BRPI1008663B1 - bacteriófago com um genoma, composição farmacêutica, uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica, método de diagnóstico do agente causador de uma infecção bacteriana e uso do bacteriófago - Google Patents

bacteriófago com um genoma, composição farmacêutica, uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica, método de diagnóstico do agente causador de uma infecção bacteriana e uso do bacteriófago Download PDF

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Carlos Jorge Sousa De São José
Clara Isabel Rodrigues Leandro
Filipa Maria Rodrigues Pardal Dias Antunes Marçal Da Silva
Sara Ferreira Liorence Grancho Lourenço
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Technophage, Investigação E Desenvolvimento Em Biotecnologia, S.A.
Tecnifarindústria Técnica Farmacêutica, S.A.
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Abstract

fagos antibacterianos, peptídeos fágicos e métodos de utilização dos mesmos a presente invenção é dirigida à área da terapia fágica para o tratamento e controlo de infecções bacterianas. em particular, a presente invenção é dirigida aos novos bacteriófados f1245/05, f168/08, f170/08, f770/05, f197/08, f86/06, f87s/06 e f91a/06, respectivos polipeptídeos isolados, composições compreendendo um ou mais dos novos bacteriófagos e/ou polipeptídeos isolados e métodos para o tratamento e prevenção de infecções bacterianas, isoladamente ou em combinação com outras terapias antibacterianas, por exemplo, antibióticos, ou outras terapias fágicas.

