ES2761835T3 - Fagos antibacterianos, péptidos de fagos y métodos de uso de los mismos - Google Patents

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Abstract

Un bacteriofago purificado que tiene un genoma que comprende al menos el 99% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3, y que tiene actividad antibacteriana contra una o mas cepas de Pseudomonas aeruginosa.

Description

DESCRIPCIÓN
Fagos antibacterianos, péptidos de fagos y métodos de uso de los mismos.
2. Campo de la invención.
La presente invención está dirigida al campo de la terapia con fagos para el tratamiento y control de infecciones bacterianas. En particular, la presente invención está dirigida a los novedosos bacteriófagos F1245/05, F168/08, F170/08, F770/05, F197/08, F86/06, F87s/06 y F91a/06, polipéptidos aislados de los mismos, composiciones que comprenden uno o más de los novedosos bacteriófagos y/o polipéptidos aislados y métodos para el tratamiento y prevención de infecciones bacterianas causadas por Acinetobacter baumannii, Enterococcus faecalis, E. faecium, Pseudomonas aeruginosa y/o Staphylococcus aureus, ya sea solos o en combinación con otras terapias antibacterianas, por ejemplo, antibióticos u otras terapias de fagos.
3. Antecedentes
Los bacteriófagos (fagos) son virus que infectan y lisan específicamente las bacterias. La terapia con fagos, un método para usar virus de fagos completos para el tratamiento de enfermedades infecciosas bacterianas, fue introducida en la década de 1920 por Felix d'Herelle. Inicialmente, la terapia con fagos se investigó enérgicamente y se realizaron numerosos estudios para evaluar el potencial de la terapia con fagos para el tratamiento de la infección bacteriana en humanos y animales. El éxito temprano provocó el desarrollo de múltiples preparaciones comerciales de fagos. Por ejemplo, en 1940 Eli Lilly Company produjo 7 productos de fagos para uso humano, incluidas las preparaciones de fagos para tratar diferentes enfermedades causadas por Staphylococcus sp., E. coli y otras bacterias patógenas. Estas preparaciones se usaron para tratar infecciones que causan abscesos, heridas purulentas, vaginitis, infecciones agudas crónicas del tracto respiratorio superior e infecciones mastoideas.
Sin embargo, con el desarrollo de antibióticos en la década de 1940, el interés por la terapéutica basada en fagos disminuyó en el mundo occidental. Uno de los factores más importantes que contribuyeron a esta disminución fue la carencia de protocolos de prueba estandarizados y métodos de producción. El fracaso en el desarrollo de estándares de la industria para la prueba para terapias con fagos interfirió con la documentación de los resultados del estudio, lo que condujo a una carencia de eficacia percibida, así como a problemas de credibilidad con respecto al valor de la terapia con fagos. Además, los problemas relacionados con la producción de muestras/especímenes de fagos complicaron el estudio y la investigación iniciales. Diversos estabilizadores y conservantes se utilizaron inicialmente en un intento de aumentar la viabilidad de la terapéutica con fagos. Sin embargo, debido a que la biología tanto del fago como de los diversos estabilizadores era poco conocida, muchos de los ingredientes agregados en un intento de prolongar la viabilidad de las preparaciones de fagos resultaron ser tóxicos para los humanos o impactar negativamente el almacenamiento a largo plazo. Otro problema relacionado con la producción de fagos fue el grado de pureza de las preparaciones comerciales de estos virus. En ese momento, las preparaciones para terapia con fagos generalmente consistían en lisados crudos de bacterias huésped que habían sido tratadas con el fago de interés. Por lo tanto, muchas preparaciones contenían lo que ahora se reconoce como componentes bacterianos no deseados, por ejemplo, endotoxinas. En consecuencia, los eventos adversos a menudo se asociaron con las preparaciones, particularmente en pacientes que los recibieron por vía intravenosa. Sin embargo, en Europa del Este y la antigua Unión Soviética, donde el acceso a los antibióticos era limitado, el desarrollo y el uso de la terapia con fagos continuó conjuntamente con, o en lugar de antibióticos.
Sin embargo, con el aumento de las cepas de bacterias resistentes a los antibióticos, el interés por la terapéutica basada en fagos ha vuelto en el mundo occidental. Aunque se pueden desarrollar nuevas clases de antibióticos, la posibilidad de que las bacterias eventualmente desarrollen resistencia a los nuevos fármacos ha intensificado la búsqueda de medios no quimioterapéuticos para controlar, prevenir y tratar las infecciones bacterianas. Existen tres estrategias principales basadas en fagos para utilizar la terapia con fagos en un entorno clínico: 1) la administración de fagos virulentos; 2) el uso de endolisinas o lisinas purificadas codificadas por bacteriófagos 3) el uso de proteínas estructurales de los fagos identificados como inhibidores metabólicos de enzimas clave para la síntesis de peptidoglicano bacteriano.
El documento Nakayama Keisuke et al. (Molecular Microbiology, Wiley-Blackwell publishing LTD, GB, 2000: 213-231) divulga que los genes de P. aeruginosa para la piocina F2 se encuentran corriente debajo de la aglomeración de genes R2 en el cromosoma de P. aeruginosa PAO1. Además, el mismo documento divulga que la piocina de tipo F2 se deriva de un origen ancestral común con el fago lambda. Aunque, la SEQ ID NO: 438 de la presente solicitud tiene solo un 54.4% de identidad (81.7% de similitud) sobre 241 posiciones en una superposición común con la proteína F1/PRF38.
El documento WO 00/69269 A1 divulga el uso de fagos específicos, designados ENB6 y ENB13, activos contra aislados clínicos de Enterococcus faecium resistente a vancomicina y sensible a vancomicina.
El documento WO 2004/052274 A2 divulga el uso de bacteriófagos para tratar infecciones bacterianas. Además, se divulga un método para la producción comercial a escala intermedia a gran escala de composición bacteriófaga, en donde el método reduce el volumen de producción y eleva el rendimiento de producción. Además se divulgan composiciones bacteriófagas mejoradas que comprenden azúcares específicos que reducen o eliminan la actividad neutralizante de fagos bacterianos.
Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar novedosos bacteriófagos y productos de fagos como agentes terapéuticos y profilácticos potenciales para uso in vivo para eliminar las bacterias patógenas. En particular, existe la necesidad de bacteriófagos capaces de lisar bacterias nosocomiales, incluidas Acinetobacter baumannii, Enterococcus faecalis, E. faecium, Pseudomonas aeruginosa y/o Staphylococcus aureus. Debido a que la mayoría de fagos y péptidos de fagos estudiados hasta la fecha exhiben actividad a menudo restringida a las especies o subespecies relacionadas de bacterias de las cuales están aisladas, las novedosas terapias basadas en fagos pueden encontrar un uso particular en el entorno hospitalario, dirigiéndose selectivamente a los patógenos nosocomiales sin afectar la flora circundante normal.
4. Resumen de la invención.
La presente invención está dirigida a bacteriófagos aislados y a polipéptidos antibacterianos aislados de origen bacteriófago para el tratamiento, prevención o manejo de condiciones asociadas con infección por bacterias Gram positivas o Gram negativas. En particular, el bacteriófago o polipéptidos aislados de la invención pueden usarse en composiciones farmacéuticas para el tratamiento, profilaxis o manejo de infección por patógenos nosocomiales, por ejemplo, bacterias Gram positivas que incluyen, pero no se limitan a Enterococcus faecalis, E. faecium, E hirae, E. avium, Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. auricularis, S. capitis, S. haemolyticus, S. hominis, S. saprophyticus, 5. simulans y S. xylosis; y/o bacterias Gram negativas que incluyen pero no se limitan a Acinetobacter baumannii y Pseudomonas aeruginosa. Se describe en el presente documento que las composiciones farmacéuticas de la invención son para uso en el tratamiento de condiciones asociadas con infección por cepas de bacterias resistentes a antibióticos, por ejemplo, cepas de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA). En realizaciones particulares, los bacteriófagos o polipéptidos aislados de la invención se usan para el tratamiento tópico de infección por patógenos nosocomiales en un sujeto que lo necesita. En otras realizaciones, los bacteriófagos o polipéptidos aislados de la invención se usan para el diagnóstico del agente infeccioso en una muestra (por ejemplo, muestra de tejido, sangre, orina, esputo) derivada de un paciente. En otras realizaciones, los bacteriófagos o polipéptidos aislados de la invención se usan como desinfectante profiláctico o antiinfeccioso para la preparación de superficies sólidas, que incluyen piel u otras superficies epidérmicas.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona un bacteriófago aislado, F770/05, que tiene un genoma que comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 3 y exhibe actividad antibacteriana contra una o más cepas de Pseudomonas aeruginosa.
En una realización, la invención proporciona una P. aeruginosa aislada infectada con un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 3.
Se describe aquí, polipéptidos aislados del bacteriófago F1245/05, F168/08, F170/08, F770/05, F197/08, F86/06, F87s/06 y/o F91a/06, cuyos polipéptidos exhiben actividad antibacteriana contra una o más especies o cepas de bacterias Gram positivas o Gram negativas, por ejemplo, A. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa y/o S. aureus. Los polipéptidos descritos en este documento aislados o derivados de F168/08 o F/170/08 exhiben actividad antibacteriana o antimicrobiana, por ejemplo, actividad de inducir muerte por lisis, contra al menos E. faecalis y/o E. faecium; aquellos aislados o derivados de F770/05 contra al menos P. aeruginosa; los aislados o derivados de F197/08, F86/06, F87s/06 o F91a/06 contra al menos S. aureus; y aquellos aislados o derivados de F1245/05 contra al menos A. baumannii.
Se describe en el presente documento, un polipéptido de la presente solicitud de patente que comprende o que consiste en una endolisina aislada o fragmento de la misma (por ejemplo, un dominio CHAP) que exhibe actividad antibacteriana contra una o más especies o cepas de bacterias, por ejemplo, bacterias Gram positivas y/o bacterias gram-negativas tal como A. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa y/o S. aureus. El polipéptido de la presente solicitud de patente es una proteína de lisina aislada, por ejemplo, una endolisina o lisina de cola, que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID n O: 68, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: : 203, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 641 o SEQ ID NO: 712.
Se describe en el presente documento, un polipéptido que comprende un fragmento, variante o derivado de la SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447 , SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 641 o SEQ ID NO: 712, en donde dicho fragmento, variante o derivado tiene actividad antibacteriana o actividad antimicrobiana, por ejemplo, actividad de inducir muerte por lisis, contra una o más cepas de E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa y/o S. aureus. En ejemplos específicos, la variante, fragmento o derivado de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 68, SEQ ID n O: 184, SEQ ID NO: 202 y/o SEQ ID NO: 203 exhibe actividad antibacteriana o antimicrobiana (por ejemplo, actividad de inducir muerte por lisis) contra una o más cepas de E. faecalis y/o E. faecium. En otros ejemplos, la variante, fragmento o derivado de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 641 y/o SEQ ID NO: 712 exhibe actividad antibacteriana o antimicrobiana (por ejemplo, actividad de inducir muerte por lisis) contra una o más cepas de S. aureus.
Se describe en el presente documento, el polipéptido aislado que comprende o que consiste en el dominio CHAP de la SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 641 o SEQ ID NO: 712. El polipéptido aislado comprende o consiste en el dominio CHAP de la SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 641 o SEQ ID NO: 712, por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758 o SEQ ID NO: 759, respectivamente. También se describe un polipéptido que comprende un fragmento, variante o derivado de la SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, Se Q ID NO: 758 o SEQ ID NO: 759, en donde dicho fragmento, variante o el derivado tiene actividad antibacteriana o actividad antimicrobiana, por ejemplo, actividad de inducir muerte por lisis, contra al menos una o más cepas de E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa y/o S. aureus. También se describe un polipéptido que comprende un fragmento, variante o derivado de la SEQ ID NO: 761 a SEQ ID NO: 816, en donde dicho fragmento, variante o derivado tiene actividad antibacteriana o actividad antimicrobiana, por ejemplo, actividad de inducir muerte por lisis, contra al menos una o más cepas de A. baumannii.
Se describe en el presente documento, un polipéptido que comprende o que consiste en una proteína de medida de cinta con longitud de cola aislada o proteína de cola (por ejemplo, componente de cola, proteína de fibra de cola, proteína de cola asociada a la adsorción), o fragmento de la misma, que tiene una función biológica asociada con el bacteriófago del que se deriva, por ejemplo, actividad antimicrobiana o antibacteriana (por ejemplo, actividad de inducir muerte por lisis), cuya función se dirige contra al menos una o más especies o cepas de E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa, S. aureus y/o A. baumannii. El polipéptido es una proteína de medida de cinta con longitud de cola aislada o proteínas de cola que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 435 , SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO : 539, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703 , SEQ ID NO: 704 o SEQ ID NO: 796. El polipéptido descrito en el presente documento comprende un fragmento, variante o derivado de la SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: : 440, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532 , SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704 o SEQ ID NO : 796, en donde dicho fragmento, variante o derivado exhibe una función biológica asociada con el bacteriófago del que deriva, por ejemplo, actividad antimicrobiana o antibacteriana (por ejemplo, actividad de inducir muerte por lisis), cuya función se dirige contra una o más cepas de E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa, S. aureus y/o A. baumannii.
También se describe en el presente documento una variante, fragmento o derivado de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 61 o SEQ ID NO: 63 que exhibe una función biológica asociada con el bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 1, por ejemplo, actividad antimicrobiana o antibacteriana (por ejemplo, actividad de inducir muerte por lisis), cuya función se dirige contra una o más cepas de E. faecalis y/o E. faecium. También se describe en el presente documento una variante, fragmento o derivado de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 204 o SEQ ID NO: 214 que exhibe una función biológica asociada con el bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 2, por ejemplo, actividad antimicrobiana o antibacteriana (por ejemplo, actividad de inducir muerte por lisis), cuya función se dirige contra una o más cepas de E. faecalis y/o E. faecium.
También se describe en el presente documento una variante, fragmento o derivado de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 435 o SEQ ID NO: 438 que exhibe una función biológica asociada con el bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 3, por ejemplo, actividad antimicrobiana o antibacteriana (por ejemplo, actividad de inducir muerte por lisis), cuya función se dirige contra una o más cepas de P. aeruginosa.
También se describe aquí una variante, fragmento o derivado de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO : 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537 , SEQ ID NO: 538 o SEQ ID NO: 539 que exhibe una función biológica asociada con el bacteriófago que tiene un genoma que comprende o que consiste en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 4, por ejemplo, actividad antimicrobiana o antibacteriana (por ejemplo, actividad de inducir muerte por lisis), cuya función se dirige contra una o más cepas de S. aureus. También se describe en el presente documento una variante, fragmento o derivado de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 567 o SEQ ID NO: 568 que exhibe una función biológica asociada con el bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 5, por ejemplo, actividad antimicrobiana o antibacteriana (por ejemplo, actividad de inducir muerte por lisis), cuya función se dirige contra una o más cepas de S. aureus. También se describe en el presente documento una variante, fragmento o derivado de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 632 o SEQ ID NO: 633 que exhibe una función biológica asociada con el bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 6, por ejemplo, actividad antimicrobiana o antibacteriana (por ejemplo, actividad de inducir muerte por lisis), cuya función se dirige contra una o más cepas de S. aureus. También se describe en el presente documento una variante, fragmento o derivado de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703 o SEQ ID NO: 704 que exhibe un producto biológico función asociada con el bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 7, por ejemplo, actividad antimicrobiana o antibacteriana (por ejemplo, actividad de inducir muerte por lisis), cuya función se dirige contra una o más cepas de S. aureus.
También se describe en el presente documento una variante, fragmento o derivado de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 761-816 que exhibe una función biológica asociada con el bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 760, por ejemplo, actividad antimicrobiana o antibacteriana (por ejemplo, actividad de inducir muerte por lisis), cuya función se dirige contra una o más cepas de A. baumannii.
También se describe en el presente documento polipéptidos aislados que exhiben actividad antimicrobiana o antibacteriana (por ejemplo, actividad de inducir muerte por lisis) contra una o más cepas de bacterias (por ejemplo, bacterias Gram positivas (por ejemplo, E. faecalis, E. faecium, S. aureus), bacterias Gram negativas (por ejemplo, de A. baumannii, P. aeruginosa) o bacterias no clasificadas bien sea como Gram positivas o Gramnegativas), en donde los polipéptidos aislados tienen una secuencia de aminoácidos con al menos 60%, 65%, 70 %, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia para una segunda secuencia de aminoácidos de la misma longitud (es decir, que consiste en el mismo número de residuos), cuya segunda secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 61, SEQ ID No : 63, SEQ ID NO : 68, SEQ ID NO: 184, Se Q ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440 , SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 641, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NOS: 761-816, y/o un fragmento de la misma.
