not shown) and the activity of phage 4 is similar to that of phage 7 (result not shown).
  • the use of the mixture of phages 2 (CNCM I-5408), 3 (CNCM I-5409) and 7 (CNCM I-5410) is the most effective.
  • the raw milk was first artificially contaminated with S. aureus bacteria at a concentration of approximately 10 6 CFU / mL.
  • Phages 3 (CNCM I-5409), 6, 9 (CNCM I-5491) and 10 (CNCM I -5492) are the most stable in raw milk. Indeed, only these 4 phages can replicate in raw milk. After 24 hours of incubation, the highest concentration is observed for phages 3, 9 and 10.
  • aureus in raw milk is greater with the addition of a mixture comprising phages 2 (CNCM I-5408), 3 (CNCM I-5409) and 7 ( CNCM I-5410) than with the individual addition of these same phages, or even with the addition of phage K (phage 1) alone ( Figure 14),
  • phage cocktail 2 (CNCM I-5408), 9 (CNCM I-5491) and 10 (CNCM I-5492) makes it possible to significantly reduce the concentration of S. aureus in raw milk (approximately 3 to 4 log) ( Figure 15 and Figure 27).
  • the addition of the phage cocktail 3 (CNCM I-5409),
  • Example 3 Combination of phages with nisin 1. Anti-S activity. nisin aureus
  • nisin (alone) was added to a culture of BH1 bacteria at different concentrations: 0.025 mg / mL, 0.05 mg / mL, 0.1 mg / mL, 0.2 mg / mL and 0.3 mg / mL.
  • Figure 16 shows that bacterial growth is completely inhibited at a concentration of 0.3 mg / mL.
  • the lower concentration of nisin (0.025 mg / mL) has no effect on the growth of bacteria.
  • Nisin concentrations of 0.1 mg / mL and 0.2 mg / mL may partially inhibit bacterial growth.
  • the nisin concentration of 0.2 mg / mL was chosen for use in combination with phages. 2. Activity of the phage and nisin combination
  • the raw milk was first artificially contaminated with S. aureus bacteria at a concentration of 10 6 CFU / mL.
  • Figure 17 shows that when nisin is added alone in milk, the inhibitory effect on the bacteria in raw milk is observed at the concentration of 0.2 mg / mL. A reduction of approximately 0.5 log is observed after 6 h and a reduction of 2.3 log after 24 h.
  • the phage cocktail 2 CNCM I-5408), 3 (CNCM I-5409) and 7 (CNCM I-5410) is added alone in the milk, it allows to have a reduction in the bacterial concentration of about 4 log after 24 h of incubation.
  • CM1 minimum inhibitory concentration
  • lysozyme alone was added to a BHI bacteria culture at different concentrations: 0.625 mg / mL, 1.25 mg / mL, 1.85 mg / mL and 2.5 mg / mL.
  • FIG. 18 shows that bacterial growth is inhibited in the presence of a lysozyme concentration of 0.625 mg / mL.
  • Example 5 Combination of phages with nisin and lysozyme
  • the raw milk was first artificially contaminated with S. aureus bacteria at a concentration of approximately 10 6 CFU / mL. Then, nisin (compound A) was added in raw milk at a concentration of 0.2 mg / mL, and / or lysozyme (compound B) at a concentration of 0.5 mg / mL.
  • Figure 19 shows the effect of nisin and / or lysozyme on the concentration of S. aureus bacteria in raw milk.
  • Figure 20 shows the effect of nisin and / or lysozyme in the presence of the cocktail of phages 2, 3 and 7 on the concentration of S. aureus bacteria in raw milk.
  • the presence of lysozyme (Compound B) at 0.5 mg / mL showed a weak effect on the development of the strain of S. aureus tested.
  • Combining lysozyme with the cocktail of phages 2, 3 and 7 somewhat improved the inhibition of bacterial growth in raw milk.
  • nisin compound A helps to inhibit bacterial growth. This inhibition is increased in the presence of the cocktail of phages 2, 3 and 7.
  • nisin compound A makes it possible to obtain an inhibition of the development of S. aureus, which is increased in the presence of the cocktail of phages 2, 9 and 10. Lysozyme shows a weak effect on bacterial growth, which is slightly improved in the presence of the cocktail of phages 2, 9 and 10.
  • Example 6 Combination of phages with antibiotics 1. Study of the effect of the phage / antibiotic combination in BHI medium
  • the phage titer was analyzed in the presence of different antibiotics (AB) at different concentrations (mg / mL): Tetracycline (AB1), Gentamycin (AB2), Chloramphenicol (AB3), Kanamycin (AB4), Ampicillin (AB5), Streptomycin (AB6), Cloxaci! Line (AB9), Oxytetracycline (AB10), Erythromycin (AB11).
  • AB antibiotics
  • the double layer technique is carried out for each culture: phages without AB, phages + AB.
  • the 100 ml containing the phage also contain the antibiotic at a given concentration in BHI.
  • the size of the lysis plaque and the number of lysis plaques obtained are compared between the condition without AB (control) and the condition with AB.
  • the number of lysis plaques reflects the number of phages.
  • a size of lysis plaques larger than the control (TM) and / or a higher number of plaques reflect a better effect of the antibiotic / phage 3 combination.
  • a difference in plaque size is observed for three antibiotics: AB9 (Cloxacillin), AB6 (Streptomycin) and AB 10 (Oxytetracycline).
  • the size of the plaques for phage 3 is larger when AB 9, AB 10 or AB6 are added.
  • the antibiotics Cloxacillin (AB9), Oxytetracycline (AB 10) and Streptomycin (AB6) were tested on phages 1 to 7 (Table 4). In the same way as above, the size of the lysis plaques was observed, as was the number of lysis plaques obtained.
  • Figure 21 shows the size of the lysis plaque obtained with phage 2 (CNCM I-5408) in combination with AB9 (Cloxacillin) (left) or AB 10 (Oxytetracycline) (right).
  • Figure 22 shows the size of the lysis plaque obtained with phage 6 in combination with AB9 (Cloxacillin) (in the middle) compared to the lysis plaque obtained with phage 6 alone (left) or AB9 alone (right) ).
  • the maximum effect is obtained with phage 2 and phage 3 respectively combined with AB9 (Cloxacillin), with phage 2 and phage 7 respectively combined with AB 10 ( Oxytetracycline), and with phage 2 and phage 4 respectively combined with AB6 (Streptomycin).
  • Figure 23 shows that the titer of the mixture of phages 2 (CNCM I-5408), 9 (CNCM I-5491) and 10 (CNCM I-5492) is affected by the addition of antibiotics, whether AB9, AB6 or AB 10.
  • the number of bacteria is evaluated by the spreading method on a Baird Parker agar plate.
  • Figure 24 shows the effect of a phage 3 combination with streptomycin (AB6) on the population of S. aureus in raw milk.
  • the bacteria develop for 48 hours and the bacteria concentration is approximately 7 log and 8 log, respectively after 24 hours and 48 hours,
  • phages makes it possible to reduce the number of bacteria by 2 log after 48 hours of incubation.
  • streptomycin (AB6) reduces the number of bacteria after 24 hours of incubation, but the bacterial population is not deactivated by the antibiotic. This population develops and the number of bacteria is important after 48 hours (approximately 6 log). This phenomenon corresponds to the mutation of the bacteria relative to the antibiotic.
  • phages When phages are combined with the antibiotic, no bacteria are detected after 24 hours and 48 hours. This shows a synergy of the phage / antibiotic combination on the reduction of bacteria in raw milk. In addition, the presence of phages helps reduce the phenomenon of bacteria resistance to the antibiotic.
  • Figures 25 and 26 show the effect of combining a phage cocktail with different antibiotics on the S. aureus population in raw milk.
  • Figure 25 shows the effect of mixing phages 2 (CNCM I-5408), 3 (CNCM I-5409) and 7 (CNCM I-5410) in the presence of the different antibiotics: AB9 (Cloxacillin), AB6 (Streptomycin) and AB 10 (Oxytetracycline).
  • Figure 26 shows the effect of mixing phages 2 (CNCM I-5408), 9 (CNCM I-5491) and 10 (CNCM I-5492) in the presence of different antibiotics: AB9 (Cloxacillin), AB6 (Streptomycin) and AB10 (Oxytetracycline).
  • AB9 Cloxacillin
  • AB6 Streptomycin
  • AB10 Oxytetracycline
  • Adding the phage cocktail alone reduces the bacterial concentration by about 2-3 log after 24 h of incubation.
  • Example 7 Test for evaluating the anti-S. aureus activity of a bacteriophage strain
  • a culture of host bacteria (S. aureus) in the exponential phase is incubated with the bacteriophage.
  • the ratio of phages / bacteria is perhaps tested: 1/100; 1/10 or 1 or 10.
  • the optical density (OD or OD) at 600 nm is monitored for 24 h at 37 ° C, with one measurement every 15 minutes.
  • the growth of the bacterium S. aureus is proportional to the OD of the bacterial culture.

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Abstract

La présente invention concerne une composition comprenant une souche de bactériophage ou un mélange de souches de bactériophages choisies parmi les souches telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5409, CNCM I-5410, CNCM I-5491 et CNCM I-5492. L'invention porte également sur l'utilisation thérapeutique de ces souches chez l'Homme et ranimai pour traiter des infections par S. aureus, en particulier pour traiter la mammite chez l'animal.

Description

NOUVELLES SOUCHES DE BACTÉRIOPHAGES ET LEURS UTILISATIONS
DOMAINE DE L’INVENTION
La présente invention concerne de nouvelles souches de bactériophages (phages) efficaces contre Staphylococcus aureus et des compositions de celles-ci, ainsi que la combinaison d’au moins une souche de bactériophage efficace contre Staphylococcus aureus avec une bactériocine et/ou avec du lysozyme et/ou avec un antibiotique. L’invention concerne également l’utilisation de ces bactériophages en tant que conservateurs alimentaires, additifs alimentaires, probiotiques, solution désinfectante, biocide ou encore leur utilisation thérapeutique pour traiter des infections ou les contaminations par Staphylococcus aureus, en particulier pour le traitement de la mammite.
ÉTAT DE LA TECHNIQUE Au cours des dernières années, avec l'émergence de souches bactériennes multi-résistantes aux antibiotiques, les recherches se tournent vers les phages. L'utilisation de phages pour inactiver les bactéries pathogènes est considérée comme un moyen intéressant de remplacement des antibiotiques en médecine humaine, vétérinaire et pour la conservation des produits alimentaires ainsi que pour l’éradication des biofilms. En effet, les phages sont considérés comme des « anti-microbiens intelligents » pour leur spécificité, ils infectent les bactéries cibles sans aucun effet sur la flore commensale et sont éliminés naturellement lorsque les bactéries hôtes sont totalement éliminées.
Il est important de noter que deux différents types de phages existent : les phages lytiques (virulents) et tempérés (lysogéniques). Pour les lytiques, la première étape de l'infection du phage est l'adsorption des phages à la paroi de la cellule bactérienne grâce à des interactions spécifiques entre des protéines virales et des récepteurs de la cellule hôte. Après avoir pénétré dans la cellule bactérienne, les phages virulents se répliquent rapidement pour synthétiser leurs protéines de capside et leur génome à l'intérieur de la cellule hôte. Enfin, les nouveaux phages s’échappent de la bactérie hôte par la rupture de la paroi cellulaire qui conduit à la mort de la cellule bactérienne. Alors que les phages tempérés intègrent leur matériel génétique dans le chromosome de la cellule hôte, qui est répliqué avec le génome de la cellule hôte (sous forme de prophage). Seuls les phages tempérés peuvent s’intégrer dans le génome bactérien et participer aux transferts horizontaux de gènes entre les populations bactériennes. Pour des applications en thérapie, uniquement les phages lytiques sont sélectionnés pour leur capacité à lyser rapidement des bactéries ciblées.
En médecine vétérinaire, l'utilisation de l’antibiotique est actuellement réduite en production animale. Les phages sont apparus comme une méthode alternative pour lutter contre les maladies bactériennes chez les animaux et pour contrôler la transmission des agents pathogènes responsables de maladies d'origine alimentaire à l'homme. Par exemple, la réduction de de Campylobacter et de toute autre bactérie pathogène par des phages a été étudiée dans plusieurs travaux y compris pour la destruction des biofilms ou en aquaculture. L’administration des phages est possible par voie orale, intraveineuse, ou par voie topique. Plusieurs études ont montré la diffusion des phages dans le sang, dans les reins ou dans le foie.