Description

DESCRIÇÃO 1. REQUERIMENTOS RELACIONADOS
[0001] Este Requerimento Internacional reivindica prioridade para o Requerimento Provisório U.S. N° de Série 61/150,585, registrado em 6 de fevereiro de 2009, intitulado "Antibacterial Phage and Uses Thereof", e para o Requerimento Provisório U.S. N° de Série 61/218,345, registrado em 18 de junho de 2009, intitulado "Antibacterial Phage, Phage Peptides and Methods of Use Thereof". Quando permitido, o assunto e conteúdo, incluindo listagens de sequências, destes requerimentos provisórios são incorporados aqui por referência na sua totalidade.
2. ÁREA DA INVENÇÃO
[0002] A presente invenção é dirigida à área da terapia fágica para o tratamento e controlo de infecções bacterianas. Em particular, a presente invenção é dirigida aos novos bacteriófagos F1245/05, F168/08, F170/08, F770/05, F197/08, F86/06, F87s/06 e F91a/06, respectivos polipeptídios isolados, composições compreendendo um ou mais dos novos bacteriófagos e/ou polipeptídios isolados e métodos para o tratamento e prevenção de infecções bacterianas causadas por Acinetobacter baumannii, Enterococcus faecalis, E. faecium, Pseudomonas aeruginosa, e/ou Staphylococcus aureus, isoladamente ou em combinação com outras terapias antibacterianas, por exemplo, antibióticos, ou outras terapias fágicas.
3. CONTEXTO
[0003] Os bacteriófagos (fagos) são vírus que especificamente infectam e procedem à lise de bactérias. A terapia fágica, um método de utilização de vírus fágicos completos para o tratamento de doenças bacterianas infecciosas, foi introduzida na década de 1920 por Felix d’Herelle. Inicialmente, a terapia fágica foi vigorosamente investigada, e foram empreendidos numerosos estudos para avaliar o potencial da terapia fágica para o tratamento de infecções bacterianas em humanos e animais. O êxito precoce desencadeou o desenvolvimento de múltiplas preparações fágicas comerciais. Por exemplo, em 1940, a Eli Lilly Company produziu 7 produtos fágicos para utilização humana, incluindo preparações fágicas para o tratamento de diferentes doenças causadas por Staphylococcus sp., E. coli e outras bactérias patogênicas. Estas preparações foram utilizadas para tratar infecções que causam abscesso, feridas purulentas, vaginite, infecções crônicas agudas do trato respiratório superior e infecções da mastóide.
[0004] No entanto, com o desenvolvimento dos antibióticos na década de 1940, o interesse nas terapêuticas à base de fagos declinou no mundo ocidental. Um dos fatores mais importantes que contribuiu para este declínio foi a falta de protocolos de teste e métodos de produção padronizados. A falha em desenvolver padrões à escala industrial para o teste de terapias fágicas interferiu na documentação de resultados de estudos, conduzindo a uma falta de eficácia apercebida e a problemas de credibilidade relativos ao valor da terapia fágica. Além disso, problemas relacionados com a produção de amostras/espécimes fágicos complicaram os estudos e investigações iniciais. Foram inicialmente utilizados diversos estabilizadores e conservantes em tentativas para aumentar a viabilidade das terapêuticas fágicas. Todavia, uma vez que a biologia dos fagos e dos vários estabilizadores era mal compreendida, muitos dos ingredientes adicionados numa tentativa de prolongar a viabilidade de preparações fágicas demonstraram ser tóxicos para humanos ou terem um impacto negativo por armazenamento de longa duração. Outro problema relacionado com a produção de fagos era o grau de pureza das preparações comerciais destes vírus. Na altura, as preparações para terapias fágicas consistiam geralmente em lisatos em bruto de bactérias hospedeiras que tinham sido tratadas com o fago de interesse. Assim, muitas preparações continham o que é agora reconhecido serem componentes bacterianos indesejados, por exemplo, endotoxinas. Em conformidade, eventos adversos estavam muitas vezes associados às preparações, particularmente em pacientes que as recebiam pela via intravenosa. Ainda assim, na Europa de Leste e na antiga União Soviética, onde o acesso a antibióticos era limitado, o desenvolvimento e utilização da terapia fágica continuou juntamente ou em vez dos antibióticos.
[0005] No entanto, com o surgimento de estirpes de bactérias resistentes a antibióticos, o interesse nas terapêuticas à base de fagos regressou ao mundo ocidental. Apesar de poderem ser desenvolvidas novas classes de antibióticos, a perspectiva de que bactérias acabarão por desenvolver resistência aos novos fármacos intensificou a busca de meios não quimioterapêuticos para controlar, prevenir e tratar infecções bacterianas. Há três estratégias principais à base de fagos para utilização da terapia fágica num ambiente clínico: 1) a administração de fagos virulentos; 2) a utilização de endolisinas ou lisinas purificadas codificadas por bacteriófagos; 3) a utilização de proteínas estruturais dos fagos identificados como inibidores metabólicos de enzimas-chave para a síntese de peptidoglicanos bacterianos.
[0006] Em consequência, é necessário desenvolver novos bacteriófagos e produtos fágicos como potenciais agentes terapêuticos e profilácticos para utilização in vivo com a finalidade de eliminar bactérias patogênicas. Em particular, são necessários bacteriófagos capazes de proceder à lise de bactérias nosocomiais, incluindo Acinetobacter baumannii, Enterococcus faecalis, E. faecium, Pseudomonas aeruginosa e/ou Staphylococcus aureus. Uma vez que a maior parte dos fagos e peptídeos fágicos estudados até à data exibe atividade muitas vezes restringida à espécie ou subespécie de bactérias relacionada de onde são isolados, as novas terapias à base de fagos poderão ter aplicação particular no cenário hospitalar, abordando seletivamente patogenes nosocomiais sem afetar a flora normal envolvente.