Se describe en el presente documento, polipéptidos aislados que comprenden o consisten en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 8-130, SEQ ID NO: 131-343, SEQ ID NO: 344-438, SEQ ID NO: 439­ 553, SEQ ID NOS: 554-616, SEQ ID NOS: 617-681, SEQ ID NOS: 682-759 y SEQ ID NOS: 761-816. También se describe en el presente documento, se proporcionan polipéptidos aislados de la invención fusionados recombinante o químicamente conjugados (por ejemplo, conjugación covalente o no covalente) a agentes terapéuticos (por ejemplo, polipéptidos heterólogos o moléculas pequeñas).
La presente solicitud de patente también describe polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la invención. Se describe en el presente documento, un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de cualquiera de las SEQ ID NO: 8-130, SEQ ID NO: 131-343, SEQ ID NO: 344-438, SEQ ID NO: 439- 553, SEQ ID NOS: 554-616, SEQ ID NOS: 617-681, SEQ ID NOS: 682-759 y SEQ ID NOS 761-816. También se describe en el presente documento, un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de cualquiera de las SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 202 , SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO : 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 567 , SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 641, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO 761-816, o fragmento activo, variante o derivado del mismo, cuyo polipéptido o fragmento activo, variante o derivado exhibe una función biológica asociada con el bacteriófago del que se aísla y/o deriva, por ejemplo, actividad antimicrobiana o antibacteriana (por ejemplo, actividad de inducir muerte por lisis). La invención también se refiere a un vector que comprende dicho ácido nucleico. En una realización específica, dicho vector es un vector de expresión. La invención proporciona además células huésped que contienen un vector que comprende polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la invención.
La presente solicitud de patente describe métodos para la producción de polipéptidos de la invención o fragmentos activos de los mismos, en particular para uso en composiciones farmacéuticas, es decir, composiciones antimicrobianas. Por ejemplo, los polipéptidos de la invención pueden aislarse directamente de cultivos celulares (por ejemplo, cultivos de células bacterianas) infectados con el bacteriófago F1245/05, F168/08, F170/08, F770/05, F197/08, F86/06, F87s/06 o F91a/06. Alternativamente, los polipéptidos de la presente invención pueden derivarse por medios recombinantes usando vectores de expresión que comprenden los polipéptidos que codifican la secuencia de ácido nucleico de la invención, por ejemplo, SEQ ID n O: 61, SEQ ID NO: 63 , Se Q ID NO: 68, SEQ ID NO: : 184, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 446 , SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO : 539, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 641, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701 , SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NOS: 761-816, o fragmentos activos, derivados o variantes de los mismos. Los polipéptidos de la invención o fragmentos de los mismos pueden producirse mediante cualquier método conocido en la técnica para la producción de un polipéptido, en particular, mediante síntesis química o mediante técnicas de expresión recombinante. También se describe en el presente documento un método para producir recombinantemente una proteína de fago, por ejemplo, una proteína de lisina, proteína de cola o fragmento activo, variante o derivado de la misma, comprendiendo dicho método: (i) cultivo bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicha proteína en un medio, una célula huésped que contiene un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos Se Q ID NO: 61, SEQ ID n O: 63, s Eq ID NO: 68, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 641, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NOS: 761-816, o un fragmento del mismo; y (ii) recuperación de dicha proteína de dicho medio. En ciertas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la invención está operativamente enlazada a un promotor heterólogo.
La invención también abarca métodos para el diagnóstico del agente causal en una presentación clínica de infección bacteriana. Los bacteriófagos o polipéptidos aislados de la invención pueden usarse para ayudar en la determinación de especies de bacterias en una muestra de paciente estableciendo la susceptibilidad de la bacteria en la muestra a los bacteriófagos y/o polipéptidos de la invención. Tales métodos abarcan además métodos de evaluación de la actividad antibacteriana de los bacteriófagos y/o polipéptidos aislados de la invención. La actividad antibacteriana de los bacteriófagos o los polipéptidos de la invención, o la susceptibilidad de una muestra desconocida a tal actividad, puede evaluarse mediante cualquier método conocido en la técnica y/o descrito aquí. En ciertas realizaciones, la actividad antibacteriana y/o la susceptibilidad se evalúa cultivando bacterias conocidas y/o muestras de tejido, sangre, fluido o torundas del paciente de acuerdo con técnicas estándar (por ejemplo, en cultivo líquido o en placas de agar), poniendo en contacto el cultivo con bacteriófagos y/o polipéptidos de la invención y monitorización del crecimiento celular después de dicho contacto. Por ejemplo, en un cultivo líquido, las bacterias (por ejemplo, A. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa, S. aureus) pueden crecer hasta una densidad óptica ("OD") representativa de un medio punto en crecimiento exponencial del cultivo; el cultivo se expone a una o más concentraciones de uno o más bacteriófagos y/o polipéptidos de la invención y la OD se monitoriza en relación con un cultivo de control. La disminución de OD en relación con un cultivo de control es representativa de un bacteriófago y/o polipéptido que exhibe actividad antibacteriana (por ejemplo, exhibe actividad de inducir muerte por lisis) contra la muestra o especie bacteriana y/o cepa analizadas en el cultivo. De manera similar, se puede permitir que se formen colonias bacterianas en una placa de agar, la placa expuesta a un bacteriófago o polipéptido de la invención, y el crecimiento subsecuente de las colonias evaluado en relación con las placas de control. La disminución del tamaño de las colonias, o la disminución del número total de colonias, indica un bacteriófago y/o polipéptido con actividad antibacteriana contra la muestra analizada y/o las especies o cepas cultivadas.
La presente invención también está dirigida a composiciones farmacéuticas que comprenden o consisten en un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o que consiste en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 3. En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica de la invención comprende un bacteriófago que tiene el genoma que comprende o que consiste en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 3 además de uno o más de otros bacteriófagos. El uno o más de otros bacteriófagos pueden ser uno o más bacteriófagos de la invención (por ejemplo, que tienen un genoma que comprende o que consiste en una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7, o SEQ ID NO: 760), una o más cepas de las mismas, o pueden ser uno o más bacteriófagos conocidos en la técnica. Además, el uno o más bacteriófagos en la composición farmacéutica de la invención pueden apuntar a la misma o diferentes especies o cepas de bacterias. También se describe en el presente documento, las composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más bacteriófagos de la invención comprenden además uno o más polipéptidos de la invención y/u otros productos de fagos como se describe en este documento o se conoce en la técnica.
Se describe en la presente solicitud de patente, composiciones farmacéuticas que comprenden polipéptidos, o fragmentos activos de los mismos, en particular aquellos que tienen actividad antimicrobiana y/o antibacteriana, aislados de bacteriófagos que tienen un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, y/o SEQ ID NO: 760. Las composiciones farmacéuticas de la presente solicitud de patente comprenden uno o más polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 61, SEQ iD NO: 63, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 184, s Eq ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO : 448, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532 , SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 641, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO : 703, SEQ ID NO: 704, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759 o SEQ ID NOS: 761 -816. Las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden un polipéptido que es una variante, derivado o fragmento de la SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 641, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, o SEQ ID NOS: 761 -816 en donde la variante, derivado o fragmento retiene una función biológica del polipéptido del cual se deriva, por ejemplo, actividad antimicrobiana o antibacteriana (por ejemplo, actividad de inducir muerte por lisis), preferiblemente contra una o más cepas de A. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa y/o S. aureus.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender adicionalmente un vehículo, excipiente o estabilizador farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la invención son composiciones antibióticas (porque exhiben actividad antibacteriana) o composiciones terapéuticas para el tratamiento, prevención y/o mejora de síntomas de una enfermedad o trastorno asociado con infección por bacterias en un sujeto en necesidad de los mismos. En realizaciones específicas, las composiciones farmacéuticas de la invención son composiciones antibacterianas o composiciones terapéuticas para el tratamiento, prevención y/o mejora de síntomas de una enfermedad o trastorno asociado con infección por A. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P . aeruginosa y/o S. aureus. En ciertas realizaciones, el sujeto que recibe una composición farmacéutica de la invención es un mamífero (por ejemplo, bovino, ovino, caprino, equino, primate (por ejemplo, humano), roedor, lagomorfo o aviar (por ejemplo, pollo, pato, ganso)).
La presente invención proporciona métodos para el tratamiento o prevención de infección bacteriana que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una composición farmacéutica que comprende uno o más bacteriófagos o productos de fago (por ejemplo, un polipéptido bacteriófago aislado o fragmento activo, variante o derivado del mismo), opcionalmente, además de uno o más bacteriófagos u otros productos de fago, como se describe en el presente documento. En el contexto de la presente invención, "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas, en el que el objetivo es eliminar, retardar, disminuir la gravedad de, ralentizar la progresión de o retrasar o prevenir los síntomas o la causa subyacente (por ejemplo, infección bacteriana) asociada con la condición o trastorno patológico. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden usarse en el tratamiento o manejo de infecciones asociadas con cualquier infección bacteriana, que incluyen, pero no se limitan a A. baumanni, S. aureus, S. epidermidis, S. auricularis, S. capitis, S . haemolyticus, S. hominis, S. saprophyticus, S. simulans, S. xylosis, M. luteus, B. subtilis, B. pumilus, E. faecalis, E. hirae, E. faecium, E. avium, P. aeruginosa. y combinaciones de los mismos. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden usarse para tratar condiciones o trastornos asociados con infecciones bacterianas que incluyen, pero no se limitan a, endoftalmitis postoperatoria, endocarditis, infecciones del sistema nervioso central, neumonía, osteomilelitis, infecciones de heridas (por ejemplo, úlceras del pie diabético), mastitis, septicemia, intoxicación alimentaria y meningitis y/u otras condiciones asociadas con infecciones bacterianas nosocomiales.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona el uso de un bacteriófago o un producto de fago aislado (por ejemplo, un polipéptido de fago aislado o fragmento activo, variante o derivado del mismo) como terapia de agente único. En otras realizaciones, la invención proporciona el uso de un bacteriófago o producto de fago (por ejemplo, un polipéptido de fago aislado o fragmento activo, variante o derivado del mismo), en combinación con un tratamiento estándar o experimental para infección bacteriana. Tal terapia de combinación puede mejorar la eficacia del tratamiento estándar o experimental. Ejemplos de agentes terapéuticos que son particularmente útiles en combinación con un polipéptido de la invención son agentes antiinflamatorios, agentes antibióticos quimioterapéuticos estándar (por ejemplo, penicilina, penicilinas sintéticas, bacitracina, meticilina, cefalosporina, polimixina, cefaclor, cefadroxilo, cefamandol nafato, cefazolina, cefixima, cefmetazol, cefonioide, cefoperazona, ceforanida, cefotanme, cefotaxima, cefotetano, cefoxitina, cefpodoxima proxetilo, ceftazidima, ceftizoxima, ceftriaxona, cefriaxona moxalactama, cefuroxima, cefalexina, cefalosporina C, sal de cefalosporina C sódica, cefalotina, sal de sodio de cefalotina, cefapirina, cefradina, cefuroximeaxetilo, dihidratecefalotin, moxalactam, loracarbef mafate y agentes quelantes), agentes anestésicos locales y/o corticosteroides. En aún otra realización, las composiciones de la presente invención pueden combinarse con uno o más bacteriófagos o productos de fago conocidos en la técnica. Las terapias combinadas abarcadas por la invención pueden formularse en una única composición farmacéutica o pueden administrarse en composiciones separadas, pero como parte de un régimen de tratamiento global.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse mediante cualquier método conocido en la técnica adecuado para la administración de un compuesto antibacteriano (por ejemplo, por vía oral o parenteral (por ejemplo, administración por inhalación, intramuscular, intravenosa o epidérmica)). En realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas de la invención se administran tópicamente, por ejemplo, en una formulación tópica. Las composiciones de la invención pueden usarse tópicamente para tratar y/o prevenir infecciones nosocomiales comunes, tales como infecciones en sitios de incisión quirúrgica o asociadas con catéteres o drenajes. En otras realizaciones, las composiciones de la invención se usan para tratar infecciones bacterianas de la piel o capas dérmicas superiores (por ejemplo, infecciones de úlceras del pie diabético).
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden usarse para usos tradicionalmente no terapéuticos, tales como agentes antibacterianos en cosméticos, o en aerosoles o soluciones para uso en superficies sólidas para evitar la colonización de bacterias (es decir, como desinfectantes).
Los métodos para seleccionar péptidos para actividad antibacteriana también se describen en el presente documento. En una realización, el método comprende seleccionar secuencias de aminoácidos contiguas de al menos 6, 10, 15, 20 o 25 residuos de longitud que están codificadas por los marcos de lectura abiertos de la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, o SEQ ID NO: 760 para actividad antibacteriana, dicha actividad antibacteriana medida por la capacidad de los péptidos para inhibir el crecimiento bacteriano en agar o cultivo líquido.
4.1 Definiciones
Como se usa en el presente documento, el término "fragmento" se refiere a un péptido o polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 5 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 15 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 20 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 25 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 40 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 50 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 60 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 70 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 80 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 90 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 100 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 125 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 150 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 175 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 200 residuos de aminoácidos contiguos, o al menos 250 residuos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de una proteína. En una realización específica, el fragmento es un fragmento funcional porque retiene al menos una función de la proteína de la que se aísla (por ejemplo, actividad antimicrobiana o antibacteriana (por ejemplo, inducir muerte celular por lisis)).
Como se usa en el presente documento, los términos "productos bacteriófagos activos" y "productos bacteriófagos" se refieren a polipéptidos, o fragmentos, variantes o derivados de los mismos, aislados de un bacteriófago de la invención, cuyo polipéptido, o fragmento, variante o derivado del mismo, exhibe una función biológica o actividad asociada con el bacteriófago del que se aisló o derivó (por ejemplo, actividad antimicrobiana o antibacteriana (por ejemplo, inducir muerte celular por lisis)).
Como se usa en el presente documento, el término "aislado" en el contexto de un péptido, polipéptido o proteína de fusión o se refiere a un péptido, polipéptido o proteína de fusión que está sustancialmente libre de material celular o proteínas contaminantes de la fuente celular o tisular de la que proviene se deriva, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos cuando se sintetiza químicamente. El lenguaje "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de un péptido, polipéptido o proteína de fusión en el que el péptido, polipéptido o proteína de fusión se separa de los componentes celulares de las células de las que se aísla o se produce recombinantemente. Por lo tanto, un péptido, polipéptido o proteína de fusión que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de un péptido, polipéptido o proteína de fusión que tiene menos de aproximadamente 30%, 20%, 10% o 5% (en peso seco) de proteína heteróloga (también denominado en el presente documento "proteína contaminante"). Cuando el péptido, polipéptido o proteína de fusión se produce de manera recombinante, también está preferiblemente sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, 10% o 5% del volumen de la preparación de proteína. Cuando el péptido, polipéptido o proteína de fusión se produce por síntesis química, preferiblemente está sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos, es decir, se separa de los precursores químicos u otros químicos que están involucrados en la síntesis del péptido, polipéptido o proteína de fusión. En consecuencia, tales preparaciones de un péptido, polipéptido, proteína de fusión o anticuerpo tienen menos del 30%, 20%, 10%, 5% (en peso seco) de precursores químicos o compuestos distintos del péptido, polipéptido o proteína de fusión de interés.
Como se usa en el presente documento, el término "aislado" en el contexto de moléculas de ácido nucleico se refiere a una molécula de ácido nucleico que está separada de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural de la primer molécula de ácido nucleico. Además, una molécula de ácido nucleico "aislada", tal como una molécula de ADNc, está sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente y puede estar libre de ADNc u otras moléculas de ADN genómico, por ejemplo, se han aislado de otros clones en una biblioteca de ácido nucleico.
El término "purificado" significa que el péptido, polipéptido, proteína de fusión o la molécula de ácido nucleico ha aumentado considerablemente en concentración mediante cualquier proceso de purificación, que incluye, pero no se limita a, cromatografía en columna, HPLC, precipitación, electroforesis, etc., por lo tanto parcialmente, eliminar sustancialmente o completamente impurezas tales como precursores u otros productos químicos implicados en la preparación del péptido, polipéptido, proteína de fusión o molécula de ácido nucleico. Un experto en la técnica apreciará la cantidad de purificación necesaria para un uso dado. Por ejemplo, la proteína aislada destinada para uso en composiciones terapéuticas destinadas a la administración a humanos normalmente debe ser de alta pureza de acuerdo con los estándares regulatorios y los buenos procesos de fabricación.