Certains produits de phages ont été approuvés et commercialisés. Par exemple, en 2006, la FDA (Food and Drug Administration) a approuvé que l'utilisation et la préparation des bactériophages soient reconnues inoffensives et que les phages soient utilisés comme additifs alimentaires pour le contrôle de bactéries pathogènes. Le produit ListexTM est appliqué pour contrôler Listeria monocytogenes du saumon fumé, dans la viande et les produits à base de volaille. Le ListexTM a également été approuvé pour l’application en industrie alimentaire par la Food Standards Australia & New Zealand (FSANZ) en 2012. En Europe, le phage P 100 est un produit similaire au ListexTM. Cependant, certaines études ont rencontré des échecs dans l’utilisation de phages ; en effet, plusieurs facteurs peuvent intervenir sur l’efficacité du traitement. Pour les applications antibactériennes, les phages doivent être lytiques et avoir un large spectre d’activité (capacité d’infecter plusieurs souches bactériennes cibles). Ils doivent être stables dans les conditions du traitement et surtout avoir accès aux bactéries ciblées. Le dernier facteur dépend de la composition et la structure de la matrice. Staphylococcus anreits est l’espèce bactérienne la plus rencontrée en pathologie humaine et vétérinaire.
Plusieurs études ont été menées sur les phages anti- Staphylococcus aureus pour développer des applications dans le traitement d’infection bactérienne chez l’homme et chez les animaux, mais aussi pour la conservation des produits alimentaires. Parmi les phages isolés et caractérisés jusqu’à présent, le phage K est le plus intéressant pour sa capacité d’ infecter plusieurs souches de S. aureus (large de spectre d’activité). Cependant, certaines études ont montré que l’infection du phage K est inhibée dans le lait cru.
En élevage d’animaux de ferme allaitants, cette bactérie est la responsable majeure de la mammite. Le traitement courant est l’utilisation des antibiotiques ou le tarissement. Cependant, l’émergence de souches multi-résistantes a rendu l’antibiotique inefficace. Les traitements actuels ne permettent pas d’avoir un taux de guérison élevé (20 à 50% et l’infection des phages est inactive dans le lait cru, ce qui pourrait réduire l’efficacité du traitement par les phages en milieu de lactation. Dans ce contexte, il est donc nécessaire de trouver un nouveau traitement pour soigner les infections liées à S. aitreas.
Les inventeurs ont découvert de manière surprenante que les bactériophages déposés à la Collection Nationale de cultures de micro-organismes (CNCM) sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5409, CNCM I-5410, CNCM I-5491 et CNCM I-5492 permettaient d’infecter un large spectre de souches de S. aureus et étaient également capables d’inhiber efficacement le développement de cette bactérie, y compris dans un milieu composé de lait cru.
Par ailleurs, les inventeurs ont également découvert que la combinaison d’au moins une souche de bactériophage anti-S. aureus avec une bactériocine, telle que la nîsine, et/ou avec du lysozyme et/ou avec un antibiotique, avait un effet synergique sur l’inhibition du développement de S. aureus , y compris dans un milieu composé de lait cru. RÉSUMÉ
La présente invention concerne une composition comprenant une souche de bactériophage choisie parmi les souches telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5409, CNCM I-5410, CNCM I-5491 et CNCM-5492. Selon un mode de réalisation, ladite composition comprend en outre au moins une souche de bactériophage choisie parmi les souches telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5409, CNCM I-5410, CNCM I-5491 et CNCM I-5492.
Selon un mode de réalisation, ladite composition comprend trois souches de bactériophage choisies parmi les souches telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5409, CNCM I-5410, CNCM I-5491 et CNCM I-5492.
Selon un mode de réalisation, ladite composition comprend les trois souches de bactériophage déposées à la CNCM sous les numéros :
- CNCM I-5408, CNCM I-5409 et CNCM I-5410,
- CNCM I-5491, CNCM I-5492 et CNCM I-5408, ou
- CNCM I-5491, CNCM I-5492 et CNCM I-5409.
Selon un mode de réalisation, ladite composition comprend en outre une bactériocine, en particulier la nisïne, et/ou du lysozyme, et/ou au moins un antibiotique.
La présente invention concerne également une composition comprenant au moins une souche de bactériophage ladite composition comprend en outre une bactériocine, en particulier la nisine, et/ou du lysozyme, et/ou au moins un antibiotique.
Selon un mode de réalisation, ladite composition comprend en outre au moins un antibiotique notamment choisi parmi la streptomycine, la cloxacilîine et l’oxytétracycline,
La présente invention concerne également un nécessaire de pièces comprenant ladite composition précédemment décrite et au moins un autre élément tel qu’une bactériocine, en particulier la nisine, et/ou du lysozyme, et/ou un antibiotique. La présente invention concerne également un nécessaire de pièces comprenant une composition comprenant au moins un bactériophage et au moins un autre élément tel qu’une bactériocïne, en particulier la nisine, et/ou du lysozyme, et/ou un antibiotique.
La présente invention porte également sur une composition telle que décrite précédemment ou un nécessaire de pièces tel que décrit précédemment, pour son utilisation comme médicament.
La présente invention concerne une composition telle que décrite précédemment ou nécessaire de pièces tel que décrit précédemment, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention d’une infection par Staphylococcus aureus chez un mammifère comme l’Homme ou l’animal.
Selon un mode de réalisation, ladite infection par Staphylococcus aureus est la mammite chez le mammifère allaitant, en particulier la vache, la brebis, la chèvre, la bufflonne ou la chamelle.
La présente invention porte sur l' utilisation d’une composition telle que décrite précédemment comme solution désinfectante, biocide, additif alimentaire, conservateur alimentaire ou probiotique.
La présente invention concerne également un nécessaire de pièces comprenant au moins une souche de bactériophage et un autre élément tel qu’une bactériocine, en particulier la nisine, et/ou du lysozyme, et/ou un antibiotique pour son utilisation selon l’une des revendications comme médicament, en particulier pour son utilisation dans le traitement ou la prévention d’une infection par Staphylococcus aureus chez un mammifère comme l’Homme ou l’animal, dans lequel ladite souche et ledit autre élément sont à administrer de façon simultanée, séparée ou séquentielle, de préférence simultanée.
La présente invention concerne une souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro CNCM I-5409.
La présente invention concerne une souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro CNCM I-5410. La présente invention concerne une souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro CNCM I-5491.
La présente invention concerne une souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro CNCM I-5492
DÉFINITIONS
Dans la présente invention, les termes ci-dessous sont définis de la manière suivante :
“Additif alimentaire” concerne un produit ajouté aux denrées alimentaires commerciales (notamment aliments industriels) destinées à l'alimentation humaine et/ou animale.
- "Antibiotique” concerne une substance, d’origine naturelle ou synthétique, utilisée contre les infections causées par les bactéries.
“Bactériocine” concerne une famille de peptides ou protéines synthétisés naturellement par certaines bactéries. Une bactériocine consiste généralement en un composé protéique de 20 à 60 acides aminés. Les bactériocines ne sont pas des antibiotiques maïs elles possèdent des propriétés antibiotiques.
- “Bactériophage” et“phage” sont utilisés indifféremment et désignent la même entité
“Biocide” est un produit destiné à détruire, repousser ou rendre inoffensifs les organismes nuisibles, à en prévenir faction ou à les combattre, par une action chimique ou biologique.
“Désinfectant” est substance capable de détruire ou d'empêcher le développement des microbes, notamment des bactéries au niveau des milieux inertes (non vivants : sols, instruments, etc)
- “Conservateur alimentaire” concerne un produit ajouté pour prévenir le développement de micro-organismes dans les denrées alimentaires et ainsi prévenir d’éventuelles intoxications alimentaires. “Lysozyme” concerne une enzyme présente dans divers liquides biologiques, comme le blanc d'œuf, le mucus nasal, les larmes, le lait ou le mucus cervical. Les lysozymes sont divisés en différents types : lysozymes de type-c (pour "chicken"), lysozymes de type-g (pour "goose"), lysozymes de type-i (pour "invertebrate"), lysozymes de type-ch (pour Chalaropsis), les lysozymes de plantes, les lysozymes bactériens et les lysozymes phagiques.
- “Mammifère” concerne une classe d'animaux vertébrés, vivipares, qui sont caractérisés essentiellement par la présence de mamelles, d'un cœur à quatre cavités, d'un système nerveux et encéphalique développé, par une température interne constante et une respiration de type pulmonaire. Parmi les mammifères, on trouve l’homme et les animaux d’élevage comme les ovins, les bovins et les carins.
- “Mammite” concerne une infection mammaire par un microorganisme, en particulier une bactérie comme S. aureus.
“Probiotique” concerne les microorganismes vivants, qui, lorsqu’ils sont consommés en quantités adéquates, confèrent un effet bénéfique sur la santé et l’immunité de l’hôte sain.
“Traitement” ou“traiter” concerne le traitement thérapeutique et les mesures prophylactiques ou préventives dont l’objet est de prévenir ou de ralentir la pathologie (ici une infection). Les sujets nécessitant un traitement incluent les sujets déjà affectés par la pathologie ainsi que ceux qui risquent de développer la pathologie. Un sujet est traité efficacement pour la pathologie si, après avoir reçu une dose thérapeutiquement efficace d’une composition selon la présente invention, le sujet montre une amélioration d’un ou de plusieurs paramètres suivants : réduction du nombre de pathogènes, diminution d’un ou plusieurs symptômes associés à la pathologie, diminution de la morbidité et de la mortalité, amélioration de la qualité de vie. DESCRIPTION DÉTAILLÉE
Souches de bactériophages
La présente invention concerne la souche de bactériophage déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro CNCM I-5408. La présente invention concerne également la souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro CNCM I-5409.
La présente invention concerne également la souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro CNCM I-5410.
La présente invention concerne également la souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro CNCM I-5491.
La présente invention concerne également la souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro CNCM I-5492.
Compositions comprenant une souche de bactériophage
Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne une composition comprenant une souche de bactériophage choisie parmi les souches telles que déposées à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous les numéros CNCM I-5409, CNCM I-5410, CNCM I-5491 et CNCM I-5492.
Dans un mode de réalisation, ladite composition comprend en outre au moins une souche de bactériophage choisie parmi les souches telles que déposées sous les numéros CNCM I -5408, CNCM I-5409, CNCM I-5410, CNCM I -5491 et CNCM I-5492. La ou les souches additionnelles comprises en outre dans la composition sont différentes de la souche choisie en premier lieu.
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention porte sur une composition comprenant au moins deux souches de bactériophage choisies parmi les souches telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5409, CNCM I-5410, CNCM I-5491 ou CNCM I-5492. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend les souches CNCM I-5409 et CNCM-5410, les souches CNCM I-5409 et CNCM-5408, les souches CNCM I-5410 et CNCM-5408, les souches CNCM I-5408 et CNCM I-5491, les souches CNCM I-5408 et CNCM I-5492, les souches CNCM I-5409 et CNCM I-5491 , les souches CNCM I-5409 et CNCM I-5492, les souches CNCM I-5410 et CNCM I-5491 , les souches CNCM I-5410 et CNCM I-5492, les souches CNCM I-5491 et CNCM I-5492.
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention porte sur une composition comprenant trois souches de bactériophage choisies parmi les souches CNCM I -5410, CNCM I-5409, CNCM-5408, CNCM I-5491, CNCM I-5492. Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend les souches CNCM I-5408, CNCM I-5409 et CNCM I-5410.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend les souches CNCM I-5491, CNCM I-5492 et CNCM I-5408.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend les souches CNCM I-5491 , CNCM I-5492 et CNCM I-5409.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comporte un véhicule phannaceutiquement acceptable. Ce véhicule peut être une solution d’eau saline, en particulier à 15% de NaCl ou une solution de tampon phosphate (PBS) qui contient un sel, par exemple NaCl ou CaCl2 ou une solution de tampon de stockage de phage SM qui contient de NaCl, MgSO4, Tris-NaCl, gélatine.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comporte un agent stabilisant, par exemple le glycérol et/ou le sorbitol et/ou le sucrose ou/et un agent pour ajuster la viscosité.
Dans un mode de réalisation particulier, dans ladite composition, la concentration de chaque souche de bactériophage est comprise entre 106/mL et 1012/mL, en particulier de 108 /mL, plus particulièrement 107/mL. Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition précédemment décrite comprenant au moins une souche de bactériophage, comprend en outre une bactériocine, en particulier la nisine, et/ou du lysozyme et/ou au moins un antibiotique.
