JP7321970B2 - シュードモナス感染症のファージ治療 - Google Patents
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Description
バクテリオファージ(又はファージ)は、細菌に感染し、それらを死滅させる能力を呈する小さなウイルスであるが、それらは、他生物由来の細胞には影響を及ぼさない。ほぼ1世紀前にWilliam Twortにより最初に記載されており、その直ぐ後にFelix d’Herelle により独立して発見され、6000を上回る異なるバクテリオファージが今までに発見され、形態学的に記載されている(細菌性ウイルス及び古細菌ウイルスを含む)。これらのウイルスの大部分が有尾であるが、小さな割合が、多面体、糸状、又は多形性である。それらは、それらの形態、それらの遺伝的内容物(DNAであるかRNAであるか)、それらの特異的な宿主、それらが住んでいる場所(海洋ウイルスであるか他の生育地であるか)、及びそれらの生活環に従って分類されうる。細菌細胞の細胞内寄生生物として、ファージは、細菌宿主内で異なる生活環を呈する:溶解性、溶原性、擬似溶原性、及び慢性感染症(非特許文献1、非特許文献2)。溶解性ファージは、それらの生活環の正常な部分として、宿主細菌細胞の溶解を起こす。溶原ファージ(溶原性ファージとも呼ばれる)は、溶解生活環により複製して宿主細菌の溶解を起こすことができるか、又は、それらは、宿主細菌DNA中にそれらのDNAを組み入れて非感染性プロファージになることができる。ファージの生活環の型を問わず、最初の工程は、ファージ物質が細菌に入りうる前での細菌細胞壁の受容体への付着である。この特異的なプロセスは、可能なファージ・細菌相互作用のスペクトルに影響する。
本発明者らは、緑膿菌(P.aeruginosa)に対して特異的な溶解活性を提示する新規なバクテリオファージを単離し、特徴付けており、それは、特に緑膿菌細菌感染症を処置するため、又は被験者における微生物バランスを改変するために、医薬的又は獣医学的製剤中の活性薬剤として使用することができる。本発明の新規なバクテリオファージは、強い溶解活性、高い選択性を示し、非常に大きなスペクトルの緑膿菌細胞の制御された破壊を誘導するために組み合わせることができる。
本発明は、特に、哺乳動物における感染症の処置のための、及び、被験者における微生物叢を改変することにより、被験者の状態を改善するための、新規なバクテリオファージ、それらの構成成分、それを含む組成物、それらの製造、及び抗菌剤としてのそれらの使用に関する。
本発明の理解を促進するために、多数の用語を以下に定義する。
本発明は、新規なバクテリオファージ治療に関する。より詳細には、本発明は、緑膿菌株に対して高い特異性を有する新規なバクテリオファージ、それらの製造、それらの構成成分、それを含む組成物、及びファージ治療におけるそれらの使用に関する。
第1の局面において、本発明は、緑膿菌株に特異的である新規なバクテリオファージの単離及び特徴付けを開示し、単独又は組み合わせのいずれかで、溶解活性の顕著な宿主範囲のスペクトルを提示する。これらのバクテリオファージは、環境サンプルから選択され、単離、配列決定、及び特徴付される。示すとおり、バクテリオファージは、緑膿菌株に対して、個々に、及び組み合わせで活性である。それらは、病原性緑膿菌株、例えば抗生物質耐性緑膿菌株(例えばESBL緑膿菌株)に対して顕著に効果的である。更に、本発明のバクテリオファージは、20未満、より好ましくは15未満、更により好ましくは0.3と15との間の顕著な産生性溶解効果(「PLE」)を有する。更に、本発明のバクテリオファージは、緑膿菌株に特異的であり、即ち、それらは、非緑膿菌細菌の溶解を起こさない。更に例証するとおり、本発明は、これらのバクテリオファージを、医薬又は獣医薬としての使用のために適切な条件において組み合わせ、製剤化し、緑膿菌株の制御されたスペクトルに対して、標的化された、非常に強力な抗菌効果を示すことができることを示す。
例証として、本発明の全ての13ファージのカクテルによって、表2及び表3中に列挙する全ての細菌を効果的に死滅させることができる。
本発明は、本発明のバクテリオファージ中に含まれる核酸、又はそのような核酸の任意のフラグメントに関する。用語フラグメントは、より好ましくは、オープンリーディングフレームを含む(又は、それからなる)フラグメントを示す。核酸は、DNA又はRNA(一本鎖又は二本鎖)でありうる。
本発明の一局面は、上に記載するとおりの少なくとも1つのバクテリオファージ、より好ましくは、少なくとも2つ又はそれ以上、場合により、医薬的又は獣医学的に許容可能な賦形剤を含む組成物に関する。記載したとおり、本発明のバクテリオファージは、緑膿菌株に対して非常に強力な溶解活性を有する。これらのバクテリオファージの組み合せを産生し、宿主スペクトルを拡大させ、非常に効果的な抗菌組成物を産生しうる。
- 配列番号1のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号4のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ;
- 配列番号1のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号5のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ;
- 配列番号3のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号9のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ;
- 配列番号3のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号4のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ;
- 配列番号3のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号10のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ;
