ES2857199T3 - Terapia con fagos de infecciones de Pseudomonas - Google Patents

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Abstract

Una composición antibacteriana que comprende al menos (a) un bacteriófago que presenta actividad lítica contra una cepa de Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) y que tiene un genoma que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:5 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 97 % con esta a lo largo de la longitud entera; y (b) un bacteriófago que presenta actividad lítica contra una cepa de Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) seleccionado de los bacteriófagos que tienen un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de una cualquiera de SEQ ID NO:1 a 4 y 6 a 13 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 97 % con estas a lo largo de la longitud entera.

Description

DESCRIPCIÓN
Terapia con fagos de infecciones de Pseudomonas
La presente invención se refiere a nuevos bacteriófagos, a composiciones que los comprenden, a su fabricación y a sus usos. La invención está particularmente adaptada al tratamiento de una infección en un mamífero y a la mejora de la condición de un sujeto mediante la modificación de la flora en dicho sujeto.
Antecedentes de la invención
Los bacteriófagos (o fagos) son virus pequeños que tienen la capacidad de infectar y matar a las bacterias, mientras que no afectan a las células de otros organismos. Descritos por primera vez hace casi un siglo por William Twort y descubiertos independientemente poco después por Félix d'Herelle, hasta la fecha se han descubierto y descrito morfológicamente más de 6000 bacteriófagos diferentes, que incluyen virus de bacterias y de arqueobacterias. La amplia mayoría de estos virus tienen cola, mientras que una pequeña proporción son polihédricos, filamentosos o pleomórficos. Pueden clasificarse según su morfología, su contenido genético (ADN frente a ARN), su hospedante específico, el lugar en donde viven (virus marinos frente a otros hábitats) y su ciclo de vida. Como parásitos intracelulares de células bacterianas, los fagos presentan diferentes ciclos de vida dentro del hospedante bacteriano: infección lítica, lisogénica, pseudolisogénica y crónica (Weinbauer, 2004; Drulis-Kawa, 2012). Los fagos líticos provocan la lisis de la célula bacteriana hospedante como una parte normal de sus ciclos de vida. Los fagos lisogénicos (también denominados fagos atemperados) pueden replicarse mediante el ciclo de vida lítico y provocar la lisis de la bacteria hospedante o pueden incorporar su ADN al ADN de la bacteria hospedante y convertirse en profagos no infecciosos. Cualquiera que sea el tipo de ciclo de vida de un fago, la primera etapa es la unión a receptores de la pared celular bacteriana antes de que el material del fago pueda entrar en la bacteria. Este proceso específico influye en el espectro de posibles interacciones de fago-bacteria.
Los bacteriófagos se emplean habitualmente como herramientas de investigación para modificar bacterias en experimentos de laboratorio.
Debido a su especificidad por la célula hospedante diana, se ha considerado el uso de fagos como terapia para tratar infecciones agudas y crónicas, en particular en dermatología, oftalmología, urología, estomatología, pediatría, otolaringología o cirugía. Sin embargo, este concepto del uso terapéutico de fagos para tratar infecciones bacterianas ha sido muy controvertido desde el principio, y no es ampliamente aceptado por el público ni por la comunidad médica. Los estudios tempranos fueron ampliamente criticados por la falta de controles apropiados y los resultados inconsistentes. La falta de reproducibilidad y los muchos resultados contradictorios en los diversos estudios publicados condujeron a the Council on Pharmacy and Chemistry of the American Medical Association a concluir que las pruebas para el valor terapéutico de los filtrados líticos fueron, en su mayor parte, contradictorias, poco convincentes y a recomendar más investigación para confirmar sus supuestos beneficios.
Desde la introducción de los antibióticos en la década de 1940, se ha prestado poca atención a este campo de productos terapéuticos, en especial en el mundo occidental. Sin embargo, el amplio uso de los antibióticos ha conducido a la emergencia generalizada y la dispersión de bacterias resistentes a antibióticos en todo el globo, lo cual provoca problemas cada vez más graves. Por tanto, superar las opciones terapéuticas limitadas que aún existen para tratar los principales microbios resistentes a múltiples fármacos se ha convertido en un importante desafío terapéutico.
Además, muchos microorganismos patógenos residen dentro de biopelículas, que provocan otros problemas añadidos cuando se diseñan nuevos agentes antimicrobianos. A este respecto, las bacterias que crecen como una biopelícula, en lugar de las formas unicelulares ("planctónicas"), tienden a ser particularmente resistentes a los agentes antimicrobianos y a provocar que al sistema inmunitaria del hospedante le resulte particularmente difícil producir una respuesta apropiada.
Desde su descubrimiento inicial al final del siglo XIX (Fordos, 1859), la bacteria Gram-negativa Pseudomonas aeruginosa se ha ganado mala fama en la lista de los patógenos humanos infames (Williams et al., 1894, Freeman et al., 1916). La llegada de la era de los antibióticos palió en gran medida el resultado previamente letal de las infecciones agudas en pacientes sanos. Solo se ha logrado una mejora relativa en la erradicación de las infecciones crónicas, que se desarrollan principalmente en individuos que padecen fibrosis quística o quemaduras graves o que están inmunocomprometidos (Gang et al., 1999, Jones et al., 2010). Dos factores intrínsecamente relacionados en el resultado letal de las infecciones en estos pacientes son la rápida prescripción de los tratamientos con antibióticos inapropiados y el desarrollo o la adquisición de cepas resistentes a múltiples fármacos. Aunque se ha indicado que el uso de uno o más antibióticos apropiados es un factor fundamental en la erradicación de las infecciones por P. aeruginosa (Kang et al., 2005, Micek et al., 2005), a la inversa, el abuso de antibióticos contribuye significativamente a aumentar la resistencia ejerciendo una presión selectiva continua para la adquisición de dichas capacidades. Los antibióticos por sí solos no son responsables de la alta prevalencia de variantes resistentes a múltiples fármacos: P. aeruginosa tiene múltiples mecanismos de resistencia intrínsecos codificados cromosómicamente, que incluyen una baja permeabilidad de la envuelta celular y numerosas bombas de eflujo de múltiples fármacos. Otro factor importante responsable del comportamiento invasivo exitoso y de la persistencia de esta bacteria es su alta adaptabilidad, que permite una rápida colonización de diferentes entornos.
Además, las bacterias patógenas, tales como P. aeruginosa, son capaces de formar biopelículas, lo cual contribuye a su mayor resistencia a los antibióticos. Estas biopelículas pueden comprender más de un tipo de bacteria rodeada por una matriz extracelular segregada y soportada por esta, y ayudan a las bacterias a colonizar diversas superficies. Las biopelículas permiten que las bacterias se unan a superficies y alcancen unas densidades de población que, de otro modo, no podrían soportarse, impartiendo una mayor resistencia no solo a antibióticos, sino también a muchos estreses ambientales, que incluyen toxinas, tales como metales pesados, lejías y otros agentes de limpieza. Se sabe que las bacterias dentro de biopelículas pueden ser 100 a 1000 veces más resistentes a los antibióticos que la misma cepa de bacteria que crece en formas planctónicas. Este aumento de la resistencia significa que las bacterias que son aparentemente sensibles a antibióticos en un ensayo de laboratorio pueden ser resistentes a la terapia en un escenario clínico. Incluso si algunas se eliminan, las biopelículas pueden proporcionar reservorios resistentes que permiten la colonización rápida cuando los antibióticos ya no estén presentes. Por tanto, es obvio que las biopelículas son factores importantes en muchas enfermedades humanas. No resulta apropiado usar tratamientos químicos contra las biopelículas, puesto que han evolucionado precisamente para contrarrestarlos. La abrasión física proporciona un medio para alterar las biopelículas. Por desgracia, muchas superficies sobre las cuales las biopelículas dan soporte a la patogénesis bacteriana están poco adaptadas para una abrasión rigurosa, concretamente, huesos, articulaciones, dispositivos médicos implantados, etc. Por ejemplo, las superficies de heridas o quemaduras son extremadamente sensibles y delicadas. Incluso cuando la abrasión es adecuada y se emplea habitualmente, la eliminación de las biopelículas es limitada. La placa oral sobre la superficie de los dientes es una biopelícula y se elimina parcialmente mediante un cepillado habitual. Sin embargo, las bacterias se mantienen sobre las superficies no cepilladas (por ejemplo, en los huecos entre los dientes) y pueden recolonizar las superficies limpias con rapidez y eficacia. A partir de esto, es evidente que las estrategias existentes para eliminar las biopelículas tienen una eficacia limitada.
La capacidad para la rápida adaptación y su capacidad para formar biopelículas son las principales razones que identifican a P. aeruginosa como patógenos oportunistas. Han adquirido la categoría de patógenos hospitalarios, y pueden aislarse a partir de muestras clínicas tomadas de heridas, esputo, vejiga, uretra, vagina, oídos, ojos y tracto respiratorio. El surgimiento de resistencia a los más poderosos antibióticos nuevos en estas cepas de P. aeruginosa clínicas, que aparece incluso durante el tratamiento, hace que la lucha contra los patógenos hospitalarios de P. aeruginosa sea un gran problema.
Además, se ha indicado que la condición patológica o fisiológica de un sujeto se ve influida por el equilibrio de los microorganismos en la flora del sujeto. Por consiguiente, la modificación de la flora microbiana, o la modificación de dicho equilibrio o el restablecimiento de dicho equilibrio mediante la destrucción de la población de P. aeruginosa también es una estrategia valiosa para mejorar la condición de un sujeto.