Autrement dit, selon un mode de réalisation particulier, la présente invention porte sur un produit combiné ou une préparation combinée comprenant ladite composition précédemment décrite comprenant au moins une souche de bactériophage, et une bactériocine, par exemple la nisine, et/ou du lysozyme et/ou un antibiotique.
Combinaison d’une souche de bactériophage avec une bactériocine
Dans un mode de réalisation particulier, la composition précédemment décrite comprenant au moins une souche de bactériophage, comprend en outre une bactériocine.
Autrement dit, selon un mode de réalisation particulier, la présente invention porte sur un produit combiné ou une préparation combinée comprenant ladite composition précédemment décrite comprenant au moins une souche de bactériophage, et une bactériocine. Un autre aspect de l’invention porte sur une composition comprenant au moins une souche de bactériophage pour son utilisation dans le traitement d’une infection par
S. aureus, caractérisée en ce que ladite composition comprend au moins une souche de bactériophage et une bactériocine.
Au sens de la présente demande, la bactériocine est par exemple choisie parmi la nisine, la colicine et la natamycine. Dans un mode de réalisation particulier, ladite bactériocine est la nisine. Dans un autre mode de réalisation, ladite bactériocine est une bactériocine recombinante, en particulier de la nisine recombinante.
Dans un cas plus particulier, la concentration en bactériocine, par exemple la nisine, est comprise entre 0.05 mg/mL et 2 mg/mL, plus particulièrement entre 0.05 mg/mL et 1 mg/mL, et notamment entre 0.05 mg/mL et 0.5 mg/mL, plus particulièrement de
0.1 mg/mL à 0.4 mg/mL, plus particulièrement de 0.1 mg/mL à 0.3 mg/ml, encore plus particulièrement de 0.2 mg/mL. Typiquement la souche de bactériophage est une souche capable d’inhiber le développement du Staphylococcus aureus. Typiquement, un test permettant de déterminer si un bactériophage inhibe le développement de S. aureus est celui décrit dans l’exemple 7 de la partie Exemples ci-après. Dans un mode de réalisation particulier, ladite souche de bactériophage est choisie parmi les souches déposées sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5409 et CNCM I-5410.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite souche de bactériophage est choisie parmi les souches déposées sous les numéros CNCM I-5491 ou CNCM I-5492.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend deux ou trois souches de bactériophage telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5409 et CNCM I-5410.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend deux ou trois souches de bactériophage teiless que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5491 et CNCM I-5492. Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend deux ou trois souches de bactériophage tels que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5409, CNCM I-5491 et CNCM I-5492.
Combinaison d'une souche de bactériophage avec du ivsozvme
Dans un mode de réalisation particulier, la composition précédemment décrite comprenant au moins une souche de bactériophage, comprend en outre une enzyme chargée positivement et ayant la capacité d’hydrolyser le peptidoglycane de la paroi bactérienne. En particulier, l’enzyme est le lysozyme.
Autrement dit, selon un mode de réalisation particulier, la présente invention porte sur un produit combiné ou une préparation combinée comprenant ladite composition précédemment décrite comprenant au moins une souche de bactériophage, et du lysozyme. Dans un mode de réalisation plus particulier, le lysozyme est un lysozyme de type-c, et plus particulièrement du lysozyme de jaune d’oeuf.
Dans un autre aspect, l'invention porte également sur une composition comprenant au moins une souche de bactériophage pour son utilisation pour le traitement d’une infection par S. aureus , caractérisée en ce que ladite composition comprend au moins une souche de bactériophage et du lysozyme.
Autrement dit, selon un mode de réalisation particulier, la présente invention porte sur un produit combiné ou une préparation combinée comprenant une composition comprenant au moins une souche de bactériophage, et du lysozyme.
Typiquement la souche de bactériophage est une souche capable d’inhiber le développement de Staphylococcus aureus.
En particulier, la concentration en lysozyme est supérieure à 1,25 mg/ml, en particulier d’au moins 2.5 mg/mL, plus particulièrement de 2.5 mg/mL,
Dans un mode de réalisation particulier, la concentration de la souche de bactériophage est comprise entre 106/mL et 1012/mL, en particulier de I08 /mL et 1010/mL, plus particulièrement 107/mL.
Combinaison d'une souche de bactériophage avec une bactériocine et du lysozyme
Dans un mode de réalisation particulier, la composition précédemment décrite comprenant au moins une souche de bactériophage, comprend en outre une bactériocine et du lysozyme.
Autrement dit, selon un mode de réalisation particulier, la présente invention porte sur un produit combiné ou une préparation combinée comprenant ladite composition précédemment décrite comprenant au moins une souche de bactériophage et une bactériocine, notamment la nisine, et du lysozyme.
Dans un mode de réalisation plus particulier, le lysozyme est un lysozyme de type-c, et plus particulièrement du lysozyme de jaune d’œuf Un autre aspect de l’invention porte sur une composition comprenant au moins une souche de bactériophage en combinaison avec une bactériocine et du lysozyme pour son utilisation dans le traitement d’une infection par S. aureus.
Autrement dit, selon un mode de réalisation particulier, la présente invention porte sur un produit combiné ou une préparation combinée comprenant une composition comprenant au moins une souche de bactériophage d’une part, du lysozyme et une bactériocine d’autre part pour son utilisation dans le traitement d’une infection par S. aureus.
Dans un mode de réalisation particulier, la concentration de la souche de bactériophage est comprise entre 106/mL et 1012/mL, en particulier de 108/mL, plus particulièrement 107/mL.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite souche de bactériophage est choisie parmi les souches déposées sous les numéros CNCM I -5408, CNCM I -5409, CNCM I -5410, CNCM I-5491 ou CNCM I-5492.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend deux ou trois bactériophages tels que déposés à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5409 et CNCM I-5410.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend deux ou trois bactériophages tels que déposés à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5491 et CNCM I-5492.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend deux ou trois bactériophages tels que déposés à la CNCM sous les numéros CNCM I-5409, CNCM I-5491 et CNCM I-5492.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition comprend au moins une souche de bactériophage en combinaison avec la nisine et du lysozyme.
Dans un mode de réalisation particulier, la concentration en nisine est comprise entre 0.05 mg/mL et 2 mg/mL, plus particulièrement entre 0.05 mg/mL et 1 mg/mL, et notamment entre 0.05 mg/mL et 0.5 mg/mL plus particulièrement de 0.1 mg/mL à 0.4 mg/mL, plus particulièrement de 0.1 mg/mL à 0.3 mg/mL, encore plus particulièrement de 0.2 mg/mL.
Dans un mode de réalisation particulier, la concentration en lysozyme est égale ou supérieure à 0.5 mg/mL. Dans un mode de réalisation particulier, la concentration en lysozyme est égale ou supérieure à 1.25 mg/mL.
Combinaison d'une souche de bactériophage avec au moins un antibiotique
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition précédemment décrite comprenant au moins une souche de bactériophage, comprend en outre au moins un antibiotique. Dans un mode de réalisation particulier, la composition précédemment décrite comprenant au moins une souche de bactériophage, est utilisée en combinaison avec au moins un antibiotique.
Autrement dit, selon un mode de réalisation particulier, la présente invention porte sur un produit combiné ou une préparation combinée comprenant ladite composition précédemment décrite comprenant au moins une souche de bactériophage et au moins un antibiotique.
Dans un autre aspect, l’invention porte également sur une composition comprenant au moins une souche de bactériophage en combinaison avec au moins un antibiotique pour son utilisation pour le traitement d’une infection par S. aureus. Typiquement la souche de bactériophage est une souche capable d’inhiber le développement de Staphylococcus aureus.
Dans un mode de réalisation particulier, ledit antibiotique est choisi parmi : la cloxacilline, l'oxytétracycline, la streptomycine, la gentamycine, le chloramphénicol, la tétracycline, l’ampicilline ou l’érythromycine. Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition précédemment décrite comprenant au moins une souche de bactériophage, est utilisée en combinaison avec la cloxacilline.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition précédemment décrite comprenant au moins une souche de bactériophage, est utilisée en combinaison avec Poxytétracycline.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition précédemment décrite comprenant au moins une souche de bactériophage, est utilisée en combinaison avec la streptomycine. Dans un mode de réalisation particulier, l'antibiotique est utilisé à une concentration comprise entre 5 mg/mL et 200 mg/mL, en particulier entre 10 mg/mL et 100 mg/mL, et notamment entre 25 mg/mL et 100 mg/mL, en particulier entre 25 mg/mL et 75 mg/mL, plus particulièrement 50 mg/mL.
Dans un mode de réalisation particulier, l'antibiotique est utilisé à une concentration comprise entre 0.125 mg/mL et 5 mg/mL, en particulier entre 0.625 mg/mL et 2.5 mg/mL, plus particulièrement 1.25 mg/mL
Dans un mode de réalisation particulier, l'antibiotique, tel que la streptomycine, la cloxacilline et Poxytétracycline, est utilisé à une concentration comprise entre 5 mg/mL et 200 mg/mL, en particulier entre 10 mg/mL et 100 mg/mL, et notamment entre 25 mg/mL et 75 mg/mL, en particulier 50 mg/mL.
Dans un mode de réalisation particulier, l'antibiotique, tel que la streptomycine, la cloxacilline et Poxytétracycline, est utilisé à une concentration comprise entre 0.625 mg/mL et 2.5 mg/mL, en particulier 1.25 mg/mL.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite souche de bactériophage est choisie parmi les souches telles que déposées sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5409, CNCM I-5410, CNCM I-5491 ou CNCM I-5492 et l'antibiotique choisi parmi la streptomycine, la cloxacilline et Poxytétracycline. Dans un mode de réalisation particulier, la composition comprend les souches déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I -5408, CNCM I -5409 et CNCM I -5410 et la streptomycine.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition comprend les souches déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I -5408, CNCM I -5409 et CNCM I -5410 et la cloxacilline.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition comprend les souches déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5409 et CNCM I-5410 et l’oxytétracycline. Dans un mode de réalisation particulier, la composition comprend les souches déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I -5408, CNCM I -5491 et CNCM I -5492 et la cloxacilline.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition comprend les souches déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I -5408, CNCM I -5491 et CNCM I-5492 et la streptomycine.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition comprend les souches déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5491 et CNCM I-5492 et l’oxytétracycline.
Dans un mode de réalisation, l’invention porte sur une composition comprenant au moins une souche de bactériophage en combinaison avec une bactériocine, par exemple la nisine, et du lysozyme et/ou un antibiotique.
Dans un mode de réalisation, l’invention porte sur une composition comprenant au moins une souche de bactériophage, ledit bactériophage étant capable d’inhiber le développement de Staphylococcus aurais, en combinaison avec une bactériocine, par exemple la nisine, et du lysozyme et/ou un antibiotique. Nécessaire de pièces
La présente demande porte également sur un nécessaire de pièces (kit de parties) comprenant une composition comprenant au moins une souche de bactériophage telle que décrite précédemment et au moins un autre élément tel qu’une bactériocine, en particulier la nisine, et/ou du lysozyme, et/ou un antibiotique,
Dans un mode de réalisation, sur un nécessaire de pièces (kit de parties) comprenant une composition comprenant au moins une souche de bactériophage et au moins un autre élément tel qu’une bactériocine, en particulier la nisine, et/ou du lysozyme, et/ou un antibiotique. Dans un mode de réalisation particulier, la présente demande porte sur un nécessaire de pièces (kit de parties) comprenant une composition comprenant au moins un bactériophage telle que décrite précédemment et au moins un antibiotique.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition dudit nécessaire de pièces comprend au moins une souche de bactériophage choisie parmi les souches de bactériophage telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5409, CNCM I-5410, CNCM I-5491 et CNCM I-5492.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition dudit nécessaire de pièces comprend deux ou trois souches de bactériophage telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I- 5409, CNCM I-5410, CNCM I-5491 et CNCM I-5492.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition dudit nécessaire de pièces comprend deux ou trois souches de bactériophage telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5409 et CNCM I-5410
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition dudit nécessaire de pièces comprend deux ou trois souches de bactériophages telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5491 et CNCM I-5492. Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition dudit nécessaire de pièces comprend deux ou trois souches de bactériophage telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5409, CNCM I-5491 et CNCM I-5492.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition dudit nécessaire de pièces comprend les trois souches de bactériophage telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I -5408, CNCM I -5491 et CNCM I -5492 et au moins un antibiotique choisi parmi la streptomycine, la cloxacilline et l’oxytétracycline.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition dudit nécessaire de pièces comprend les trois souches de bactériophage telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I- 5491 et CNCM I-5492 et une bactériocine, préférentiellement la nisine.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition dudit nécessaire de pièces comprend les trois souches de bactériophage telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5491 et CNCM I-5492 et du lysozyme. Dans un mode de réalisation particulier, ladite composition dudit nécessaire de pièces comprend tes trois souches de bactériophage telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5491 et CNCM I-5492 et une bactériocine telle que la nisine et du lysozyme.
