ES2926129T3

ES2926129T3 - Terapia con fagos

Info

Publication number: ES2926129T3
Application number: ES15794130T
Authority: ES
Inventors: Flavie Pouillot; Hélène Blois
Original assignee: Pherecydes Pharma SA
Current assignee: Phaxiam Therapeutics SA
Priority date: 2014-11-07
Filing date: 2015-11-06
Publication date: 2022-10-24
Anticipated expiration: 2035-11-06
Also published as: BR112017009545B1; PT3215607T; LT3215607T; IL251976A0; US20210228659A1; WO2016071503A1; JP6894376B2; US11779617B2; JP2017534684A; CN107429236A; PL3215607T3; WO2016071503A8; DK3215607T3; HUE060113T2; EP3215607A1; AU2015341683A1; US20170319637A1; EP3018201A1; CA2966944A1; IL251976B

Abstract

La presente invención se refiere a la terapia con bacteriófagos. Más particularmente, la presente invención se refiere a nuevos bacteriófagos que tienen una alta especificidad frente a cepas de Pseudomonas aeruginosa, su fabricación, componentes de los mismos, composiciones que los comprenden y usos de los mismos en la terapia con fagos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Terapia con fagos

La presente invención se refiere a nuevas composiciones de bacteriófagos, su preparación y usos de las mismas. La invención es particularmente adecuada para el tratamiento de una infección en un mamífero, particularmente en el sistema respiratorio.

Antecedentes de la invención

Los bacteriófagos (o fagos) son pequeños virus que muestran la capacidad de infectar y destruir bacterias sin afectar a las células de otros organismos. Ya descritos inicialmente hace casi un siglo por William Twort, y descubiertos de forma independiente poco después por Félix d'Herelle, hasta ahora se han descubierto y descrito morfológicamente más de 6000 bacteriófagos diferentes, incluidos virus bacterianos y arqueales. La gran mayoría de esos virus tienen cola, mientras que una pequeña proporción son poliédricos, filamentosos o pleomórficos. Pueden clasificarse según su morfología, su contenido genético (ADN frente a ARN), su hospedador específico, el lugar donde viven (virus ma rinos frente a otros hábitats) y su ciclo de vida. Como parásitos intracelulares de las células bacterianas, los fagos muestran diferentes ciclos de vida dentro del hospedador bacteriano: infección lítica, lisogénica, pseudo-lisogénica y crónica (Weinbauer, 2004; Drulis-Kawa, 2012). Los fagos líticos provocan la lisis de la célula bacteriana hospedadora como una parte normal de sus ciclos de vida. Los fagos lisogénicos (también denominados fagos templados) pueden replicarse por medio del ciclo de vida lítico y provocar la lisis de la bacteria hospedadora, o pueden incorporar su ADN en el ADN de la bacteria hospedadora y convertirse en profagos no infecciosos. Cualquiera que sea el tipo de ciclo de un fago, el primer paso es la unión a los receptores de la pared celular bacteriana antes de que el material del fago pueda entrar en la bacteria. Ese proceso específico influye en el espectro de las posibles interacciones fago-bacteria.

Los bacteriófagos se utilizan comúnmente como herramientas de investigación para modificar bacterias en experimen tos de laboratorio.

Debido a su especificidad para la célula hospedadora diana, se ha considerado el uso de fagos como una terapia para tratar infecciones agudas y crónicas, particularmente en dermatología, oftalmología, urología, estomatología, pediatría, otorrinolaringología o cirugía. Sin embargo, ese concepto del uso terapéutico de fagos para tratar infecciones bacte rianas ha sido muy controvertido desde el principio y no ha sido aceptado ampliamente públicamente o por la comu nidad médica. Los primeros estudios fueron ampliamente criticados por la falta de controles apropiados y resultados inconsistentes. La falta de reproducibilidad y muchos resultados contradictorios obtenidos en los diversos estudios publicados llevaron al Consejo de Farmacia y Química de la Asociación Médica Estadounidense a concluir que la evidencia del valor terapéutico de los filtrados líticos era en su mayor parte contradictoria, poco convincente y reco mendaba investigaciones adicionales para confirmar sus supuestos beneficios.

Desde la introducción de los antibióticos en la década de 1940, se ha prestado poca atención a ese campo de la terapéutica, especialmente en el mundo occidental. Pero el uso extensivo de antibióticos ha llevado a la aparición y la propagación generalizada de bacterias resistentes a los antibióticos por todo el mundo, causando problemas cada vez más graves. Por lo tanto, se ha convertido en un gran desafío terapéutico, superar las opciones terapéuticas limitadas que permanecen para tratar los principales microbios resistentes a múltiples fármacos.

Desde su descubrimiento inicial a fines del siglo XIX (Fordos 1859), la bacteria Gram-negativa Pseudomonas aeruginosa ha ganado un lugar notorio en la lista de agentes patógenos humanos malignos (Williams y otros, 1894, Freeman y otros, 1916). La llegada de la era de los antibióticos palió en gran medida el desenlace fatal de las infecciones agudas en pacientes sanos. Solo se ha logrado una mejora relativa en la erradicación de las infecciones crónicas, que se desarrollan principalmente en individuos que padecen fibrosis quística o quemaduras graves o que están inmunocomprometidos (Gang et al., 1999, Jones et al., 2010). Dos factores intrínsecamente relacionados en una terminación fatal de la infección en esos pacientes, son la prescripción rápida de tratamientos antibióticos inadecuados y el desarrollo o adquisición de cepas multirresistentes. Si bien se ha informado que el uso de un (unos) antibiótico(s) apropiado(s) es un factor esencial en la erradicación de infecciones con P. aeruginosa (Kang et al., 2005, Micek et al., 2005), por el contrario, el abuso de antibióticos contribuye significativamente a aumentar la resistencia al ejercerse una presión selectiva continua para la adquisición de tales capacidades. Los antibióticos por sí solos no explican la alta prevalencia de variantes multirresistentes: P. aeruginosa tiene múltiples mecanismos intrínsecos de resistencia codificados cromosómicamente, incluyendo la baja permeabilidad de la envuelta celular y numerosas bombas de salida de múltiples fármacos. Otro factor importante que explica el exitoso comportamiento invasivo y la persistencia de esa bacteria es su alta adaptabilidad, lo que permite una rápida colonización de diferentes entornos.