Por tanto, son muy necesarios nuevos agentes o composiciones antibacterianos que puedan usarse para destruir cepas de P. aeruginosa, incluso cuando están organizadas en biopelículas bacterianas, que sean adecuados para su uso en la terapia humana o animal, así como para descontaminar materiales.
En la técnica anterior se describen genomas de bacteriófagos: fago SN en EBI n.° de registro FM887021; fago LUZ24 en EBI n.° de registro AM910650; fago MR299-2 en EBI n.° de registro JN254801; fago PB1 en EBI n.° de registro EU716414 (véase también Ceyssens et al., 2009, Environ. Microbiol., 11(11):2874-2883); fago NH-4 en EBI n.° de registro JN254800; fago JG024 en EBI n.° de registro GU815091 (véase también Garbe et al., BMC Microbiol., 2010, 10(1 ):301); fago PaP4 en EBI n.° de registro KC294142; fago KPP12 en EBI n.° de registro AB560486; y fago LMA2 en Eb I n.° de registro FM201282. Se describe un cóctel de bacteriófagos en Alemayehu et al., Mbio, 2012, 3(2):e00029-12;documento EP2465926; y Wright et al., Clinical Otolaryngology and Allied Sciences, 2009, 34:349-357.
Sumario de la invención
Los inventores han aislado y caracterizado nuevos bacteriófagos que presentan actividad lítica específica contra Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) y que pueden usarse como agentes activos en preparaciones farmacéuticas o veterinarias, en particular para tratar infecciones bacterianas de P. aeruginosa o para modificar el equilibrio microbiano en un sujeto. Los nuevos bacteriófagos de la invención muestran una fuerte actividad lítica, alta selectividad, y pueden combinarse para inducir la destrucción controlada de un espectro muy amplio de células de P. aeruginosa.
Un objeto de la invención consiste en proporcionar composiciones antibacterianas que comprenden al menos uno o al menos dos bacteriófagos que presentan actividad lítica contra una cepa de Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), según se define en las reivindicaciones.
Otro objeto de la invención se refiere a un bacteriófago que presenta actividad lítica contra una cepa de Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) y que tiene un genoma que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:5 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 99 % con esta a lo largo de la longitud entera.
Los bacteriófagos de la invención muestran actividad lítica contra cepas resistentes a múltiples fármacos de P. aeruginosa, en particular contra cepas patógenas resistentes a antibióticos, tales como cefalosporinasa, carbenicilinasas y ^-lactamasas de espectro extendido (Strateva T. y Yordanov D., 2009).
La invención se refiere además a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:5 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 99 % con esta a lo largo de la longitud entera.
Otro objeto de la invención es una composición que comprende un ácido nucleico, según se definió anteriormente. Las composiciones de la invención generalmente comprenden además un excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable. Pueden ser líquidas, semilíquidas, sólidas o estar liofilizadas.
Otro objeto de la invención se refiere a un bacteriófago, un ácido nucleico o una composición, como se definió anteriormente, para su uso en el tratamiento de una infección en un mamífero, para modificar la flora microbiana en un mamífero o para descontaminar un material.
La descripción también se refiere a uno o varios bacteriófagos líticos, para su uso para mejorar la condición de un sujeto mediante la modificación de la flora microbiana en dicho sujeto. La flora microbiana puede modificarse corrigiendo, adaptando o restableciendo un equilibrio adecuado de los microorganismos en dicha flora.
También se describe un método para tratar una infección en un mamífero, que comprende la administración a dicho mamífero de al menos un bacteriófago, ácido nucleico, polipéptido o composición, como se definió anteriormente. También se describe un método para tratar una superficie o un material sospechoso de estar contaminado por una bacteria de P. aeruginosa, que comprende aplicar a dicha superficie o material al menos un bacteriófago, ácido nucleico, polipéptido o composición, como se definió anteriormente. La superficie o el material puede ser una superficie de cualquier dispositivo, recipiente o material de laboratorio, tejido, etc.
También se describe un kit que comprende una composición, como se definió anteriormente, y un medio para aplicarla a un sujeto o a una superficie.
Otro objeto de la invención describe un método para predecir o determinar la eficacia de una terapia de bacteriófagos en un sujeto, en el que el método comprende determinar in vitro una actividad lítica de uno o más bacteriófagos que comprenden al menos un bacteriófago que tiene un genoma que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:5 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 99 % con esta a lo largo de la longitud entera, contra una cepa de P. aeruginosa procedente de una muestra de dicho sujeto, y la actividad lítica de dichos uno o más bacteriófagos contra al menos una cepa de P. aeruginosa procedente de dicha muestra es indicativa de un tratamiento eficaz.
En otro aspecto, la invención describe un método para seleccionar un sujeto o para determinar si un sujeto es susceptible de beneficiarse de una terapia de bacteriófagos, en el que el método comprende la etapa de determinar in vitro una actividad lítica de uno o más bacteriófagos que comprenden al menos un bacteriófago que tiene un genoma que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:5 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 99 % con esta a lo largo de la longitud entera, contra una cepa de P. aeruginosa procedente de una muestra de dicho sujeto, y una actividad lítica de dichos uno o más bacteriófagos contra al menos una cepa de P. aeruginosa es indicativa de un sujeto respondedor.
La invención puede usarse en cualquier mamífero, preferiblemente en seres humanos, o para tratar cualquier material, incluyendo materiales de laboratorio o dispositivos médicos.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Eficacia in vitro de los bacteriófagos de la invención sobre diversas combinaciones de cepas de P. aeruginosa.
Figura 2: Eficacia in vitro de los bacteriófagos de la invención sobre diversas combinaciones de cepas de P. aeruginosa.
Figura 3: Eficacia de los bacteriófagos de la invención in vivo sobre una infección mediada por la cepa Is580 de P. aeruginosa.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a un nuevo bacteriófago, sus componentes, a composiciones que lo comprenden, a su fabricación y a sus usos como agentes antibacterianos, en particular para el tratamiento de una infección en un mamífero, y para mejorar la condición de un sujeto mediante la modificación de la flora microbiana en dicho sujeto, según se define en las reivindicaciones.
Definiciones
Para facilitar la comprensión de la invención, a continuación se define una serie de términos y expresiones.
Tal como se emplea en la presente, el término "bacteriófago" o "fago" se refiere a una partícula de fago funcional que comprende un genoma de ácido nucleico encapsulado en una envuelta proteica o cápsida. El término también se refiere a porciones del bacteriófago que incluyen, por ejemplo, una porción de cabeza, o un ensamblaje de componentes del fago, que proporcionan sustancialmente la misma actividad funcional.
La expresión "característica fenotípica" indica, más preferiblemente, la morfología y/o la gama de hospedantes de un bacteriófago. Los métodos para fenotipificar bacteriófagos son muy conocidos per se en la técnica e incluyen, por ejemplo, determinar la gama de hospedantes bacterianos y/o la actividad contra la biopelícula producida por ciertas cepas bacterianas.
La expresión "actividad lítica", tal como se emplea en la invención, indica la propiedad de un bacteriófago para provocar la lisis de una célula bacteriana. La actividad lítica de un bacteriófago puede ensayarse en cepas de P. aeruginosa según técnicas conocidas per se en la técnica (véase también la sección experimental).
El término "variante" de un bacteriófago de referencia indica los bacteriófagos que presentan una o más variaciones en la secuencia genómica y/o el polipéptido o polipéptidos codificados por esta, en comparación con dicho bacteriófago de referencia, que conservan, al mismo tiempo, las mismas características fenotípicas que el bacteriófago de referencia. Los variantes generalmente comprenden, por ejemplo, mutaciones silenciosas, mutaciones conservativas, deleciones poco importantes y/o replicaciones poco importantes del material genético, y conservan las características fenotípicas del bacteriófago de referencia. En un aspecto preferido, el variante conserva cualquier característica o propiedad observables que dependen del genoma del bacteriófago, es decir, características fenotípicas de dicho bacteriófago y/o actividad lítica contra las cepas de P. aeruginosa. Los variantes preferidos tienen menos del 5 % de variación en el ácido nucleico en comparación con el genoma del bacteriófago de referencia, aún más preferiblemente menos del 4 %, más preferiblemente menos del 2 %. Como alternativa, o en combinación, los variantes tienen preferiblemente menos del 5 % de variación en los aminoácidos en una secuencia de polipéptido codificada en comparación con un polipéptido del bacteriófago de referencia.
La expresión "porcentaje de identidad", con relación a las secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos, indica el nivel de identidad u homología entre dichas secuencias, y puede ser determinado mediante técnicas conocidas per se en la técnica. Generalmente, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos se determina mediante programas de ordenador, tales como GAP proporcionado en el paquete de programas GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, versión 8, agosto de 1996, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EE. UU. 53711) (Needleman, S.B. y Wunsch, C.D. (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453). Con la configuración ajustada, por ejemplo, a secuencias de ADN (concretamente: penalización de creación de huecos de 5,0, y penalización de extensión de huecos de 0,3), las moléculas de ácidos nucleicos pueden alinearse entre sí usando el software de alineamiento Pileup disponible como parte del paquete de programas GCG. El porcentaje de identidad entre dos secuencias indica la identidad a lo largo de la longitud entera de dichas secuencias.