Dans un mode de réalisation particulier, sur un nécessaire de pièces (kit de parties) comprenant une composition comprenant au moins une souche de bactériophage telle que décrite précédemment et une bactériocine, en particulier la nisine, et du lysozyme, et au moins un antibiotique.
Utilisations des compositions et de leurs combinaisons
La présente demande porte également sur l’utilisation des compositions comprenant au moins une souche de bactériophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment. En particulier, il s’agit d’une utilisation comme solution désinfectante. En particulier, il s’agit d’une utilisation comme solution anti-Staphylocoque doré. Ces solutions peuvent être utilisées sur toutes sortes de surfaces, par exemple sur du matériel médical, des instruments chirurgicaux, des dispositifs médicaux destinés à l’implantation in vivo (prothèses par exemple).
Elles peuvent également être utilisées sur la peau chez le mammifère, aussi bien chez l’Homme que chez l’animal.
Une utilisation particulière est une utilisation sur le pis des mammifères allaitants, plus particulièrement des mammifères allaitants de ferme.
La présente demande porte également sur l’utilisation des compositions comprenant au moins une souche de bactériophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment, comme additif alimentaire.
En particulier, il s’agit d’additif alimentaire pour l’alimentation animale. Ces additifs ont pour but d’améliorer certaines caractéristiques des aliments, par exemple pour en relever le goût ou pour rendre plus digestes les matières premières des aliments pour animaux.
Plus particulièrement, ladite composition est utilisée comme additif zootechnique.
La présente demande porte également sur l’utilisation des compositions comprenant au moins une souche de bactériophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment, comme biocide.
La présente demande porte également sur l’utilisation des compositions comprenant au moins une souche de bactériophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment, comme conservateurs alimentaires.
La présente demande porte également sur l’utilisation des compositions comprenant au moins une souche de bactériophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment, comme probiotique, Utilisations thérapeutiques des compositions et de leurs combinaisons
La présente demande porte également sur les compositions comprenant au moins une souche de bactériophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment ou un nécessaire de pièces selon la présente invention, pour une utilisation comme médicament. La présente demande porte également sur les compositions telles que décrites précédemment comprenant au moins une souche de bactériophage et/ou une bactériocine et/ou du lysozyme pour une utilisation comme médicament.
La présente demande porte également sur les compositions comprenant au moins une souche de bactériophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment, pour une utilisation dans l'élimination d’un biofilm ou la prévention de la formation d’un biofilm. Typiquement, il s’agît d’un biofilm formé ou pouvant se former à la surface d’un dispositif médical (par exemple prothèse) après son implantation in vivo,
La présente demande porte également sur les compositions comprenant au moins une souche de bactériophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment ou un nécessaire de pièces selon la présente invention, pour une utilisation dans le traitement ou la prévention d’une infection par à S. aureus.
La caractérisation d’une infection par S. aureus est bien connue de l’Homme du métier. Une infection par S. aureus peut entraîner, de manière non limitative, les pathologies suivantes : - des infections cutanées suppuratives c'est-à-dire avec production de pus (formes les plus fréquentes) telles que furoncles, panaris, folliculite, sycosis, cellulite, érysipèle, suppurations de plaies, pemphigus néonatal, impétigo, mammites ;
- des myosites aiguës ;
- des otites et sinusites ;
- des infections de différents viscères : infections de l'appareil respiratoire : pneumonies, endocardite (en particulier chez les patients porteurs de prothèses), infections urinaires, phlébites, certains types d'entérite, méningites ;
- syndrome du choc toxique ; - intoxication alimentaire ;
- infection des os tel que les ostéomyélites.
En particulier, la présente demande porte sur les compositions comprenant au moins une souche de bactériophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment ou un nécessaire de pièces selon la présente invention, pour une utilisation dans le traitement ou la prévention d’une infection par S. aureus chez le mammifère.
En particulier, la présente demande porte sur les compositions comprenant au moins une souche de bactériophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment ou un nécessaire de pièces selon la présente invention, pour une utilisation dans le traitement ou la prévention d’une infection par S. aureus chez l’Homme.
En particulier, la présente demande porte sur les compositions comprenant au moins une souche de bactériophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment ou un nécessaire de pièces selon la présente invention, pour une utilisation dans le traitement ou la prévention d’une infection par S. aureus chez l’animal.
Dans un autre mode de réalisation, la présente invention porte sur l’une des compositions précédemment décrites ou un nécessaire de pièces selon la présente invention pour son utilisation dans le traitement ou la prévention d’une infection par S. aureus, dans laquelle ladite infection par S. aureus est la mammite chez le mammifère allaitant.
Typiquement, ledit mammifère allaitant est un mammifère allaitant de ferme, plus particulièrement choisi parmi les bovins, les ovins, les caprins et les camélidés. En particulier, le mammifère allaitant de ferme est choisi parmi la vache, la brebis, la chèvre, la bufflonne ou la chamelle.
Dans un mode de réalisation plus particulier, ladite infection par S. aureus est la mammite bovine. Méthode de traitement ou de prévention
La présente demande porte également sur une méthode de traitement et/ou de prévention d’infection par une bactérie, comprenant l’administration d’une dose efficace, d’une composition comprenant au moins une souche de bactériophage. La présente demande porte également sur une méthode de traitement et/ou de prévention d’infection par S. aureus , comprenant l’administration d’une dose efficace, de ladite composition comprenant au moins une souche de bactériophage telle que précédemment décrite, ou d’une des combinaisons de cette composition telle que précédemment décrite.
La présente demande porte également sur une méthode de traitement et/ou de prévention d’infection par une bactérie, comprenant l’administration d’une dose efficace, d’une composition comprenant au moins une souche de bactériophage, de ladite composition comprenant au moins une souche de bactériophage et/ou une bactériocine et/ou du lysozyme.
La présente demande porte également sur une méthode de traitement et/ou de prévention d’infection par une bactérie, comprenant l’administration d’une dose efficace, d’un nécessaire de pièce comprenant d’une composition comprenant au moins une souche de bactériophage, de ladite composition comprenant au moins une souche de bactériophage et/ou une bactériocine et/ou du lysozyme.
La présente demande porte également sur une méthode de traitement et/ou de prévention d’infection par S. aureus comprenant l’administration d’une dose efficace, de ladite composition comprenant au moins une souche de bactériophage et/ou une bactériocine et/ou du lysozyme.
Les modes de réalisations décrits ci-dessus pour les utilisations thérapeutiques sont valables pour une telle méthode de traitement et/ou de prévention d’infection par une bactérie, plus particulièrement S. aureus.
La présente demande porte également sur une méthode de traitement et/ou de prévention d’infection comprenant l’administration d’une dose efficace d’un nécessaire de pièces comprenant au moins une souche de bactériophage et un autre élément tel qu’une bactériocine, en particulier la nisine, et/ou du lysozyme, et/ou un antibiotique, dans lequel ladite souche et ledit autre élément sont à administrer de façon simultanée, séparée ou séquentielle, de préférence simultanée.
Mode d’administration
Dans la présente demande, les compositions comprenant au moins une souche de bactériophage et leurs combinaisons telles que décrites précédemment, peuvent être administrées par voie parentérale, par voie orale ou par voie topique.
Par voie parentérale, on entend une injection intramusculaire, intraveineuse, sous-cutanée, intramammaire ou intradermique.
Par voie orale, on entend une administration par ingestion. Une administration par voie orale peut être, de manière non limitative, sous la forme de comprimé, gélule, suspension buvable, sachet, poudre, sirop ou capsule.
Par voie topique, on entend une application externe sur une surface du sujet telle que la peau ou les muqueuses. Une administration par voie topique peut être, de manière non limitative, sous la forme de sprays, crèmes telles qu’une crème de nettoyage ou de désinfection, de laits, de pommades, de poudres, de tampons imbibés, de solutions, de gels, de sprays, de lotions telles qu’une lotion de nettoyage ou de désinfection, d’émulsions ou de suspensions, Une administration par voie topique peut également être sous la forme d’une préparation solide telle qu’un savon ou un pain de nettoyage.
Dans un mode de réalisation particulier, lorsque ladite composition comprenant au moins une souche de bactériophage est utilisée en combinaison avec au moins un autre élément tel qu’une bactériocine, en particulier la nisine, et/ou du lysozyme, et/ou un antibiotique ou lorsque ledit nécessaire de pièces comprenant au moins une souche de bactériophage et un autre élément tel qu’une bactériocine, en particulier la nisine, et/ou du lysozyme, et/ou un antibiotique, des voies d’administration différentes peuvent être utilisées pour les différents éléments.
Dans la présente demande, lorsque ladite composition comprenant au moins une souche de bactériophage est utilisée en combinaison avec au moins un autre élément tel qu’une bactériocine, en particulier la nisine, et/ou du lysozyme, et/ou un antibiotique ou lorsque ledit nécessaire de pièces comprenant au moins une souche de bactériophage et un autre élément tel qu’une bactériocine, en particulier la nisine, et/ou du lysozyme, et/ou un antibiotique, l’utilisation peut être réalisée de manière simultanée, séparée ou séquentielle.
En particulier, lorsque ladite composition comprenant au moins une souche de bactériophage est utilisée en combinaison avec au moins un autre élément, ou lorsque ledit nécessaire de pièces comprenant au moins une souche de bactériophage et un autre élément, l’administration de ladite composition est séparée dans le temps, et ladite composition étant utilisée en dernier. Dans ce mode de réalisation, le ou les autres éléments du nécessaire de pièces peuvent être utilisés de manière simultanée, ou séparée dans le temps.
En particulier, lorsque la composition comprenant une souche de bactériophage est utilisée sous la forme d’un nécessaire de pièces en combinaison avec une bactériocine, telle que la nisine, l’administration de ladite composition est séparée dans le temps, la bactériocine étant utilisée en premier.
En particulier, lorsque la composition comprenant au moins une souche de bactériophage est utilisée en combinaison avec au moins un antibiotique sous la forme d’un nécessaire de pièces, l’administration de ladite composition est séparée dans le temps, l’antibiotique étant utilisé en premier.
En particulier, lorsque fa composition comprenant une souche de bactériophage est utilisée en combinaison avec une bactériocine, telle que la nisine, et un antibiotique (sous la forme d’un nécessaire de pièces), l’administration de ladite composition est séparée dans le temps, la composition comprenant un bactériophage étant utilisée en dernier lieu et la bactériocine et l’antibiotique étant utilisés de manière simultanée ou séparée.
BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 est un gel d’électrophorèse montrant le profil de digestion de l’ADN des phages 2 à 7 (notés P2 à P7) et P14 (noté P 14) par EcoRI,
Figure 2 est un gel d’électrophorèse montrant le profil de digestion de l’ADN des phages 2, 3, 5, 6, 9 à 14 (notés Phil 2, Phil 3, Phil 5, Phil 6, Phil 9 à Phil 14) par EcoRI.
Figure 3 est une photographie montrant l’appréciation de la lyse des phages : (-) pas d’activité, activité croissante : +, ++, ++, ++++ et +++++.
Figure 4 est une photographie montrant la différence de la taille de plage de lyse entre le pliage K (phage 1) et le phage 2 (CNCM I-5408) sur la souche bactérienne S. aureus 81. Figure 5 est une photographie montrant la différence de la taille de plage de lyse entre le phage K (phage 1) et le phage 2 (CNCM I- 5408) sur la souche bactérienne S. aureus U1 la.
Figure 6 est une photographie montrant la différence de la taille de plage de lyse entre le phage K (phage 1) et le phage 2 (CNCM I- 5408) sur la souche bactérienne S. aureus E2V-A.
Figure 7 est un ensemble de photographies de microcopie électronique montrant le phage K (phage 1) et le phage 2 (CNCM I-5408).
Figure 8 est un histogramme montrant la stabilité des phages 1 à 7 en fonction du pH. Les phages sont dénombrés par la technique de double couche à t=1h. Figure 9 est un histogramme montrant la stabilité des phages 1 à 7 en fonction de la température. Les phages sont dénombrés par la technique de double couche à t=1h.