Como se usa en el presente documento, el término "derivado" en el contexto de polipéptidos se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que ha sido alterada por la introducción de sustituciones, deleciones o adiciones de residuos de aminoácidos. El término "derivado" como se usa en el presente documento también se refiere a un polipéptido que se ha modificado, es decir, mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula al polipéptido. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, un polipéptido puede modificarse, por ejemplo, por glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivación por grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolítica, enlazamiento a un ligando celular u otra proteína, etc. Se puede producir un polipéptido derivado mediante modificaciones químicas usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, un polipéptido derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos. Un derivado de polipéptido posee una función similar o idéntica al polipéptido del que se deriva. El término "derivado" como se usa en referencia a un polipéptido "derivado" de un organismo también puede referirse al aislamiento de un polipéptido directamente de dicho organismo (por ejemplo, células bacterianas o fagos).
Como se usa en el presente documento, el término "célula huésped" se refiere a la célula sujeto particular transfectada con una molécula de ácido nucleico y la progenie o progenie potencial de tal célula que contiene la molécula de ácido nucleico o la versión cromosómicamente integrada de la misma. La progenie de tal célula puede no ser idéntica a la célula madre transfectada con la molécula de ácido nucleico debido a mutaciones o influencias ambientales que pueden ocurrir en generaciones sucesivas o la integración de la molécula de ácido nucleico en el genoma de la célula huésped. Para la expresión de proteínas y polipéptidos bacteriófagos, la célula huésped preferiblemente no es de la misma especie o cepa de la que se aisló o cultivó el bacteriófago.
Como se usa en el presente documento, el término "en combinación" se refiere al uso de más de un agente profiláctico y/o terapéutico. El uso del término "en combinación" no restringe el orden en que los agentes profilácticos y/o terapéuticos se administran a un sujeto con una enfermedad o trastorno. Se puede administrar un primer agente profiláctico o terapéutico antes de (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas antes), concomitantemente con o subsecuentemente a (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos , 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, o 12 semanas después) la administración de un segundo agente profiláctico o terapéutico (diferente del primer agente profiláctico o terapéutico) a un sujeto con una enfermedad o trastorno.
Como se usa en el presente documento, los términos "ácidos nucleicos" y "secuencias de nucleótidos" incluyen moléculas de ADN y/o ARN monocatenarias y bicatenarias, o combinaciones de los mismos. Como se usa en este documento, el término "codificado por el ácido nucleico" se refiere a una secuencia de aminoácidos que resulta de la traducción de la secuencia directa, inversa, complementaria o inversamente complementaria de la secuencia de ácido nucleico referenciada usando el código genético estándar (es decir, tripletes de codones estándar) como son bien conocidos en la técnica.
Como se usa en el presente documento, los términos "agente profiláctico" y "agentes profilácticos" se refieren a bacteriófagos y/o polipéptidos de la invención, que pueden usarse en la prevención, tratamiento, manejo o mejora de uno o más síntomas asociados con la infección por una bacteria. .
Como se usa en el presente documento, los términos "agente terapéutico" y "agentes terapéuticos" se refieren a bacteriófagos y/o polipéptidos de la invención que pueden usarse en la prevención, tratamiento, manejo o mejora de uno o más síntomas de una enfermedad o trastorno, en particular, una enfermedad o trastorno asociado con una infección bacteriana.
Como se usa en el presente documento, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de un agente terapéutico suficiente para dar como resultado la mejora de uno o más síntomas de una enfermedad o trastorno, en particular, una enfermedad o trastorno asociado con una infección bacteriana.
Como se usa en el presente documento, los términos "tratar", "tratamiento" y "trato" se refieren a la mejora de uno o más síntomas asociados con una infección bacteriana que resulta de la administración de uno o más bacteriófagos y/o polipéptidos de la invención. Como se señaló anteriormente, "tratamiento" y los términos relacionados se refieren tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas, en las que el objetivo es eliminar, retrasar, disminuir la gravedad de, ralentizar la progresión de, o demorar o prevenir los síntomas o la causa subyacente (por ejemplo, infección bacteriana) asociada con la condición o trastorno patológico.
Como se usa en el presente documento, los términos "actividad antibacteriana" y "actividad antimicrobiana" con referencia a un bacteriófago, proteína bacteriófaga aislada (o variante, derivado o fragmento de la misma), o producto bacteriófago, se usan indistintamente para referirse a la capacidad de matar y/o inhibir el crecimiento o la reproducción de un microorganismo, en particular, las bacterias de la especie o cepa que infecta el bacteriófago. En ciertas realizaciones, la actividad antibacteriana o antimicrobiana se evalúa cultivando bacterias (por ejemplo, bacterias Gram positivas (por ejemplo, E. faecalis, E. faecium, S. aureus), bacterias Gram negativas (por ejemplo, A. baumannii, P. aeruginosa ) o bacterias no clasificadas como Gram positivas o Gram negativas) de acuerdo con las técnicas estándar (por ejemplo, en cultivo líquido o en placas de agar), poniendo en contacto el cultivo con un bacteriófago o polipéptido de la invención y monitorizando el crecimiento celular después de dicho contacto. Por ejemplo, en un cultivo líquido, la bacteria puede crecer hasta una densidad óptica ("OD") representativa de un punto medio en el crecimiento exponencial del cultivo; el cultivo se expone a una o más concentraciones de uno o más bacteriófagos o polipéptidos de la invención y la OD se monitoriza en relación con un cultivo de control. La disminución de OD en relación con un cultivo de control es representativa de un bacteriófago o polipéptido que exhibe actividad antibacteriana (por ejemplo, exhibe actividad de inducir muerte por lisis). De manera similar, se puede permitir que se formen colonias bacterianas en una placa de agar, la placa expuesta a un bacteriófago o polipéptido de la invención, y el crecimiento subsecuente de las colonias evaluadas relacionadas con las placas de control. La disminución del tamaño de las colonias, o la disminución del número total de colonias, indican un bacteriófago o polipéptido con actividad antibacteriana.
Como se usa en el presente documento, un "dominio CHAP" se refiere a un dominio amidasa conservado que se encuentra en varias peptidoglicano hidrolasas codificadas por fagos y significa "cisterna, amidohidrolasas/peptidasas dependientes de histidina". Véase, por ejemplo, Rigden D, et. al., Trends Biochem Sci. 28 de mayo de 2003 (5): 230­ 4. Se encuentra en una superfamilia de amidasas, incluidas la amidasa GSP y las hidrolasas de peptidoglicano. La familia incluye al menos dos tipos diferentes de actividades de escisión de peptidoglicano: actividad de L-muramoil-L-alanina amidasa y D-alanil-glicil endopeptidasa. Los dominios CHAP generalmente contienen residuos de cisteína e histidina conservados e hidrolizan sustratos que contienen Y-glutamilo. Se cree que estos residuos de cisteína son esenciales para la actividad de varias de estas amidasas, y sus grupos tiol parecen funcionar como nucleófilos en los mecanismos catalíticos de todas las enzimas que contienen este dominio. Los dominios CHAP a menudo se encuentran en asociación con otros dominios que escinden el peptidoglicano, por ejemplo, actúan de manera cooperativa para escindir sustratos especializados. Véase también, Bateman A, et al., Trends Biochem Sci. 28 de mayo de 2003 (5): 234-7.
5. Breve descripción de las figuras.
Figura 1: Esquema de la organización del genoma F168/08, que comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1. Los marcos de lectura abiertos ("ORF") predichos en el genoma están representados por flechas y numerados en negro. La dirección de una flecha indica la dirección de la transcripción. Codificación de colores: negro - ORFs para cuyos productos se podría realizar una asignación funcional basada en las funciones conocidas de proteínas homólogas (los productos que codifican los ORF que exhiben homología con las mismas proteínas o proteínas similares se indican usando el mismo número y diferenciados por letras minúsculas); Gris: ORFs que codifican productos que son similares a las proteínas de función desconocida; Blanco o vacío: ORFs que codifican proteínas que no comparten una homología significativa con las proteínas en las bases de datos disponibles. Los ORF asignados funcionalmente también se listan en la figura. La información en la figura también se incluye en forma de tabla en la FIG. 2)
Figuras 2A-X: características del genoma del bacteriófago F168/08, incluidos los productos genéticos y la asignación de funciones putativas. La figura incluye una lista de los ORF del genoma y proporciona para cada ORF (i) su posición dentro del genoma, (ii) la secuencia de aminoácidos codificada, (iii) una lista de proteínas homólogas y dominios conservados dentro de su polipéptido codificado y (iv) una asignación de función putativa. Los ORF 1-116 listados en la Figura 2 codifican las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8-130, respectivamente.
Figuras 3A-B: el rango de huésped de F168/08 determinado por la prueba de punto en 105 cepas de Enterococcus faecalis (EFS) (3A) y 56 Enterococcus faecium (EFM) (3B) aisladas de muestras clínicas. Cada punto contenía 5 |jl de suspensión de bacteriófagos con títulos indicados (preparados a partir de lisado purificado con CsCl). La sensibilidad de cada cepa al fago se evaluó con base a una escala relativa que variaba de halos de lisis turbios (+) a claros (++++). La resistencia a la infección por fagos se indica como (-).
Figura 4: Esquema de la organización del genoma F170/08, que comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 2. Los ORF predichos en el genoma están representados por flechas y numerados en negro. La dirección de una flecha indica la dirección de la transcripción. Codificación de colores: negro - ORFs para cuyos productos se podría realizar una asignación funcional basada en las funciones conocidas de proteínas homólogas (los productos que codifican ORF que exhiben homología con las mismas proteínas o proteínas similares se indican usando el mismo número y diferenciados por letras minúsculas); Gris: ORFs que codifican productos que son similares a las proteínas de función desconocida; Blanco o vacío: ORFs que codifican proteínas que no comparten una homología significativa con las proteínas en las bases de datos disponibles. Los ORF asignados funcionalmente también se listan en la figura. La información en la figura también se incluye en forma de tabla en la FIG. 5)
Figuras 5A-AR: características del genoma del bacteriófago F170/08, incluidos los productos genéticos y la asignación de funciones putativas. La figura incluye una lista de los ORF del genoma y proporciona para cada ORF (i) su posición dentro del genoma, (ii) la secuencia de aminoácidos codificada, (iii) una lista de proteínas homólogas y dominios conservados dentro de su polipéptido codificado y (iv) una asignación de función putativa. Los ORF 1-213 listados en la Figura 5 codifican las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 131-343, respectivamente.
Figuras 6A-B: el rango de huésped de F170/08 determinado por la prueba de punto en 105 cepas de Enterococcus faecalis (EFS) (6A) y 56 Enterococcus faecium (EFM) (6B) aisladas de muestras clínicas. Cada punto contenía 5 j l de suspensión de bacteriófagos con títulos indicados (preparados a partir de lisado purificado con CsCl). La sensibilidad de cada cepa al fago se evaluó con base a una escala relativa que variaba de halos de lisis turbios (+) a claros (++++). La resistencia a la infección por fagos se indica como (-).
Figura 7: Esquema de la organización del genoma F770/05, que comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 3. Los ORF predichos en el genoma están representados por flechas y numerados en negro. La dirección de una flecha indica la dirección de la transcripción. Codificación de colores: negro - ORFs para cuyos productos se podría realizar una asignación funcional basada en las funciones conocidas de proteínas homólogas (los productos que codifican ORF que exhiben homología con las mismas proteínas o proteínas similares se indican usando el mismo número y diferenciados por letras minúsculas); Gris: ORFs que codifican productos que son similares a las proteínas de función desconocida; Blanco o vacío: ORFs que codifican proteínas que no comparten una homología significativa con las proteínas en las bases de datos disponibles. Los ORF asignados funcionalmente también se listan en la figura. La información en la figura también se incluye en forma de tabla en la FIG. 8)
Figuras 8A-AC: Características del genoma del bacteriófago F770/05, incluidos productos genéticos y asignación de funciones putativas. La figura incluye una lista de los ORF del genoma y proporciona para cada ORF (i) su posición dentro del genoma, (ii) la secuencia de aminoácidos codificada, (iii) una lista de proteínas homólogas y dominios conservados dentro de su polipéptido codificado y (iv) una asignación de función putativa. Los ORF 1-95 listados en la FIG. 8 codifican las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 344-438, respectivamente.
Figura 9: El rango de huésped de F770/05 determinado por la prueba de punto en 100 cepas de Pseudomonas aeruginosa (PSA) aisladas de muestras clínicas. Cada punto contenía 5 |jl de suspensión de bacteriófagos con títulos indicados (preparados a partir de lisado purificado con CsCl). La sensibilidad de cada cepa al fago se evaluó con base en una escala relativa que variaba de halos de lisis turbios (+) a claros (++++). La resistencia a la infección por fagos se indica como (-).
Figura 10: Esquema de la organización del genoma F197/08, que comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 4. Los ORF predichos en el genoma están representados por flechas y numerados en negro. La dirección de una flecha indica la dirección de la transcripción. Codificación de colores: negro - ORFs para cuyos productos se podría realizar una asignación funcional basada en las funciones conocidas de proteínas homólogas (los productos que codifican ORF que exhiben homología con las mismas proteínas o proteínas similares se indican usando el mismo número y diferenciados por letras minúsculas); Gris: ORFs que codifican productos que son similares a las proteínas de función desconocida; Blanco o vacío: ORFs que codifican proteínas que no comparten una homología significativa con las proteínas en las bases de datos disponibles. Los ORF asignados funcionalmente también se listan en la figura. La información en la figura también se incluye en forma de tabla en la FIG. 11)
Figuras 11A-AA: Características del genoma del bacteriófago F197/08, incluidos productos genéticos y asignación de funciones putativas. La figura incluye una lista de los ORF del genoma y proporciona para cada ORF (i) su posición dentro del genoma, (ii) la secuencia de aminoácidos codificada, (iii) una lista de proteínas homólogas y dominios conservados dentro de su polipéptido codificado y (iv) una asignación de función putativa. Los ORF 1-66 listados en la FIG. 11 codifican las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 439-553, respectivamente.
Figura 12: El rango de huésped de F197/08 determinado por la prueba de punto en 100 cepas de Staphylococcus aureus (STA) aisladas de muestras clínicas. Cada punto contenía 5 j l de suspensión de bacteriófagos con títulos indicados (preparados a partir de lisado purificado con CsCl). La sensibilidad de cada cepa al fago se evaluó con base en una escala relativa que variaba de halos de lisis turbios (+) a claros (++++). La resistencia a la infección por fagos se indica como (-).
Figura 13: Esquema de la organización del genoma F86/06, que comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 5. Los ORF predichos en el genoma están representados por flechas y numerados en negro. La dirección de una flecha indica la dirección de la transcripción. Codificación de colores: negro - ORFs para cuyos productos se podría realizar una asignación funcional basada en las funciones conocidas de proteínas homólogas (los productos que codifican los ORF que exhiben homología con las mismas proteínas o proteínas similares se indican usando el mismo número y diferenciados por letras minúsculas); Gris: ORFs que codifican productos que son similares a las proteínas de función desconocida; Blanco o vacío: ORFs que codifican proteínas que no comparten una homología significativa con las proteínas en las bases de datos disponibles. Los ORF asignados funcionalmente también se listan en la figura. La información en la figura también se incluye en forma de tabla en la FIG. 14)
Figuras 14A-S: características del genoma del bacteriófago F86/06, incluidos los productos genéticos y la asignación de funciones putativas. La figura incluye una lista de los ORF del genoma y proporciona para cada ORF (i) su posición dentro del genoma, (ii) la secuencia de aminoácidos codificada, (iii) una lista de proteínas homólogas y dominios conservados dentro de su polipéptido codificado y (iv) una asignación de función putativa. Los ORF 1-63 listados en la FIG. 14 codifican las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 554-616, respectivamente.
Figura 15: El rango de huésped de F86/06, determinado por la prueba de punto en 100 cepas de Staphylococcus aureus (STA) aisladas de muestras clínicas. Cada punto contenía 5 j l de suspensión de bacteriófagos con títulos indicados (preparados a partir de lisado purificado con CsCl). La sensibilidad de cada cepa al fago se evaluó con base en una escala relativa que variaba de halos de lisis turbios (+) a claros (++++). La resistencia a la infección por fagos se indica como (-).
Figura 16: Esquema de la organización del genoma F87s/06, que comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 6. Los ORF predichos en el genoma están representados por flechas y numerados en negro. La dirección de una flecha indica la dirección de la transcripción. Codificación de colores: negro - ORFs para cuyos productos se podría realizar una asignación funcional basada en las funciones conocidas de proteínas homólogas (los productos que codifican ORFs que exhiben homología con las mismas proteínas o proteínas similares se indican usando el mismo número y diferenciados por letras minúsculas); Gris: ORFs que codifican productos que son similares a las proteínas de función desconocida; Blanco o vacío: ORF que codifican proteínas que no comparten una homología significativa con las proteínas en las bases de datos disponibles. Los ORF asignados funcionalmente también se listan en la figura. La información en la figura también se incluye en forma de tabla en la FIG. 17)
Figuras 17A-U: características del genoma del bacteriófago F87s/06, incluidos productos genéticos y asignación de funciones putativas. La figura incluye una lista de los ORF del genoma y proporciona para cada ORF (i) su posición dentro del genoma, (ii) la secuencia de aminoácidos codificada, (iii) una lista de proteínas homólogas y dominios conservados dentro de su polipéptido codificado y (iv) una asignación de función putativa. Los ORF 1-61 listados en la FIG. 17 codifican las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 617-681, respectivamente.