El término "fragmento" de un ácido nucleico indica generalmente un fragmento que tiene al menos 10 nucleótidos consecutivos de dicho ácido nucleico, más preferiblemente al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 o más nucleótidos consecutivos de dicho ácido nucleico.
El término "fragmento" de un polipéptido indica generalmente un fragmento que tiene al menos 5 aminoácidos consecutivos de dicho polipéptido, más preferiblemente al menos 10, 15, 20, 30, 40, 50 o más aminoácidos consecutivos de dicho polipéptido.
La expresión "cepa ESBL de P. aeruginosa" se refiere a cepas de P. aeruginosa que producen cefalosporinasa y/o ^-lactamasas de espectro extendido, que incluyen diversas formas de resistencia a antibióticos, tales como fi-lactamasa de AmpC o ^-lactamasas que hidrolizan carbenicilina de clase A, etc.
El término "específico" o "especificidad" con relación a un bacteriófago se refiere al tipo de hospedante que dicho bacteriófago es capaz de infectar. La especificidad habitualmente es mediada por las fibras de la cola de los bacteriófagos, que están implicadas en la interacción con receptores expresados sobre las células. Un bacteriófago "específico" para P. aeruginosa indica, más preferiblemente, un bacteriófago que puede infectar una o varias cepas de P. aeruginosa y que no puede infectar a bacterias que no son P. aeruginosa bajo condiciones fisiológicas.
Tal como se emplea en la presente, el término "polipéptido" se refiere a polipéptidos de cualquier tamaño, que incluyen péptidos pequeños, por ejemplo, de 5 a 20 aminoácidos, polipéptidos más largos, proteínas o sus fragmentos.
El término "PLE" o "efecto lítico productivo (Productive Lytic Effect)" indica la proporción entre el tamaño de estallido y el tiempo lítico productivo de un bacteriófago concreto. El tamaño de estallido y el tiempo lítico productivo son parámetros que definen la interacción de fago-hospedante y se corresponden, respectivamente, con el rendimiento promedio de partículas de bacteriófago producidas por la infección de una bacteria por un fago, y con el tiempo que tarda un bacteriófago libre en lisar una célula bacteriana.
En el contexto de la presente memoria descriptiva, debe considerarse que la expresión "bacteriófago aislado" significa un material retirado de su entorno original en que aparece en la naturaleza. Con relación a un bacteriófago, la expresión indica, en particular, un fago que, por ejemplo, se cultiva y/o se purifica aparte del entorno en que está localizado en la naturaleza. Con relación a un ácido nucleico o un polipéptido, el término "aislado" indica, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico o polipéptido que está separada de al menos algunos de los componentes de su entorno natural, tales como, por ejemplo, una proteína, un lípido y/o un ácido nucleico.
La expresión "farmacéutica o veterinariamente aceptable", tal como se emplea en la presente, se refiere a cualquier material (por ejemplo, portador, excipiente o vehículo) que es compatible para su uso en un sujeto mamífero. Estos incluyen disoluciones o vehículos fisiológicamente aceptables que son inocuos o que no provocan ninguna reacción inmunitaria específica o no específica significativa contra un organismo ni abrogan la actividad biológica del compuesto activo. Para la formulación de la composición en una preparación líquida, puede usarse disolución salina, agua estéril, disolución de Ringer, disolución salina fisiológica tamponada, disolución de infusión de albúmina, disolución de dextrosa, disolución de maltodextrina, glicerol, etanol, y sus mezclas como excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable. Si es necesario, pueden añadirse otros aditivos convencionales, tales como espesantes, diluyentes, tampones, conservantes, agentes tensioactivos, antioxidantes y agentes bacteriostáticos. Además, también pueden añadirse diluyentes, dispersantes, tensioactivos, ligantes y lubricantes a la composición para preparar formulaciones inyectables, tales como disoluciones, suspensiones y emulsiones acuosas, formulaciones orales, tales como píldoras, cápsulas, gránulos o comprimidos, o formulaciones en polvo. Tal como se emplea en la presente, "PFU" significa unidad formadora de placa ("plaque forming unit"), como se define en la técnica. Los bacteriófagos líticos lisan la célula hospedante, provocando una zona aclarada (o placa) sobre una placa de cultivo. En teoría, cada placa está formada por un fago, y el número de placas multiplicado por el factor de dilución es igual al número total de fagos en una preparación de ensayo.
El término "tratamiento" o "terapia" indica un tratamiento curativo o profiláctico de una enfermedad. Un tratamiento curativo se define como un tratamiento que provoca la cura de una enfermedad, o un tratamiento que alivia, reduce, estabiliza o elimina los síntomas de una enfermedad o el sufrimiento que provoca, directa o indirectamente, o que mejora la condición de un sujeto o reduce el avance de una enfermedad. Un tratamiento profiláctico comprende un tratamiento que da como resultado la prevención de una enfermedad y un tratamiento que reduce y/o retrasa la incidencia de una enfermedad o el riesgo de que aparezca.
El término "mamífero" incluye sujetos humanos, así como mamíferos no humanos, tales como mascotas (por ejemplo, perros, gatos), caballos, rumiantes, ovejas, cabras, cerdos, etc.
El término "biopelícula", tal como se emplea en la presente, indica una formación bacteriana heterogénea que crece sobre diversas superficies, preferiblemente una comunidad bacteriana que crece dentro de una matriz de exopolisacáridos adherida a superficies sólidas biológicas o no biológicas.
El término "comprometer", tal como se emplea en la presente, se refiere a cualquier alteración de la integridad. Comprometer una biopelícula bacteriana significa la penetración de la biopelícula por un bacteriófago, la infección de las bacterias asociadas con la biopelícula y/o su lisis y/o la eliminación parcial o total de la biopelícula (concretamente, deteniendo la colonización y/o alterando las biopelículas).
El término "muestra", tal como se emplea en la presente, significa cualquier muestra que contenga células. Los ejemplos de dichas muestras incluyen fluidos, tales como sangre, plasma, saliva u orina, así como muestras de biopsias, órganos, tejidos o células. La muestra puede tratarse antes de su uso.
Tal como se emplea en la presente, el término "sujeto" o "paciente" se refiere a un animal, preferiblemente a un mamífero, aún más preferiblemente a un ser humano, que incluye adultos y niños. Sin embargo, el término "sujeto" también incluye animales no humanos, en particular mamíferos, tales como perros, gatos, caballos, vacas, cerdos, ovejas y primates no humanos, entre otros.
El término "eficacia" de un tratamiento o "respuesta" a una terapia de bacteriófagos, tal como se emplea en la presente, se refiere a un tratamiento que provoca una disminución en el número de cepas de P. aeruginosa en un sujeto después del tratamiento de bacteriófagos, en comparación con el número de cepas de P. aeruginosa antes del tratamiento. Un sujeto que es un "buen respondedor" se refiere a un sujeto que muestra o que mostrará una recuperación clínicamente significativa cuando se trata con una terapia de bacteriófagos.
El término “cóctel" o composición de bacteriófagos indica una combinación de diferentes tipos de bacteriófagos. Los bacteriófagos en un cóctel/composición preferiblemente se formulan juntos, es decir, en un mismo recipiente o envase, aunque pueden usarse como kits de partes, en los que los bacteriófagos (o algunos de los bacteriófagos) se formulan o envasan por separado, y se combinan cuando se usan o administran.
Descripción de realizaciones
La invención se refiere a un nuevo bacteriófago que tiene una alta especificidad contra cepas de Pseudomonas aeruginosa, a su fabricación, a sus componentes, a composiciones que los contienen y a sus usos en una terapia con fagos, según se define en las reivindicaciones.
Bacteriófagos:
En un primer aspecto, la descripción se refiere al aislamiento y la caracterización de bacteriófagos que son específicos para cepas de P. aeruginosa y que presentan, solos o en una o más combinaciones, un notable espectro de gama de hospedantes de actividad lítica. Estos bacteriófagos se han seleccionado a partir de muestras ambientales, se han aislado, secuenciado y caracterizado. Tal como se indica, los bacteriófagos, individualmente y en una o más combinaciones, son activos contra cepas de P. aeruginosa. Son notablemente eficaces contra cepas de P. aeruginosa patogénicas, tales como cepas de P. aeruginosa resistentes a antibióticos, tal como la cepa ESBL de P. aeruginosa. Además, los bacteriófagos de la descripción tienen un notable efecto lítico productivo ("PLE") menor que 20, más preferiblemente menor que 15, y aún más preferiblemente entre 0,3 y 15. Además, los bacteriófagos de la descripción son específicos para cepas de P. aeruginosa, es decir, no provocan la lisis de bacterias que no son P. aeruginosa. Tal como se ilustra a continuación, la descripción demuestra que estos bacteriófagos pueden combinarse y formularse en condiciones adecuadas para su uso como agentes farmacéuticos o veterinarios para que muestren un efecto antibacteriano muy potente y dirigido contra un espectro controlado de cepas de P. aeruginosa.
De modo más específico, se han seleccionado y caracterizado los siguientes bacteriófagos. También se indican sus correspondientes secuencias de ácidos nucleicos.