- 配列番号1のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号3のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号4のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ;
- 配列番号1のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号3のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号5のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ;或いは
- 配列番号1のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号3のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号9のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ。
- 配列番号1のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ;
- 配列番号2のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ;
- 配列番号3のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ;
- 配列番号4のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ;
- 配列番号5のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ;
- 配列番号6のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ;
- 配列番号7のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ;
- 配列番号8のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ;
- 配列番号9のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ;
- 配列番号10のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ;
- 配列番号11のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ;
- 配列番号12のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ;及び
- 配列番号13のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも90%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ。
実験の項において示すとおり、本発明のバクテリオファージ及び組成物は、インビトロ又はインビボで緑膿菌細菌を選択的に死滅させることができる。組成物は、インビボでさえ、低い投与量でさえ、異なる緑膿菌細菌の混合物を破壊することができる。更に、本発明の組成物は、バイオフィルム中に埋め込まれた細菌を死滅させるのに有効であり、それは、病原性細菌について特に重要である。また、本発明の組成物及びバクテリオファージは、厳密には、哺乳動物細胞に影響することができず、従って、特異的であり、インビボでの副作用を欠いている。
本発明は、また、被験者におけるバクテリオファージ治療の有効性を予測又は決定するための方法に関し、この方法は、前記被験者からのサンプルからの緑膿菌株に対する、BP1384、BP1429、BP1430、BP1433、BP1450、BP1644、BP1647、BP1648、BP1649、BP1650、BP1658、BP1661、及び/又はBP1662より選択される1つ又は複数のバクテリオファージの溶解活性を決定する工程を含み、そのような溶解活性は、効率的な処置を示す。好ましい局面において、この方法は、更に、場合により、前記被験者のサンプルからの緑膿菌株に対する溶解活性を有する1つ又は複数のバクテリオファージにより、前記被験者を処置する工程を含む。
ファージの単離及び調製
MDR緑膿菌細菌を、環境水から各々の病原性バクテリオファージを単離し、濃縮するために使用した。環境サンプルとLuria Bertani(LB)中の細菌の一晩培養物とを混合し、震盪しながら37℃で24時間インキュベートし、特定のバクテリオファージを濃縮した。インキュベーションの終了時、クロロホルムの液滴を培養物に加えた。培養物を、11,000gで5分間スピンダウンし、細菌細胞及びデブリを除いた。上清を、0.2μmフィルターに供し、残留細菌細胞を取り除いた。濃縮されたファージ溶液を、埋め込まれた緑膿菌を含むLB寒天培地上にプレーティングした。プラークが、37℃での24時間のインキュベーション後、プレート上に形成した。単一のプラークを、その後のファージの精製及び増幅のために取り出した。ファージを、次に、LBブロス又は生理食塩水の懸濁液中で4℃で保存した。
懸濁液中でのファージの力価は、プラークカウントにより推定した(Postic, 1961)。懸濁液の10倍希釈物を、増殖する株の乾燥した菌叢上に送達した。プレートを、一晩のインキュベート後に読み取った。また、プラークカウント法によりプラーク形態の可視化が可能になった。
バクテリオファージの宿主範囲を、LMGコレクションからの20の緑膿菌のコレクションの間で決定した。109個の細菌細胞を、溶融寒天と混合し、この混合物を固体寒天上に注ぎ、二重層寒天プレートを作製した。固化後、単離バクテリオファージストック溶液を、異なる細菌株とともに、各々のプレート上にスポットした。20分間でスポットを吸収させた後、プレートを反転させ、溶解度を記録する前に、37℃で24時間インキュベートし、その後、溶解の程度を記録した(Postic, 1961; Yang, 2010)。