Además, las bacterias patógenas como P. aeruginosa son capaces de formar biopelículas, que contribuyen a su mayor resistencia frente a los antibióticos. Esas biopelículas pueden comprender más de un tipo de bacterias sostenidas y rodeadas por una matriz extracelular excretada y que ayudan a las bacterias a colonizar diversas superficies. Las biopelículas permiten que las bacterias se fijen sobre las superficies y alcancen densidades de población que de otro modo serían intolerables, impartiendo una mayor resistencia no solo frente a los antibióticos, sino también frente a muchas tensiones ambientales, incluidas toxinas tales como metales pesados, blanqueadores y otros agentes de limpieza. Se sabe que las bacterias dentro de las biopelículas pueden ser de 100 a 1000 veces más resistentes a los antibióticos que la misma cepa de bacterias que crece en formas planctónicas. Ese aumento de la resistencia significa que las bacterias que aparentemente son sensibles a los antibióticos en una prueba de laboratorio, pueden ser resis tentes a la terapia en un entorno clínico. Incluso si algunas se eliminan, las biopelículas pueden proporcionar reservorios resistentes que permiten una rápida colonización una vez que los antibióticos ya no están presentes. Por lo tanto, es obvio que las biopelículas son factores importantes en muchas enfermedades humanas. Los tratamientos químicos no son adecuados para un uso contra las biopelículas, ya que precisamente éstas han evolucionado para contrarres tarlos. La abrasión física proporciona un medio para romper las biopelículas. Desafortunadamente, muchas superficies sobre las que las biopelículas favorecen la patogenia bacteriana, no se adaptan bien a una abrasión rigurosa, es decir, huesos, articulaciones, dispositivos médicos implantados, etc. Por ejemplo, las superficies de heridas o quemaduras son extremadamente sensibles y delicadas. Incluso cuando la abrasión es adecuada y en un uso rutinario, la elimina ción de biopelículas es limitada. La placa bucal sobre la superficie de los dientes es una biopelícula y se elimina parcialmente con un cepillado regular. Sin embargo, las bacterias se mantienen sobre las superficies sin cepillar (por ejemplo, en los espacios entre los dientes) y pueden recolonizar las superficies limpias de forma rápida y eficaz. A partir de esto, está claro que los enfoques existentes para eliminar las biopelículas tienen una eficacia limitada.

La capacidad para una rápida adaptación y su capacidad para formar biopelículas son las principales razones que identifican a P. aeruginosa como agentes patógenos oportunistas. Han adquirido el estatus de agentes patógenos hospitalarios y pueden aislarse a partir de muestras clínicas extraídas de heridas, esputo, vejiga, uretra, vagina, oídos, ojos y vías respiratorias. La aparición de una resistencia frente a los nuevos antibióticos más potentes en tales cepas de P. aeruginosa, que ocurre incluso durante un tratamiento, hace que la lucha con los agentes patógenos hospitala rios de P. aeruginosa sea un gran problema.

Por lo tanto, existe una gran necesidad de nuevos agentes o composiciones antibacterianas que puedan usarse para destruir las cepas de P. aeruginosa, incluso cuando se organizan en forma de biopelículas bacterianas, adecuados para uso en la terapia humana o animal, así como para la descontaminación de materiales.

Los genomas de bacteriófagos se han descrito en la técnica anterior: el fago SN con el número de registro de EMBL FM887021; el fago 14-1 con el número de registro de EBI FM897211; el fago JG024 con el número de registro de Genbank GU815091; el fago NH-4 con el número de registro de EMBL JN254800; el fago KPP12 con el número de registro de EMBL AB560486; el fago LMA2 con el número de registro de EMBL FM201282; el fago LBL3 con el número de registro de EBI FM201281; el fago LUZ24 con el número de registro de EMBL AM910650; el fago phiIBB-PAA2 con el número de registro de EBI KF856712; así como otros fagos en el documento PCT/EP2014/072905. Un cóctel de bacteriófagos se describe en Wright et al., Clinical Otolaryngology and Allied Sciences, 2009, 34: 349-357; Weiling et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2010, 54(1): 397-404; Reardon, Nature, 2014, 510(7503): 15-16; y Alemayehu et al., Mbio, 2012,3(2): e00029-12.

Compendio de la invención

Los inventores han aislado y caracterizado nuevos bacteriófagos que presentan una actividad lítica fuerte y específica hacia cepas de Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Esos bacteriófagos, especialmente en combinaciones, brin dan un efecto antibacteriano muy potente y pueden usarse como agentes activos en preparaciones farmacéuticas o veterinarias, particularmente para tratar infecciones bacterianas con P. aeruginosa.

Un objeto de la invención es proporcionar composiciones antibacterianas que comprenden al menos dos bacteriófagos que tienen actividad lítica contra una cepa de Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), tal y como se definen en las reivindicaciones.

Otro objeto de la invención se refiere a un bacteriófago que tiene actividad lítica frente a una cepa de Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) y que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir de una cualquiera de SEQ ID NOs: 2 a 7 o una secuencia que tiene al menos un 97% de identidad con la misma.

Los bacteriófagos de la invención muestran una fuerte actividad lítica frente a cepas resistentes a múltiples fármacos de P. aeruginosa, en particular cepas patógenas resistentes a antibióticos tales como las cepas resistentes a la cefalosporinasa, las carbenicilinasas, la carbapenemasa y/o las ^-lactamasas de espectro amplio, y por lo tanto son parti cularmente adecuadas y ventajosas para tratar infecciones bacterianas.

La invención se refiere además a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir de una cualquiera de SEQ ID NOs: 2 a 7 o una secuencia que tiene al menos un 97% de identidad con la misma.

Otro objeto de la invención es una composición que comprende un ácido nucleico como se ha definido anteriormente.

Las composiciones de la invención normalmente comprenden además un excipiente o un vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable. Pueden ser líquidas, semilíquidas, sólidas o estar liofilizadas.

Otro objeto de la invención se refiere a un bacteriófago, un ácido nucleico o una composición tal y como se han definido anteriormente, para uso en el tratamiento de una infección en un mamífero, para modificar la flora microbiana en un mamífero o para descontaminar un material.

La invención también se refiere a u un bacteriófago, un ácido nucleico o una composición tal y como se han definido anteriormente, para uso para mejorar el estado de un sujeto modificando la flora microbiana en dicho sujeto. La flora microbiana puede modificarse corrigiendo, adaptando o restableciendo un equilibrio adecuado de los microorganismos en dicha flora.

La invención también describe un método para tratar una infección en un mamífero, que comprende la administración a dicho mamífero de al menos un bacteriófago, un ácido nucleico o una composición tal y como se han definido anteriormente.

La invención también describe un método para tratar una superficie o un material sospechoso de estar contaminado con una bacteria P. aeruginosa, que comprende aplicar a dicha superficie o material al menos un bacteriófago, un ácido nucleico o una composición tal y como se han definido anteriormente. La superficie o el material puede ser una superficie de cualquier dispositivo, recipiente o material de laboratorio, tela, etc.

La invención describe además un kit que comprende una composición tal y como se ha definido anteriormente y un medio para aplicar la misma a un sujeto o una superficie.

La invención se puede utilizar en cualquier mamífero, preferentemente en seres humanos, o para tratar cualquier material, incluidos materiales de laboratorio o dispositivos médicos.

Breve descripción de los dibujos

Fig.1: Eficacia del bacteriófago 1384 sobre la cepa PAO1

Fig.2: Eficacia del bacteriófago 1777 sobre la cepa PAO1

Fig.3: Eficacia del bacteriófago 1792 sobre la cepa PAO1

Fig.4: Eficacia del bacteriófago 1797 sobre la cepa PAO1

Fig.5: Eficacia del bacteriófago 1800 sobre la cepa PAO1

Fig.6: Eficacia del bacteriófago 1902 sobre la cepa PAO1

Fig.7: Eficacia del cóctel de bacteriófagos sobre la cepa PAO1

Fig.8: Eficacia del cóctel de bacteriófagos sobre la cepa CF1

Fig.9: Eficacia del cóctel de bacteriófagos sobre la cepa CF2

Fig.10: Eficacia del cóctel de bacteriófagos sobre la cepa CF3

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a nuevos bacteriófagos, a componentes de los mismos, a composiciones que los comprenden, a su preparación y a los usos de los mismos como agentes antibacterianos, particularmente para el tratamiento de una infección en un mamífero o para mejorar el estado de un sujeto modificando la flora microbiana en dicho sujeto.