Tabla 1
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Se ha determinado el perfil lítico de estos bacteriófagos en un amplio número de cepas de P. aeruginosa. Estos bacteriófagos se han seleccionado por su potencia y potencial de combinación, como se describe en la siguiente tabla. En esta tabla se presenta el efecto lítico de los bacteriófagos sobre cepas de referencia y resistentes a patógenos para confirmar su elevado potencial lítico.
Tabla 2
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A continuación, se presentan otros resultados de cepas muy resistentes procedentes de heridas o quemaduras, que también confirman el notable perfil de actividad de los bacteriófagos de la descripción, y su complementariedad. Tabla 3
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*CAR : Resistencia de clase ATB
Como puede observarse a partir de las tablas 2 y 3, individualmente, los fagos tienen un poder lítico muy fuerte, y pueden producirse combinaciones (o cócteles) de estos bacteriófagos que sean capaces de matar todas las cepas de P. aeruginosa ensayadas, produciendo con ello composiciones antibacterianas de amplio espectro. Como ilustración, un cóctel de los 13 fagos es capaz de matar, de modo eficaz, todas las bacterias listadas en la tabla 2 y la tabla 3.
Además, se ha ensayado la especificidad de los bacteriófagos en muchas cepas que no son de P. aeruginosa. Más en concreto, la sección experimental demuestra que los bacteriófagos descritos en la presente no tienen efecto lítico sobre ninguna bacteria seleccionada de Escherichia coli, Acinebacter baumanii, Enterobacter aerogenes, Enterobacter asburiae, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumonía, Porteus mirabilis, Staphylococus aureus, Stenotrophomonas maltophila y/o Serratia marcescens.
Por tanto, un objeto concreto de la invención reside en un bacteriófago que presenta actividad lítica contra una cepa de P. aeruginosa y que tiene un genoma que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:5 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 99 % con esta a lo largo de la longitud entera.
Los bacteriófagos de la invención pueden cultivarse, expandirse, aislarse, purificarse y usarse, por ejemplo, en una terapia con fagos de trastornos mediados por P. aeruginosa, tal como será descrito con más detalle a continuación. Además, pueden producirse y/o aislarse variantes de estos bacteriófagos que conservan un fenotipo (por ejemplo, especificidad y actividad lítica) de los bacteriófagos mediante técnicas conocidas per se en la técnica.
Los bacteriófagos de la invención pueden prepararse mediante métodos convencionales de cultivo, aislamiento y purificación. Por ejemplo, se cultivan bacterias productoras de P. aeruginosa, se infectan con una muestra de un bacteriófago y después se tratan para retirar los residuos y las células bacterianas. La disolución enriquecida en bacteriófagos puede cultivarse en un medio, por ejemplo, medio de agar, con cepas hospedantes susceptibles de P. aeruginosa en su interior para obtener placas. Después puede escogerse una única placa para la posterior purificación y amplificación de los bacteriófagos. Pueden realizarse uno o más ciclos de amplificación selectiva de los bacteriófagos de la invención, por ejemplo, mezclando los bacteriófagos con P. aeruginosa competente, seguido de la adición de un medio de crecimiento y de una incubación en condiciones de crecimiento de ensayo seleccionadas. Después de una centrifugación, el sobrenadante amplificado aclarado se filtra a través de un filtro y se somete a otro ciclo de amplificación selectiva o se ensaya para la presencia de actividad lítica.
Después pueden evaluarse la titulación del fago en una suspensión y la visualización de la morfología de las placas de los bacteriófagos de la invención mediante métodos conocidos, por ejemplo, mediante recuento de placas. Además, pueden procesarse los bacteriófagos de la invención en diversas formas (líquida, liofilizada, etc.) para una conservación a corto plazo, a largo plazo, congelada o cualquier otra forma de conservación, mediante cualquier método adecuado, como se conoce en la técnica (véase, por ejemplo, Clark, 1962).
La actividad de los bacteriófagos de la invención puede evaluarse mediante métodos muy conocidos en la técnica, tales como un ensayo de placas, también conocido como el método de agar doble, basado en el cultivo del bacteriófago con bacterias hospedantes potenciales y seguido de la evaluación de su capacidad para matar a las células bacterianas hospedantes. En el método de ensayo de placas, el bacteriófago induce la lisis de cepas de P. aeruginosa diana después de un periodo de incubación en medio agar blando, que produce zonas de aclaramiento en la placa de cultivo denominadas placas.
En una realización concreta, la invención se refiere al bacteriófago BP1450, o uno de sus variantes, según se define en las reivindicaciones. El bacteriófago BP1450, o dicho variante de este, puede producirse o expandirse, por ejemplo, en la cepa PAO1 de P. aeruginosa. BP1450, o cualquiera de sus variantes, es específico y presenta actividad lítica contra las cepas LMG24882, LMG24883, LMG24886, LMG24887, LMG24891, LMG24892, LMG24893, LMG24896, LMG24898, LMG24903, LMG24904, LMG24905, LMG24909 y/o LMG24913. BP1450 comprende un genoma que comprende una secuencia indicada en SEQ ID NO:5 o que tiene una identidad de al menos 97 %, 98 % o 99 % con SEQ ID NO:5. También se proporciona una secuencia de ácido nucleico aislada a partir del bacteriófago BP1450, o uno de sus variantes, como se define en las reivindicaciones. El bacteriófago BP1450 de la invención también se caracteriza por un PLE menor que 20, más preferiblemente menor que 15, y aún más preferiblemente de aproximadamente 2.
En otro aspecto concreto, la descripción se refiere al bacteriófago BP1384, o a cualquiera de sus variantes. El bacteriófago BP1384, o cualquiera de sus variantes, puede producirse o expandirse, por ejemplo, en la cepa PAO1 de P. aeruginosa. BP1384, o cualquiera de sus variantes, es específico y presenta actividad lítica contra las cepas LMG24882, LMG24883, LMG24886, LMG24891, LMG24892, LMG24893, LMG24896, LMG24898 y/o LMG24909. BP1384 comprende un genoma que comprende una secuencia indicada en SEQ ID NO:1 o que tiene una identidad de al menos 80 %, más preferiblemente una identidad de al menos 85 %, y aún más preferiblemente una identidad de al menos 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con SEQ ID NO:1. También se describe una secuencia de ácido nucleico aislada a partir del bacteriófago BP1384, o uno de sus variantes. El bacteriófago BP1384 también se caracteriza por un PLE menor que 20, más preferiblemente menor que 15, y aún más preferiblemente de aproximadamente 6,2.
En otro aspecto concreto, la descripción se refiere al bacteriófago BP1429, o a cualquiera de sus variantes. El bacteriófago BP1429, o cualquiera de sus variantes, puede producirse o expandirse, por ejemplo, en la cepa PAO1 de P. aeruginosa. BP1429, o cualquiera de sus variantes, es específico y presenta actividad lítica contra las cepas LMG24882, LMG24891, LMG24892, LMG24893, LMG24896, LMG24898 y/o LMG24916. BP1429 comprende un genoma que comprende una secuencia indicada en SEQ ID NO:2 o que tiene una identidad de al menos 80 %, más preferiblemente una identidad de al menos 85 %, y aún más preferiblemente una identidad de al menos 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con SEQ ID NO:2. También se describe una secuencia de ácido nucleico aislada a partir del bacteriófago BP1429, o uno de sus variantes. El bacteriófago BP1429 también se caracteriza por un PLE menor que 20, más preferiblemente menor que 15, y aún más preferiblemente de aproximadamente 0,70.
En otro aspecto, la descripción se refiere al bacteriófago BP1430, o a cualquiera de sus variantes. El bacteriófago BP1430, o cualquiera de sus variantes, puede producirse o expandirse, por ejemplo, en la cepa PAO1 de P. aeruginosa. BP1430, o cualquiera de sus variantes, es específico y presenta actividad lítica contra las cepas LMG24882, LMG24883, LMG24891, LMG24892, LMG24893, LMG24896, LMG24898, LMG24901 y/o LMG24918.
BP1430 comprende un genoma que comprende una secuencia indicada en SEQ ID NO:3 o que tiene una identidad de al menos 80 %, más preferiblemente una identidad de al menos 85 %, y aún más preferiblemente una identidad de al menos 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con SeQ ID NO:3. También se describe una secuencia de ácido nucleico aislada a partir del bacteriófago B1430, o uno de sus variantes. El bacteriófago BP1430 también se caracteriza por un PLE menor que 20, más preferiblemente menor que 15, y aún más preferiblemente de aproximadamente 3.
En otro aspecto, la descripción se refiere al bacteriófago BP1433, o a cualquiera de sus variantes. El bacteriófago BP1433, o cualquiera de sus variantes, puede producirse o expandirse, por ejemplo, en la cepa PAO1 de P. aeruginosa. BP1433, o cualquiera de sus variantes, es específico y presenta actividad lítica contra las cepas LMG24882, LMG24883, LMG24886, LMG24887, LMG24891, LMG24892, LMG24893, LMG24896, LMG24896, LMG24905, LMG24909 y/o LMG24916. BP1433 comprende un genoma que comprende una secuencia indicada en SEQ ID NO:4 o que tiene una identidad de al menos 80 %, más preferiblemente una identidad de al menos 85 %, y aún más preferiblemente una identidad de al menos 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con SEQ ID NO:4. También se describe una secuencia de ácido nucleico aislada a partir del bacteriófago BP1433, o uno de sus variantes. El bacteriófago BP1433 también se caracteriza por un PLE menor que 20, más preferiblemente menor que 15, y aún más preferiblemente de aproximadamente 4.