Figura 18: El rango de huésped de F87s/06 según lo determinado por la prueba de punto en 100 cepas de Staphylococcus aureus (STA) aisladas de muestras clínicas. Cada punto contenía 5 |jl de suspensión de bacteriófagos con títulos indicados (preparados a partir de lisado purificado con CsCl). La sensibilidad de cada cepa al fago se evaluó con base en una escala relativa que variaba de halos de lisis turbios (+) a claros (++++). La resistencia a la infección por fagos se indica como (-).
Figura 19: Esquema de la organización del genoma F91a/06, que comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 7. Los ORF predichos en el genoma están representados por flechas y numerados en negro. La dirección de una flecha indica la dirección de la transcripción. Codificación de colores: negro - ORFs para cuyos productos se podría realizar una asignación funcional basada en las funciones conocidas de proteínas homólogas (los productos que codifican ORF que exhiben homología con las mismas proteínas o proteínas similares se indican usando el mismo número y diferenciados por letras minúsculas); Gris: ORFs que codifican productos que son similares a las proteínas de función desconocida; Blanco o vacío: ORFs que codifican proteínas que no comparten una homología significativa con las proteínas en las bases de datos disponibles. Los ORF asignados funcionalmente también se listan en la figura. La información en la figura también se incluye en forma de tabla en la FIG. 20)
Figuras 20A-U: características del genoma del bacteriófago F91a/06, incluidos productos genéticos y asignación de funciones putativas. La figura incluye una lista de los ORF del genoma y proporciona para cada ORF (i) su posición dentro del genoma, (ii) la secuencia de aminoácidos codificada, (iii) una lista de proteínas homólogas y dominios conservados dentro de su polipéptido codificado y (iv) una asignación de función putativa. Los ORF 1-64 listados en la FIG. 20 codifican las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 682-754, respectivamente.
Figura 21: El rango de huésped de F91a/06 según lo determinado por la prueba de punto en 100 cepas de Staphylococcus aureus (STA) aisladas de muestras clínicas. Cada punto contenía 5 j l de suspensión de bacteriófagos con títulos indicados (preparados a partir de lisado purificado con CsCl). La sensibilidad de cada cepa al fago se evaluó con base en una escala relativa que variaba de halos de lisis turbios (+) a claros (++++). La resistencia a la infección por fagos se indica como (-).
Figura 22: Organización esquemática del genoma F1245/05, que comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 760. Los ORF predichos en el genoma de 43 kb están representados por flechas y numerados en negro. Para los ORFs funcionalmente asignados, el número se sustituye por la función predicha. La dirección de una flecha indica la dirección de la transcripción. Codificación de color: negro - ORFs para cuyos productos se podría realizar una asignación funcional basada en proteínas homólogas; Gris: ORF que codifican productos que son similares a las proteínas de función desconocida; Rayado - ORFs con una función asignada basada en su posición relativa del genoma y en la presencia de dominios de transmembrana putativos en el producto codificado; Flechas vacías: ORFs que codifican proteínas que no comparten una homología significativa con proteínas en bases de datos.
Figuras 23A-I: Se proporcionan características del genoma del bacteriófago F1245/05, incluidos productos genéticos y asignación de funciones putativas.
Figuras 24A-E: Se proporciona el rango de huésped de F1245/05 según lo determinado por la prueba de punto en 100 cepas de Acinetobacter baumannii aisladas de muestras clínicas. Cada punto contenía 5 j l de suspensiones de bacteriófagos con títulos indicados (preparados a partir de lisado purificado con CsCl). La sensibilidad al fago se presenta como una escala que va desde halos de lisis turbios (+) hasta claros (++++). La resistencia a la infección por fagos se indica como (-).
6. Descripción detallada
La presente invención está dirigida a bacteriófagos aislados, y sus productos de polipéptidos aislados, que tienen actividad antibacteriana contra una o más especies o cepas de los patógenos nosocomiales A. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa y S. aureus. En el presente documento se describen bacteriófagos o polipéptidos aislados que exhiben actividad antimicrobiana y/o antibacteriana contra cepas de S. aureus resistentes a meticilina (MRSA). Además, los bacteriófagos y polipéptidos descritos en este documento pueden exhibir actividad anti bacteriana o antimicrobiana contra una o más especies o cepas de bacterias patógenas que incluyen, pero no se limitan a, S. epidermidis, S. auricularis, S. capitis, S. haemolyticus, S . hominis, S. saprophyticus, S. simulans, S. xylosis, Micrococcus luteus, Bacilus subtilis, B. pumilus, E. hirae y E. avium.
Se describe en el presente documento un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1. Un ejemplo específico a este respecto es el bacteriófago aislado F168/08, que se direcciona a varias cepas de E. faecalis y E. faecium. Los marcos de lectura abiertos (ORF) en el genoma F168/08, las secuencias de aminoácidos codificadas por los ORF y la asignación de funciones putativas de las secuencias de aminoácidos codificadas (es decir, proteínas y/o polipéptidos codificados) se proporcionan en la FIG. 2 (también proporciona las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOS: 8-130).
Los Enterococci son bacterias esféricas Gram positivas que forman colonias en grupos o cadenas. Se encuentran como parte de la flora del tracto digestivo en muchos mamíferos, incluidos los humanos. Las infecciones por Enterococcus representan el 12% de todas las infecciones nosocomiales. Una infección por Enterococcus puede causar infecciones abdominales complicadas, infecciones de la piel y la estructura de la piel, infecciones del tracto urinario e infecciones del torrente sanguíneo, que pueden ser difíciles de tratar, particularmente en los casos en que la cepa involucrada ha desarrollado resistencia a varios antibióticos. En tales casos, la infección puede ser mortal, especialmente cuando el paciente ya es inmunodeficiente.
Enterococcus faecalis representa la mayoría de las infecciones por Enterococci y es una bacteria comensal Gram positiva que habita en el tracto gastrointestinal de humanos y otros mamíferos. Es no móvil y facultativamente anaeróbico. E. faecalis puede causar endocarditis, así como infecciones de vejiga, próstata y epididimales, incluidas infecciones potencialmente mortales en humanos, especialmente en el entorno nosocomial. E. faecalis es resistente a muchos agentes antimicrobianos de uso común (tales como, por ejemplo, aminoglucósidos, aztreonam, cefalosporinas, clindamicina, las penicilinas semisintéticas nafcilina y oxacilina, trimetoprim-sulfametoxazol y similares).
Se sabe que Enterococcus faecium tiene resistencia a varios tipos de antibióticos, incluidas las quinolonas y los aminoglucósidos. También se conocen cepas de E. faecium resistentes a la vancomicina. La resistencia a varios antibióticos y la tolerancia a las condiciones adversas hacen que E. faecium sea una preocupación importante para la comunidad médica, que ha calificado a este microbio como un "supergermen". También se describe aquí un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 2. Un ejemplo específico de acuerdo con esta realización es el bacteriófago aislado F170/08, que está direccionado a un número de cepas de E. faecalis y E. faecium. Los marcos de lectura abiertos (ORF) en el genoma F178/08, las secuencias de aminoácidos codificadas por los ORF y la asignación de funciones putativas de las secuencias de aminoácidos codificadas (es decir, proteínas y/o polipéptidos codificados) se proporcionan en la FIG. 5 (también proporciona las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOS: 131-343).
En una realización, la invención proporciona un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 3. Un ejemplo específico de acuerdo con esta realización es el bacteriófago aislado F770/05, que está direccionado a u número de cepas de P. aeruginosa. Los marcos de lectura abiertos (ORF) en el genoma F770/05, las secuencias de aminoácidos codificadas por los ORF y la asignación de funciones putativas de las secuencias de aminoácidos codificadas (es decir, proteínas y/o polipéptidos codificados) se proporcionan en la FIG. 8 (también proporciona las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOS: 344-438).
Pseudomonas aeruginosa es una bacteria Gram negativa común en forma de bastón que se encuentra en el suelo, el agua, la flora de la piel y la mayoría de los ambientes artificiales. Prospera no solo en atmósferas normales, sino también con poco oxígeno como anaerobio facultativo, y puede infectar tejidos dañados o inidviduales inmunocomprometidos. Cuando tales colonizaciones ocurren en órganos corporales críticos tal como los pulmones, el tracto urinario y los riñones, los resultados pueden ser fatales. Debido a que prospera en las superficies, esta bacteria también se encuentra sobre y en equipos médicos, incluidos los catéteres, causando infecciones cruzadas en hospitales y clínicas. P. aeruginosa es uno de los patógenos oportunistas y nosocomiales más relevantes, y se ha estimado que una de cada diez infecciones adquiridas por vía hospitalaria es de Pseudomonas. La P. aeruginosa es también la causa más común de infecciones por lesiones por quemaduras y el colonizador más frecuente de dispositivos médicos, tal como los catéteres.
También se describe aquí un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 4. Un ejemplo específico a este respecto es el bacteriófago aislado F197/08, que está direccionado a un número de cepas de S. aureus. Los marcos de lectura abiertos (ORF) en el genoma F197/08, las secuencias de aminoácidos codificadas por los ORF y la asignación de funciones putativas de las secuencias de aminoácidos codificadas (es decir, proteínas y/o polipéptidos codificados) se proporcionan en la FIG. 11 (también proporciona las secuencias de aminoácidos s Eq ID NOS: 439-553).
También se describe aquí un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 5. Un ejemplo específico a este respecto es el bacteriófago aislado F86/06, que está direccionado a un número de cepas de S. aureus. Los marcos de lectura abiertos (ORF) en el genoma F86/06, las secuencias de aminoácidos codificadas por los ORF y la asignación de funciones putativas de las secuencias de aminoácidos codificadas (es decir, proteínas y/o polipéptidos codificados) se proporcionan en la FIG. 14 (también proporciona las secuencias de aminoácidos s Eq ID NOS: 554-616).
También se describe aquí un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 6. Un ejemplo específico a este respecto es el bacteriófago aislado F87s/06, que está direccionado a un número de cepas de S. aureus. Los marcos de lectura abiertos (ORF) en el genoma F87s/06, las secuencias de aminoácidos codificadas por los ORF y la asignación de funciones putativas de las secuencias de aminoácidos codificadas (es decir, proteínas y/o polipéptidos codificados) se proporcionan en la FIG. 17 (también proporciona las secuencias de aminoácidos s Eq ID NOS: 617-681).
También se describe aquí un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 7. Un ejemplo específico a este respecto es el bacteriófago aislado F91a/06, que está direccionado a un número de cepas de S. aureus. Los marcos de lectura abiertos (ORF) en el genoma F91a/06, las secuencias de aminoácidos codificadas por los ORF y la asignación de funciones putativas de las secuencias de aminoácidos codificadas (es decir, proteínas y/o polipéptidos codificados) se proporcionan en la FIG. 20 (también proporciona las secuencias de aminoácidos s Eq ID NOS: 682-754).
S. aureus es una bacteria Gram positiva esférica, facultativamente anaeróbica, que a menudo forma parte de la flora cutánea que se encuentra en la nariz y en la piel. S. aureus puede causar una variedad de enfermedades, desde infecciones menores de la piel, tal como granos, hasta gastroenteritis, hasta enfermedades que amenazan la vida, tales como neumonía, meningitis, osteomielitis, endocarditis, síndrome de choque tóxico (TSS), bacteriemia y sepsis. Es una de las cinco causas más comunes de infecciones nosocomiales y, a menudo, la causa de infecciones de heridas posquirúrgicas. Hoy en día, S. aureus se ha vuelto resistente a muchos antibióticos de uso común, y se ha estimado que solo el 2% de todos los aislamientos de S. aureus son sensibles a la penicilina. Las penicilinas de segunda generación, tales como meticilina, oxacilina, cloxacilina y flucloxacilina, se desarrollaron para tratar S. aureus resistente a la penicilina. La meticilina fue el primer antibiótico en esta clase que se usó, pero solo dos años después, se informó el primer caso de S. aureus resistente a la meticilina (MRSA). Desde la década de 1990, ha habido una explosión en la prevalencia de MRSA en los hospitales, donde ahora se considera endémica.
Un genoma que comprende o que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 760 también se describe en el presente documento. Un ejemplo específico a este respecto es el bacteriófago aislado F1245/05, que está direccionado a un número de cepas de A. baumannii. Los marcos de lectura abiertos (ORF) en el genoma F1245/05, las secuencias de aminoácidos codificadas por los ORF y la asignación de funciones putativas de las secuencias de aminoácidos codificadas (es decir, proteínas y/o polipéptidos codificados) se proporcionan en la FIG.
23 (también proporciona las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOS: 761-816).
Acinetobacter baumannii es una especie de bacteria que causa una serie de infecciones clínicas graves, particularmente en individuos con sistemas inmunes comprometidos. Acinetobacter baumannii es un bacilo Gram negativo aerobio pleomórfico que se aísla comúnmente del entorno hospitalario y de pacientes hospitalizados. La bacteria a menudo ingresa a través de heridas abiertas, catéteres o tubos de respiración. Acinetobacter baumannii generalmente coloniza los ambientes acuáticos y a menudo se cultiva a partir de esputo o secreciones respiratorias, heridas y orina de pacientes hospitalizados. En un entorno hospitalario, Acinetobacter baumannii comúnmente coloniza soluciones de irrigación y soluciones intravenosas. También se sabe que es resistente a múltiples antibióticos y el número de infecciones nosocomiales causadas por A. baumanni ha aumentado en los últimos años.
En ciertas realizaciones, el bacteriófago de la invención comprende o consiste en un genoma que tiene una identidad de secuencia de al menos 99% con la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 3, cuyo bacteriófago exhibe al menos una actividad biológica, por ejemplo, antimicrobiana o antibacteriana (por ejemplo, actividad de inducir muerte por lisis), de uno o más del bacteriófago F770/05. Alternativamente o además, también se describe en el presente documento, aunque no es parte de la invención, el bacteriófago de la presente solicitud de patente puede tener un genoma que comprende un fragmento funcional de la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 760, incluidas las secuencias de cualquiera de los marcos de lectura abiertos descritos en las Figs. 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20 y 23.
La presente solicitud de patente también proporciona bacterias aisladas infectadas con uno o más de los bacteriófagos de la invención. La presente solicitud de patente describe E. faecalis o E. faecium aislados infectados con un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2. En una realización, la invención proporciona P. aeruginosa aislada infectada con un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 3. La presente solicitud de patente también describe S. aureus aislado infectado con un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y/o SEQ ID NO: 7) También se describe aquí A. baumannii aislado infectado con un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 760.
La presente solicitud de patente proporciona métodos de producción y aislamiento de un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 760. Se describe aquí, un método para producir y/o aislar un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 que comprende (i) obtener un cultivo de E. faecalis o E. faecium, (ii) infectarlo con el bacteriófago que tiene un genoma que comprende o que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; (iii) cultivar hasta que se observe una lisis significativa del cultivo y (iv) aislar del cultivo el bacteriófago. En ciertas realizaciones, la invención proporciona un método para producir y/o aislar un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 3 que comprende (i) obtener un cultivo de P. aeruginosa, (ii ) infectarlo con el bacteriófago que tiene un genoma que comprende o que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 3; (iii) cultivar hasta que se observe una lisis significativa del cultivo y (iv) aislar del cultivo el bacteriófago. También se describe en el presente documento, aunque no es parte de la invención, un método para producir y/o aislar un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7 que comprende (i) obtener un cultivo de S. aureus, (ii) infectarlo con el bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7; (iii) cultivar hasta que se observe una lisis significativa del cultivo y (iv) aislar del cultivo el bacteriófago. También se describe en el presente documento un método para producir y/o aislar un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 760 que comprende (i) obtener un cultivo de A. baumannii, (ii) infectarlo con el bacteriófago que tiene un genoma que comprende o que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 760; (iii) cultivar hasta que se observe una lisis significativa del cultivo y (iv) aislar del cultivo el bacteriófago.
El bacteriófago puede aislarse de una muestra bacteriana usando cualquier método descrito en este documento o conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Carlson, "Working with bacteriophages: common techniques and methodological approaches," En, Kutter and Sulakvelidze (Eds) Bacteriophages: Biology and Applications, 5th ed. CRC Press (2005).