Definiciones

Para facilitar la comprensión de la invención, a continuación se define una serie de términos.

Tal y como se usa en este documento, el término "bacteriófago" o "fago" se refiere a una partícula de fago funcional que comprende un genoma de ácido nucleico empaquetado en una envuelta o cápside proteica. El término también se refiere a porciones del bacteriófago, que incluyen, por ejemplo, una porción de la cabeza o un conjunto de compo nentes del fago, que proporcionan sustancialmente la misma actividad funcional.

La expresión "característica fenotípica"designa más preferiblemente la morfología y/o la variedad de hospedadores de un bacteriófago. Los métodos para realizar el fenotipo de bacteriófagos son bien conocidos de por sí en parte e incluyen, por ejemplo, determinar la variedad de hospedadores bacterianos y/o la actividad contra la biopelícula pro ducida por ciertas cepas bacterianas.

La expresión "actividad lítica" tal y como se usa en la invención, designa la propiedad de un bacteriófago para provocar la lisis de una célula bacteriana. La actividad lítica de un bacteriófago puede someterse a ensayo en cepas de P. aeruginosa según métodos conocidos de por sí en la técnica (véase también la sección experimental).

El término "variante" de un bacteriófago de referencia designa un bacteriófago que tiene variación(es) en la secuencia genómica y/o en los polipéptido(s) codificado(s), en comparación con dicho bacteriófago de referencia, mientras con serva la misma característica fenotípica que el bacteriófago de referencia. Las variantes normalmente comprenden, por ejemplo, mutaciones silenciosas, mutaciones conservadoras, deleciones menores y/o replicaciones menores de material genético, y conservan las características fenotípicas del bacteriófago de referencia. En una realización prefe rida, las variantes según la invención conservan cualquier característica o propiedad observable que dependa del genoma del bacteriófago de la invención, es decir, características fenotípicas de dicho bacteriófago y/o actividad lítica frente a cepas de P. aeruginosa. Las variantes preferidas tienen menos de un 5% de variación en el ácido nucleico, en comparación con el genoma del bacteriófago de referencia, incluso más preferiblemente menos de un 4%, más preferiblemente menos de un 2%. Alternativamente, o en combinación, las variantes tienen preferiblemente menos de un 5% de variación de aminoácidos en una secuencia polipeptídica codificada, en comparación con un polipéptido del bacteriófago de referencia.

La expresión "cepa ESBL de P. aeruginosa" se refiere a cefalosporinasa y/o ^-lactamasas de espectro amplio que producen cepas de P. aeruginosa, incluidas varias formas de resistencia a los antibióticos como ^-lactamasa AmpC o ^-lactamasas hidrolizantes de carbenicilina de Clase A, etc.

El término "específico” o "especificidad" en relación con un bacteriófago se refiere al tipo de hospedador que dicho bacteriófago es capaz de infectar. Un bacteriófago "específico"de P. aeruginosa indica más preferentemente un bac teriófago que puede infectar una o varias cepas de P. aeruginosa y que no puede infectar una bacteria que no es P. aeruginosa en condiciones fisiológicas.

Tal y como se usa en este documento, el término "polipéptido" se refiere a polipéptidos de cualquier tamaño, incluidos péptidos pequeños, por ejemplo, de 5 a 20 aminoácidos, polipéptidos más largos, proteínas o fragmentos de los mis mos.

El término "PLE"o "efecto lítico productivo"designa la relación entre el tamaño del estallido y el tiempo de lisis pro ductiva de un bacteriófago dado. El tamaño del estallido y el tiempo productivo de lisis son parámetros que definen la interacción fago-hospedador y corresponden, respectivamente, al rendimiento medio de las partículas de bacteriófago producidas por la infección de una bacteria a través de un fago, y al tiempo que tarda un bacteriófago libre en lisar una célula bacteriana.

En el contexto de la presente memoria descriptiva, la expresión "bacteriófago aislado"debe considerarse que significa un bacteriófago extraído de su entorno natural y/o separado de un componente de su entorno natural. La expresión indica, en particular, un fago que se cultiva, por ejemplo, in vitro, se purifica y/o se formula con cualquier diluyente o excipiente adecuado. En relación con un ácido nucleico o polipéptido, el término "aislado" designa, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico o un polipéptido que se separa de al menos un componente de su entorno natural, como por ejemplo, una proteína, un lípido y/o un ácido nucleico.

La expresión "farmacéutica o veterinariamente aceptable"tal y como se usa en este documento, se refiere a cualquier material (por ejemplo, vehículo, excipiente o diluyente) que sea compatible para uso en un sujeto mamífero. Esto incluye soluciones o vehículos fisiológicamente aceptables que son inocuos o no provocan ninguna reacción inmunitaria significativa específica o no específica en un organismo, o no anulan la actividad biológica del compuesto activo. Para la formulación de la composición en forma de una preparación líquida, se puede usar solución salina, agua estéril, solución de Ringer, solución salina fisiológica tamponada, solución de infusión de albúmina, solución de dextrosa, solución de maltodextrina, glicerol, etanol y mezclas de los mismos como excipiente o vehículo farmacéutica o veteri nariamente aceptable. Si es necesario, se pueden añadir otros aditivos convencionales como agentes espesantes, diluyentes, tampones, conservantes, tensioactivos, antioxidantes y bacteriostáticos. Además, se puede añadir adicio nalmente a la composición diluyentes, dispersantes, tensioactivos, aglutinantes y lubricantes para preparar formula ciones inyectables, tales como soluciones acuosas, suspensiones y emulsiones, formulaciones orales tales como píl doras, cápsulas, gránulos o comprimidos, o formulaciones en polvo.

Tal y como se usa en este documento, "UFP" significa unidad formadora de placa, como bien se define en la técnica. Los bacteriófagos líticos lisan la célula hospedadora, provocando una zona de aclaramiento (o placa) sobre una placa de cultivo. En teoría, cada placa está formada por un fago y el número de placas multiplicado por el factor de dilución es igual al número total de fagos en una preparación de un ensayo.

El término "tratamiento" o "terapia" designa un tratamiento curativo o profiláctico de una enfermedad. Un tratamiento curativo se define como un tratamiento que da como resultado la cura de una enfermedad, o un tratamiento que alivia, reduce, estabiliza o elimina los síntomas de una enfermedad o el sufrimiento que causa, directa o indirectamente, o que mejora el estado de un sujeto o reduce la progresión de una enfermedad. Un tratamiento profiláctico comprende un tratamiento que tiene como resultado la prevención de una enfermedad y/o un tratamiento que reduce y/o retrasa la incidencia de una enfermedad o el riesgo de que ocurra.

El término "biopelícula" tal y como se usa en este documento, designa una formación bacteriana heterogénea que crece sobre diversas superficies; preferiblemente una comunidad bacteriana que crece incluida en una matriz de exopolisacárido adherida sobre superficies sólidas biológicas o no biológicas.