En otro aspecto, la descripción se refiere al bacteriófago BP1644, o a cualquiera de sus variantes. El bacteriófago BP1644, o cualquiera de sus variantes, puede producirse o expandirse, por ejemplo, en la cepa PAO1 de P. aeruginosa. BP1644, o cualquiera de sus variantes, es específico y presenta actividad lítica contra las cepas LMG24882, LMG24883, LMG24886, LMG24891, LMG24892, LMG24893, LMG24896, LMG24898, LMG24905 y/o LMG24909. BP1644 comprende un genoma que comprende una secuencia indicada en SEQ ID NO:6 o que tiene una identidad de al menos 80 %, más preferiblemente una identidad de al menos 85 %, y aún más preferiblemente una identidad de al menos 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con SEQ ID NO:6. También se describe una secuencia de ácido nucleico aislada a partir del bacteriófago BP1644, o uno de sus variantes. El bacteriófago BP1644 también se caracteriza por un PLE menor que 20, más preferiblemente menor que 15, y aún más preferiblemente de aproximadamente 1,5.
En otra realización concreta, la descripción se refiere al bacteriófago BP1647, o a cualquiera de sus variantes. El bacteriófago BP1647, o cualquiera de sus variantes, puede producirse o expandirse, por ejemplo, en la cepa PAO1 de P. aeruginosa. BP1647, o cualquiera de sus variantes, es específico y presenta actividad lítica contra las cepas LMG24882, LMG24883, LMG24891, LMG24892, LMG24893, LMG24896, LMG24898, LMG24903 y/o LMG24916. BP1647 comprende un genoma que comprende una secuencia indicada en SEQ ID NO:7 o que tiene una identidad de al menos 80 %, más preferiblemente una identidad de al menos 85 %, y aún más preferiblemente una identidad de al menos 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con SeQ ID NO:7. También se describe una secuencia de ácido nucleico aislada a partir del bacteriófago BP1647, o uno de sus variantes. El bacteriófago BP1647 también se caracteriza por un PLE menor que 20, más preferiblemente menor que 15, y aún más preferiblemente de aproximadamente 0,4.
En otra realización concreta, la descripción se refiere al bacteriófago BP1648, o a cualquiera de sus variantes. El bacteriófago BP1648, o cualquiera de sus variantes, puede producirse o expandirse, por ejemplo, en la cepa PAO1 de P. aeruginosa. BP1648, o cualquiera de sus variantes, es específico y presenta actividad lítica contra las cepas LMG24882, LMG24883, LMG24891, LMG24893, LMG24896, LMG24898 y/o LMG24909. BP1648 comprende un genoma que comprende una secuencia indicada en SEQ ID NO:8 o que tiene una identidad de al menos 80 %, más preferiblemente una identidad de al menos 85 %, y aún más preferiblemente una identidad de al menos 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con SEQ ID NO:8. También se describe una secuencia de ácido nucleico aislada a partir del bacteriófago BP1648, o uno de sus variantes. El bacteriófago BP1648 también se caracteriza por un PLE menor que 20, más preferiblemente menor que 15, y aún más preferiblemente de aproximadamente 2.
En otro aspecto, la descripción se refiere al bacteriófago BP1649, o a cualquiera de sus variantes. El bacteriófago BP1649, o cualquiera de sus variantes, puede producirse o expandirse, por ejemplo, en la cepa PAO1 de P. aeruginosa. BP1649, o cualquiera de sus variantes, es específico y presenta actividad lítica contra las cepas LMG24882, LMG24883, LMG24886, LMG24887, LMG24891, LMG24892, LMG24893, LMG24896, LMG24898, LMG24905, LMG24909 y/o LMG24913. BP1649 comprende un genoma que comprende una secuencia indicada en SEQ ID NO:9 o que tiene una identidad de al menos 80 %, más preferiblemente una identidad de al menos 85 %, y aún más preferiblemente una identidad de al menos 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con SEQ ID NO:9. También se describe una secuencia de ácido nucleico aislada a partir del bacteriófago BP1649, o uno de sus variantes. El bacteriófago BP1155 también se caracteriza por un PLE menor que 20, más preferiblemente menor que 15, y aún más preferiblemente de aproximadamente 3,5.
En otra realización concreta, la descripción se refiere al bacteriófago BP1650, o a cualquiera de sus variantes. El bacteriófago BP1650, o cualquiera de sus variantes, puede producirse o expandirse, por ejemplo, en la cepa PAO1 de P. aeruginosa. BP1650, o cualquiera de sus variantes, es específico y presenta actividad lítica contra las cepas LMG24882, LMG24893, LMG24896, LMG24898, LMG24905 y/o LMG24909. BP1650 comprende un genoma que comprende una secuencia indicada en SEQ ID NO:10 o que tiene una identidad de al menos 80 %, más preferiblemente una identidad de al menos 85 %, y aún más preferiblemente una identidad de al menos 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con SEQ ID NO:10. También se describe una secuencia de ácido nucleico aislada a partir del bacteriófago BP1650, o uno de sus variantes. El bacteriófago BP1650 también se caracteriza por un PLE menor que 20, más preferiblemente menor que 15, y aún más preferiblemente de aproximadamente 14. En otro aspecto, la descripción se refiere al bacteriófago BP1658, o a cualquiera de sus variantes. El bacteriófago BP1658, o cualquiera de sus variantes, puede producirse o expandirse, por ejemplo, en la cepa PAO1 de P. aeruginosa. BP1658, o cualquiera de sus variantes, es específico y presenta actividad lítica contra las cepas LMG24882, LMG24887, LMG24891, LMG24893, LMG24896 y/o LMG24898. BP1658 comprende un genoma que comprende una secuencia indicada en SEQ ID NO:11 o que tiene una identidad de al menos 80 %, más preferiblemente una identidad de al menos 85 %, y aún más preferiblemente una identidad de al menos 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con SeQ ID NO:11. También se describe una secuencia de ácido nucleico aislada a partir del bacteriófago BP1658, o uno de sus variantes. El bacteriófago BP1658 también se caracteriza por un PLE menor que 20, más preferiblemente menor que 15, y aún más preferiblemente de aproximadamente 3. En otro aspecto, la descripción se refiere al bacteriófago BP1661, o a cualquiera de sus variantes. El bacteriófago BP1661, o cualquiera de sus variantes, puede producirse o expandirse, por ejemplo, en la cepa PAO1 de P. aeruginosa. BP1661, o cualquiera de sus variantes, es específico y presenta actividad lítica contra las cepas LMG24882, LMG24883, LMG24886, LMG24891, LMG24892, LMG24893, LMG24896, LMG24898 y/o LMG24909. BP1661 comprende un genoma que comprende una secuencia indicada en SEQ ID NO:12 o que tiene una identidad de al menos 80 %, más preferiblemente una identidad de al menos 85 %, y aún más preferiblemente una identidad de al menos 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con SEQ ID NO:12. También se describe una secuencia de ácido nucleico aislada a partir del bacteriófago BP1661, o uno de sus variantes. El bacteriófago BP1661 también se caracteriza por un PLE menor que 20, más preferiblemente menor que 15, y aún más preferiblemente de aproximadamente 4.
En otro aspecto, la descripción se refiere al bacteriófago BP1662, o a cualquiera de sus variantes. El bacteriófago BP1662, o cualquiera de sus variantes, puede producirse o expandirse, por ejemplo, en la cepa PAO1 de P. aeruginosa. BP1662, o cualquiera de sus variantes, es específico y presenta actividad lítica contra las cepas LMG24883, LMG24891, LMG24892, LMG24893, LMG24896, LMG24898 y/o LMG24916. BP1662 comprende un genoma que comprende una secuencia indicada en SEQ ID NO:13 o que tiene una identidad de al menos 80 %, más preferiblemente una identidad de al menos 85 %, y aún más preferiblemente una identidad de al menos 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con SEq ID NO:13. También se describe una secuencia de ácido nucleico aislada a partir del bacteriófago BP1662, o uno de sus variantes. El bacteriófago BP1662 también se caracteriza por un PLE menor que 20, más preferiblemente menor que 15, y aún más preferiblemente de aproximadamente 1.
Ácidos nucleicos
La invención se refiere a un ácido nucleico contenido en un bacteriófago, como se define en las reivindicaciones. Cualquier fragmento de dicho ácido nucleico también se describe en la presente. El término fragmento indica, más preferiblemente, un fragmento que contiene (o que consiste en) un marco de lectura abierto. El ácido nucleico puede ser ADN o ARN, monocatenario o bicatenario.
El ácido nucleico puede aislarse a partir de los bacteriófagos depositados o puede producirse usando la tecnología del ADN recombinante (por ejemplo, amplificación por reacción en cadena de polimerasa (PCR), clonación), síntesis enzimática o química, o sus combinaciones, según las técnicas generales conocidas per se en la técnica. También se incluyen secuencias homólogas y sus fragmentos, que incluyen, pero no se limitan a variantes alélicos naturales y secuencias de ácidos nucleicos modificadas, en las que se han insertado, delecionado, sustituido y/o invertido nucleótidos.
La invención se refiere a un ácido nucleico que comprende la secuencia SEQ ID NO:5 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 99 % o más con esta a lo largo de la longitud entera.