La presente solicitud de patente describe polipéptidos aislados de bacteriófagos de la invención. Los polipéptidos aislados pueden ser proteínas bacteriófagas de longitud completa o pueden ser fragmentos, variantes o derivados de las proteínas bacteriófagas, siempre que el fragmento, variante o derivado muestre al menos una actividad biológica asociada con el bacteriófago o polipéptido del que se deriva. Los polipéptidos se aíslan del bacteriófago F1245/05 (que típicamente infecta a A. baumannii), F168/08 o F170/08 (que típicamente infecta a E. faecalis y/o E. faecium), el bacteriófago F770/05 (que típicamente infecta a P. aeruginosa) o bacteriófago F197/08, F86/06, F87s/06 o F91a/06 (que típicamente infectan a S. aureus).
El polipéptido descrito en el presente documento es una endolisina o lisina aislada de un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 760 (por ejemplo, Bacteriófago F168/08, F170/08, F197/08, F86/06, F87s/06, F91a/06 o F1245/05 respectivamente). El polipéptido descrito en el presente documento es una endolisina o lisina que tiene la secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en Se Q ID NO: 798, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 184 , SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 203, NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 641 o SEQ ID NO: 712. El polipéptido aislado descrito en el presente documento es un fragmento, variante o derivado de una endolisina o lisina aislada de un bacteriófago de la invención, cuyo fragmento, variante o derivado exhibe al menos una actividad biológica, preferiblemente actividad antibacteriana (por ejemplo, actividad de inducir muerte por lisis), de la endolisina, la lisina o el bacteriófago del que se aísla o deriva. Por consiguiente, también se describe en el presente documento, polipéptidos aislados que son fragmentos, variantes o derivados de endolisinas o lisinas aisladas de bacteriófagos de la invención, cuyos fragmentos, variantes o derivados exhiben actividad antibacteriana o antimicrobiana (por ejemplo, actividad de inducir muerte por lisis) contra uno o más de A. baumannii, E. faecalis, E. faecium o S. aureus. Los polipéptidos aislados que son fragmentos, variantes o derivados de endolisinas o lisinas aisladas de bacteriófagos de la invención que exhiben actividad antibacteriana o antimicrobiana (por ejemplo, actividad de inducir muerte por lisis) contra una o más especies de bacterias distintas de A. baumannii, E. faecalis, E. faecium o S. aureus (por ejemplo, P. aeruginosa). También se describe en el presente documento, un polipéptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 202 o SEQ ID NO: 203, o un fragmento, variante o derivado del mismo, cuyo polipéptido exhibe actividad antibacteriana o antimicrobiana contra E. faecalis o E. faecium. También se describe en el presente documento, un polipéptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 641 o SEQ ID NO: 712, o un fragmento, variante o derivado del mismo, cuyo polipéptido exhibe actividad antibacteriana o antimicrobiana contra S. aureus. Se describe en el presente documento, un polipéptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 798, o un fragmento, variante o derivado del mismo, cuyo polipéptido exhibe actividad antibacteriana o antimicrobiana contra A. baumanni.
Se describe en el presente documento, un polipéptido que comprende o que consiste en un dominio CHAP aislado de una endolisina o lisina del bacteriófago F168/08, F170/08, F770/05, F197/08, F86/06, F87s/06 o F91a/06. Se ha demostrado que los dominios CHAP aislados retienen la actividad antibacteriana, por ejemplo, actividad de inducir muerte por lisis, de la endolisina o lisina de la que derivan; Los dominios CHAP pueden identificarse y aislarse mediante métodos rutinarios en la técnica (véase, por ejemplo, Rigden et al., 2003, Trends Biochem. Sci. 28:230-234; Bateman et al., 2003, Trends Biochem. Sci. 28:234-237). También se describe en el presente documento, el polipéptido de la presente solicitud de patente que comprende o que consiste en un dominio CHAP aislado de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de la Se Q ID n O: 68, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 641 o SEQ ID NO: 712. También se describe en el presente documento, un polipéptido aislado que comprende o consiste en el dominio CHAP derivado de un segundo polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 641 o SEQ ID NO: 712, en donde el dominio CHAP tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758 o SEQ ID NO: 759, respectivamente. Es decir, la SEQ ID NO: 755 corresponde a un dominio CHAP derivado del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 68; la SEQ ID NO: 756 corresponde a un dominio CHAP derivado del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 446, y así sucesivamente. También se describe aquí, un fragmento, variante o derivado de un dominio CHAP aislado de una endolisina o lisina del bacteriófago F168/08, F170/08, F770/05, F197/08, F86/06, F87s/06 o F91a/06, cuyo fragmento, variante o derivado exhibe al menos una actividad biológica, por ejemplo, inducir muerte celular por lisis, del dominio CHAP del que se deriva y en el que dicho dominio CHAP tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ Id NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758 o SEQ ID NO: 759. Las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 755-SEQ ID NO: 759 se proporcionan en la Tabla 1.
Tabla 1: Secuencias de aminoácidos de dominios CHAP aislados de bacteriófagos de la invención
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Se describe en el presente documento, un polipéptido de la invención que comprende o que consiste en una proteína de medida de cinta con longitud de cola o proteína de cola (por ejemplo, componente de cola, proteína de fibra de cola, proteína de cola asociada a la adsorción), o fragmento de la misma, aislada de un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la SEQ iD NO: 1, SEQ ID NO: 2, Se Q ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, o SEQ ID NO : 760 (por ejemplo, bacteriófago F168/08, F170/08, F770/05, F197/08, F86/06, F87s/06, F91a/06 o F1245/05, respectivamente), en donde la medida de cinta con longitud de cola mide la proteína o la proteína de la cola, o un fragmento de la misma, tiene una función biológica asociada con el bacteriófago del que se deriva, por ejemplo, actividad antimicrobiana o antibacteriana (por ejemplo, actividad de inducir muerte por lisis). La actividad antimicrobiana o antibacteriana de la proteína de medida de cinta con longitud de cola o la proteína de cola está dirigida contra al menos una o más especies o cepas de A. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa y/o S. aureus. El polipéptido como se describe en la presente solicitud de patente es una proteína de la medida de cinta de cola o proteína de cola que tiene la secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en la SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214 , SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO : 538, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702 , SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704, o SEQ ID NO: 796. También se describe aquí, el polipéptido aislado de la invención es un fragmento, variante o derivado de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO : 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538 , SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704, o SEQ ID NO: 796, cuyo fragmento variante o derivado exhibe al menos una actividad biológica o función del bacteriófago del que está aislado o derivado, por ejemplo, actividad antimicrobiana o antibacteriana (por ejemplo, actividad de inducir muerte por lisis). También se describe en el presente documento, la al menos una actividad biológica o función del fragmento, variante o derivado está dirigido contra una o más cepas de E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa, S. aureus y/o A. baumannii.
Se describe aquí que, el polipéptido aislado de la presente solicitud de patente es una variante de un polipéptido bacteriófago, cuya variante comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad de secuencia con una segunda secuencia de aminoácidos de la misma longitud (es decir, que consiste en el mismo número de residuos), cuya segunda secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 184 , SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO : 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 539 , SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 641, S EQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 796, o SEQ ID NO: 798, y/o un fragmento del mismo, y en donde la variante exhibe al menos una función o actividad biológica del bacteriófago del que se deriva (por ejemplo, actividad antimicrobiana o antibacteriana (por ejemplo, actividad de inducir muerte por lisis)) contra una o más cepas de bacterias (por ejemplo, bacterias Gram positivas (por ejemplo, E. faecalis, E. faecium, S. aureus), bacterias Gram negativas (por ejemplo, P. aeruginosa, A baumannii) o bacterias no clasificadas como Gram positivas o Gram negativas).
Se describe en el presente documento, un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 2-124, SEQ ID NO: 126-338, SEQ ID NO: 340-434, SEQ ID NO: 436-550, SEQ ID NOS: 552-614, SEQ ID NOS: 616-680, SEQ ID NOS: 682-759, SEQ ID NOS: 761-816 y fragmentos biológicos activos de los mismos. También se describe en el presente documento, un polipéptido variante que exhibe al menos una actividad biológica asociada con el polipéptido o bacteriófago del que se aisló o derivó dirigido contra al menos una o más cepas de E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa, S. aureus y/o A. baumannii.
Se describe en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica la secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 8-130, SEQ ID NO: 131-343, SEQ ID NO: 344-438, SEQ ID NO: 439-553, SEQ ID NOS: 554-616, SEQ ID NOS: 617-681, SEQ ID NOS: 682-759, SEQ ID NOS: 761-816 y fragmentos activos de los mismos. También se describe aquí que, la secuencia de ácido nucleico de cualquiera de los marcos de lectura abiertos identificados en las Figs. 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20 y 23.
En el presente documento se describe que los polipéptidos se fusionan recombinantemente o se conjugan químicamente (incluidas tanto las conjugaciones covalentes como no covalentes) a agentes terapéuticos, por ejemplo, polipéptidos heterólogos o moléculas pequeñas, para generar proteínas de fusión o polipéptidos quiméricos. La fusión no necesariamente debe ser directa, sino que puede ocurrir a través de secuencias enlazadoras o mediante conjugación química. Ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos a los que se pueden conjugar los polipéptidos de la invención son citotoxinas peptídicas o no peptídicas (incluidos antimicrobianos y/o antibióticos), moléculas trazadoras/marcadoras (por ejemplo, radionúclidos y fluoróforos) y otros compuestos antibióticos o antibacterianos. conocido en la técnica.
6.1 Composiciones antibióticas
Los bacteriófagos o polipéptidos aislados de la presente invención pueden administrarse solos o incorporarse a una composición farmacéutica para el uso en el tratamiento o la profilaxis de infecciones bacterianas, por ejemplo, infecciones causadas por bacterias que incluyen, pero no se limitan a, A. baumannii, E. faecalis , E. faecium, P. aeruginosa y S. aureus. Los polipéptidos pueden combinarse con un vehículo, excipiente o estabilizador farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de vehículos, excipientes y estabilizadores farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, reguladores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular; proteínas, tales como albúmina sérica y gelatina; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN™, polietilenglicol (PEG) y PLURONICS™. La composición farmacéutica de la presente invención (por ejemplo, composición antibacteriana) también puede incluir un lubricante, un agente humectante, un edulcorante, un agente aromatizante, un emulsionante, un agente de suspensión y un conservante, además de los ingredientes anteriores.
Los bacteriófagos y/o polipéptidos de la presente invención también se pueden combinar con uno o más agentes terapéuticos y/o profilácticos útiles para el tratamiento de infección bacteriana como se describe en este documento y/o se conoce en la técnica (por ejemplo, una o más lisinas). Por lo tanto, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender dos o más bacteriófagos aislados de la invención (con actividad antibacteriana contra la misma o diferentes especies o cepas bacterianas), la combinación de un bacteriófago y un polipéptido de la invención o la combinación de un bacteriófago y/o polipéptido de la invención y un bacteriófago y/o polipéptido terapéutico conocido en la técnica. En realizaciones específicas, los componentes terapéuticos de una combinación se direccionan a dos o más especies o cepas de bacterias o exhiben actividad enzimática diferente. Por ejemplo, las lisinas, en general, exhiben una actividad de amidasa, endopeptidasa, muramidasa o glucosamidasa. En consecuencia, la combinación de lisinas que exhiben diferentes actividades puede proporcionar una mejora sinérgica de la actividad terapéutica de la composición farmacéutica de la invención.
Ejemplos de otros agentes terapéuticos que pueden usarse en combinación con el polipéptido de la invención incluyen, pero no se limitan a, agentes antibióticos estándar, agentes antiinflamatorios, agentes antivirales, agentes anestésicos locales y corticosteroides.
Los antibióticos estándar que pueden usarse con composiciones farmacéuticas que comprenden polipéptidos de la invención incluyen, pero no se limitan a, amikacina, gentamicina, kanamicina, neomicina, netilmicina, paromomicina, rodostreptomicina, estreptomicina, tobramicina, apramicina, rifamicina, naftomicina, mupirocina, geldanamicina, ansamitocina, carbacefemas, imipenem, meropenem, ertapenem, faropenem, doripenem, panipenem/betamipron, biapenem, PZ-601, cefalosporinas, cefacetrilo, cefadroxilo, cefalexina, cefaloglicina, cefalonio, cefaloridina, cefalotina, cefapirina, cefatrizina, cefazaflur, cefazedona, cefazolina, cefradina, cefroxadina, ceftezol, cefaclor, cefonicid, cefprozil, cefuroxima, cefuzonam, cefmetazol, cefotetan, cefoxitin, cefcapene, cefdaloxima, cefdinir, cefditoren, cefetamet, cefixima, cefmenoxima, cefteram, ceftibuten, ceftiofur, ceftioleno, ceftizoxima, ceftriaxona, cefoperazona, ceftazidima latamoxef, cefclidina, cefepima, cefluprenam, cefoselis, cefozopran, cefpirome, cefquinome, flomoxef. ceftobiprol, azitromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, roxitromicina, aztreonam, pencilina y derivados de penicilina, actinomicina, bacitracina, colistina, polimixina B, cinoxacina, flumequina, ácido nalidíxico, ácido oxolínico, ácido piromídico, ácido pipemídico, rosoxacina, ciprofloxacina, enoxacina, fleroxacina, lomefloxacina, nadifloxacina, norfloxacina, ofloxacina, pefloxacina, rufloxacina, balofloxacina, gatifloxacina, grepafloxacina, levofloxacina, moxifloxacina, pazufloxacina, sparfloxacina, temafloxacina, tosufloxacina, clinafloxacina, garenoxacina, gemifloxacina, stifloxacina, trovalfloxacina, prulifloxacina, acetazolamida, benzolamida, bumetanida, celecoxib, clortalidona, clopamida, diclorfenamida, dorzolamida, etoxizolamida, furosemida, hidroclorotiazida, indapamida, mafendida, mefrusida, metolazona, probenecid, sulfacetamida, sulfadimetoxina, sulfadoxina, sulfanilamidas, sulfametoxazol, sulfasalazina, sultiame, sumatriptán, xipamida, tetraciclina, clortetraciclina, oxitetraciclina, doxiciclina, limeciclina, meclociclina, metaciclina, minociclina, rolitetraciclina y cualquier combinación de los mismos en cantidades que sean efectivas para mejorar de forma aditiva o sinérgica el efecto terapéutico del bacteriófago o polipéptido de la invención para una infección dada.
Los anestésicos locales que pueden usarse en las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen tetracaína, clorhidrato de tetracaína, lidocaína, clorhidrato de lidocaína, clorhidrato de dimetisoquina, dibucaína, clorhidrato de dibucaína, butambenpicrato y clorhidrato de pramoxina. Una concentración de ejemplo de anestésico local es de aproximadamente 0.025% a aproximadamente 5% en peso de la composición total.
Los corticosteroides que pueden ser útiles en combinación con los polipéptidos, fagos y/o composiciones farmacéuticas de la invención incluyen betametasona, dipropionato, fluocinolona, actínido, valerato de betametasona, actinida de triamcinolona, propionato de clobetasol, desoximetasona, diacetato de diflorasona, amcinonida, flurandrenolida, valerato de hidrocortisona, butirato de hidrocortisona y desonida. Una concentración de ejemplo de corticosteroide es de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 1% en peso de la composición total.
En ciertas realizaciones, una formulación que comprende un bacteriófago y/o polipéptido de la invención comprende además regulador SM (Tris-HCl 0,05 M (pH 7.4-7.5); NaCl 0,1 M; MgSO410 mM). En otras realizaciones, la formulación comprende además regulador SM y MgCh 10 mM. En todavía otras realizaciones, la formulación comprende además regulador SM y aproximadamente 20% o aproximadamente 30% de etanol.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden un bacteriófago y/o polipéptido de la presente invención pueden formularse en una formulación de dosis unitaria o multidosis. Las formulaciones adecuadas se pueden seleccionar del grupo que consiste en ungüentos, soluciones, suspensiones o emulsiones, extractos, polvos, gránulos, aerosoles, pastillas, tabletas o cápsulas e incluyen adicionalmente un agente dispersante o un agente estabilizante.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse por inhalación, en forma de supositorio o pesario, por vía tópica (por ejemplo, en forma de una loción, solución, crema, pomada o polvo pulverizable), por vía epidérmica o transdérmica (por ejemplo, mediante uso de un parche para la piel), por vía oral (por ejemplo, como una tableta, que puede contener excipientes tales como almidón o lactosa), como una cápsula, óvulo, elixires, soluciones o suspensiones (cada uno opcionalmente contiene saborizantes, colorantes y/o excipientes) , o se pueden inyectar por vía parenteral (por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular o subcutánea). Para la administración parenteral, las composiciones pueden usarse mejor en forma de una solución acuosa estéril que puede contener otras sustancias, por ejemplo, suficientes sales o monosacáridos para hacer que la solución sea isotónica con la sangre. Para la administración bucal o sublingual, las composiciones pueden administrarse en forma de tabletas o pastillas que pueden formularse de manera convencional. En una realización preferida, un bacteriófago y/o polipéptido de la presente invención se administra tópicamente, ya sea como un agente único, o en combinación con otros tratamientos con antibióticos como se describe en este documento o se conoce en la técnica.