El término "vulnerar" tal y como se usa en este documento, se refiere a cualquier alteración de la integridad. Por vulneración de una biopelícula bacteriana, se entiende una penetración en la biopelícula por medio de bacteriófagos, una infección de las bacterias asociadas a una biopelícula y/o una lisis de las mismas y/o una desaparición parcial o total de la biopelícula (es decir, al detener la colonización y/o al alterar las biopelículas).

El término "muestra", tal y como se usa en este documento, significa cualquier muestra que contenga células. Los ejemplos de esas muestras incluyen fluidos corporales tales como sangre, plasma, saliva u orina, así como biopsias, órganos, tejidos o muestras de células. La muestra se puede tratar antes de su uso.

Tal y como se usa en este documento, el término "sujeto" o "paciente" se refiere a un animal, preferentemente un mamífero, incluso más preferentemente un ser humano, incluidos adultos y niños. El término "sujeto" también incluye animales no humanos, en particular mamíferos no humanos tales como mascotas (por ejemplo, perros, gatos), caba llos, vacas, cabras, cerdos, ovejas y primates no humanos, entre otros.

El término "eficacia" de un tratamiento o "respuesta" frente a una terapia con bacteriófagos, tal y como se usa en este documento, se refiere a un tratamiento que da como resultado una disminución en el número de cepas de P. aeruginosa en un sujeto después de un tratamiento con bacteriófagos, en comparación con el número de cepas de P. aeruginosa antes del tratamiento. Un sujeto “que responde bien” se refiere a un sujeto que muestra o mostrará una recu peración clínicamente significativa cuando se trata con una terapia con bacteriófagos.

El término "cóctel' de bacteriófagos designa una combinación de diferentes tipos de bacteriófagos. Los bacteriófagos en un cóctel se formulan preferiblemente juntos en un mismo recipiente o envase, aunque se pueden usar como kits de partes en los que algunos de los bacteriófagos se formulan o envasan por separado y se combinan cuando se usan o administran.

Descripción de las realizaciones

La presente invención se refiere a nuevas terapias con bacteriófagos. Más particularmente, la presente invención se refiere a nuevos bacteriófagos que tienen una especificidad elevada contra cepas de Pseudomonas aeruginosa, a su preparación, a componentes de los mismos, a composiciones que los comprenden y a usos de los mismos en fagoterapia.

Bacteriófagos:

En un primer aspecto, la invención describe el aislamiento y la caracterización de nuevos bacteriófagos que son es pecíficos para cepas de P. aeruginosa y presentan, ya sea solos o en combinación(es), un notable espectro de varie dad de hospedadores con actividad lítica. Esos bacteriófagos se han seleccionado a partir de muestras ambientales, se han aislado, secuenciado y caracterizado. Son, individualmente y en combinación(es), activos contra cepas de P. aeruginosa. Son notablemente efectivos contra cepas patógenas de P. aeruginosa, incluidas las cepas de P. aerugi nosa resistentes a los antibióticos, tales como una cepa ESBL de P. aeruginosa. Además, los bacteriófagos de la invención tienen un notable efecto lítico productivo ("PLE") comprendido entre 1 y 7. Además, los bacteriófagos de la invención son específicos para cepas de P. aeruginosa, es decir, no causan la lisis de bacterias que no son P. aeru ginosa. Como se ilustrará más adelante, la invención muestra que esos bacteriófagos se pueden combinar y formular en condiciones adecuadas para un uso como agentes farmacéuticos o veterinarios para mostrar un efecto antibacte riano dirigido y muy potente contra un espectro controlado de cepas de P. aeruginosa.

Más específicamente, se han aislado los siguientes bacteriófagos. También se indica su secuencia de ácido nucleico correspondiente.

Tabla 1

El perfil lítico de esos bacteriófagos se ha determinado en un amplio número de cepas de P. aeruginosa. Estos bac teriófagos han sido seleccionados por su potencia y potencial de combinación, como se describe en la siguiente tabla. En esa tabla se presenta el efecto lítico de los bacteriófagos sobre las cepas de referencia y las resistentes a agentes patógenos, confirmando su alto potencial lítico.

Tabla 2

pm: lisis parcial

Como se puede observar en la tabla 2, se pueden producir combinaciones (o cócteles) de esos bacteriófagos que pueden destruir todas las cepas de P. aeruginosa analizadas, produciendo así composiciones antibacterianas de am plio espectro. Como ejemplo ilustrativo, un cóctel de los 7 bacteriófagos puede destruir todas las bacterias analizadas.

Además, la especificidad de los bacteriófagos se ha sometido a ensayo en muchas cepas que no son P. aeruginosa. Más particularmente, la sección experimental demuestra que los bacteriófagos de la invención no tienen un efecto lítico sobre ninguna bacteria seleccionada entre Escherichia coli, Acinetobacter baumanii, Enterobacter aerogenes, Enterobacter asburiae, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Staphylococcus aureus, Stenotrophomonas maltophila y Serratia marcescens. Esos bacteriófagos, solos o combinados, representan por tanto agentes potentes para el tratamiento de infecciones con P. aeruginosa.

Por tanto, un objeto particular de la invención reside en un bacteriófago que tiene actividad lítica frente a una cepa de P. aeruginosa y que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir de una cualquiera de SEQ ID NOs: 2 a 7 o una secuencia que tiene al menos un 97% de identidad con la misma, preferible mente al menos un 98% o un 99% de identidad con la misma.

Los bacteriófagos de la invención se pueden cultivar, multiplicar, aislar, purificar y usar, por ejemplo, en una terapia con fagos para trastornos mediados con P. aeruginosa, como se describirá con más detalle a continuación. Además, las variantes de esos bacteriófagos que conservan un fenotipo (p. ej., especificidad y actividad lítica) de los bacterió fagos, pueden producirse y/o aislarse mediante métodos conocidos de por sí en la técnica.

Los bacteriófagos de la invención se pueden preparar mediante métodos estándar de cultivo, aislamiento y purifica ción. Por ejemplo, las bacterias productoras de P. aeruginosa se cultivan, se infectan con una muestra de un bacte riófago y luego se tratan para eliminar las células bacterianas y los desechos. La solución de bacteriófagos enriquecida se puede sembrar en placas en un medio, por ejemplo medio agar, con cepas de P. aeruginosa hospedadoras sus ceptibles de ser insertadas para obtener placas. Luego, se puede seleccionar una sola placa para la posterior purifi cación y amplificación de los bacteriófagos. Se pueden realizar uno o más ciclos de amplificación selectiva de los bacteriófagos de la invención, por ejemplo, mezclando los bacteriófagos con las P. aeruginosa competentes, seguido de la adición de un medio de crecimiento y la incubación en condiciones de crecimiento seleccionadas para la prueba. Después de la centrifugación, el material sobrenadante amplificado del aclaramiento se filtra a través de un filtro y se somete a otro ciclo de amplificación selectiva o se analiza para determinar la presencia de actividad lítica.