Figure 10 est un graphique montrant le suivi du développement des phages 1 à 7 dans le milieu BHI en fonction du temps. Les phages sont dénombrés par la technique de double couche à t=0h, t=2h, t=4h, t=6h, t=8h et t=24h. Figure 11 est un graphique montrant le suivi de la prolifération de S. aureus (DO à 600 nm en fonction du temps) dans le milieu BITI en fonction de la présence des phages 1 , 2, 3, 5, 7 ou du mélange des phages 2, 3 et 7.
Figure 12 est un histogramme montrant le suivi du développement des phages 1 à 7 ou du mélange des phages 2, 3 et 7 dans le lait cru en fonction du temps. Les phages sont dénombrés par la technique de double couche à t=0h (ajout des phages), et après t=6h, t=8h et t=24h d’incubation.
Figure 13 est un histogramme montrant le suivi du développement des phages 2, 3, 6, 7, 9, 10, 11 ou du mélange des phages 2, 9 et 10 dans le lait cru en fonction du temps. Les phages sont dénombrés par la technique de double couche à t=0h (ajout des phages), et après t=8h et t=24h d’incubation.
Figure 14 est un histogramme montrant le suivi de la prolifération de S. aureus dans le lait cru en fonction de la présence des phages 1 à 7 ou du mélange des phages 2, 3 et 7, TM étant le témoin sans phage. Les bactéries sont dénombrées sur le milieu Baird Parker (T0) (ajout des phages), et après 8h (T8h) et 24h (T24h) d’incubation à 37°C.
Figure 15 est un histogramme montrant le suivi de la prolifération de S. aureus dans le lait cru en fonction de la présence des phages 2, 3, 6, 7, 9, 10, 11 ou du mélange des phages 2, 9 et 10 ou en l’absence de phage (Lait sans phages). Les bactéries sont dénombrées sur le milieu Baird Parker après ajout des phages (T0), et après, 8h (T8h) et 24h (T24h) d’incubation à 37°C.
Figure 16 est un graphique montrant le suivi de la prolifération de S. aureus (mesure en continu de la DO à 600 nm en fonction du temps (min)) dans le milieu BHI en présence de différentes concentrations en nisine (composé A) (TM= bactéries sans nisine).
Figure 17 est un histogramme montrant le suivi de la prolifération de S. aureus dans le lait cru en l’absence de de la nisine (composé A) (TM (lait contaminé sans phage et sans composé A), d’un mélange des phages 2, 3 et 7, en présence de la nisine (composé A) seul et d’un mélange des phages 2, 3 et 7 et de nisine (composé A). Les bactéries sont dénombrées sur le milieu Baird Parker après ajout des phages (T0), et après, 8h (T8h) et 24h (T24h) d’incubation à 37°C.
Figure 18 est un graphique montrant le suivi de la prolifération de S. aureus (mesure en continu de la DO à 600 nm en fonction du temps (min)) dans le milieu BHI en présence de différentes concentrations en lysozyme (composé B) (TM= bactéries sans lysozyme).
Figure 19 est un histogramme montrant le suivi de la prolifération de S. aureus dans le lait cru en présence de bactéries, en présence de la nisine à 0.2 mg/mL (composé A) et/ou de lysozyme à 0.5 mg/mL (composé B) et de bactéries. Les bactéries sont dénombrées sur le milieu Baird Parker après ajout des phages (T0), et après, 8h (T8h) et 24h (T24h) d’incubation à 37°C.
Figure 20 est un histogramme montrant le suivi de la prolifération de S. aureus dans le lait cru en présence de bactéries, en présence du mélange des phages 2, 3 et 7, ainsi que de nisine à 0.2 mg/mL (composé A) et/ou de lysozyme à 0.5 mg/mL (composé B) et de bactéries. Les bactéries sont dénombrées sur le milieu Baird Parker après ajout des phages (T0), et après, 8h (T8h) et 24h (T24h) d’incubation à 37°C.
Figure 21 est une photographie de boites de Pétri montrant la taille de la plage de lyse obtenue avec le phage 2 (CNCM I-5408) en combinaison avec AB9 (Cloxacilline à 1.25 mg/mL), (à gauche) ou AB 10 (Oxytétracycline à 1.25 mg/mL) (à droite), et au centre une boite comprenant le phage 2 sans antibiotique. Figure 22 est une photographie de boites de Pétri montrant la taille de la plage de lyse obtenue avec le phage 6 en combinaison avec AB9 (Cloxacilline à 1.25 mg/mL) (au milieu) par rapport à la plage de lyse obtenue avec le phage 6 seul (à gauche) ou AB9 seul (à droite).
Figure 23 est un histogramme montrant le suivi du développement du cocktail de phages 2, 9 et 10 (cocktail 2) dans le lait cru en fonction du temps en l’absence ou en présence de différents antibiotiques : AB6 (Streptamycine à 50 mg/mL), AB9 (Cloxacilline à 50 mg/mL) ou AB 10 (Oxytétracycline à 50 mg/mL). Les phages sont dénombrés par la technique de double couche à ajout des phages (T0), et après, 8h (T8h) et 24h (T24h).
Figure 24 est un histogramme montrant la réduction du nombre de bactéries S. aurais par une combinaison phage 3/streptomycine. (AB6-Streptomycine). Les bactéries sont dénombrées sur le milieu Baird Parker après ajout des phages (T0), et après, 24h (T24h) et 48h (T48h) d’incubation à 37°C.
Figure 25 est un histogramme montrant le suivi de la prolifération de S. aureus dans le lait cru en l’absence de phage et antibiotiques (TM bactéries (sans phages)), en présence du cocktail de phages 2, 3 et 7 (cocktail 1 de phages) en combinaison avec différents antibiotiques : AB6 (Streptamycine à 50 mg/mL), AB9 (Cloxacilline à 50 mg/mL) ou AB 10 (Oxytétracycline à 50 mg/mL). Les bactéries sont dénombrées sur le milieu Baird Parker après ajout des phages (T0), et après, 8h (T8h) et 24h (T24h) d’incubation à 37°C.
Figure 26 est un histogramme montrant le suivi de la prolifération de S. aureus dans le lait cru en l’absence de phage et antibiotiques, en présence différents antibiotiques : AB6 (Streptamycine à 50 mg/mL), AB9 (Cloxacilline à 50 mg/mL) ou AB10 (Oxytétracycline à 50 mg/mL), en présence du cocktail de phages 2, 9 et 10 (cocktail 2 de phages) en combinaison avec différents antibiotiques : AB6 (Streptamycine à 50 mg/mL), AB9 (Cloxacilline à 50 mg/mL) ou AB 10 (Oxytétracycline à 50 mg/mL). Les bactéries sont dénombrées sur le milieu Baird Parker après ajout des phages (T0), et après, 8h (T8h) et 24h (T24h) d’incubation à 37°C .
Figure 27 est un histogramme montrant le suivi de la prolifération de S. aureus dans le lait cru en l’absence de phage (TM bactéries), en présence du cocktail de phages 2, 9 et 10 ; 3, 9 et 10 ; 9 et 10 ; 3 et 10 et du phage 10 seul. Les bactéries sont dénombrées sur le milieu Baird Parker après ajout des phages (T0), et après, 8h (T8h) et 24h (T24h) d’incubation à 37°C.
Figure 28 est un histogramme montrant le suivi de la prolifération de S. aureus dans le lait cru en présence de la nisine et/ou du lysozyme seui(e)(s) ou en combinaison avec le cocktail de phages 2, 9 et 10. Les bactéries sont dénombrées sur le milieu Baird Parker su moment de l’addition des pliages (T=0h), après 8h (T-8h) et24h (T=24h) d’incubation à 37°C.
EXEMPLES La présente invention se comprendra mieux à la lecture des exemples suivants qui illustrent non-limitativement l’invention.
Dans les exemples ci-dessous, les acronymes suivant ont été utilisés PFU : Plaque-forming units ou Unités de Formation de Plaque, CFU ou UFC: Unité de Formation de Colonie. Exemple 1: . Isolement et caractérisation des pliages
1. Isolement des phages
Les phages spécifiques aux s. aureus ont été isolés à partir de 286 échantillons provenant des milieux d’élevage de toute la France. Ces échantillons comprenaient 1 17 échantillons de laits crus, 45 échantillons de la peau de vache, 59 échantillons d’eau et 65 échantillons de fèces. Seuls les phages lytiques et naturels ont été recherchés. La présence des phages a été détectée par la méthode des spots en boîtes de Pétri. Il s’agit de déposer une goutte d’un échantillon sur la gélose de culture inondée préalablement avec une culture de la bactérie hôte en phase exponentielle. La présence de phages se traduit par l’apparition d’une zone de lyse autour du spot déposé. Ensuite, les échantillons à l’origine d’une lyse seront testés par la technique de la double couche, La culture de bactéries hôtes est mélangée avec l’échantillon dans un volume de gélose molle en surfusion puis additionnée de CaCl2 ou/et de MgCl2 (10mM). Ce mélange est versé à la surface d’une boîte de Pétri contenant une couche de gélose. La présence d’un phage est matérialisée par l’apparition d’une plage de lyse. Un repiquage des plages de lyse est ensuite effectué pour obtenir un seul phage isolé. L’étape de multiplication a été effectuée afin d’augmenter la concentration en phages en vue de leur caractérisation. Résultats
184 isolats de phages ont été isolés à partir de l’ensemble des échantillons.
Les phages isolés ont été mis dans la culture pour la multiplication en vue de leur caractérisation. Après chaque cycle de multiplication, la présence de phage a été vérifiée par la méthode de spot. La concentration des phages isolés après la multiplication a été vérifiée par la technique de double couche.
2. Caractérisation des phages par les enzymes de restriction
Après extraction et purification de l’ADN phagique, celui-ci a subi une digestion enzymatique par EcoRI. La séparation est effectuée par électrophorèse en gel d’agarose. Les fragments de digestion sont révélés par une coloration au GelRed comme agent intercalant de l’ADN.
Résultats
L’ADN de différents phages isolés a été digéré par l’enzyme de restriction EcoRI (Figure 1 et Figure 2).
Les résultats de migration sur gel des fragments de digestion ont montré des profils de digestion différents selon les différents isolats. Cela démontre qu’il s’agit de phages différents. Les phages ayant le même profil ont été regroupés. Quatorze profils ont été identifiés : phage 1 , phage 2, phage 3, phage 4, phage 5, phage 6, phage 7, phage 8 (non montré), phage 9, phage 10, phage 1 1, phage 12 et phage 13, phage 14. Pour la suite, pour chaque profil, un phage a été sélectionné pour la suite des tests afin d’étudier leur activité.
Pour confirmer que ces phages sont différents de ceux publiés, la morphologie des phages est observée par microcopie électronique et le séquençage du génome est réalisé.
Pour cela, les phages ont été cultivés avec une bactérie hôte de Staphylococcus aureus (S. aureus). Cette culture de phage a été centrifugée à 10 000g pendant 10 min. Le surnageant a été récupéré et filtré sur une membrane 0,22 mm. Le surnageant a ensuite été traité par l’ADNase, ARNase (1 mg/mL) avant de faire Pextraction d’ADN des phages par un protocole du laboratoire en utilisant du phénol/chloroforme et de l'isopropanol.
L’ADN de phage a ensuite été séquencé par la technologie NGS en PE 2 x 300 bp sur MiSeq System. Exemple 2 : Activité et stabilité des phages
1. Détermination du spectre d’activité des phages isolés
Selon les profils de digestion, neuf phages ont finalement été sélectionnés pour tester leur activité sur différentes souches de S. aureus isolées à partir des échantillons d’élevage.
Pour les phages 2 à 7, l’activité des phages isolés est comparée à celle du phage de référence qui est le phage K (phage 1).
Résultats
Le spectre d’activité a été testé sur les 30 souches de S . aureus (Tableau 1) ou sur 25 souches bactériennes dont 19 souches de S. aureus et 6 souches non S. aureus (Tableau 2) par la méthode de spot. L’intensité de lyse de ces phages sur chacune des souches bactériennes est détaillée dans le tableau 1 et le tableau 2. Le tableau 1 représente donc le spectre d’activité des phages isolés sur les souches de S. aureus bovine et le tableau 2 représente le spectre d’activité des phages isolés sur différentes souches bactériennes. La lyse obtenue par la méthode de spot est notée de (-) = pas d’activité à (++++) = très active. Tableau 1
L’appréciation de l’intensité de lyse (de 0 (-) à +++++) est illustrée en Figure 3. La notation « C » signifie que quelques colonies sont observées dans la plage de lyse.