各々のファージの電子顕微鏡写真は、透過型電子顕微鏡を用いて撮った。
ファージDNAを単離するために、ファージを、上に記載するとおりに増殖させた。ファージDNAを、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1、V/V)を用いた抽出、エタノール沈殿、及び水中での分解により単離した。全ゲノム配列決定を行い、BLASTアルゴリズムを使用して、National Center for Biotechnology Information[NCBI]データベース中に記載される遺伝子との類似性を決定した。ゲノムを、潜在的なオープンリーディングフレーム(ORF)についてスキャンした。
一工程の成長実験を、以前の記載に従って行い、最初に産生性溶解時間、吸着速度、次にファージバーストサイズを決定した。吸着速度を決定するために、サンプルを、異なる時間間隔で採取し、溶液中の遊離ファージ粒子を分析した。産生時間及びファージバーストサイズの決定のために、緑膿菌細菌をファージ溶液と混合し、ファージを15分間吸着させた。混合物を直ちに5000rpmで10分間の遠心分離に供し、遊離ファージ粒子を取り除いた。ペレットを5新鮮LB培地中に再懸濁し、培養物を継続的に37℃でインキュベートした。サンプルを3分間隔で採取し、ファージ力価を決定した。これらの結果によって、細菌当たりに産生されたファージの数(バーストサイズ)、産生時間、及び産生性溶解効果(PLE)を算出することが可能になった(下の表5に示すとおり)。
以下のカクテル組成物を構成し、各々が、10~9と10~11pfuとの間の各バクテリオファージを含む:
細菌の種々の株を、2.109個のバクテリオファージ/mlで、本発明のバクテリオファージカクテルを用いて試験した。異なる細菌濃度を、2.109個のバクテリオファージ/mlでバクテリオファージカクテル上にプレーティングし、37℃で24時間インキュベートした。
カクテルの特異性を、10の細菌種(大腸菌(Escherichia coli)、アシネトバクター・バウマニ(Acinebacter baumanii)、エンテロバクター・アエロゲネスC(Enterobacter aerogenes C)、エンテロバクター・アスブリエ(Enterobacter asburiae)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumonia)、プロテウス・ミラビリス(Porteus mirabilis)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococus aureus)、ステノトロフォモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophila)、セラチア・マルセッセンス(Serratia marcescens)を含む)での試験により確認した。
LMGコレクションのいくつかの株を、緑膿菌の遺伝的多様性及び抗生物質耐性の種々の形態を表すために選んだ。株は、1つ又はいくつかの抗生物質に感受性又は耐性のいずれかであった(表9に記載するとおり)。それらは、個々に、又は2~8株との組み合わせにおいて成長させた。バクテリオファージカクテルを、1~10e-6のMOIで、即ち、1対100万の希釈率(細菌/ファージ)で加えた。
単離Is580株(1997年に熱傷患者で回収された)を、以下の実験のために使用した。
Is580株は、アンピシリン、AMC、PIP、CEF、CXM、アキセチルCXM、FOX、CPD、CTX、CAZ、GEN、TOB、OFX、NIT、SXTに耐性である。
SKH1マウス(又はヘアレスマウス)を、緑膿菌感染症のマウスモデルとして使用した。
- マウスは、感染前の-3日目から2日毎に、1.5mgのシクロホスファミド(Cy)の3回のIP注射により免疫抑制した。
- マウスは、30mg/kgでの2μlの液体イペリットにより、皮膚上を熱傷させた。
- 熱傷部位における細菌懸濁液の皮下注射による熱傷後2日目の感染症。
Claims (10)
- 緑膿菌(P.aeruginosa)株に対する溶解活性を有し、そして配列番号1~5のいずれか1つから選択されるヌクレオチド配列又はそれと全長で少なくとも97%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むゲノムを有する、バクテリオファージ。
- 病原性緑膿菌株に対して溶解活性であるか、緑膿菌株に特異的であるか、又は抗生物質耐性緑膿菌株に対して活性であるか、又は20未満の産生性溶解効果(「PLE」)を有するか、又はそれらの組合わせである、請求項1記載のバクテリオファージ。
- 0.3と15との間の産生性溶解効果(「PLE」)を有する、請求項1又は2記載のバクテリオファージ。
- 緑膿菌株が、病原性であり、そしてセファロスポリナーゼ、カルベニシリナーゼ、及び広域スペクトルβラクタマーゼに対する耐性である、請求項1又は2記載のバクテリオファージ。
- 配列番号1~5のいずれか1つから選択されるヌクレオチド配列又はそれと全長で少なくとも97%同一性を有するヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
- 請求項1~4のいずれか一項記載のバクテリオファージ及び医薬的に許容可能な賦形剤又は担体を含む、抗菌組成物。
- 液体、半液体、固体又は凍結乾燥の製剤である、請求項6記載の組成物。
- 緑膿菌により引き起こされる感染症の患者における処置のための医薬の製造のための、請求項1~4のいずれか一項記載のバクテリオファージの又は請求項6又は7記載の組成物の使用。
- 被験体において微生物叢を改変することによる、被験体の緑膿菌により引き起こされる状態を改善するための医薬の製造のための、請求項1~4のいずれか一項記載のバクテリオファージの又は請求項6又は7記載の組成物の使用。
- 緑膿菌で汚染された物質を除染するための、請求項1~4のいずれか一項記載のバクテリオファージの又は請求項6又は7記載の組成物のin vitro使用。
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