El título de fagos en una suspensión y la visualización de la morfología de las placas de bacteriófagos de la invención pueden evaluarse luego mediante métodos conocidos, por ejemplo, mediante recuento de placas. Además, el proce samiento de los bacteriófagos de la invención en diversas formas (líquida, liofilizada, etc.) para almacenamiento a corto, largo plazo, congelación o cualquier otro tipo de almacenamiento, puede llevarse a cabo mediante cualquier método adecuado como es bien conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Clark, 1962).

La actividad de los bacteriófagos de la invención puede evaluarse mediante métodos bien conocidos en la técnica, tales como el ensayo de placas, también conocido como método de doble agar, basado en el cultivo de bacteriófagos con bacterias hospedadoras potenciales y seguido de la evaluación de su capacidad para destruir la célula bacteriana hospedadora. En el método de ensayo de placas, el bacteriófago induce la lisis de las cepas diana de P. aeruginosa después de un período de incubación en medio de agar blando, lo que da como resultado zonas de aclaramiento sobre la placa conocidas como placas.

Ácidos nucleicos

La invención describe un ácido nucleico contenido en un bacteriófago de la invención, o cualquier fragmento de ese ácido nucleico. El término fragmento designa, más preferentemente, un fragmento que contiene (o consiste en) un marco de lectura abierto. El ácido nucleico puede ser ADN o ARN, monocatenario o bicatenario.

El ácido nucleico se puede aislar desde los bacteriófagos depositados, o producirse usando tecnología de ADN re combinante (p. ej., amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), clonación), síntesis enzimática o química, o combinaciones de las mismas, de acuerdo con métodos generales conocidos de por sí en la técnica. También se incluyen secuencias homólogas y fragmentos de las mismas que incluyen, pero no se limitan a, variantes alélicas naturales y secuencias de ácido nucleico modificadas en las que se han insertado, delecionado, sustituido y/o invertido nucleótidos.

En una realización particular, la invención se refiere a un ácido nucleico que comprende una secuencia seleccionada a partir de una cualquiera de SEQ ID NOs: 2-7, o una secuencia que tiene al menos 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con una cualquiera de SEQ ID NOs: 2-7.

El ácido nucleico de la invención puede estar en forma libre o clonado en un vector, tal como un plásmido, un vector vírico, una casete de expresión, un cósmido, etc.

Composiciones de la invención

Un aspecto de la invención se refiere a composiciones que comprenden al menos un bacteriófago como se ha descrito anteriormente, más preferiblemente al menos 2 o más y, opcionalmente, un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico o veterinario. Como se ha descrito, los bacteriófagos de la invención tienen una actividad lítica muy potente contra las cepas de P. aeruginosa. Se pueden producir combinaciones de esos bacteriófagos para ampliar el espectro del hospedador y producir composiciones antibacterianas muy eficaces.

Más particularmente, la invención se refiere a una composición antibacteriana que comprende al menos dos bacterió fagos que tienen actividad lítica contra una cepa de Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), seleccionándose di chos al menos dos bacteriófagos entre los bacteriófagos que tienen un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos procedente de una cualquiera de SEQ ID NOs: 1 a 7 o una secuencia que tiene al menos un 97% de identidad con SEQ ID NOs: 2 a 7.

En una realización preferida, las composiciones de la invención comprenden al menos tres, incluso más preferible mente al menos cuatro bacteriófagos distintos, seleccionados a partir de los bacteriófagos que tienen un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 1 a 7 o una secuencia que tiene al menos al menos 97% de identidad con SEQ ID NOs: 2 a 7. Las composiciones particulares de la invención comprenden al menos un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 o 4, o una secuencia que tiene al menos 97% de identidad con la misma.

Ejemplos específicos de composiciones de la invención comprenden:

- un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 o una secuencia que tiene al menos un 97% de identidad con la misma;

- un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4 o una secuencia que tiene al menos un 97% de identidad con la misma;

- un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5 o una secuencia que tiene al menos un 97% de identidad con la misma;

- un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 o una secuencia que tiene al menos un 97% de identidad con la misma, y un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4 o una secuencia que tiene al menos un 97% identidad con la misma;

- un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 o una secuencia que tiene al menos un 97% de identidad con la misma, y un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5 o una secuencia que tiene al menos un 97% identidad con la misma;

- un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 o una secuencia que tiene al menos un 97% de identidad con la misma, y un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4 o una secuencia que tiene al menos un 97% de identidad con la misma;

- un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 o una secuencia que tiene al menos un 97% de identidad con la misma, y un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4 o una secuencia que tiene al menos un 97% de identidad con la misma, y un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleó tidos de SEQ ID NO: 5 o una secuencia que tiene al menos un 97% de identidad con la misma.

En una realización preferida, las composiciones de la invención comprenden al menos:

- un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1;

- un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o una secuencia que tiene al menos un 97% de identidad con la misma;

- un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 o una secuencia que tiene al menos un 97% de identidad con la misma;

- un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4 o una secuencia que tiene al menos un 97% de identidad con la misma;

- un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5 o una secuencia que tiene al menos un 97% de identidad con la misma;

- un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 6 o una secuencia que tiene al menos un 97% de identidad con la misma; y

- un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7 o una secuencia que tiene al menos un 97% de identidad con la misma.

Las composiciones de la invención pueden comprender además agentes antibacterianos adicionales, en particular otros bacteriófagos que tienen una especificidad de hospedador diferente.

Las composiciones más preferidas de la invención son líticas frente a más del 85% de todas las cepas bacterianas de la colección LMG, obtenidas a partir de la colección de bacterias BCCM/LMG. Esa colección contiene un gran número de cepas con una alta diversidad genética entre las especies bacterianas.

Las composiciones de la invención pueden comprender cualquier cantidad eficaz del o de los bacteriófagos seleccio nados. Preferiblemente, comprenden entre 10e4 y 10e12 UFP de cada uno de dichos bacteriófagos, preferentemente entre 10e5 y 10e10 UFP. Las cantidades relativas de cada tipo de bacteriófago en una composición de la invención pueden ser ajustadas por un experto en la materia. Típicamente, cuando la composición antibacteriana comprende varios (n) bacteriófagos distintos, como se han definido anteriormente, el % de A de la cantidad relativa total de cada bacteriófago en la composición es más preferiblemente % de A= (100/ni)xV, en donde ni representa el número de tipos distintos de bacteriófagos y V es un factor de variabilidad comprendido entre 0,2 y 5. Lo más preferiblemente, V está comprendido entre 0,3 y 3, incluso más preferiblemente entre 0,5 y 2, generalmente entre 0,8 y 1,5. En una realización típica preferida, cada tipo de bacteriófago está presente en una composición de la invención en cantidades relativas aproximadamente iguales.