Un bacteriófago y/o polipéptido de la presente invención también se puede administrar por vía dérmica o transdérmica. Para la aplicación tópica en la piel, los bacteriófagos y/o polipéptidos de la presente invención pueden combinarse con uno o una combinación de vehículos, que incluyen, pero no se limitan a, un líquido acuoso, un líquido con base de alcohol, un gel soluble en agua, una loción, una pomada, una base líquida no acuosa, una base de aceite mineral, una mezcla de aceite mineral y vaselina, lanolina, liposomas, portadores de proteínas tales como albúmina sérica o gelatina, carmel celulosa en polvo y una combinación de los mismos. Un modo de administración tópico puede incluir un frotis, un pulverizador, un parche de liberación prolongada, una toallita con absorción de líquido y combinaciones de los mismos. El bacteriófago y/o polipéptido de la invención se puede aplicar a un parche o vendaje directamente o en uno de los portadores. Los parches pueden estar húmedos o secos, en donde el fago y/o polipéptido (por ejemplo, una lisina) está en forma liofilizada en el parche. Los portadores de composiciones tópicas pueden comprender vehículos semisólidos y de tipo gel que incluyen un espesante polimérico, agua, conservantes, surfactantes activos o emulsionantes, antioxidantes, filtros solares y un sistema de disolvente o disolvente mixto. La Patente US. No.
5,863,560 divulga un número de combinaciones diferentes de vehículos que pueden ayudar en la exposición de la piel a un medicamento.
Para administración intranasal o por inhalación, el bacteriófago y/o polipéptido de la invención se administra convenientemente en forma de un inhalador de polvo seco o una presentación en aerosol de un recipiente presurizado, bomba, aerosol o nebulizador con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, un hidrofluoroalcano tal como 1,1,1,2-tetrafluoroetano (HFA 134A.TM.) o 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano (HFA 227EA.TM.), dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. El recipiente presurizado, la bomba, el aerosol o el nebulizador pueden contener una solución o suspensión del compuesto activo, por ejemplo usando una mezcla de etanol y el propelente como disolvente, que puede contener adicionalmente un lubricante, por ejemplo trioleato de sorbitán. Las cápsulas y cartuchos (hechos, por ejemplo, de gelatina) para uso en un inhalador o insuflador pueden formularse para contener una mezcla en polvo del bacteriófago y/o polipéptido de la invención y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.
Para la administración en forma de supositorio o pesario, las composiciones terapéuticas pueden aplicarse tópicamente en forma de gel, hidrogel, loción, solución, crema, pomada o polvo pulverizable. Las composiciones de la invención también se pueden administrar por vía ocular. Para uso oftálmico, las composiciones de la invención pueden formularse como suspensiones micronizadas en solución salina estéril isotónica, ajustada con pH, o, preferiblemente, como soluciones en solución salina estéril isotónica, ajustada con pH, opcionalmente en combinación con un conservante tal como cloruro de bencilalconio. Alternativamente, se pueden formular en un ungüento tal como vaselina.
Las dosificaciones y concentraciones de fármaco deseadas de las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variar dependiendo del uso particular. La determinación de la dosificación o ruta de administración apropiada está dentro de la habilidad de un médico común. Los experimentos con animales pueden proporcionar una guía confiable para la determinación de dosis efectivas en terapia humana. El escalado entre especies de dosis efectivas puede ser realizado por un experto en la técnica siguiendo los principios descritos por Mordenti, J. y Chappell, W. Mordenti, J. and Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" en Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp42-96.
6.2 Uso terapéutico
Los bacteriófagos y polipéptidos de la presente invención tienen actividad contra una pluralidad de cepas de E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa, S. aureus y/o A. baumannii-, como se describe en las Figs. 3A-B, 6A-B, 9, 12, 15, 18, 21 y 23. Por lo tanto, las composiciones de la presente invención pueden usarse en métodos para prevenir y tratar infecciones asociadas con E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa, S. aureus y/o A. baumannii tanto en humanos como en animales. En otras realizaciones, las composiciones de la presente invención pueden usarse para tratar infecciones asociadas con especies o cepas relacionadas de estas bacterias, que incluyen, pero no se limitan a S. epidermidis, S. auricularis, S. capitis, S. haemolyticus, S. hominis, S. saprophyticus, S. simulans, S. xylosis, Micrococcus luteus, Bacilus subtilis, B. pumilus, E. hirae, y/o una o más de las cepas de A. baumannii, por ejemplo, una o más de las cepas descritas en la Figura 24)
En realizaciones específicas, el sujeto que recibe una composición farmacéutica de la invención es un mamífero (por ejemplo, bovino, ovino, caprino, equino, primate (por ejemplo, humano), roedor, lagomorfo o aviar (por ejemplo, pollo, pato, ganso)). En el contexto de la presente invención, "tratamiento" se refiere al tratamiento terapéutico y en el que el objetivo eliminar, retardar, disminuir la gravedad de, ralentizar la progresión de o retrasar o prevenir los síntomas o la causa subyacente (por ejemplo, infección bacteriana) asociada con la condición patológica o desorden. "Tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas, en las que el objetivo es eliminar, retardar, disminuir la gravedad de, ralentizar la progresión de o retrasar o prevenir los síntomas o la causa subyacente (por ejemplo, infección bacteriana) asociada con condición o trastorno patológico También se contempla que un bacteriófago y/o polipéptido de la invención actúe como una medida profiláctica o preventiva, evitando la aparición de infección causada por una o más bacterias.
A. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa y S. aureus son responsables de muchas infecciones oportunistas graves, particularmente en individuos con sistemas inmunes comprometidos. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se contemplan para tratar cualquier infección asociada con A. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa o S. aureus, o asociadas con otras especies o cepas de bacterias, incluidas, pero no limitadas a, infecciones de la piel (incluidas, entre otras, úlceras cutáneas, úlceras de decúbito y úlceras del pie diabético), infecciones en y alrededor de heridas, infecciones postoperatorias, infecciones asociadas con catéteres y drenajes quirúrgicos e infecciones de la sangre.
A. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa y S. aureus también están asociadas con infecciones que involucran sistemas de órganos que tienen un alto contenido de líquidos, y se contempla que los bacteriófagos y/o polipéptidos de la invención tengan uso terapéutico en la prevención y tratamiento de estas infecciones. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden usarse para la prevención o el tratamiento de infecciones del tracto respiratorio, del líquido cefalorraquídeo, del líquido peritoneal y del tracto urinario. Las composiciones de la invención también se pueden usar para prevenir y/o tratar neumonía nosocomial, infecciones asociadas con diálisis peritoneal ambulatoria continua (CAPD), bacteruria asociada a catéter y meningitis nosocomial.
En una realización preferida, un bacteriófago y/o polipéptido de la invención se usa profilácticamente en un entorno hospitalario, particularmente para prevenir infecciones asociadas con heridas, úlceras y aberturas en la piel debido al cateterismo, y cualquier otro procedimiento o dispositivo médico.
En ciertas realizaciones, un bacteriófago y/o polipéptido de la invención se usa como un agente único para tratar o prevenir infecciones asociadas con A. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa, S. aureus u otras especies bacterianas. En otras realizaciones de la invención, se usa un bacteriófago y/o polipéptido de la invención en combinación con otros agentes, incluidos otros bacteriófagos (por ejemplo, que se direccionan a una especie o cepa diferente de bacterias), o con antibióticos que se direccionan a la misma o diferentes tipos de bacterias, incluidas las bacterias seleccionadas de cualquier bacteria Gram positiva, cualquier bacteria Gram negativa y cualquier otro grupo de bacterias que no esté clasificado como Gram positivo o Gram negativo. Las composiciones de la invención también se pueden usar en combinación con cualquier otro medio de tratamiento de infección bacteriana conocido por un experto en la técnica.
La invención también contempla métodos de prevención y métodos de tratamiento de una infección causada por bacterias que incluyen, pero no se limitan a, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa, S. aureus y/o A. baumannii, que comprenden administrar a un mamífero que lo necesite, una composición que comprende una lisina que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 641, ID NO: 712, y/o SEQ ID NO: 798, o un fragmento, variante o derivado de la misma, en donde el fragmento, variante o derivado exhibe actividad antibacteriana o antimicrobiana contra las especies de bacterias de las cuales se aisló el bacteriófago original. En un ejemplo específico, también se describe aquí que, la presente solicitud de patente proporciona métodos para prevenir o tratar una infección causada por una bacteria que incluye, pero no se limita a, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa, S. aureus , y/o A. baumannii, que comprende administrar a un mamífero que lo necesite una composición que comprende un dominio CHAP aislado de una lisina, o un fragmento, variante o derivado de la misma que exhibe al menos una actividad biológica del dominio CHAP del que fue aislado (por ejemplo, inducir muerte celular por lisis). Se describe aquí que, el dominio CHAP aislado comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758 o SEQ ID NO: 759. Se describe aquí que, la invención proporciona métodos para prevenir y tratar una infección causada por bacterias que incluyen, pero no se limitan a, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa, S. aureus y/o A. baumannii, que comprende administrar a un mamífero que lo necesite una composición que comprende una proteína de medida de cinta de cola o proteína de cola que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214 , SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO : 538, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702 , SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704, y/o SEQ ID NO: 796, o un fragmento, variante o derivado de la misma, en donde el fragmento, variante o derivado exhibe una actividad biológica asociada con el bacteriófago original. En todavía otras realizaciones, la invención proporciona métodos para prevenir y tratar una infección causada por bacterias que incluyen, pero no se limitan a, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa, S. aureus y/o A. baumannii, que comprende administrar a un mamífero que lo necesite, una composición que comprende bacteriófago que tiene un genoma que comprende o que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la Se Q ID NO: 1, SEQ ID n O: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, y/o SEQ ID NO: 760. Las combinaciones de las lisinas (o fragmentos, variantes o derivados de las mismas como se describe anteriormente) y de las proteínas de cinta de cola o proteínas de cola (o fragmentos, variantes o derivados de las mismas como se describe anteriormente), opcionalmente con uno o más bacteriófagos de la invención o con otros tratamientos, tales como antibióticos, también se contemplan, así como métodos de tratamiento y métodos para prevenir una infección bacteriana usando una o más de las combinaciones descritas en este documento.
Como se usa en el presente documento, el término "en combinación" se refiere al uso de más de un agente profiláctico y/o terapéutico. El uso del término "en combinación" no restringe el orden en que los agentes profilácticos y/o terapéuticos se administran a un sujeto con una enfermedad o trastorno. Se puede administrar un primer agente profiláctico o terapéutico antes de (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas antes), concomitantemente con, o subsecuente a (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, o 12 semanas después) la administración de un segundo agente profiláctico o terapéutico (diferente del primer agente profiláctico o terapéutico) a un sujeto con una enfermedad o trastorno.
6.3 Uso desinfectante y antiinfeccioso
Los patógenos bacterianos con mayor frecuencia infectan en el sitio de la membrana mucosa (por ejemplo, respiratorio superior e inferior, intestinal, urogenital y ocular). Las membranas mucosas son a menudo el reservorio, a veces el único reservorio, para muchas bacterias patógenas que se encuentran en el medio ambiente (por ejemplo, neumococos, estafilococos y estreptococos). Hay muy pocos antiinfecciosos diseñados para controlar el estado del portador de bacterias patógenas. Sin embargo, los estudios han demostrado que al reducir o eliminar este reservorio en entornos tales como hospitales y hogares de ancianos, la incidencia de infecciones por estas bacterias se reducirá notablemente.
Los bacteriófagos y/o polipéptidos de la presente invención pueden usarse en composiciones antiinfecciosas para controlar el crecimiento de bacterias (por ejemplo, bacterias Gram positivas (por ejemplo, E. faecalis, E. faecium, S. aureus), bacterias Gram negativas (por ejemplo, P. aeruginosa, A. baumannii) o bacterias no clasificadas como Gram positivas o Gram negativas, para prevenir o reducir la incidencia de infecciones graves. Además del uso en composiciones para la aplicación a membranas mucosas, también se puede incorporar un bacteriófago y/o polipéptido de la presente incorporación en formulaciones tales como geles, cremas, ungüentos o aerosoles para controlar o prevenir la colonización de bacterias en las superficies del cuerpo (por ejemplo, piel y membranas mucosas) (por ejemplo, para la esterilización de campos quirúrgicos o de las manos y la piel expuesta de trabajadores de la salud y/o pacientes) y otras superficies sólidas (por ejemplo, electrodomésticos, encimeras y, en particular, equipos de hospital)
6.4 Métodos de diagnóstico
La presente invención también abarca métodos de diagnóstico para determinar el agente causal en una infección bacteriana. En ciertas realizaciones, el diagnóstico del agente causal en una presentación de infección bacteriana se realiza (i) cultivando muestras de tejido, sangre o líquido de un paciente de acuerdo con técnicas estándar, (ii) poniendo en contacto el cultivo con uno o más bacteriófagos y/o polipéptidos de la invención y (iii) monitorizando el crecimiento celular y la evidencia de lisis después de dicho contacto. Debido a que la actividad de los bacteriófagos y/o sus productos aislados (por ejemplo, polipéptidos o fragmentos biológicamente activos, variantes o derivados de los mismos) tiende a ser específica de especie o cepa, la susceptibilidad o falta de susceptibilidad, a uno o más bacteriófagos y/o polipéptidos de la invención puede ser indicativo de la especie o cepa de bacterias infecciosas. Por ejemplo, la disminución del crecimiento de los cultivos de prueba después de poner en contacto con un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o con un producto de polipéptido aislado del mismo, puede ser indicativo de la muestra de prueba que comprende E. faecalis o E. faecium. De manera similar, un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o que consiste en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 3, o un producto de polipéptido aislado del mismo, puede usarse para identificar infección por P. aeruginosa; un bacteriófago que tiene un genoma que comprende o que consiste en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 760, o un producto de polipéptido aislado del mismo, puede usarse para identificar la infección por A. baumannii, mientras que tiene un genoma que comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID n O: 7, o un producto de polipéptido aislado del mismo, pueden usarse para identificar la infección por S. aureus.
6.5 Variantes de aminoácidos
Las variantes de secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de la invención pueden crearse de tal manera que sean variantes de sustitución, inserción o deleción. Las variantes de deleción carecen de uno o más residuos de la proteína nativa que no son esenciales para la función (por ejemplo, actividad antimicrobiana o antibacteriana). Los mutantes de inserción típicamente implican la adición de material en un punto no terminal en el polipéptido. Las variantes de sustitución típicamente contienen el intercambio de un aminoácido por otro en uno o más sitios dentro de la proteína, y pueden diseñarse para modular una o más propiedades del polipéptido, tal como la estabilidad contra a la escisión proteolítica, sin la pérdida de otras funciones o propiedades. Las sustituciones de este tipo son preferiblemente conservadoras, es decir, un aminoácido se reemplaza por uno de forma y carga similares. Las sustituciones conservadoras son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, los cambios de: alanina a serina; arginina a lisina; asparagina a glutamina o histidina; aspartato a glutamato; cisteína a serina; glutamina a asparagina; glutamato a aspartato; glicina a prolina; histidina a asparagina o glutamina; isoleucina a leucina o valina; leucina a valina o isoleucina; lisina a arginina; metionina a leucina o isoleucina; fenilalanina a tirosina, leucina o metionina; serina a treonina; treonina a serina; triptófano a tirosina; tirosina a triptófano o fenilalanina; y valina a isoleucina o leucina.
Una vez que se identifican áreas generales del gen que codifican la proteína lisina particular como se describe en el presente documento, se puede emplear la mutagénesis puntual para identificar con particularidad cuales residuos de aminoácidos son importantes en las actividades antibacterianas. Por lo tanto, un experto en la técnica podrá generar cambios de base única en la cadena de ADN para dar como resultado un codón alterado y una mutación sin sentido.
Preferiblemente, la mutación de los aminoácidos de una proteína crea una molécula de segunda generación equivalente, o incluso mejorada. Por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos en una estructura de proteína sin pérdida detectable de función (por ejemplo, actividad antibacteriana o antimicrobiana). Al hacer tales cambios, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice de aminoácidos hidropáticos para conferir una función biológica interactiva a una proteína se entiende generalmente en la técnica. Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, la interacción con un peptidoglicano dentro de la capa externa de una bacteria Gram positiva. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático sobre la base de sus características de hidrofobicidad y carga; por ejemplo: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteína/cistina (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptófano 0.9); tirosina (-1.3); prolina (-1,6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5); glutamina (­ 3.5); aspartato (-3.5); asparagina (-3.5); lisina (-3.9); y arginina (-4.5).