Ces résultats montrent que :
- Le phage K (ATCC 19685-B1) (phage 1) infecte 28 souches sur les 30 souches testées, soit 93 % (Tableau 1).
- Le bactériophage déposé à la CNCM sous le numéro CNCM I-5408 (phage 2) infecte 29 souches sur les 30 souches testées, soit 97 % (Tableau 1) ;
- Le bactériophage déposé à la CNCM sous le numéro CNCM I-5409 (phage 3) infecte 22 souches sur les 30 souches testées, soit 73 % (Tableau 1) ;
- Le bactériophage 4 infecte 25 souches sur les 30 souches testées, soit 83 % (Tableau 1) ;
- Le bactériophage 5 infecte 14 souches sur les 30 souches testées, soit 47 % (Tableau 1) ;
- Le bactériophage 6 infecte 14 souches sur les 30 souches testées, soit 47 % (Tableau I) ;
- Le bactériophage déposé à la CNCM sous le numéro CNCM I-5410 (phage 7) infecte 28 souches sur les 30 souches testées soit 93 % (Tableau 1) ;
- Le cocktail des trois phages (2, 3 et 7) infecte 30 souches sur les 30 souches testées, soit
100 % (Tableau 1) ;
- Le bactériophage 8 infecte 14 souches sur 19 souches S. aureus, soit 68.4% (Tableau 2)
- Le bactériophage déposé à la CNCM sous le numéro CNCM I-5491 (phage 9) infecte 15 souches sur 19 souches S.aureus soit 79% (Tableau 2) ;
- Le bactériophage déposé à la CNCM sous le numéro CNCM I-5492 (phage 10) infecte
15 souches sur 19 souches S.aureus soit 79% (Tableau 2) ; - Le cocktail des trois phages (2, 9 et 10) infecte 19 souches sur 19 souches S. aureus soit 100% des souches S. aureus testées (Tableau 2).
Le spectre d’activité du phage 2 (CNCM I -5408) est le plus large et comparable au phage K (phage référence). Cependant, le phage K ne peut pas infecter toutes les souches testées. En revanche, certains mélanges de bactériophages selon l’invention permettent d’infecter plus de souches de S. aureus que le phage K, voire 100% des souches de S. aureus testées.
En particulier, il a été montré que le mélange des phages n°CNCM I -5408 (phage 2), n°CNCM I-5409 (phage 3), et n°CNCM I-5410 (phage 7) permettait d’infecter la totalité des 30 souches, soit 100 % des souches testées (Tableau 1).
Il a été également montré que le mélange des phages n°CNCM I-5408 (phage 2), n°CNCM I-5491 (phage 9), et n° CNCM I-5492 (phage 10) permettait d’infecter la totalité des 19 souches S. aureus , soit 100 % des souches S. aureus testées (Tableau 2).
Les phages selon l’invention ont un large spectre d’activité sur l’infection de souches de S. aureus et ont aussi été sélectionnées pour leur vitesse d’élimination de S. aureus (après 3 h d’incubation à 37°C en BHI).
Différence entre le phage K (phage 1) et le phase 2 (CNCM I-5408)
Le phage K (noté phage 1 dans les figures) est utilisé comme phage de référence. Le phage 2 et le phage K ont leur spectre d’activité similaire, sauf leur infection sur la souche Q14b. Le phage 2 infecte cette souche de bactérie et non le phage K.
D’autres caractéristiques permettent de distinguer l’activité du phage K de celle du phage 2, telle que la différence de la morphologie de la plage de lyse du phage 1 (phage K) et phage 2 sur la souche bactérienne de S. aureus 81. En effet, comme montré en Figure 4, la taille de la plage de lyse du phage K est plus large que celle du phage 2.
Un autre exemple est la morphologie de la plage de lyse du phage 1 (phage K) et phage 2 sur les souches bactériennes de S. aureus U 1 la (Figure 5) et E2V-A (Figure 6). Le phage 2 et le phage K se distinguent également par rapport à leur morphologie observée en microscopie électronique comme montré en Figure 7.
2. Stabilité des phages
Les expériences ont été réalisées avec la souche hôte de S. aureus (ATCC25923). Les bactéries se développent à 37°C en bouillon BH1 (Brain Heart Infusion) composé d’extrait cœur-cervelle (17,5 g/L), peptone pancréatique de gélatine (10 g/L), chlorure de sodium (5 g/L), phosphate disodique (2.5 g/L), glucose (2 g/L). Les bactéries sont conservées à -80°C dans BHI contenant 15% (volume/volume) de glycérol.
La concentration des phages est évaluée par la méthode de double couche. Cette méthode permet d’observer les plages de lyses révélant la présence de phages. Pour cela, 100 mL de la souche bactérienne hôte en début de phase stationnaire, 100 mL de l’échantillon à tester contenant par exemple le ou les phages à tester, ainsi que 20 mM de MgSO4 sont ajoutés dans 3 mL de BHI semi solide (0,4% d’agar) stocké à 46°C. Ce mélange est ensuite étalé uniformément sur une boite de gélose de BHI solide 1% d’agar. Après une incubation de 18 h à 37°C, le nombre de phage est estimé par le nombre de plages PFU (Plaque formation unité)/mL sur boite. Les échantillons sont dilués dans du tampon SM composé de NaCl (100 mM), MgSO4(7H20) (8 mM), Tris HCl pH 7,5 (50 mM), gélatine 0,002%.
L’activité anti bactérienne d’un phage ou d’un mélange (cocktail) de phages peut être évaluée par le suivi de la densité optique (DO) au cours du temps à 600 nm. Pour cela, une culture de bactérie hôte (S. aureus ) à la phase exponentielle est incubée avec les phages. La concentration de bactéries est de 106UFC/mL et les phages ont été ajoutés à 107UFP/ml. Le ratio de phage s/bactéries est : 1/10. Le suivi de la DO à 600 nm est réalisé avec l’aide d’un spectromètre pendant 24 h à 37°C (température pour les bactéries S. aureus). Si la DO de la culture de bactéries incubées avec les phages est diminuée par rapport à une culture témoin comprenant seulement les bactéries, cela signifie que le phage ou mélange de phages peut inhiber la croissance bactérienne de S. aureus.
L’activité antibactérienne d’un phage ou d’un mélange (cocktail) de phages peut également être évaluée par le dénombrement des bactéries sur un milieu spécifique, la gélose Baird Parker (milieu à pH 6,8 ± 0,2 composée de tryptone (10 g/L), d’extrait de viande de bœuf (5 g/L), d’extrait de levure (lg/L), de pyruvate de sodium (10 g/L), de glycocolle (12 g/L), de chlorure de lithium (5 g/L), agar (20 g/L)). Pour cela, à différents temps d’expérience, 1 mL de milieu expérimental est prélevé. Une série de dilution de 1/10 est réalisée. 100 mL de chaque dilution est étalé sur la gélose Baird Parker pour visualiser les colonies de S.aureus. Après 48 h d’incubation à 37°C, le nombre de bactéries est traduit par le nombre de colonies de S.aureus sur le milieu Baird Parker. En tenant compte de la dilution et du nombre de colonies sur la gélose, le nombre de bactéries contenues dans un mL est calculé. En comparant la concentration de bactéries d’une culture TM (sans phage) et celle de la culture avec des pliages, il est possible d’estimer la capacité du phage ou du mélange de phages à réduire la population de bactéries.
2.1. Stabilité des phages à différents pH
Les 6 phages phage 2 (n°CNCM I-5408), phage 3 (n°CNCM I-5409), phage 7 (n°CNCM I -5410), phage 4, phage 5 et phage 6, ont été sélectionnés pour tester leur stabilité à différents pH. Les résultats sont comparés avec le phage K (phage 1).
Les phages à une concentration initiale de 107 UFP/ml (unité formatrice de plaque) ont été incubés pendant 1 heure à 37°C, à différents pH : 3 ; 3.5, 4, 4.5, 5, 7, 8 et 9.
La concentration des phages a alors été évaluée par la technique de la double couche, pour évaluer l’effet du pH sur l’activité des phages (Figure 8).
Les résultats en Figure 8 montrent que la concentration de tous les phages est maximale de pH 4.5 à 9.0, ils ont conservé leurs concentrations initiales. En revanche, une réduction de la concentration de phages a été observée au pH 3,5 et au pH 3. Les phages 2 (CNCM I5408), 3 (CNCM I-5409) et 7 (CNCM I-5410) sont les plus stables à pH 3,5, en particulier le phage 3. Tous les phages sont inactivés à pH 3, à l’exception du phage 3 qui résiste à un pH 3.0, cependant une réduction de sa concentration initiale de quasiment 6 log est observée. Parmi les phages selon l’invention, les phages 2 (CNCM I -5408) et 3 (CNCM I -5409) sont donc plus stables à pH acide. 11 est également important de noter qu’à pH 3.5, les phages 2 (CNCM I -5408) et 3 (CNCM I -5409) conservent une bonne stabilité contrairement au phage K de référence. Le pH de l'estomac étant entre 2 et 5, dans le cadre d’une administration par voie orale, il est important que les phages soient stables à des pH acides.
2.2. Stabilité des phages à différentes températures
Les 6 phages phage 2 (n°CNCM I-5408), phage 3 (n°CNCM I-5409), phage 7 (n°CNCM I -5410), phage 4, phage 5 et phage 6, ont été sélectionnés pour tester leur stabilité à différentes températures. Les résultats sont comparés avec le phage K (phage I).
Les phages à une concentration initiale de 107 UFP/ml, ont été incubés pendant 1 heure à différentes températures : 30°C ; 37°C, 45°C, 55 °C> 60 °C, 65°C, 75°C et 85°C. La concentration des phages a alors été évaluée par la technique de la double couche pour évaluer l’effet de la température sur l’activité des phages (Figure 9).
Les résultats en Figure 9 montrent que la concentration de tous les phages est maximale de 30°C à 45°C. Ils conservent leurs concentrations initiales, ce qui indique qu’ils sont stables à ces températures. A 55°C, une diminution de la concentration des phages 3 (CNCM I-5409), 4 et 5 a été observée (respectivement 2 log, 2.5 log et 2 log). Cependant, à une température de 60°C, la concentration des phages 1 et 2 (CNCM I-5408) est réduite de 2 log par rapport à leur concentration initiale, contrairement au phage 3 (CNCM I-5409) pour lequel la concentration initiale est réduite de 6 log par rapport à la concentration initiale. Les phages 4 et 5 sont complètement inhibés. Enfin, à une température de 65°C tous les phages sont désactivés, à l’exception des phages 6 et 7 (CNCM I-5410).
La Figure 9 permet également de constater que les températures optimales des phages sont de 30 à 45°C. Les phages 1, 2 (CNCM I -5408) et 3 (CNCM I-5409) sont résistants jusqu’à une température de 60°C, contrairement aux phages 4 et 5. Les phages 2 (CNCM I -5408) et le phage 3 (CNCM I -5409) sont les plus stables à des températures élevées. La température corporelle des mammifères étant très variable, par exemple 37°C pour l’Homme, 39°C pour les ovins et les bovins, il est important que les pliages soient stables sur une large gamme de température.
2.3. Activité des phages dans le BHI
Prolifération des pliages dans le milieu BHI
Afin de comparer l’activité entre les phages en milieu BHI, la prolifération des phages (concentration initiale de 107 UFP/ml) a été étudiée au cours du temps à 37°C. La concentration des phages a été évaluée par la technique de double couche à T^Oh, 2h, 4h, 8h et 24h. L’objectif est de trouver le ou les phages ayant la concentration la plus élevée au cours du temps.
La Figure 10 montre qu 'après 24 h d’incubation, la concentration du phage 3 (CNCM I-5409) et du phage 5 est plus élevée que celle des autres phages (1010 UFP/mL) par comparaison avec le phage 1 et le phage 2 (CNCM I-5408) (109 UFP/mL environ).
Réduction des bactéries par des phages dans le milieu BHI
La réduction des bactéries (concentration initiale 106UFC/ml) par les phages en milieu BHI (concentration initiale de 107 UFP/ml) a été étudiée par suivi de la densité optique de la culture bactérienne à 600 nm (Figure 1 1). La concentration des bactéries est proportionnelle à la densité optique dans une gamme de concentrations. La réduction de la densité optique reflète la capacité d’inhiber le développement bactérien.