Las composiciones antibacterianas de la invención pueden estar en diversas formas, tales como formulaciones líqui das, semilíquidas, sólidas o liofilizadas. Las composiciones de la invención comprenden preferiblemente un diluyente o un vehículo adecuado, tal como un excipiente o un vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable. Las compo siciones según la presente invención pueden incluir cualquier excipiente o vehículo, tales como agentes espesantes, diluyentes, tampones, conservantes, tensioactivos y similares, además del o de los bacteriófagos seleccionados. Eso incluye soluciones o vehículos fisiológicamente aceptables que son inofensivos o que no provocan ninguna reacción inmunitaria significativa específica o no específica en un organismo o que no anulan la actividad biológica del bacte riófago. Para la formulación líquida, se puede usar solución salina, agua estéril, solución de Ringer, solución salina fisiológica tamponada, solución de infusión de albúmina, solución de dextrosa, solución de maltodextrina, glicerol, etanol y mezclas de las mismas como excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable. Si es apro piado, se pueden añadir otros aditivos convencionales tales como agentes espesantes, diluyentes, tampones, conser vantes, tensioactivos, antioxidantes y bacteriostáticos. Además, se pueden añadir adicionalmente a la composición diluyentes, dispersantes, tensioactivos, aglutinantes y lubricantes para preparar formulaciones inyectables tales como soluciones acuosas, suspensiones y emulsiones, formulaciones orales tales como píldoras, cápsulas, gránulos o com primidos, o formulaciones en polvo. Las formulaciones para administración tópica pueden incluir tiritas, apósitos, par ches, películas, ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aerosoles, tampones, toallas higiénicas, lí quidos y polvos. Las formulaciones para descontaminar o para uso médico también pueden incluir aerosoles o esprays.

Las composiciones de la invención se pueden usar en el campo de la medicina, incluidas las áreas de medicina humana o veterinaria, p. ej., el tratamiento de una infección en un mamífero o para mejorar el estado de un sujeto. Las composiciones se pueden usar para destruir bacterias de P. aeruginosa en un organismo, para el tratamiento de una infección. La composición también se puede usar para mejorar el estado de un mamífero modificando la flora micro biana en dicho mamífero. En particular, las composiciones de la invención pueden eliminar específicamente cepas de P. aeruginosa sobre la piel o las membranas mucosas de un mamífero, modificando de ese modo su flora micro biana y restableciendo un equilibrio adecuado.

En una realización particular, la invención también describe un método para tratar una infección en un mamífero que comprende la administración a dicho mamífero de una composición o un bacteriófago o un ácido nucleico o un polipéptido como se ha definido anteriormente.

La invención también se refiere al uso de una composición, un bacteriófago, un ácido nucleico o tal y como se describe para la preparación de un medicamento para tratar una infección en un mamífero, o para restaurar la flora microbiana en dicho mamífero.

Las composiciones de la invención se pueden usar para tratar varias infecciones mediadas por P. aeruginosa, parti cularmente del sistema respiratorio. El número de pacientes con neumonía llegó hasta 2 a 3 millones en EE.UU. y de 3 a 4 millones en Europa en el año 2013. Pseudomonas aeruginosa es uno de los principales agentes microbiológicos responsables de la patología, especialmente en la población infantil y anciana, así como en pacientes inmunocomprometidos, con fibrosis quística, fuertemente quemados y politraumatizados. Aunque las fuentes epidemiológicas fluc túan y hay un aumento reciente de las infecciones con bacterias Gram-negativas (incluyendo P. aeruginosa), las esti maciones para 2014 indican que al menos el 15% de las neumonías están causadas por P. aeruginosa (por ejemplo, 15,9% según el ECDC Annual Surveillance Report - 2013). Desde un punto de vista conservador, alrededor del 20% de esos gérmenes son resistentes a varios o a todos los antibióticos de nuestro arsenal terapéutico (sorprendente mente, el mayor número de casos resistentes se observa en la unidad de cuidados intensivos). Como consecuencia, las cifras estimadas indican que al menos 90.000 casos de neumonía en EE.UU. y 120.000 en Europa están inducidos por cepas bacterianas de P. aeruginosa multirresistentes a antibióticos. Por lo tanto, la invención es particularmente adecuada para tratar la neumonía asociada con, o causada por, una infección con P. aeruginosa. Por tanto, un objeto de la invención reside en un método para tratar la neumonía en un sujeto que lo requiere, que comprende administrar una composición de la invención a dicho sujeto. El método es particularmente adecuado para el tratamiento de una neumonía inducida por bacterias de P. aeruginosa resistentes a antibióticos. El sujeto puede ser cualquier sujeto hu mano, como niños, adultos o ancianos.

Las composiciones de la invención pueden administrarse por cualquier vía conveniente, incluidas la vía intravenosa, oral, transdérmica, subcutánea, mucosa, intramuscular, intrapulmonar, intranasal, parenteral, rectal, vaginal y tópica. En una realización preferida, los bacteriófagos o las composiciones se administran mediante instilación intrapulmonar o intranasal. Las composiciones se pueden administrar directa o indirectamente, por ejemplo, a través de un soporte. A este respecto, las composiciones, por ejemplo, pueden aplicarse o pulverizarse sobre la zona afectada. Las compo siciones de la invención también se pueden administrar por vía oral o parenteral. El experto en la materia puede ajustar la dosificación adecuada para aplicar, rociar o administrar las composiciones de la presente invención, dependiendo de una variedad de factores que incluyen la formulación, el modo de administración, la edad, el peso, el sexo, el estado y la dieta del mamífero que se está tratando en el momento de la administración, la vía de administración y la sensibi lidad de la reacción. Un médico con conocimientos ordinarios en la técnica puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad eficaz de la composición requerida.

El experto en la materia también puede ajustar la dosificación para que se obtenga una actividad lítica frente a cepas de P. aeruginosa resistentes a antibióticos. Una dosis eficaz para obtener una actividad lítica in vivo incluye normal mente una concentración de al menos 10e4 UFP/ml, preferiblemente desde aproximadamente 10e2 a 10e12 UFP/ml, según la vía de administración.

Como se muestra en la sección experimental, los bacteriófagos y las composiciones de la invención pueden destruir selectivamente las bacterias de P. aeruginosa in vitro o in vivo. Las composiciones pueden destruir mezclas de dife rentes bacterias de P. aeruginosa, incluso in vivo, incluso con dosificaciones bajas. Además, las composiciones de la invención son efectivas para destruir bacterias incluidas en biopelículas, lo que es particularmente importante para las bacterias patógenas. Además, las composiciones y los bacteriófagos de la invención son estrictamente incapaces de afectar a las células de mamíferos y, por lo tanto, son específicos y carecen de efectos secundarios in vivo.

La invención también se refiere al uso de una composición, un bacteriófago, un ácido nucleico o un polipéptido de la invención para descontaminar un material. Debido a su potente efecto antibacteriano y a su capacidad para incluso vulnerar la integridad de una biopelícula bacteriana, las composiciones de la invención pueden usarse como agentes descontaminantes, para eliminar o al menos provocar una reducción en el número de bacterias sobre un material. Estos métodos pueden aplicarse para el tratamiento de una variedad de superficies biológicas o no biológicas en contextos médicos y no médicos, incluyendo materiales sólidos o dispositivos como, por ejemplo, lentes de contacto, superficies de dispositivos que se van a implantar en el cuerpo, tuberías, conductos, recipientes de laboratorio, textiles, etc.