El ácido nucleico de la invención puede estar en forma libre o clonado en un vector.
Composiciones de la invención
Un aspecto de la invención se refiere a composiciones, como se define en las reivindicaciones, que comprenden al menos un bacteriófago, como se describió anteriormente, más preferiblemente al menos 2 o más, y, opcionalmente, un excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable. Tal como se describió, los bacteriófagos de la invención tienen una actividad lítica muy potente contra cepas de P. aeruginosa. Pueden producirse combinaciones de estos bacteriófagos para expandir el espectro de hospedantes y producir composiciones antibacterianas muy eficaces. Más en concreto, la invención se refiere a una composición antibacteriana que comprende al menos dos bacteriófagos que presentan actividad lítica contra una cepa de Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), teniendo uno de dichos al menos dos bacteriófagos un genoma que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:5 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 97 %, 98 % o 99 % con esta a lo largo de la longitud entera, y teniendo uno de dichos al menos dos bacteriófagos un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de una cualquiera de SEQ ID NO:1 a 4 y 6 a 13 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 97 %, 98 % o 99 % con esta a lo largo de la longitud entera.
En una realización preferida, las composiciones de la invención comprenden al menos tres, aún más preferiblemente al menos cuatro bacteriófagos diferentes, según se define en las reivindicaciones.
Las composiciones de la invención pueden comprender al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 11, 12 o todos los 13 tipos diferentes de bacteriófagos, como se describió anteriormente.
Un aspecto de la invención se relaciona con una composición con al menos el bacteriófago BP1450.
La descripción también se refiere a una composición que comprende al menos dos bacteriófagos distintos seleccionados de BP1384, BP1429, BP1430, BP1433, BP1450, BP1644, BP1647, BP1648, BP1649, BP1650, BP1658, BP1661 y/o BP1662, o sus variantes.
En un aspecto concreto, una composición de la descripción comprende BP1384 en combinación con al menos otro bacteriófago seleccionado de BP1429, BP1430, BP1433, BP1450 o BP1644.
En otro aspecto concreto, una composición de la descripción comprende BP1384 en combinación con al menos otro bacteriófago seleccionado de BP1450 y BP1647.
En otro aspecto concreto, una composición de la descripción comprende BP1430 en combinación con al menos otro bacteriófago seleccionado de BP1450, BP1644, BP1649 y BP1661.
En otro aspecto concreto, una composición de la descripción comprende BP1433 en combinación con al menos otro bacteriófago seleccionado de BP1450, BP1647.
En otro aspecto preferido, la composición de la descripción comprende BP1384 en combinación con al menos otro bacteriófago seleccionado de BP1429, BP1647, BP1649 y BP1662.
La descripción también se refiere a una composición que comprende una combinación de todos los bacteriófagos BP1384, BP1429, BP1430, BP1433, BP1450, BP1644, BP1647, BP1648, BP1649, BP1650, BP1658, BP1661 y/o BP1662, o sus variantes. Los ejemplos específicos de composiciones de la invención comprenden:
• un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 97 % con esta a lo largo de la longitud entera, y un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:5 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 97 % con esta a lo largo de la longitud entera; o
• un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 97 % con esta a lo largo de la longitud entera, y un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 97 % con esta a lo largo de la longitud entera, y un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:5 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 97 % con esta a lo largo de la longitud entera.
Una realización específica de la invención se refiere a una composición que comprende:
• un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 97 % con esta a lo largo de la longitud entera;
• un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:2 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 97 % con esta a lo largo de la longitud entera;
• un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 97 % con esta a lo largo de la longitud entera;
• un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:4 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 97 % con esta a lo largo de la longitud entera;
• un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:5 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 97 % con esta a lo largo de la longitud entera;
• un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:6 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 97 % con esta a lo largo de la longitud entera;
• un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:7 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 97 % con esta a lo largo de la longitud entera;
• un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:8 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 97 % con esta a lo largo de la longitud entera;
• un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:9 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 97 % con esta a lo largo de la longitud entera;
• un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:10 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 97 % con esta a lo largo de la longitud entera;
• un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:11 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 97 % con esta a lo largo de la longitud entera;
• un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:12 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 97 % con esta a lo largo de la longitud entera; y
• un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:13 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 97 % con esta a lo largo de la longitud entera.
Las composiciones de la invención pueden comprender además otros agentes antibacterianos, en particular otros bacteriófagos que tengan una especificidad de hospedante distinta.
Las composiciones preferidas de la invención son líticas contra cepas de P. aeruginosa resistentes a antibióticos. Otras composiciones preferidas de la invención son líticas contra más del 90 % de todas las cepas bacterianas de la colección LMG, obtenidas a partir de la colección de bacterias BCCM/LMG, muy conocida.
Las composiciones antibacterianas de la invención pueden estar en diversas formas, tales como formulaciones líquidas, semilíquidas, sólidas o liofilizadas.
Las composiciones de la presente invención pueden comprender cualquier cantidad eficaz del bacteriófago o bacteriófagos seleccionados. Preferiblemente, comprenden entre 10e4 y 10e12 PFU de cada uno de dichos bacteriófagos, preferiblemente entre 10e5 y 10e10 PFU. Las cantidades relativas de cada tipo de bacteriófago en una composición de la invención pueden ser ajustadas por los expertos en la técnica. Generalmente, cuando la composición antibacteriana comprende varios (n) bacteriófagos distintos, como se definió anteriormente, la cantidad relativa total %A de cada bacteriófago en la composición es más preferiblemente %A= (100/ni)xV, en la que ni representa el número de tipos diferentes de bacteriófagos, y V es un factor de variabilidad comprendido entre 0,2 y 5. Lo más preferiblemente, V está comprendido entre 0,3 y 3, aún más preferiblemente entre 0,5 y 2, y en general entre 0,8 y 1,5. En una realización típica preferida, cada tipo de bacteriófago está presente en una composición de la invención en cantidades relativas aproximadamente iguales.
Las composiciones de la invención preferiblemente comprenden un vehículo o diluyente adecuado, tal como un excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable. Las composiciones según la presente invención pueden incluir cualquier excipiente o vehículo, tales como espesantes, diluyentes, tampones, conservantes, agentes tensioactivos y similares, además del bacteriófago o bacteriófagos elegidos. Estos incluyen disoluciones o vehículos fisiológicamente aceptables que son inocuos o que no provocan ninguna reacción inmunitaria específica o no específica significativa contra un organismo ni abrogan la actividad biológica del bacteriófago. Para la formulación líquida, puede usarse disolución salina, agua estéril, disolución de Ringer, disolución salina fisiológica tamponada, disolución de infusión de albúmina, disolución de dextrosa, disolución de maltodextrina, glicerol, etanol, y sus mezclas como excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable. Si resulta apropiado, pueden añadirse otros aditivos convencionales, tales como espesantes, diluyentes, tampones, conservantes, agentes tensioactivos, antioxidantes y agentes bacteriostáticos. Además, también pueden añadirse diluyentes, dispersantes, tensioactivos, ligantes y lubricantes a la composición para preparar formulaciones inyectables, tales como disoluciones, suspensiones y emulsiones acuosas, formulaciones orales, tales como píldoras, cápsulas, gránulos o comprimidos, o formulaciones en polvo. Las formulaciones para la administración tópica pueden incluir tiritas, vendas, parches, películas, ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, pulverizados, tampones, compresas, líquidos y polvos. Las formulaciones para la descontaminación o para un uso médico también pueden incluir aerosoles o pulverizados.
Las composiciones de la invención pueden usarse en el campo médico, que incluye las áreas médicas humana o veterinaria, por ejemplo, para el tratamiento de una infección en un mamífero o para mejorar la condición de un sujeto. Las composiciones pueden usarse para matar bacterias de P. aeruginosa en un organismo, para tratar una infección. La composición también puede usarse para mejorar la condición de un mamífero mediante la modificación de la flora microbiana en dicho mamífero. En particular, las composiciones de la invención pueden eliminar específicamente cepas de P. aeruginosa sobre la piel o las membranas mucosas de un mamífero, modificando con ello su flora microbiana y restableciendo un equilibrio adecuado.
En un aspecto concreto, la descripción también se refiere a un método para tratar una infección en un mamífero, que comprende la administración a dicho mamífero de una composición o bacteriófago o ácido nucleico o polipéptido, como se definió anteriormente. En un aspecto concreto, el método comprende administrar al menos uno, preferiblemente al menos dos, aún más preferiblemente al menos tres bacteriófagos seleccionados de BP1384, BP1429, BP1430, BP1433, BP1450, BP1644, BP1647, BP1648, BP1649, BP1650, BP1658, BP1661 y/o BP1662, o sus variantes.
La descripción también se refiere al uso de una composición, bacteriófago o ácido nucleico, como se describió, para la fabricación de un medicamento para tratar una infección en un mamífero o para restablecer la flora microbiana en dicho mamífero.