La Figure 11 montre une différence significative en milieu BHI entre le témoin (culture sans phages) et la culture en présence des phages. Les bactéries dans la culture témoin se développent rapidement dès les premières heures et atteignent une phase stationnaire après 8h d’incubation (DO environ 2,2). Le développement des bactéries est inhibé par l’ensemble des phages. Le phage 1, le phage 2 (CNCM I-5408) et le mix des phages 2, 3 et 7, inhibent complètement la croissance bactérienne pendant les premières heures. L’activité du phage 3 est similaire à celle du phage 6 (résultat non présenté) et l’activité du phage 4 est similaire à celle du phage 7 (résultat non présenté). Pour obtenir la meilleure inhibition du développement de S. aureus en milieu BRI, l’utilisation du mélange des phages 2 (CNCM I-5408), 3 (CNCM I-5409) et 7 (CNCM I-5410) est la plus efficace.
2.4. Activité des phages dans le lait cm L’activité des phages 2 (CNCM I -5408), 3 (CNCM I-5409), 4, 5, 6, 7 (CNCM I-5410), 9 (CNCM I -5491), 10 (CNCM I -5492) et 1 1 a été ensuite étudiée dans le lait cru afin d’évaluer leur efficacité dans le milieu de la lactation.
Le lait cru a été tout d’abord contaminé artificiellement par les bactéries de S. aureus à une concentration d’environ 106UFC/mL. Les phages ont été ajouté à 107UFP/mL (M.O.I=10).
La concentration en phages a été évaluée au cours du temps par la méthode de double couche à T=0h, 6h, 8h et 24h (Figure 12) ou à T=0h, 8h et 24h (Figure 13).
Les bactéries ont été dénombrées sur milieu Baird Parker à T=0h, 8h et 24h (Figures 14 et 15) Prolifération des phages dans le lait cru
Par rapport au milieu BHI, la prolifération des phages est plus limitée dans le lait cru. La concentration des phages est stable pendant les 8 premières heures, puis diminue légèrement pour certains phages après 24h d’incubation (Figures 12 et 13). Toutefois, une différence entre les phages a été observée. Les phages 3 (CNCM I-5409), 6, 9 (CNCM I-5491 ) et 10 (CNCM I -5492) sont les plus stables dans le lait cru. En effet, seuls ces 4 phages peuvent se répliquer dans le lait cru. Après 24h d’incubation, la concentration la plus élevée est observée pour les phages 3, 9 et 10. Une concentration tout aussi élevée après 24h d’incubation est également observée pour le mélange de phages 2 (CNCM I -5409), 3 (CNCM I -5410) et 7 (CNCM I -5410) (Figure 12) et le mélange de phages 2 (CNCM I-5409), 9 (CNCM I-5491) et 10 (CNCM I-5492) (Figure 13). Réduction des bactéries par des phases dans ie lait cru
En milieu BHI, l’ajout des phages permet de réduire complètement les bactéries. Dans le lait cru, une plus faible réduction des bactéries est observée pour les phages 2 à 7 (Figure 14). L’ajout individuel de ces phages ne permet pas de réduire significativement la concentration bactérienne, y compris l’ajout du phage K de référence. Seul l’ajout du cocktail de phages 2, 3 et 7 permet d’avoir une forte réduction (environ 4 log) de la concentration bactérienne. L’effet sur la réduction de la population bactérienne de S. aureus dans le lait cru est plus importante avec l’ajout d’un mélange comprenant les phages 2 (CNCM I-5408), 3 (CNCM I-5409) et 7 (CNCM I-5410) qu’avec l’ajout individuel de ces mêmes phages, ou encore que l’ajout du phage K (phage 1) seul (Figure 14),
En revanche, l’ajout du phage 10 (CNCM I -5492) seul, et dans une moindre mesure l’ajout du phage 9 (CNCM I-5491 ) seul, permettent de réduire la concentration bactérienne dans le lait cru (environ 2 log pour le phage 9 et de 3 à 4 log pour le phage 10) (Figure 15 et Figure 27).
Comme vu précédemment, l’ajout de cocktails de phages est également efficace pour réduire la concentration bactérienne. En effet, l’ajout du cocktail de phages 2 (CNCM I-5408), 9 (CNCM I- 5491) et 10 (CNCM I-5492) permet de réduire significativement la concentration en S. aureus dans le lait cru (environ de 3 à 4 log) (Figure 15 et Figure 27). L’ajout du cocktail de phages 3 (CNCM I-5409),
9 (CNCM I-5491) et 10 (CNCM I-5492) ou du cocktail de phages 3 (CNCM I-5409) et
10 (CNCM I-5492) permet de réduire la concentration bactérienne dans le lait cru d’environ 4 log, tandis que l’ajout du cocktail de phages 9 (CNCM I-5491) et 10 (CNCM I-5492) permet de réduire la concentration bactérienne dans le lait cru d’environ 3 log (Figure 27). Exemple 3 : Combinaison des phages avec la nisine 1. Activité anti-S. aureus de la nisine
La CMI (concentration minimale inhibitrice) de la nisine a été évaluée. Pour cela, la nisine (seule) a été ajoutée dans une culture de bactéries en BH1 à différentes concentrations : 0.025 mg/mL, 0,05 mg/mL, 0.1 mg/mL, 0.2 mg/mL et 0.3 mg/mL.
La croissance de S. aureus en milieu BHI (concentration initiale 106UFC/ml), a été suivie au cours du temps par DO à 600 nm, en présence des différentes concentrations en nisine (composé A) (Figure 16).
La Figure 16 montre que la croissance bactérienne est inhibée complètement à une concentration de 0.3 mg/mL. La concentration de la nisine la plus faible (0.025 mg/mL) n’a pas d’effet sur la croissance des bactéries.
Les concentrations en nisine de 0.1 mg/mL et 0.2 mg/mL peuvent inhiber partiellement la croissance bactérienne. La concentration de la nisine de 0.2 mg/mL a été choisie pour une utilisation en combinaison avec des phages. 2. Activité de la combinaison phage et nisine
Le lait cru a été tout d’abord contaminé artificiellement par des bactéries de S. aureus à une concentration de 106 UFC/mL. La nisine a ensuite été ajoutée dans le lait à une concentration de 0.2 mg/mL, et le cocktail de phages 2, 3 et 7 à une concentration de 107 UFP/mL (ratio des phages dans le cocktail 1 : 1 : 1) (ratio phages/bactéries (MO.I) =10). Les bactéries ont été dénombrées sur milieu Baird Parker à T=0h, T=6h et T=24h pour suivre la réduction de la bactérie S. aureus dans le lait cru en présence de la nisine et/ou des phages (Figure 17).
La Figure 17 montre que lorsque la nisine est ajoutée seule dans le lait, l’effet inhibiteur sur la bactérie dans le lait cru est observé à la concentration de 0.2 mg/mL. Une réduction d’environ 0,5 log est observée après 6 h et une réduction de 2.3 log après 24h. Lorsque le cocktail de phages 2 (CNCM I-5408), 3 (CNCM I-5409) et 7 (CNCM I-5410) est ajouté seul dans le lait, il permet d’avoir une réduction de la concentration bactérienne d’environ 4 log après 24 h d’incubation.
Lorsque les phages sont ajoutés dans le lait en combinaison avec la nisine, un effet synergique est observé. En effet, de manière inattendue, une réduction de la concentration bactérienne d’environ 6 log est obtenue après 6 h d’incubation, et une réduction d’environ 6,5 log est obtenue après 24 h.
Exemple 4 : Combinaison des phages avec le lysozyme
La CMl (concentration minimale inhibitrice) du lysozyme a été évaluée. Pour cela, le lysozyme (seul) a été ajouté dans une culture de bactéries en BHI à différentes concentrations : 0.625 mg/mL, 1.25 mg/mL, 1.85 mg/mL et 2.5 mg/mL.
La croissance de S. aureus en milieu BHI (concentration initiale 106UFC/ml), a été suivie au cours du temps par DO à 600 nm, en présence des différentes concentrations en lysozyme (composé B) (Figure 18). La Figure 18 montre que la croissance bactérienne est inhibée en présence d’une concentration de lysozyme de 0,625 mg/mL.
Exemple 5 : Combinaison des phages avec la nisine et le lysozyme
Le lait cru a été tout d’abord contaminé artificiellement par des bactéries de S. aureus à une concentration d’environ 106 UFC/mL. Ensuite, la nisine (composé A) a été ajoutée dans le lait cru à une concentration de 0.2 mg/mL, et/ou le lysozyme (composé B) à une concentration de 0.5 mg/mL. Le cocktail de phages 2, 3 et 7 ou le cocktail de phages 2, 9 et 10 a été ajouté à une concentration de 107 UFP/mL (ratio des phages dans le cocktail 1 :1 : 1) (ratio phage/bactérie (M.O.I) =10).
Les bactéries ont été dénombrées sur milieu Baird Parker à T=0h, 8h et 24h d’incubation à 37°C. La Figure 19 représente l’effet de la nisine et/ou du lysozyme sur la concentration de bactérie S. aureus dans le lait cru.
La Figure 20 représente l’effet de la nisine et/ ou du lysozyme en présence du cocktail de phages 2, 3 et 7 sur la concentration de bactéries S. aureus dans le lait cru. La présence du lysozyme (Composé B) à 0.5 mg/mL a montré un faible effet sur le développement de la souche de S. aureus testée. Le fait de combiner le lysozyme avec le cocktail de phages 2, 3 et 7 a un peu amélioré l’inhibition du développement des bactéries dans le lait cru.
Comme observé précédemment, la nisine (composé A) permet d’obtenir une inhibition du développement bactérien. Cette inhibition est accrue en présence du cocktail de phages 2, 3 et 7.
Cependant, un effet antibactérien très surprenant a été observé lorsque les phages étaient combinés avec la nisine (composé A) et le lysozyme (composé B). En effet, avec cette combinaison, la population de S. aureus est drastiquement diminuée. Cet effet sur le développement de S. aureus est supérieur à l’effet obtenu séparément avec la nisine, le lysozyme et les combinaisons nisine/phages et lysozyme/phages. En combinant le cocktail de phages 2, 3 et 7 avec la nisine et le lysozyme, une très faible quantité de bactéries est détectée. A noter même que pour certains réplicas de cette expérience, l’absence de bactéries a été observée après 24 h. La Figure 28 représente l’effet de la nisine et/ ou du lysozyme seul(e)(s) ou en présence du cocktail de phages 2, 9 et 10 sur la concentration de bactéries S. aureus dans le lait cru.
Comme observé précédemment, la nisine (composé A) permet d’obtenir une inhibition du développement de S. aureus, qui est accrue en présence du cocktail de phages 2, 9 et 10. Le lysozyme montre un faible effet sur la croissance bactérienne, qui est un peu amélioré en présence du cocktail de phages 2, 9 et 10.
Tout comme le cocktail de phages 2, 3 et 7, un effet antibactérien synergique a été observé lors que le cocktail de phages 2, 9 et 10 est combiné avec la nisine et le lysozyme. En effet, cet effet est supérieur à l’effet obtenu séparément avec la nisine, le lysozyme, le cocktail de pliages 2, 9 et 10, et les combinaisons nisine/phages, lysozyme/phages et nisine/lysozyme.
Exemple 6 : Combinaison des phages avec des antibiotiques 1. Etude de l 'effet de la combinaison phages/antibiotiques en milieu BHI
Pour étudier l’effet de la combinaison des phages avec des antibiotiques sur le développement de S. aureus, le titre de phages a été analysé en présence de différents antibiotiques (AB) à différentes concentrations (mg/mL) : Tétracycline (AB1), Gentamycine (AB2), Chloramphénicol (AB3), Kanamycine (AB4), Ampicilline (AB5), Streptomycine (AB6), Cloxaci!line (AB9), Oxytétracycline (AB10), Erythromycine (AB11). Les phages ont été ajoutés à une concentration de 107phages/mL dans une culture de la bactérie S. aureus.
La technique de la double couche est réalisée pour chaque culture : phages sans AB, phages+AB. Pour cela, les 100 ml contenant le phage contiennent également l’antibiotique à une concentration donnée dans le BHI. Après 24h d’incubation à 37°C, la taille de la plage de lyse et le nombre de plages de lyse obtenus sont comparés entre la condition sans AB (témoin) et la condition avec AB. Le nombre de plages de lyse reflète le nombre de phages.
L’étude a été réalisée avec le phage 3 (CNCM I-5409) Les résultats sont rapportés dans le tableau 3.