Ensayos diagnósticos/predictivos de la invención:

La invención también describe un método para predecir o determinar la eficacia de una terapia con bacteriófagos en un sujeto, en donde el método comprende una etapa para determinar la actividad lítica de uno o más bacteriófagos de la invención frente a una cepa de P. aeruginosa procedente de una muestra de dicho sujeto, siendo dicha actividad lítica indicativa de un tratamiento eficaz. En un aspecto preferido, el método comprende además opcionalmente una etapa de tratar a dicho sujeto con uno o más bacteriófagos que tienen una actividad lítica sobre una cepa de P. aeruginosa procedente de una muestra de dicho sujeto.

En otro aspecto, la invención describe un método para seleccionar un sujeto o determinar si un sujeto es susceptible de beneficiarse de una terapia con bacteriófagos, en donde el método comprende la etapa de determinar la actividad lítica de uno o más bacteriófagos de la invención frente a una cepa de P. aeruginosa procedente de una muestra de dicho sujeto, en donde una actividad lítica de uno o más bacteriófagos de la invención frente al menos una cepa de P. aeruginosa indica un sujeto respondedor.

Otro objeto de la invención describe un método para predecir la respuesta de un sujeto frente a una terapia con bacteriófagos, en donde el método comprende la etapa de determinar la actividad lítica de uno o más bacteriófagos de la invención frente a una cepa de P. aeruginosa procedente de una muestra de dicho sujeto, en donde una actividad lítica de uno o más bacteriófagos de la invención frente al menos una cepa de P. aeruginosa es indicativa de una buena respuesta a dicha terapia.

Otros aspectos y ventajas de la invención se describirán en la siguiente sección experimental, que es únicamente ilustrativa.

Ejemplos

Materiales y métodos

Determinación de la variedad de hospedadores

Las variedades de hospedadores de bacteriófagos se determinaron entre una colección de 20 P. aeruginosa proce dentes de la colección LMG. Se mezclaron 109 células bacterianas con agar fundido y esa mezcla se vertió sobre agar sólido para formar placas de agar de doble capa. Después de la solidificación, las soluciones madre de bacteriófagos aislados se dispersaron sobre cada placa con diferentes cepas bacterianas. Después de dejar 20 min para que se absorbieran las manchas, las placas se invirtieron y se incubaron durante 24 h a 37°C antes de registrar el grado de lisis (Postic, 1961; Yang, 2010).

Secuenciación, análisis y anotación de genomas de fagos

Para aislar el ADN de los fagos, los fagos se multiplicaron como se ha descrito anteriormente. El ADN de los fagos se aisló mediante extracción con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1, V/V), precipitación con etanol y resolución en agua. Se realizó la secuenciación del genoma completo y se utilizó el algoritmo BLAST para determinar la similitud con los genes descritos en la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica [NCBI]. Los genomas se analizaron en busca de posibles marcos de lectura abierta (ORFs).

Ejemplo 1: Aislamiento de bacteriófagos

Los bacteriófagos se aislaron a partir de muestras ambientales. Las bacterias de P. aeruginosa resistentes a múltiples fármacos (MDR, por sus siglas en inglés) se usaron para aislar y enriquecer cada bacteriófago virulento desde el agua del entorno. Más concretamente, las muestras ambientales y el cultivo de bacterias durante la noche en Luria Bertani (LB) se mezclaron y se incubaron a 37°C durante 24 h con agitación para enriquecer los bacteriófagos específicos. Al final de la incubación, se añadió al cultivo gotas de cloroformo. El cultivo se centrifugó a 11.000 g durante 5 minutos para eliminar las células bacterianas y los desechos. El material sobrenadante se filtró con un filtro de 0,2 gm para eliminar las células bacterianas residuales. La solución de fagos enriquecidos se sembró en medio agar LB con P. aeruginosa incluida. Se formaron placas sobre las placas después de 24 horas de incubación a 37°C. Se seleccionó una única placa para la posterior purificación y amplificación del fago. A continuación, el fago se almacenó a 4°C en una suspensión en caldo LB o en solución salina fisiológica.

El título de fagos en una suspensión se estimó mediante un recuento de placas (Postic, 1961). Se administraron diluciones de diez veces de una suspensión sobre un césped seco de la cepa que se propagaba. Se realizó una lectura de las placas después de una noche de incubación. El método de recuento de placas también permitía la visualización de la morfología de las placas.

Se seleccionaron 7 bacteriófagos altamente activos. Su secuencia fue determinada y se proporcionan en la presente solicitud, de acuerdo con la siguiente tabla:

Tabla 1

La actividad de los bacteriófagos, solos o en combinación, se sometió a ensayo adicionalmente con diferentes modelos y condiciones como se describe en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 2: Características y cinéticas del hospedador bacteriófago

Se llevaron a cabo experimentos de crecimiento de una sola etapa de acuerdo con las descripciones anteriores, para determinar primero el tiempo de lisis productiva, la tasa de adsorción y luego el tamaño de estallido del fago. Para determinar la tasa de adsorción, se tomaron muestras a diferentes intervalos de tiempo para analizar las partículas de fago libres en las soluciones. Para determinar el tiempo productivo y el tamaño de estallido de los fagos, se mezclaron bacterias P. aeruginosa con soluciones de fagos y se permitió que los fagos se adsorbieran durante 15 min. La mezcla se sometió inmediatamente a centrifugación a 5000 rpm durante 10 min para eliminar las partículas de fagos libres. El sedimento se resuspendió en 5 medios LB de nuevo aporte y el cultivo se incubó continuamente a 37°C. Se tomaron muestras a intervalos de 5 min y se determinó el título de fagos. Estos resultados permitieron calcular el número de fagos producidos por cada bacteria (tamaño de estallido), el tiempo productivo y el efecto lítico productivo (PLE), como se muestra en la tabla 3 a continuación.

Tabla 3:

Estos resultados muestran que todos los fagos tienen una potente capacidad de producción vírica y tasas de absor ción. La mayoría de los fagos tienen un PLE por debajo de 7, lo que demuestra un perfil notable. El fago 1777 es particularmente eficaz a este respecto. Además, los diferentes tiempos de PLE y de adsorción permiten crear cócteles con una variabilidad seleccionada.

Ejemplo 3: Composición de los bacteriófagos

Se constituyen las siguientes composiciones de cócteles, cada una de las cuales comprende entre 109 y 1011 UFP de cada bacteriófago:

Tabla 4

Ejemplo 4: Actividad antibacteriana

Varias cepas de bacterias se incuban con un cóctel de bacteriófagos de la invención con 2.109 bacteriófagos/ml durante 24 h a 37°C. Los cócteles se someten a ensayo en las 16 bacterias distintas de P. aeruginosa, indicadas en la tabla 2. El % de las especies de bacterias sensibles a los cócteles se indica en la tabla 5 a continuación:

Tabla 5

Las bacterias se numeraron y se usaron para el cálculo de la tasa de resistencia (número de bacterias después de la incubación/número de bacterias sembradas en placas) con el cóctel VI. Se obtuvieron tasas de resistencia, tal y como se muestra en la siguiente tabla 6:

Tabla 6:

Todas las bacterias sometidas a ensayo son sensibles a las composiciones de la invención.

Ejemplo 5: Especificidad del cóctel

La especificidad del cóctel se confirmó mediante pruebas con diez especies diferentes de bacterias Gram-negativas y Gram-positivas, incluyendo Escherichia coli (varias cepas), Acinetobacter baumanii, Enterobacter aerogenes C, Enterobacter asburiae, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Staphylococcus aureus, Stenotrophomonas maltophila, Serratia marcescens.