Las composiciones o agentes de la invención pueden administrarse mediante cualquier vía conveniente, que incluye la vía intravenosa, oral, transdérmica, subcutánea, mucósica, intramuscular, intrapulmonar, intranasal, parenteral, rectal, vaginal y tópica. En una realización preferida, los bacteriófagos o las composiciones se administran por vía tópica, por ejemplo, mediante la aplicación sobre la piel de un sujeto. Las composiciones pueden administrarse directa o indirectamente, por ejemplo, a través de un soporte. A este respecto, las composiciones, por ejemplo, pueden aplicarse o pulverizarse sobre el área afectada. Las composiciones de la invención también pueden administrarse mediante la vía oral o parenteral. La dosificación adecuada para aplicar, pulverizar o administrar las composiciones de la presente invención puede ser ajustada por los expertos en la técnica dependiendo de una diversidad de factores, que incluyen la formulación, el modo de administración, la edad, el peso, el sexo, la condición, la dieta del mamífero que está siendo tratado en el momento de la administración, la vía de administración y la sensibilidad de reacción. Un médico que sea experto en la técnica puede determinar con facilidad y recetar la cantidad eficaz de la composición requerida.
Los expertos en la técnica también pueden ajustar la dosificación, de modo que se obtenga una actividad lítica contra cepas de P. aeruginosa resistentes a antibióticos. Una dosis eficaz para obtener una actividad lítica in vivo generalmente incluye una concentración de al menos 10e2 PFU/ml, preferiblemente de aproximadamente 10e2 a 10e12 PFU/ml, dependiendo de la vía de administración. La administración puede realizarse solo una vez o, si es necesario, puede repetirse.
Las composiciones de la invención pueden administrarse para tratar infecciones de P. aeruginosa, generalmente del tracto respiratorio, tracto urinario, quemaduras, heridas, oído, piel o tejidos blandos, o infecciones gastrointestinales o postquirúrgicas.
Tal como se muestra en la sección experimental, los bacteriófagos y las composiciones de la invención son capaces de matar selectivamente bacterias de P. aeruginosa in vitro o in vivo. Las composiciones pueden destruir mezclas de diferentes bacterias de P aeruginosa , incluso in vivo, incluso a una dosificación baja. Además, las composiciones de la invención son eficaces para matar bacterias en el interior de biopelículas, lo cual resulta particularmente importante para bacterias patogénicas. Además, las composiciones y los bacteriófagos de la invención son estrictamente incapaces de afectar a células de mamífero y, por tanto, son específicas y no tienen efectos secundarios in vivo.
La invención también se refiere al uso de una composición, bacteriófago o ácido nucleico de la invención para descontaminar un material. Debido a su potente efecto antibacteriano y a su capacidad para incluso comprometer la integridad de una biopelícula bacteriana, las composiciones de la invención pueden usarse como agente descontaminante, para eliminar o al menos provocar una reducción en el número de bacterias sobre un material. Estos métodos pueden aplicarse para el tratamiento de una diversidad de superficies biológicas o no biológicas en contextos médicos y no médicos, que incluyen dispositivos o materiales sólidos, tales como, por ejemplo, lentes de contacto, superficies de dispositivos que se van a implantar en el cuerpo, tuberías, conductos, recipientes de laboratorio, tejidos, etc.
Ensayos de diagnóstico/predictivos de la invención
La invención también se refiere a un método para predecir o determinar la eficacia de una terapia de bacteriófagos en un sujeto, en el que el método comprende una etapa de determinar una actividad lítica de los bacteriófagos, como se define en las reivindicaciones.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para seleccionar un sujeto o para determinar si un sujeto es susceptible de beneficiarse de una terapia de bacteriófagos, en el que el método comprende la etapa de determinar una actividad lítica de los bacteriófagos, como se define en las reivindicaciones.
Otro objeto de la invención describe un método para predecir la respuesta de un sujeto a una terapia de bacteriófagos, en el que el método comprende la etapa de determinar una actividad lítica de BP1450 contra una cepa de P. aeruginosa a partir de una muestra de dicho sujeto, siendo indicativa una actividad lítica de dicho bacteriófago de la invención contra al menos una cepa de P. aeruginosa de una buena respuesta a dicha terapia. Otros aspectos y ventajas de la invención se describirán en la siguiente sección experimental, que solo es ilustrativa.
EJEMPLOS
Materiales y métodos
Aislamiento y preparación de fagos
Se usaron bacterias MDR de P. aeruginosa para aislar y enriquecer en cada bacteriófago virulento procedente de agua de un entorno. Las muestras del entorno y un cultivo realizado durante la noche de bacterias en Luria Bertani (LB) se mezclaron y se incubaron a 37 °C durante 24 h con agitación para enriquecer en bacteriófagos específicos. Al final de la incubación, se añadieron gotas de cloroformo al cultivo. El cultivo se centrifugó a 11.000 g durante 5 minutos para retirar los residuos y las células bacterianas. El sobrenadante se sometió a un filtro de 0,2 pm para retirar las células bacterianas residuales. La disolución enriquecida en fagos se cultivó en placa sobre medio de agar LB agar que contenía P. aeruginosa. Se formaron placas sobre la placa de cultivo después de una incubación durante 24 h a 37 °C. Se escogió una única placa para la posterior purificación y amplificación de los fagos. Los fagos después se conservaron a 4 °C en una suspensión en caldo de cultivo LB o en disolución salina fisiológica. Se calculó la titulación de los fagos en una suspensión mediante recuento de placas (Postic, 1961). Se trasladaron diluciones en 10 veces de una suspensión a un césped secado de la cepa de propagación. Las placas se leyeron después de una incubación durante la noche. El método de recuento de placas también permitió la visualización de la morfología de las placas.
Determinación de la gama de hospedantes
Se determinó la gama de hospedantes de los bacteriófagos entre una colección de 20 P. aeruginosa procedentes de la colección LMG. Se mezclaron 109 células bacterianas con agar fundido, y esta mezcla se vertió sobre agar sólido para preparar placas de agar de doble capa. Después de la solidificación, se rociaron disoluciones madre de bacteriófagos aislados sobre cada placa con diferentes cepas de bacterias. Después de dejar que transcurriesen 20 min para que las manchas se absorbieran, las placas se invirtieron y se incubaron durante 24 h a 37 °C antes de registrar el grado de lisis (Postic, 1961; Yang, 2010).
Microscopía electrónica
Se tomaron micrografías electrónicas de cada fago con un microscopio de transmisión de electrones.
Secuenciación, análisis y anotación de los genomas de los fagos
Para aislar el ADN de los fagos, estos se propagaron como se describió anteriormente. El ADN de los fagos se aisló mediante extracción con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1, en v/v), precipitación con etanol y resolución en agua. Se realizó la secuenciación del genoma completo y se usó el algoritmo BLAST para determinar la similitud con genes descritos en la base de datos National Center for Biotechnology Information [NCBI]. Los genomas se barrieron para descubrir marcos de lectura abiertos ("open reading frames", ORF) potenciales.
Ejemplo 1: Características del bacteriófago-hospedante y cinética
Se realizaron experimentos de crecimiento en una sola etapa según las descripciones previas para determinar, en primer lugar, el tiempo lítico productivo, la tasa de adsorción, y después el tamaño de estallido del fago. Para determinar la tasa de adsorción se tomaron muestras en diferentes momentos para analizar las partículas de fagos libres en las disoluciones. Para la determinación del tiempo productivo y el tamaño de estallido del fago se mezclaron bacterias de P. aeruginosa con disoluciones de fagos y se dejó que los fagos se adsorbieran durante 15 min. La mezcla se sometió a una centrifugación inmediatamente a 5000 rpm durante 10 min para retirar las partículas de fagos libres. El sedimento se resuspendió en 5 medio LB fresco y el cultivo se incubó continuamente a 37 °C. Se tomaron muestras a intervalos de 3 min y se determinó la titulación de fagos. Estos resultados permiten calcular el número de fagos producidos por bacteria (tamaño de estallido), el tiempo productivo y el efecto lítico productivo (PLE), tal como se muestra en la siguiente tabla 5.
Tabla 4
Figure imgf000015_0001
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Estos resultados demuestran que todos los fagos tienen una capacidad de producción vírica y unas tasas de absorción potentes. La mayoría de los fagos tienen un PLE menor que 7, lo cual demuestra un perfil notable. Los fagos 1429 y 1647 son particularmente eficaces a este respecto. Además, los diferentes PLE y tiempos de adsorción permiten crear cócteles con variabilidad seleccionada.
Ejemplo 2: Preparación de composiciones de cócteles
Se constituyeron las siguientes composiciones de cócteles, y cada una comprende entre 10-9 y 10-11 pfu de cada bacteriófago:
Tabla 5
Figure imgf000016_0004
Se constituyeron las siguientes dos composiciones de cócteles adicionales que comprende todos los diversos fagos, que cubren la diversidad más importante de especies de P. aeruginosa:
Composición de cóctel A:
Figure imgf000016_0002
Figure imgf000016_0003
Composición de cóctel B:
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000017_0002
Ejemplo 3: Sensibilidad de las bacterias a cócteles de bacteriófagos
Se ensayaron diversas cepas de bacterias con los cócteles de bacteriófagos a 2x109 bacteriófagos/ml. Se cultivaron en placa diferentes concentraciones bacterianas sobre el cóctel de bacteriófagos a 2x109 bacteriófagos/ml y se incubaron durante 24 h a 37 °C.