Tableau 3
Une taille de plages de lyse plus grande que le témoin (TM) et/ou un nombre de plages plus élevé traduisent un meilleur effet de la combinaison antibiotique /phage 3. Après avoir testé 9 antibiotiques, une différence au niveau de la taille de plages est observée pour trois antibiotiques : AB9 (Cloxacilline), AB6 (Streptomycine) et AB 10 (Oxytétracycline). La taille des plages pour le phage 3 est plus importante lorsqu’est ajouté l' AB 9, l' AB 10 ou l'AB6. Par la suite, les antibiotiques Cloxacilline (AB9), Oxytétracycline (AB 10) et Streptomycine (AB6) ont été testés sur les phages 1 à 7 (Tableau 4). De la même manière que précédemment, la taille des plages de lyse a été observée, de même que le nombre de plage de lyse obtenu.
Tableau 4
Un effet sur la taille des plages de lyse est observé pour quasiment tous les phages en combinaison avec AB9 (Cloxacilline), AB 10 (Oxytétracycline) ou AB6 (Streptomycine).
A titre d’exemple, la Figure 21 montre la taille de la plage de lyse obtenue avec le phage 2 (CNCM I-5408) en combinaison avec AB9 (Cloxacilline) (à gauche) ou AB 10 (Oxytétracycline) (à droite). La Figure 22 montre la taille de la plage de lyse obtenue avec le phage 6 en combinaison avec AB9 (Cloxacilline) (au milieu) par rapport à la plage de lyse obtenue avec le phage 6 seul (à gauche) ou AB9 seul (à droite).
Concernant le nombre de plages, l'effet maximum (nombre de plages le plus élevé) est obtenu avec le phage 2 et le phage 3 respectivement combiné avec AB9 (Cloxacilline), avec le phage 2 et le phage 7 respectivement combiné avec AB 10 (Oxytétracycline), et avec le phage 2 et le phage 4 respectivement combiné avec AB6 (Streptomycine).
2. Prolifération des phages dans le lait cru en présence d'antibiotiques
Pour étudier l’effet des antibiotiques sur la prolifération des phages dans le lait cru, le titre du mélange des phages 2 (CNCM I-5408), 9 (CNCM I-5491) et 10 (CNCM I-5492) a été mesuré à t=0h, t=8 e t=24h en présence de différents antibiotiques : AB9 (Cloxacilline), AB6 (Streptomycine) et AB 10 (Oxytétracycline).
Le lait cru a été tout d’abord contaminé artificiellement par les bactéries de S.aureus à une concentration d’environ 106UFC/mL. L’antibiotique a été ensuite ajouté dans le lait à 50 mg/mL. Les phages ont été ajoutés à 107UFP/mL (M.0.1=10). La Figure 23 représente la concentration des phages en présence des antibiotiques ;
La Figure 23 montre que le titre du mélange de phages 2 (CNCM I- 5408), 9 (CNCM I-5491) et 10 (CNCM I-5492) est affecté par l’ajout des antibiotiques, que ce soit AB9, AB6 ou AB 10.
3. Réduction du nombre de bactéries S. aureus dans le lait cru par une combinaison phages/antibiotiques
20 mL de lait cru ont tout d’abord été contaminé artificiellement par des bactéries de S. aureus à une concentration de I06UFC/mL. Les phages (ou cocktail de phages) sont ensuite ajoutés à une concentration de 107 UFP/mL. L’AB est ajouté à la concentration de 50 mg/mL,
La concentration des bactéries est mesurée en début d’expérience à t=0 (moment d’ajout des phages), puis après 24 h et 48h d’incubation à 37°C pour le phage 3 (Figure 24) ou après 8h et 24h d’incubation à 37°C pour le cocktail de phages 2, 3 et 7 (Figure 25) et le cocktail de phages 2, 9 et 10 (Figure 26). Le nombre de bactéries est évalué par la méthode d’étalement sur boite de gélose Baird Parker.
La Figure 24 montre l'effet d’une combinaison phage 3 avec streptomycine (AB6) sur la population de S. aureus dans le lait cru.
Dans le témoin (bactéries seules), les bactéries se développent pendant 48h et la concentration de bactéries est de 7 log et 8 log environ, respectivement après 24h et 48h,
L’ajout des phages permet de réduire le nombre de bactéries de 2 log après 48h d’incubation. L’ajout de streptomycine (AB6) permet de réduire le nombre de bactéries après 24h d’incubation mais la population bactérienne n’est pas désactivée par l’antibiotique. Cette population se développe et le nombre de bactéries est important après 48h (environ 6 log). Ce phénomène correspond à la mutation de la bactérie par rapport à l’antibiotique.
Lorsque les phages sont combinés avec l’antibiotique, aucune bactérie n’est détectée après 24h et 48h. Cela montre une synergie de la combinaison phage/antibiotique sur la réduction des bactéries dans le lait cru. De plus, la présence des phages permet de réduire le phénomène de la résistance des bactéries à l’antibiotique.
Les Figure 25 et 26 montrent l’effet de la combinaison d’un cocktail de phages avec différents antibiotiques sur la population de S. aureus dans le lait cru. La Figure 25 montre l’effet du mélange des phages 2 (CNCM I-5408), 3 (CNCM I-5409) et 7 (CNCM I-5410) en présence des différents antibiotiques : AB9 (Cloxacilline), AB6 (Streptomycine) et AB 10 (Oxytétracycline).
La Figure 26 montre l’effet du mélange des phages 2 (CNCM I-5408), 9 (CNCM I-5491) et 10 (CNCM I-5492) en présence de différents antibiotiques : AB9 (Cloxacilline), AB6 (Streptomycine) et AB10 (Oxytétracycline). Lorsque l’antibiotique est ajouté seul dans le lait, l’effet inhibiteur sur la bactérie dans le lait cru est observé à la concentration de 50 mg/mL. Une réduction d’environ 3 à 4 log est observée pour AB6 et AB9, et de 2 log environ pour AB 10.
L’ajout du cocktail de phages seul (e.g. cocktail de phages 2, 3 et 7 ou cocktail de phages 2, 9 et 10) permet de réduire la concentration bactérienne d’environ 2-3 log après 24 h d’incubation.
Lorsque le cocktail de phages 2, 3 et 7 ou le cocktail de phages 2, 9 et 10 est ajouté dans le lait cru avec l’antibiotique AB6 ou AB9, une synergie est observée. En effet, une réduction d’environ 6 log après 24 h est observée lorsque le cocktail de phages 2, 9 et 10 est combiné avec AB6 ou AB9 et lorsque le cocktail de phages 2, 3 et 7 est combiné avec AB6, La réduction est d’environ 5 log après 24h pour le cocktail de phages 2, 3 et 7 lorsqu’il est ajouté en présence de AB9.
Ainsi, ces données démontrent une synergie de la combinaison des phages ou d’un cocktail de phages avec des antibiotiques, en particulier AB6 et AB9, sur la réduction de S. aureus dans le lait cru.
Exemple 7 : Test d'évaluation de l'activité anti- S. aureus d’une souche de bactériophage
Afin d’établir la capacité d’un bactériophage ou d’un mélange de bactériophages à inhiber le développement de S. aureus , une culture de bactérie hôte (S. aureus ) à la phase exponentielle est incubée avec le bactériophage. Le ratio de phages/bactéries est peut-être testé : 1/100 ; 1/10 ou 1 ou 10. Le suivi de la densité optique (OD ou DO) à 600 nm est réalisé pendant 24 h à 37°C, à raison d’une mesure toutes les 15 minutes. La croissance de la bactérie S. aureus est proportionnelle à la DO de la culture bactérienne.
En parallèle, une culture témoin correspondant à une culture de S. aureus seul (sans pliage), est réalisée.
Si la DO de la culture de S. aureus incubée avec la souche de bactériophage diminue d’au moins 50% après 8h et 18h d’incubation par rapport au témoin, cela signifie que la souche de bactériophage inhibe la croissance de S. aureus. Références à du matériel biologique déposé
Dans la présente demande, il est fait référence aux souches de bactériophages suivantes, déposées à la CNCM le 21 Mars 2019 par Vetophage SAS, dont l’adresse est ENS Lyon, 46 Allée d’Italie -, 69007 Lyon :
- phage 2, référence d’identification auprès de la CNCM « Vetophage - phi 2 », dont le numéro d’enregistrement est « I-5408 » ;
- phage 3, référence d’identification auprès de la CNCM « Vetophage - phi 3 », dont le numéro d’enregistrement est « I-5409 » ;
- phage 7, référence d’identification auprès de la CNCM « Vetophage - phi 7 », dont le numéro d’enregistrement est « I-5410 » ;
Dans la présente demande, il est fait référence aux souches de bactériophages suivantes, déposées à la CNCM le 12 février 2020 par Vetophage SAS, dont l’adresse est ENS Lyon, 46 Allée d’Italie -, 69007 Lyon :
- phage 9, référence d’identification auprès de la CNCM « Vetophage - phi 9 », dont le numéro d’enregistrement est « I-5491 » ;
- phage 10, référence d’identification auprès de la CNCM « Vetophage - phi 10 », dont le numéro d’enregistrement est « I-5492 ».

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition comprenant une souche de bactériophage choisie parmi les souches telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I -5409, CNCM I -5410, CNCM I-5491 et CNCM-5492.
2. Composition selon la revendication 1, comprenant en outre au moins une souche de bactériophage choisie parmi les souches telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5409, CNCM I-5410, CNCM I-5491 et CNCM I-5492.
3, Composition selon la revendication 1 ou 2, comprenant trois souches de bactériophage choisies parmi les souches telles que déposées à la CNCM sous les numéros CNCM I-5408, CNCM I-5409, CNCM I-5410, CNCM I-5491 et CNCM I-5492.
4. Composition selon la revendication 3, comprenant les trois souches de bactériophage déposées à la CNCM sous les numéros
- CNCM I-5408, CNCM I-5409 et CNCM I-5410,
- CNCM I-5491 , CNCM I-5492 et CNCM I-5408, ou
- CNCM I-5491 , CNCM I-5492 et CNCM I-5409.
5. Composition comprenant au moins une souche de bactériophage ladite composition comprend en outre une bactériocine, en particulier la nisine, et/ou du lysozyme, et/ou au moins un antibiotique.
6. Composition selon l'une des revendications 1 à 4, dans laquelle ladite composition comprend en outre une bactériocine, en particulier la nisine, et/ou du lysozyme, et/ou au moins un antibiotique.
7. Composition selon l’une des revendications 1 à 4, dans laquelle ladite composition comprend en outre au moins un antibiotique notamment choisi parmi la streptomycine, la cloxacilline et Toxytétracycline.
8. Nécessaire de pièces comprenant une composition comprenant au moins un bactériophage et au moins un autre élément tel qu’une bactériocine, en particulier la nisine, et/ou du lysozyme, et/ou un antibiotique.
9. Nécessaire de pièces comprenant une composition selon l’une des revendications 1 à 4 et au moins un autre élément tel qu’une bactériocine, en particulier la nisine, et/ou du lysozyme, et/ou un antibiotique.
10. Composition selon l’une des revendications 1 à 7 ou nécessaire de pièces selon la revendication 8 ou 9, pour son utilisation comme médicament.
11. Composition selon l’une des revendications 1 à 7 ou nécessaire de pièces selon la revendication 8 ou 9, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention d’une infection par Staphylococcus aureus chez un mammifère comme l’Homme ou l’animal.
12. Composition ou nécessaire de pièces pour son utilisation selon la revendication 11, dans laquelle ladite infection par Staphylococcus aureus est la mammite chez le mammifère allaitant, en particulier la vache, la brebis, la chèvre, la bufflonne ou la chamelle.
13. Utilisation d’une composition selon l’une des revendications 1 à 7 ou nécessaire de pièces selon la revendication 8 ou 9 comme solution biocide, désinfectante, additif alimentaire, conservateurs alimentaires ou probiotique.
14. Nécessaire de pièces comprenant au moins une souche de bactériophage et un autre élément tel qu’une bactériocine, en particulier la nisine, et/ou du lysozyme, et/ou un antibiotique pour son utilisation selon l’une des revendications 10 à 12, dans lequel ladite souche et ledit autre élément sont à administrer de façon simultanée, séparée ou séquentielle, de préférence simultanée.
15. Souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro CNCM I-5409.
16. Souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro CNCM I-5410.
17. Souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro CNCM I-5491.
18. Souche de bactériophage déposée à la CNCM sous le numéro CNCM I-5492.
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