La Tabla 7 muestra la falta de actividad lítica del cóctel que contiene los 7 bacteriófagos.

Tabla 7

La tabla anterior muestra claramente que no había actividad lítica sobre las bacterias, pero si tenía lugar con las cepas de P. aeruginosa. Por lo tanto, los bacteriófagos y el cóctel de la invención son altamente específicos para las cepas de P. aeruginosa.

Ejemplo 6: Eficacia de cada bacteriófago sobre la cepa de P. aeruginosa PAO1

Se seleccionó la cepa PAO1 porque es una cepa de laboratorio de uso común. Las bacterias se cultivaron individual mente y cada bacteriófago se añadió individualmente (Fig. 1-6) o en cóctel (Fig. 7) con una MOI de 1 a 10e-4, es decir, con una relación de dilución (bacterias/fagos) de 1 a 10.000.

La Fig. 1 muestra que el bacteriófago 1384 es eficaz con una MOI de 1,0,1 o 0,01.

La Fig. 2 muestra que el bacteriófago 1777 es eficaz con una MOI de 1.

La Fig. 3 muestra que el bacteriófago 1792 es activo contra la cepa PAO1 durante al menos 6 h incluso con una MOI de 10e-4.

La Fig. 4 muestra que el bacteriófago 1797 es activo contra la cepa PAO1 durante al menos 6 h incluso con una MOI de 10e-4.

La Fig. 5 muestra que el bacteriófago 1800 es activo contra la cepa PAO1 durante al menos 6 h incluso con una MOI de 10e-4.

La Fig. 6 muestra que, dependiendo de la MOI, el bacteriófago 1800 es activo frente a la cepa PAO1 durante al menos 6 horas.

La Fig. 7 muestra la eficacia del cóctel de bacteriófagos VI sobre la cepa PAO1. El cóctel es muy activo frente a la cepa PAO1 durante al menos 6 horas incluso con una MOI de 10e-4 y es más eficaz que los fagos de forma individual.

Ejemplo 7: Eficacia de un cóctel de bacteriófagos de la invención sobre las cepas de P. aeruginosa resistentes a antibióticos de una fibrosis quística

Se eligieron varias cepas para representar a P. aeruginosa que causa problemas respiratorios. Se cultivaron indivi dualmente y se añadió el cóctel de bacteriófagos VI con una MOI de 1 a 10e-4, es decir, con una relación de dilución (bacterias/fagos) de 1 a 10.000.

Tabla 8: Información sobre las cepas bacterianas

Los resultados se presentan en las Fig. 8, 9 y 10.

La Fig. 8 muestra que el cóctel es totalmente eficaz sobre la cepa CF1 incluso después de 6 h y con una MOI muy baja.

La Fig. 9 muestra que el cóctel es muy eficaz sobre la cepa CF2 incluso después de 6 horas.

La Fig. 10 muestra que el cóctel es eficaz sobre la cepa CF3.

Los resultados muestran que el cóctel de bacteriófagos VI era muy eficaz sobre tres cepas bacterianas nosocomiales de P. aeruginosa aisladas a partir de pacientes hospitalizados, incluso después de haber sido diluidas hasta diez mil veces. Estos resultados demuestran que las composiciones de la invención pueden usarse para tratar in vivo una infección con P. aeruginosa, y son activas contra cepas bacterianas multirresistentes.

Referencias

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición antibacteriana que comprende al menos dos bacteriófagos que tienen actividad lítica contra una cepa de Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), seleccionándose dichos al menos dos bacteriófagos a partir de los bacteriófagos que tienen un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 1 a 7 o una secuencia que tiene al menos un 97% de identidad con SEQ ID NOs: 2 a 7.

2. La composición según la reivindicación 1, que comprende al menos tres, aún más preferiblemente al menos cuatro bacteriófagos distintos seleccionados a partir de los bacteriófagos que tienen un genoma que comprende una secuen cia de nucleótidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 1 a 7 o una secuencia que tiene al menos un 97% de identidad con SEQ ID NOs: 2 a 7.

3. La composición según la reivindicación 1, que comprende al menos un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 o 4, o una secuencia que tiene al menos un 97% de identidad con la misma.

4. La composición según la reivindicación 1 o 3, que comprende:

• un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4 o una secuencia que tiene al menos un 97% de identidad con la misma; y

• un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 6 o una secuencia que tiene al menos un 97% de identidad con la misma.

5. La composición según la reivindicación 1, que comprende uno cualquiera de los cócteles de bacteriófagos selec cionados a partir del grupo que consiste en:

6. La composición según la reivindicación 1 o 2, que comprende:

• un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1;

• un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o una secuencia que tiene al menos un 97% de identidad con la misma;

• un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 o una secuencia que tiene al menos un 97% de identidad con la misma;

• un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4 o una secuencia que tiene al menos un 97% de identidad con la misma;

• un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5 o una secuencia que tiene al menos un 97% de identidad con la misma;

• un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 6 o una secuencia que tiene al menos un 97% de identidad con la misma; y

• un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7 o una secuencia que tiene al menos un 97% de identidad con la misma.

7. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que es lítica contra cepas de P. aeruginosa re sistentes a antibióticos.

8. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que es lítica contra más del 90% de todas las cepas bacterianas de la colección LMG.

9. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que además comprende un excipiente o un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que es una formulación líquida, semilíquida, sólida o liofilizada.

11. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende entre 10e4 y 10e12 UFP de cada bacteriófago.

12. Una composición tal y como se define en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para uso en el tratamiento de una infección en un mamífero.

13. La composición para uso según la reivindicación 12, en el tratamiento de una infección del tracto respiratorio.

14. Una composición según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para uso para mejorar el estado de un mamífero modificando la flora microbiana en dicho mamífero.

15. Uso in vitro de una composición según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para desconta minar un material.

16. Un método para preparar una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende producir por separado dichos al menos dos bacteriófagos y combinar dichos bacteriófagos con un vehículo o un exci piente adecuado.

17. Un bacteriófago que tiene actividad lítica frente a una cepa de Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) y que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir de una cualquiera de s Eq ID NOs: 2 a 7 o una secuencia que tiene al menos un 97% de identidad con la misma.

18. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir de una cualquiera de SEQ ID NOs: 2 a 7 o una secuencia que tiene al menos un 97% de identidad con la misma.

19. Una composición que comprende un bacteriófago según se define en la reivindicación 17 o un ácido nucleico según se define en la reivindicación 18.

20. Un bacteriófago según se define en la reivindicación 17, o un ácido nucleico según se define en la reivindicación 18, o una composición según se define en la reivindicación 19, para uso en el tratamiento de una infección en un mamífero.

21. Un bacteriófago según se define en la reivindicación 17, o un ácido nucleico según se define en la reivindicación 18, o una composición según se define en la reivindicación 19, para uso para mejorar el estado de un mamífero modificando la flora microbiana en dicho mamífero.

22. Uso in vitro de un bacteriófago según se define en la reivindicación 17, o de un ácido nucleico según se define en la reivindicación 18, o de una composición según se define en la reivindicación 19, para descontaminar un material.