Los cócteles se ensayaron con las 22 bacterias de P. aeruginosa distintas listadas en las tablas 2 y 3. El porcentaje de especies de bacterias sensibles a los cócteles se listan en la siguiente tabla 6:
Tabla 6
Figure imgf000017_0003
Las bacterias se enumeraron y se usaron para el cálculo de la tasa de resistencia (número de bacterias después de la incubación/número de bacterias cultivadas en placa). Las tasas de resistencia con un cóctel que comprende los 13 tipos diferentes de bacteriófagos se muestran en la siguiente tabla 7:
Tabla 7
Figure imgf000017_0004
Todas las bacterias ensayadas eran sensibles a las composiciones ensayadas.
Ejemplo 4: Especificidad del cóctel
Se confirmó la especificidad del cóctel ensayando diez especies de bacterias, que incluyen Escherichia coli, Acinebacter baumanii, Enterobacter aerogenes C, Enterobacter asburiae, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Staphylococus aureus, Stenotrophomonas maltophila, Serratia marcescens.
La tabla 8 resume la actividad lítica para cada bacteriófago usado independientemente o en una combinación como un cóctel de 13 bacteriófagos.
Figure imgf000018_0001
La anterior tabla demuestra claramente que no apareció actividad lítica en otras bacterias distintas de la cepa de P. aeruginosa. Por tanto, los bacteriófagos y el cóctel son muy específicos para cepas de P. aeruginosa.
Ejemplo 5: Eficacia de los bacteriófagos contra la cepa de P. aeruginosa in vitro
Se eligieron varias cepas de la colección LMG para representar la diversidad genética de P. aeruginosa y diversas formas de resistencia a antibióticos. Las cepas fueron sensibles o resistentes a uno o varios antibióticos, como se describe en la tabla 9. Se cultivaron individualmente o en combinación con 2 a 8 cepas. El cóctel de bacteriófagos se añadió a una MOI de 1 a 10e-6, es decir, a una proporción de dilución (bacteria/fago) de 1 a 1 millón.
Tabla 9: Información acerca de las cepas bacterianas
Figure imgf000018_0002
Figure imgf000019_0001
Los resultados se presentan en la figura 1 y en la siguiente tabla 10.
Tabla 10: Eficaca del cóctel de bacteriófagos obtenida in vitro con una mezcla de P. aeruoginosa a 2x10e7 cfu/ml y a diversas diluciones
Figure imgf000019_0002
Las composiciones son capaces de matar una mezcla de 8 cepas diferentes de bacterias de P. aeruginosa juntas. El cóctel sigue siendo eficaz contra 8 cepas a una dilución de 1/1000.
Ejemplo 6: Eficacia de los bacteriófagos contra una cepa de P. aeruginosa in vivo
Se usó una cepa Is580 aislada, recogida de un paciente con quemaduras en 1997, para los siguientes experimentos.
La cepa Is580 es resistente a la ampicilina, AMC, PIP, CEF, CXM, axetil CXM, FOX, CPD, CTX, CAZ, GEN, TOB, OFX, NIT, SXT.
Se usó el ratón SKH1 (o ratón sin pelo) como modelo de ratón para la infección por P. aeruginosa.
Modus operandi: (véase la siguiente tabla 11)
• Los ratones se inmunodeprimieron mediante 3 inyecciones IP de 1,5 mg de ciclofosfamida (Cy) cada 2 días desde el día -3 antes de la infección.
• Se quemó la piel de los ratones con 2 gl de iperita líquida a 30 mg/kg.
• Se infectó dos días después de la quemadura mediante una inyección subcutánea de una suspensión de bacterias en el sitio quemado.
Tabla 11
Figure imgf000020_0001
Las composiciones de cócteles se prepararon según el ejemplo 1 y se aplicaron compresas empapadas en el cóctel de bacteriófagos a 10e7 fagos/ml en el día 0.
Se ensayaron diversas concentraciones de cepas de P. aeruginosa con 100 gl de cóctel de bacteriófagos. Tal como se muestra en la figura 2, todas las cepas de P. aeruginosa fueron destruidas 6 h después del tratamiento. Tras la administración de la cepa Is580 de P. aeruginosa mediante inyección subcutánea a ratones SKH1, solo 35 % de los ratones sobrevivieron en ausencia de un tratamiento posterior. En los ratones tratados mediante una inyección de un cóctel de bacteriófagos, tal como se presenta en la anterior tabla 10, se observó una notable tasa de supervivencia (véase la figura 3): 100 % de supervivencia para los ratones SKH1 tratados por vía subcutánea, 16 días después de la infección. Por comparación, se observó 50 % de supervivencia en ratones SKH1 tratados con antibióticos 2 días después de la infección.
Por consiguiente, las composiciones pueden tratar una infección in vivo y pueden inducir una tasa de supervivencia del 100 % en ratones infectados.
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Claims (20)

  1. REIVINDICACIONES
    1 Una composición antibacteriana que comprende al menos (a) un bacteriófago que presenta actividad lítica contra una cepa de Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) y que tiene un genoma que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:5 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 97 % con esta a lo largo de la longitud entera; y (b) un bacteriófago que presenta actividad lítica contra una cepa de Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) seleccionado de los bacteriófagos que tienen un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de una cualquiera de SEQ ID NO:1 a 4 y 6 a 13 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 97 % con estas a lo largo de la longitud entera.
  2. 2. - La composición de la reivindicación 1, que comprende al menos (a) un bacteriófago que presenta actividad lítica contra una cepa de Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) y que tiene un genoma que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:5 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 97 % con esta a lo largo de la longitud entera; y (b) dos, más preferiblemente al menos tres bacteriófagos diferentes seleccionados de los bacteriófagos que tienen un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de una cualquiera de SEQ ID NO:1 a 4 y 6 a 13 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 97 % con estas a lo largo de la longitud entera.
  3. 3. - La composición de la reivindicación 1, que comprende al menos:
    • un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 97 % con esta a lo largo de la longitud entera, y un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:5 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 97 % con esta a lo largo de la longitud entera; o
    • un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 97 % con esta a lo largo de la longitud entera, y un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 97 % con esta a lo largo de la longitud entera, y un bacteriófago que tiene un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:5 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 97 % con esta a lo largo de la longitud entera.
  4. 4. - La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende una combinación de todos los bacteriófagos BP1384, BP1429, BP1430, BP1433, BP1450, BP1644, BP1647, BP1648, BP1649, BP1650, BP1658, BP1661 y BP1662 que comprenden la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 a 13, respectivamente.
  5. 5. - La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es lítica contra cepas de P. aeruginosa resistentes a antibióticos.
  6. 6. - La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
  7. 7. - La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que es una formulación líquida, semilíquida, sólida o liofilizada.
  8. 8. - La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende entre 10e4 y 10e12 PFU de cada bacteriófago.
  9. 9. - Una composición según se define en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso en el tratamiento de una infección en un mamífero.
  10. 10. - Una composición según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso para mejorar la condición de un mamífero mediante la modificación de la flora microbiana en dicho mamífero.
  11. 11. - El uso in vitro de una composición según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para descontaminar un material.
  12. 12. - Un método para preparar una composición según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende producir por separado dichos bacteriófagos, y combinar dichos bacteriófagos con un vehículo o excipiente adecuado.
  13. 13. - Un método para predecir o determinar la eficacia de una terapia de bacteriófagos en un sujeto, en el que el método comprende la etapa de determinar in vitro una actividad lítica de uno o más bacteriófagos que comprenden al menos un bacteriófago que tiene un genoma que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:5, o una secuencia que tiene una identidad de al menos 99 % con esta a lo largo de la longitud entera, contra una cepa de P. aeruginosa procedente de una muestra de dicho sujeto, y una actividad lítica de dichos uno o más bacteriófagos contra al menos una cepa de P. aeruginosa procedente de dicha muestra de dicho sujeto es indicativa de un tratamiento eficaz.
  14. 14. - Un método para seleccionar un sujeto o para determinar si un sujeto es susceptible de beneficiarse de una terapia de bacteriófagos, en el que el método comprende la etapa de determinar in vitro una actividad lítica de uno o más bacteriófagos que comprenden al menos un bacteriófago que tiene un genoma que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:5, o una secuencia que tiene una identidad de al menos 99 % con esta a lo largo de la longitud entera, contra una cepa de P. aeruginosa procedente de una muestra de dicho sujeto, en el que la presencia de una actividad lítica de dichos uno o más bacteriófagos es indicativa de un sujeto respondedor.
  15. 15. - Un bacteriófago que presenta actividad lítica contra una cepa de Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) y que tiene un genoma que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:5 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 99 % con esta a lo largo de la longitud entera.
  16. 16.- Un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:5 o una secuencia que tiene una identidad de al menos 99 % con esta a lo largo de la longitud entera.
  17. 17. - Una composición que comprende un bacteriófago según se define en la reivindicación 15, o un ácido nucleico según se define en la reivindicación 16.
  18. 18. - Un bacteriófago según se define en la reivindicación 15, o un ácido nucleico según se define en la reivindicación 16, o una composición según se define en la reivindicación 17, para su uso en el tratamiento de una infección en un mamífero.
  19. 19. - Un bacteriófago según se define en la reivindicación 15, o un ácido nucleico según se define en la reivindicación 16. o una composición según se define en la reivindicación 17, para su uso para mejorar la condición de un mamífero mediante la modificación de la flora microbiana en dicho mamífero.
  20. 20.- El uso in vitro de un bacteriófago según se define en la reivindicación 15, o de un ácido nucleico según se define en la reivindicación 16, o de una composición según se define en la reivindicación 17, para descontaminar un material.
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