También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede realizarse efectivamente sobre la base de hidrofilicidad. Al igual que la hidrofobicidad, se han asignado valores de hidrofilicidad a cada aminoácido: arginina (+3.0); lisina (+3.0); aspartato (+3.0 ± 1); glutamato (+3.0 1); serina (+0.3); asparagina (+0.2); glutamina (+0.2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0.5 1); alanina (-0.5); histidina (-0.5); cisteína (-1.0); metionina (-1.3); valina (-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5) y triptófano (-3.4). Se pueden obtener moléculas equivalentes mediante la sustitución de un aminoácido por otro cuando sus índices de hidrofilicidad estén dentro de 2, preferiblemente ± 1, o lo más preferiblemente ± 5 entre sí. Se describe aquí que, la invención abarca péptidos aislados que comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, inserción, sustitución, deleción, etc.) en relación con una secuencia de aminoácidos divulgada en el presente documento. También se describe en el presente documento que las mutaciones se hacen de tal manera que se retiene la actividad biológica del polipéptido particular. Por ejemplo, la presente invención abarca polipéptidos aislados del bacteriófago F1245/05, F168/08, F170/08, F770/05, F197/08, F86/06, F87s/06 y/o F91a/06, que están mutados para comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más modificaciones de aminoácidos en relación con una secuencia de aminoácidos listada aquí, y que exhiben actividad antibacteriana contra una o más especies o cepas de bacterias Gram positivas o Gram negativas, por ejemplo, A. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa y/o S. aureus. También se describe aquí que, los polipéptidos de la presente solicitud de patente derivados de F168/08 o F/170/08 exhiben actividad antibacteriana o antimicrobiana, por ejemplo, actividad de inducir muerte por lisis, contra al menos E. faecalis y/o E. faecium; los derivados de F770/05 contra al menos P. aeruginosa; los derivados de F197/08, F86/06, F87s/06 o F91a/06 contra al menos S. aureus; y los derivados de F1245/05 contra al menos A. baumannii.
6.6 Polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la invención
La invención proporciona polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la invención. La invención también abarca polinucleótidos que hibridan bajo condiciones de hibridación de alta rigurosidad, rigurosidad intermedia o inferior, por ejemplo, como se definió anteriormente, a polinucleótidos que codifican un polipéptido de la invención y que codifican polipéptidos modificados que tienen actividad antibiótica y/u otra actividad biológica.
Los polinucleótidos pueden obtenerse, y la secuencia de nucleótidos de los polinucleótidos puede determinarse, mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención puede generarse a partir de ácido nucleico a partir de una fuente adecuada (por ejemplo, bacteriófago F1245/05, F168/08, F170/08, F770/05, F197/08, F197/08, F86/06, F87s/06 o F91a/06). Las secuencias de nucleótidos pueden aislarse de los genomas de fagos mediante métodos de rutina conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Carlson, "Working with bacteriophages: common techniques and methodological approaches," In, Kutter and Sulakvelidze (Eds) Bacteriophages: Biology and Applications, 5th ed. CRC Press (2005)). Si una fuente que contiene un ácido nucleico que codifica un polipéptido particular no está disponible, pero se conoce la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la invención, un ácido nucleico que codifica el polipéptido puede sintetizarse químicamente y clonarse en vectores de clonación replicables usando cualquier método bien conocido en la ttécnica.
Una vez que se determina la secuencia de nucleótidos del polipéptido de la invención, la secuencia de nucleótidos del polipéptido puede manipularse usando métodos bien conocidos en la técnica para la manipulación de secuencias de nucleótidos, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante, mutagénesis dirigida al sitio, PCR, etc. (véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY and Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY), para generar polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos diferente, por ejemplo para crear sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos.
Se describe en el presente documento que, se proporcionan las siguientes secuencias de nucleótidos: la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 85 de la SEQ ID NO: 760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 87 hasta el nucleótido 584 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 594 hasta el nucleótido 767 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 724 hasta el nucleótido 1035 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 1005 hasta el nucleótido 1823 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 1816 hasta el nucleótido 2130 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 2132 hasta el nucleótido 2383 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 2383 hasta el nucleótido 3690 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 3687 to 4469 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 4466 hasta el nucleótido 5458 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 5632 hasta el nucleótido 7956 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 8010 hasta el nucleótido 8912 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 8915 hasta el nucleótido 9262 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 9252 hasta el nucleótido 10223 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 10213 hasta el nucleótido 10782 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 10769 hasta el nucleótido 11218 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 11202 hasta el nucleótido 11420 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 11413 hasta el nucleótido 12342 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 12339 hasta el nucleótido 12515 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 12512 hasta el nucleótido 13165 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 13170 hasta el nucleótido 15599 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 15609 hasta el nucleótido 15872 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 15979 hasta el nucleótido 16173 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 16175 hasta el nucleótido 16482 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 16494 hasta el nucleótido 18059 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 18072 hasta el nucleótido 18815 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 18857 hasta el nucleótido 19879 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 19930 hasta el nucleótido 20178 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 20180 hasta el nucleótido 20545 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 20646 hasta el nucleótido 21203 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 21212 hasta el nucleótido 23506 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 23506 hasta el nucleótido 24186 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 24201 hasta el nucleótido 27068 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 27084 hasta el nucleótido 30212 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 30214 hasta el nucleótido 32505 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 32515 hasta el nucleótido 32880 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 32873 hasta el nucleótido 33460 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 33460 hasta el nucleótido 33816 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 33825 hasta el nucleótido 35777 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 35774 hasta el nucleótido 35872 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 35869 hasta el nucleótido 36027 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 36038 hasta el nucleótido 36193 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 36916 hasta el nucleótido 36788 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 37209 hasta el nucleótido 37427 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 37868 hasta el nucleótido 38386 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 38383 hasta el nucleótido 38586 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 38912 hasta el nucleótido 39406 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 39406 hasta el nucleótido 39915 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 39917 hasta el nucleótido 40021 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 40018 hasta el nucleótido 40101 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 40101 hasta el nucleótido 40670 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 40720 hasta el nucleótido 41838 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 41822 hasta el nucleótido 42127 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 42105 hasta el nucleótido 42308 de la SEQ ID NO:760; la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 42382 hasta el nucleótido 42912 de la SEQ ID NO:760; y la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 42896 hasta el nucleótido 43015 de la SEQ ID NO:760.
6.7 Eexpresión recombinante de moléculas de la invención
Una vez que se ha obtenido una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de la invención (por ejemplo, un polipéptido), el vector para la producción de las moléculas puede producirse mediante tecnología de ADN recombinante usando técnicas bien conocidas en la técnica. Los métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica pueden usarse para construir vectores de expresión que contienen las secuencias de codificación para las moléculas de la invención y señales de control transcripcionales y traduccionales apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. (Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY and Ausubel et al. eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY).
La presente invención proporciona vectores de expresión que codifican los polipéptidos de la invención. Un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de una molécula identificada por los métodos de la invención puede transferirse a una célula huésped mediante técnicas convencionales (por ejemplo, electroporación, transfección liposómica y precipitación con fosfato de calcio) y las células transfectadas se cultivan luego mediante técnicas convencionales. para producir las moléculas de la invención. También se describe en el presente documento que la célula huésped es distinta de la especie de la bacteria madre de la que se deriva el bacteriófago que comprende la secuencia. También se describe en el presente documento que la expresión de las moléculas de la invención está regulada por un promotor específico constitutivo, inducible o tisular. También se describe aquí que, el vector de expresión es pQE-30 (Qiagen) o pET-29 (a) (Novagen).
Las células huésped utilizadas para expresar las moléculas identificadas por los métodos de la invención pueden ser células bacterianas (no susceptibles a la proteína bacteriófaga o fragmento de la misma de la invención) como Escherichia coli. Se puede utilizar una variedad de sistemas de vectores de expresión del huésped para expresar las moléculas identificadas por los métodos de la invención. Tales sistemas de expresión del huésped representan vehículos mediante los cuales las secuencias codificantes de las moléculas de la invención pueden ser producidas y posteriormente purificadas, pero también representan células que pueden, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificantes de nucleótidos apropiadas, expresar las moléculas de la invención en situ. Estos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias que no son susceptibles a la proteína bacteriófaga o fragmento de la misma de la invención (por ejemplo, E. coli y B. subtilis) transformadas con ADN de bacteriófago recombinante, ADN plasmídico o expresión de ADN cósmido. vectores que contienen secuencias codificantes para las moléculas identificadas por los métodos de la invención; levadura (por ejemplo, Saccharomyces Pichia) transformada con vectores de expresión de levadura recombinante que contienen secuencias que codifican las moléculas identificadas por los métodos de la invención; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen las secuencias que codifican las moléculas identificadas por los métodos de la invención; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de coliflor (CaMV) y virus del mosaico del tabaco (TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen secuencias que codifican las moléculas identificadas por los métodos de la invención ; o sistemas de células de mamífero (por ejemplo, COS, CHO, BHK, 293, 293T, células 3T3, células linfáticas (véase el documento US 5,807,715), células Per C.6 (células retinianas humanas desarrolladas por Crucell) que albergan constructos de expresión recombinante que contienen promotores derivados del genoma de las células de mamíferos (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor del virus vaccinia 7.5K).
En sistemas bacterianos no susceptibles a la proteína o fragmento de bacteriófago de la invención, se pueden seleccionar ventajosamente un número de vectores de expresión dependiendo del uso previsto para la molécula que se expresa. Por ejemplo, cuando se va a producir una gran cantidad de tal proteína, para la generación de composiciones farmacéuticas de un polipéptido, pueden ser deseables los vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteína de fusión que se purifican fácilmente. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, el vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2: 1791), en el que la secuencia de la proteína se puede ligar individualmente al vector en marco con la Región de codificación Z lac de tal manera que se produzca una proteína de fusión; vectores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); y similares. Los vectores pGEX también pueden usarse para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente de las células lisadas mediante adsorción y unión a una matriz de perlas de glutatión-agarosa seguidas de elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX están diseñados para incluir sitios de escisión de proteasa de factor Xa o trombina de tal manera que el producto del gen diana clonado pueda liberarse de la unidad estructural GST.
En un sistema de insectos, el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) se usa como un vector para expresar genes extraños. El virus crece en las células de Spodoptera frugiperda. La secuencia de codificación del polipéptido puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de polihedrina) del virus y colocarse bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo, el promotor de polihedrina).
Una vez que una molécula de la invención (es decir, polipéptidos) se ha expresado de forma recombinante, se puede purificar por cualquier método conocido en la técnica para la purificación de polipéptidos, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, cromatografía en columna de intercambio iónico, afinidad y dimensionamiento), centrifugación, solubilidad diferencial, o mediante cualquier otra técnica estándar para la purificación de polipéptidos o anticuerpos.
Ciertas modificaciones y mejoras se les ocurrirán a los expertos en la técnica al leer la descripción anterior. Debe entenderse que todas de tales modificaciones y mejoras se han eliminado en este documento en aras de la concisión y la legibilidad, pero están de manera adecuada dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.
7. Ejemplos
Se entiende que los siguientes ejemplos y realizaciones descritos en este documento son solo para fines ilustrativos y que diversas modificaciones o cambios a la luz de los mismos serán sugestivos para los expertos en la técnica y se incluirán dentro del espíritu y el alcance de esta solicitud y el alcance de las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se indique otra cosa, los bacteriófagos de la invención se aislaron, procesaron y analizaron de acuerdo con los siguientes métodos.
7.1 Métodos
7.1.1 purificación de fagos.
Las preparaciones de reserva de bacteriófagos aislados de muestras clínicas se prepararon de acuerdo con los protocolos descritos en Carlson, "Working with bacteriophages: common techniques and methodological approaches," En, Kutter and Sulakvelidze (Eds) Bacteriophages: Biology and Applications, 5th ed. CRC Press (2005).
Las preparaciones de reserva de bacteriófagos se concentraron por precipitación con PEG de acuerdo con el protocolo descrito por Carlson and Yamamoto et al., 2004, PNAS 101:6415-6420. En resumen, la preparación de reserva se incubó en NaCl 1 M durante una hora a 4°C con agitación. A continuación, se añadió gradualmente PEG 8000 (AppliChem, Cheshire, MA) a una concentración final del 10% (p/v). La composición se incubó luego durante la noche a 4°C. Después del período de incubación, la composición se centrifugó a 10000 x g durante 30 minutos a 4°C. El sedimento se resuspendió luego en regulador SM (Tris-HCL 0.05 M a pH 7.4, NaCl 0.1 M, MgSO410 mM) con gelatina al 1% p/v y se centrifuga nuevamente a 1000 rpm a 4 °C durante 10 minutos. El sobrenadante que contiene el fago suspendido se guardó para una purificación adicional. El sobrenadante se purificó usando un gradiente de CsCl de acuerdo con los métodos de Carlson.
Se eliminó el CsCl de la reserva de fagos purificados y concentrados por diálisis. Se preparó una membrana de diálisis, membrana tubular de celulosa regenerada de alto grado Cellu.Sep Hl (Cellu.Sep, River Street, EE. UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La diálisis consistió en una primera incubación de 30 minutos en Tris-HCl 100 mM y NaCl 3 M (pH 7.4) a 4 °C. Esto fue seguido por una segunda incubación de 30 minutos en Tris-HCl 100 mM y NaCl 0.3 M (pH 7,4) a 4 °C. Después de la diálisis, el fago suspendido se retiró del interior de la bolsa de diálisis y se almacenó a 4 °C.
7.1.2 Extracción de ADN del fago
A 5 ml de las muestras de bacteriófagos purificados y concentrados se añadió EDTA 20 mM a pH 8.0, SDS a 0.5% (p/v) y Proteinasa K a una concentración final de 40 |jg/ml. La mezcla se incubó a 56 °C durante una hora. Se realizaron extracciones sucesivas en fenol:cloroformo:alcohol en una proporción de 25:24:1, hasta que la interfaz entre las fases acuosa y orgánica fue clara. La fase acuosa se trató luego con un volumen igual de cloroformo y se centrifugó a 13.0000 x g durante 10 minutos a 4°C. La fase acuosa se eliminó una vez más, y el ADN se precipitó añadiendo dos volúmenes de etanol absoluto e incubando durante treinta minutos a 20 °C. Las muestras se centrifugaron luego a 11.000 x g durante 30 minutos a 4 °C. Las pellas se lavaron con etanol al 70% a temperatura ambiente y se resuspendió en 50 j l de agua ultrapura (Gibco, California). La concentración de ADN se determinó midiendo la absorbancia a 260 nm en un espectrofotómetro ND-1000. La integridad del ADN del fago aislado se analizó por electroforesis en un gel de agarosa al 1%.
7.1.3 Análisis de genomas bacteriófagos
La secuenciación del genoma del bacteriófago permitió la identificación de posibles marcos de lectura abiertos (ORFs) dentro del genoma. Los ORF putativos de los bacteriófagos se usaron para buscar en la base de datos de la colección de nucleótidos del NCBI, secuencias de ADN homólogas usando el programa BLASTN (véase, por ejemplo, Zhang et al., 2000, J. Comput. Biol. 7: 203-214).
7.2 Ejemplo 1: Bacteriófago F168/08
La comparación de los ORF putativos del genoma del bacteriófago F168/08 con las secuencias en la base de datos de nucleótidos de NCBI reveló que solo pequeñas porciones del genoma (< 1%) exhibían homología con secuencias conocidas. Los ORF F168/08, sus secuencias de aminoácidos codificadas y proteínas homólogas conocidas se proporcionan en la Figura 2. La predicción de ORFs se realizó integrando los resultados obtenidos con los programas GeneMark.hmm y MetaGeneAnnotator (Besemer, J. and Borodovsky, M. 1999. Nucleic Acids Res., 27: 3911-3920; Noguchi, H. et al., 2008. DNA Res., 15: 387-396). Las búsquedas de homología de proteínas se llevaron a cabo con el programa BLASTP (Alschul, S.F. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 3389-33402) usando la base de datos de secuencias de proteínas no redundantes de NCBI. Los dominios conservados en proteínas se predijeron usando BLAST especializado en NCBI (Marchler-Bauer, A. et al., 2007. Nucleic Acids Res. 35: 237-240). Los ORFs cuyos productos presentan homología con las mismas proteínas se indican con el mismo número agregado de una letra minúscula, en la FIG. 2. La identificación de los genes de ARN de transferencia putativos (ARNt) se llevó a cabo utilizando el programa tRNAscan-SE (Lowe, T.M. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 955-964).
Las figs. 3A-B proporcionan los resultados de pruebas puntuales que evaluaron la actividad del bacteriófago F168/08 contra 105 cepas de Enterococcus faecalis (A) y 56 cepas de Enterococcus faecium (B) aisladas de muestras clínicas. Cada punto constaba de 5 |jl de suspensión de bacteriófagos con los títulos indicados, preparados a partir de un lisado purificado con CsCl. La sensibilidad al fago se representa como una escala que va desde halos de lisis turbios (+) hasta claros (++++). La resistencia a la infección por fagos se indica como (-).
7.3 Ejemplo 2: Bacteriófago F170/08
La comparación de los ORF putativos del genoma del bacteriófago F170/08 con las secuencias en la base de datos de nucleótidos de NCBI reveló que aproximadamente el 94% de su genoma era muy similar al del fago Enterococcus OEF24C, con identidades individuales de ORF que van del 80 al 100%. Los ORF F170/08, sus secuencias de aminoácidos codificadas y proteínas homólogas conocidas se proporcionan en la FIG. 5. La predicción de ORFs se realizó integrando los resultados obtenidos con los programas GeneMark.hmm y MetaGeneAnnotator (Besemer, J. and Borodovsky, M. 1999. Nucleic Acids Res., 27: 39l 1 -3920; Noguchi, H. et al., 2008. DNA Res., 15: 387-396). Las búsquedas de homología de proteínas se llevaron a cabo con el programa BLASTP (Alschul, S.F. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 3389-33402) usando la base de datos de secuencias de proteínas no redundantes de NCBI. Los dominios conservados en proteínas se predijeron usando BLAST especializado en NCBI (Marchler-Bauer, A. et al., 2007. Nucleic Acids Res. 35: 237-240). Los ORFs cuyos productos presentan homología con las mismas proteínas se indican con el mismo número agregado de una letra minúscula, en la FIG. 5. La identificación de los genes de ARN de transferencia putativos (ARNt) se llevó a cabo utilizando el programa tRNAscan-SE (Lowe, T.M. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 955-964).
Las figs. 6A-B proporcionan los resultados de pruebas puntuales que evaluaron la actividad del bacteriófago F170/08 contra 105 cepas de Enterococcus faecalis (A) y 56 cepas de Enterococcus faecium (B) aisladas de muestras clínicas. Cada punto constaba de 5 j l de suspensión de bacteriófagos con los títulos indicados, preparados a partir de un lisado purificado con CsCl. La sensibilidad al fago se representa como una escala que va desde halos de lisis turbios (+) hasta claros (++++). La resistencia a la infección por fagos se indica como (-).
7.4 Ejemplo 3: Bacteriófago F770/05
La comparación de los ORF putativos del genoma del bacteriófago F770/05 con las secuencias en la base de datos de nucleótidos de NCBI reveló que solo pequeñas porciones del genoma (< 1%) exhibían homología con secuencias conocidas. Los ORF F170/05, sus secuencias de aminoácidos codificadas y proteínas homólogas conocidas se proporcionan en la FIG. 8. La predicción de ORFs se realizó integrando los resultados obtenidos con los programas GeneMark.hmm y MetaGeneAnnotator (Besemer, J. and Borodovsky, M. 1999. Nucleic Acids Res., 27: 3911-3920; Noguchi, H. et al., 2008. DNA Res., 15: 387-396). Las búsquedas de homología de proteínas se llevaron a cabo con el programa BLASTP (Alschul, S.F. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 3389-33402) usando la base de datos de secuencias de proteínas no redundantes de NCBI. Los dominios conservados de proteínas se predijeron usando BLAST especializado en NCBI (Marchler-Bauer, A. et al., 2007. Nucleic Acids Res. 35: 237-240).
La Figura 9 proporciona los resultados de pruebas puntuales que evaluaron la actividad del bacteriófago F170/05 contra 100 cepas de Pseudomonas aeruginosa aisladas de muestras clínicas. Cada punto constaba de 5 j l de suspensión de bacteriófagos con los títulos indicados, preparados a partir de un lisado purificado con CsCl. La sensibilidad al fago se representa como una escala que va desde halos de lisis turbios (+) hasta claros (++++). La resistencia a la infección por fagos se indica como (-).
7.5 Ejemplo 4: Bacteriófago F197/08
La comparación de los ORF putativos del genoma del bacteriófago F197/08 con las secuencias en la base de datos de nucleótidos NCBI reveló que el genoma era altamente homólogo con múltiples genomas de fago estafilocócico. En particular, aproximadamente el 90% del genoma F197/08 es muy similar al del bacteriófago Staphylococcus phiSauS-IPLA35, con identidades de ORF individuales que van del 80 al 98%. Los ORF F197/08, sus secuencias de aminoácidos codificadas y proteínas homólogas conocidas se proporcionan en la FIG. 11. La predicción de ORFs se realizó integrando los resultados obtenidos con los programas GeneMark.hmm y MetaGeneAnnotator (Besemer, J. and Borodovsky, M. 1999. Nucleic Acids Res., 27: 3911-3920; Noguchi, H. et al., 2008. DNA Res., 15: 387-396). Las búsquedas de homología de proteínas se llevaron a cabo con el programa BLASTP (Alschul, S.F. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 3389-33402) usando la base de datos de secuencias de proteínas no redundantes de NCBI. Los dominios conservados en proteínas se predijeron usando BLAST especializado en NCBI (Marchler-Bauer, A. et al., 2007. Nucleic Acids Res. 35: 237-240). Los ORFs cuyos productos presentan homología con las mismas proteínas se indican con el mismo número agregado de una letra minúscula, en la FIG. 11)
La Figura 12 proporciona los resultados de pruebas puntuales que evaluaron la actividad del bacteriófago F197/08 contra 100 cepas de Staphylococcus aureus aisladas de muestras clínicas. Cada punto constaba de 5 j l de suspensión de bacteriófagos con los títulos indicados, preparados a partir de un lisado purificado con CsCl. La sensibilidad al fago se representa como una escala que va desde halos de lisis turbios (+) hasta claros (++++). La resistencia a la infección por fagos se indica como (-).
7.6 Ejemplo 5: Bacteriófago F86/06
La comparación de los ORF putativos del genoma del bacteriófago F86/06 con las secuencias en la base de datos de nucleótidos NCBI reveló que el genoma era altamente homólogo con múltiples genomas de fagos estafilocócicos. En particular, aproximadamente el 80% del genoma F86/06 es muy similar al del bacteriófago Staphylococcus tp310-1, con identidades individuales de ORF que van del 85 al 100%. Los ORF F86/06, sus secuencias de aminoácidos codificadas y proteínas homólogas conocidas se proporcionan en la FIG. 14. La predicción de ORFs se realizó integrando los resultados obtenidos con los programas GeneMark.hmm y MetaGeneAnnotator (Besemer, J. and Borodovsky, M. 1999. Nucleic Acids Res., 27: 3911-3920; Noguchi, H. et al., 2008. DNA Res., 15: 387-396). Las búsquedas de homología de proteínas se llevaron a cabo con el programa BLASTP (Alschul, S.F. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 3389-33402) usando la base de datos de secuencias de proteínas no redundantes de NCBI. Los dominios conservados en proteínas se predijeron usando BLAST especializado en NCBI (Marchler-Bauer, A. et al., 2007. Nucleic Acids Res. 35: 237-240).
La Figura 15 proporciona los resultados de pruebas puntuales que evaluaron la actividad del bacteriófago F86/06 contra 100 cepas de Staphylococcus aureus aisladas de muestras clínicas. Cada punto constaba de 5 |jl de suspensión de bacteriófagos con los títulos indicados, preparados a partir de un lisado purificado con CsCl. La sensibilidad al fago se representa como una escala que va desde halos de lisis turbios (+) hasta claros (++++). La resistencia a la infección por fagos se indica como (-).
7.7 Ejemplo 6: Bacteriófago F87s/06
La comparación de los ORF putativos del genoma bacteriófago F87s/06 con las secuencias en la base de datos de nucleótidos NCBI reveló que el genoma era altamente homólogo con múltiples genomas de fago estafilocócico. En particular, aproximadamente el 82% del genoma F87s/06 es muy similar al del bacteriófago de Staphylococcus ONM3, con identidades de ORF individuales que van del 90 al 100%. Los ORF F86/06, sus secuencias de aminoácidos codificadas y proteínas homólogas conocidas se proporcionan en la FIG. 17. La predicción de ORFs se realizó integrando los resultados obtenidos con los programas GeneMark.hmm y MetaGeneAnnotator (Besemer, J. and Borodovsky, M. 1999. Nucleic Acids Res., 27: 3911-3920; Noguchi, H. et al., 2008. DNA Res., 15: 387-396). Las búsquedas de homología de proteínas se llevaron a cabo con el programa BLASTP (Alschul, S.F. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 3389-33402) usando la base de datos de secuencias de proteínas no redundantes de NCBI. Los dominios conservados en proteínas se predijeron usando BLAST especializado en NCBI (Marchler-Bauer, A. et al., 2007. Nucleic Acids Res. 35: 237-240). Los ORFs cuyos productos presentan homología con las mismas proteínas se indican con el mismo número agregado de una letra minúscula, en la FIG. 17)
La Figura 18 proporciona los resultados de pruebas puntuales que evaluaron la actividad del bacteriófago F87s/06 contra 100 cepas de Staphylococcus aureus aisladas de muestras clínicas. Cada punto constaba de 5 j l de suspensión de bacteriófagos con los títulos indicados, preparados a partir de un lisado purificado con CsCl. La sensibilidad al fago se representa como una escala que va desde halos de lisis turbios (+) hasta claros (++++). La resistencia a la infección por fagos se indica como (-).
7.8 Ejemplo 7: Bacteriófago F91a/06
La comparación de los ORF putativos del genoma del bacteriófago F91a/06 con las secuencias en la base de datos de nucleótidos NCBI reveló que el genoma era altamente homólogo con múltiples genomas de fagos estafilocócicos. En particular, aproximadamente el 82% del genoma F91a/06 es muy similar al del bacteriófago Staphylococcus ONM3, con identidades de ORF individuales que van del 86 al 99%. Los ORF F91a/06, sus secuencias de aminoácidos codificadas y proteínas homólogas conocidas se proporcionan en la FIG. 20. La predicción de ORFs se realizó integrando los resultados obtenidos con los programas GeneMark.hmm y MetaGeneAnnotator (Besemer, J. and Borodovsky, M. 1999. Nucleic Acids Res., 27: 3911-3920; Noguchi, H. et al., 2008. DNA Res., 15: 387-396). Las búsquedas de homología de proteínas se llevaron a cabo con el programa BLASTP (Alschul, S.F. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 3389-33402) usando la base de datos de secuencias de proteínas no redundantes de NCBI. Los dominios conservados en proteínas se predijeron usando BLAST especializado en NCBI (Marchler-Bauer, A. et al., 2007. Nucleic Acids Res. 35: 237-240). Los ORFs cuyos productos presentan homología con las mismas proteínas se indican con el mismo número agregado de una letra minúscula, en la FIG. 20)
La Figura 21 proporciona los resultados de pruebas puntuales que evaluaron la actividad del bacteriófago F91a/06 contra 100 cepas de Staphylococcus aureus aisladas de muestras clínicas. Cada punto constaba de 5 j l de suspensión de bacteriófagos con los títulos indicados, preparados a partir de un lisado purificado con CsCl. La sensibilidad al fago se representa como una escala que va desde halos de lisis turbios (+) hasta claros (++++). La resistencia a la infección por fagos se indica como (-).
7.9 Ejemplo 8: Bacteriófago F1245/05
Los ORF de F1245/05, sus secuencias de aminoácidos codificadas y las proteínas homólogas conocidas se proporcionan en las Figs. 23A-I. La predicción de ORFs se realizó integrando los resultados obtenidos con los programas GeneMark.hmm y MetaGeneAnnotator (Besemer, J. and Borodovsky, M. 1999. Nucleic Acids Res., 27: 3911-3920; Noguchi, H. et al., 2008. DNA Res., 15: 387-396). Las búsquedas de homología de proteínas se llevaron a cabo con el programa BLASTP (Alschul, S.F. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 3389-33402) usando la base de datos de secuencias de proteínas no redundantes de NCBI. Los dominios conservados de proteínas se predijeron usando BLAST especializado en NCBI (Marchler-Bauer, A. et al., 2007. Nucleic Acids Res. 35: 237-240). La función de la proteína se predijo basándose en la localización del genoma del gen correspondiente y en la presencia de dominios transmembrana putativos del producto codificado (TMHMM server v. 2.0; Krogh, A. et al., 2001. J. Mol. Biol., 305: 567-580.
Las figs. 24 A-E proporciona los resultados de pruebas puntuales que evaluaron la actividad del bacteriófago F1245/05 contra 100 cepas de Acinetobacter baumanni aisladas de muestras clínicas. Cada punto constaba de 5 |jl de suspensión de bacteriófagos con los títulos indicados, preparados a partir de un lisado purificado con CsCl. La sensibilidad al fago se representa como una escala que va desde halos de lisis turbios (+) hasta claros (++++). La resistencia a la infección por fagos se indica como (-).

Claims (21)

REIVINDICACIONES
1. Un bacteriófago purificado que tiene un genoma que comprende al menos el 99% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3, y que tiene actividad antibacteriana contra una o más cepas de Pseudomonas aeruginosa.
2. Una composición farmacéutica que comprende el bacteriófago de la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
3. La composición farmacéutica de la reivindicación 2, que comprende el bacteriófago que tiene el genoma que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3.
4. La composición farmacéutica de la reivindicación 2 o 3, que comprende además uno o más bacteriófagos adicionales efectivos contra Pseudomonas aeruginosa.
5. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, para uso en el tratamiento o la reducción de la incidencia de una infección bacteriana en un sujeto en necesidad de la misma, en el que dicha infección bacteriana es una infección por Pseudomonas aeruginosa.
6. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, para uso de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la infección es una infección nosocomial.
7. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, para uso de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la composición farmacéutica se administra por vía tópica.
8. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, para uso de acuerdo con la reivindicación 5, en la que el sujeto es un mamífero, preferiblemente un humano.
9. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, para uso de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la infección es una infección de la piel, preferiblemente en la que dicha infección de la piel es una infección asociada con una lesión por quemadura o una úlcera de pie diabético.
10. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, para uso de acuerdo con la reivindicación 9, en la que la composición farmacéutica se administra por vía tópica.
11. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, para uso de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la infección es una infección de los pulmones.
12. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, para uso de acuerdo con la reivindicación 11, en la que la composición farmacéutica se administra mediante inhalación,
preferiblemente en la que dicha administración por inhalación usa una bomba, un aerosol o un nebulizador; y/o preferiblemente en la que la composición farmacéutica para administración por inhalación comprende un inhalador de polvo seco o un pulverizador en aerosol.
13. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, para uso de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la infección es una infección del tracto urinario o los riñones.
14. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, para uso de acuerdo con la reivindicación 13, en la que la composición farmacéutica se administra por vía tópica.
15. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, para uso de acuerdo con la reivindicación 5, en la que dicha composición farmacéutica comprende además al menos uno de:
(i) un antibiótico contra Pseudomonas aeruginosa; y
(ii) un bacteriófago adicional que se sabe que tiene actividad antibacteriana contra Pseudomonas aeruginosa.
16. Un método para diagnosticar el agente causante de una infección bacteriana que comprende:
(i) cultivar una muestra de tejido de un paciente;
(ii) poner en contacto el cultivo de la etapa (i) con el bacteriófago de la reivindicación 1; y
(iii) monitorizar por evidencia de crecimiento o lisis del cultivo;
en el que la evidencia de lisis del cultivo indica que el cultivo comprende una cepa de bacterias Pseudomonas aeruginosa susceptibles al bacteriófago o proteína utilizada en la etapa (ii).
17. El método de la reivindicación 16, en el que la muestra es una muestra de sangre, orina, esputo, fluido, biopsia de tejido o torunda recogidos de dicho paciente.
18. Un método in vitro para reducir o inhibir la colonización o el crecimiento de una o más cepas de Pseudomonas aeruginosa en una superficie sólida que comprende poner en contacto dicha superficie sólida con el bacteriófago de la reivindicación 1.
19. El método de la reivindicación 18, en el que dicha superficie es la superficie de un aparato hospitalario o una pieza de equipo hospitalario, preferiblemente en donde dicho aparato o equipo es un aparato quirúrgico o pieza de equipo quirúrgico.
20. El bacteriófago de la reivindicación 1, para uso en la reducción o inhibición de la colonización de una o más cepas de Pseudomonas aeruginosa en las superficies de un cuerpo.
21. El bacteriófago de la reivindicación 1, para uso de acuerdo con la reivindicación 20, en el que dicha superficie corporal es la piel, o una membrana mucosa de un mamífero, preferiblemente de un humano.
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