4. RESUMO DA INVENÇÃO
[0007] A presente invenção é dirigida a bacteriófagos isolados e a polipeptídios antibacterianos isolados de origem bacteriofágica para o tratamento, prevenção ou gestão de estados associados a infecções causadas por bactérias Gram-positivas ou Gram-negativas. Em particular, os bacteriófagos ou polipeptídios isolados da invenção podem ser utilizados em composições farmacêuticas para o tratamento, profilaxia ou gestão de infecções causadas por patogenes nosocomiais, por exemplo, bactérias Gram- positivas, incluindo mas não se limitando a Enterococcus faecalis, E. faecium, E. hirae, E. avium, Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. auricularis, S. capitis, S. haemolyticus, S. hominis, S. saprophyticus, S. simulans e S. xylosis, e/ou bactérias Gram-negativas, incluindo mas não se limitando a Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa. Em certas formas de realização, as composições farmacêuticas da invenção têm aplicação no tratamento de estados associados a infecções causadas por estirpes de bactérias resistentes a antibióticos, por exemplo, estirpes de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA). Em formas de realização particulares, os bacteriófagos ou polipeptídios isolados da invenção são utilizados para o tratamento tópico de infecções causadas por patogenes nosocomiais num sujeito necessitado. Noutras formas de realização, os bacteriófagos ou polipeptídios isolados da invenção são utilizados para o diagnóstico do agente infeccioso numa amostra (por exemplo, amostra de tecido, sangue, urina, expectoração) derivada de um paciente. Noutras formas de realização, os bacteriófagos ou polipeptídios isolados da invenção são utilizados como desinfetante ou anti-infeccioso profiláctico para a preparação de superfícies sólidas, incluindo pele ou outras superfícies epidérmicas.
[0008] Em certas formas de realização, a invenção proporciona um bacteriófago isolado, F168/08 ou F170/08, que tem um genoma que compreende a sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 1 ou ID SEQ NO: 2, respectivamente, e que exibe atividade antibacteriana contra uma ou mais estirpes de Enterococcus faecalis e/ou E. faecium. Noutras formas de realização, a invenção proporciona um bacteriófago isolado, F770/05, que tem um genoma que compreende a sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 3 e que exibe atividade antibacteriana contra uma ou mais estirpes de Pseudomonas aeruginosa. Ainda noutras formas de realização, a invenção proporciona o bacteriófago isolado, F197/08, F86/06, F87s/06 ou F91a/06, que tem um genoma que compreende a sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 4, ID SEQ NO: 5, ID SEQ NO: 6 ou ID SEQ NO: 7, respectivamente, e que exibe atividade antibacteriana contra uma ou mais estirpes de Staphylococcus aureus. Ainda noutras formas de realização, a invenção proporciona um bacteriófago isolado, F1245/05, que tem um genoma que compreende a sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 760 e que exibe atividade antibacteriana contra uma ou mais estirpes de Acinetobacter baumannii.
[0009] A invenção também abrange bactérias isoladas infectadas com um ou mais bacteriófagos da invenção. Em formas de realização específicas, a invenção proporciona uma E. faecalis isolada infectada com um bacteriófago que tem um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 1 e/ou ID SEQ NO: 2. Noutras formas de realização, a invenção proporciona uma E. faecium isolada infectada com um bacteriófago que tem um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 1 e/ou ID SEQ NO: 2. Ainda noutras formas de realização, a invenção proporciona uma P. aeruginosa isolada infectada com um bacteriófago que tem um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 3. Ainda noutras formas de realização, a invenção proporciona uma S. aureus isolada infectada com um ou mais bacteriófagos que têm um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 4, ID SEQ NO: 5, ID SEQ NO: 6 e/ou ID SEQ NO: 7. Ainda noutras formas de realização, a invenção proporciona uma A. baumannii isolada infectada com um bacteriófago que tem um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 760.
[0010] A presente invenção abrange polipeptídios isolados dos bacteriófagos F1245/05, F168/08, F170/08, F770/05, F197/08, F86/06, F87s/06 e/ou F91a/06, cujos polipeptídios exibem atividade antibacteriana contra uma ou mais espécies ou estirpes de bactérias Gram-positivas ou Gram-negativas, por exemplo, A. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa e/ou S. aureus. Em formas de realização específicas, os polipeptídios da invenção isolados ou derivados de F168/08 ou F/170/08 exibem atividade antibacteriana ou antimicrobiana, por exemplo, atividade de morte por lise, contra pelo menos E. faecalis e/ou E. faecium; os isolados ou derivados de F770/05 contra pelo menos P. aeruginosa; os isolados ou derivados de F197/08, F86/06, F87s/06 ou F91a/06 contra pelo menos S. aureus, e os isolados ou derivados de F1245/05 contra pelo menos A. baumannii.
[0011] Em certas formas de realização, um polipeptídio da invenção compreende ou consiste numa endolisina isolada, ou respectivo fragmento (por exemplo, um domínio CHAP), que exibe atividade antibacteriana contra uma ou mais espécies ou estirpes de bactérias, por exemplo, bactérias Gram-positivas e/ou bactérias Gram-negativas, como A. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa e/ou S. aureus. Em formas de realização específicas, o polipeptídio da invenção é uma proteína lisina isolada, por exemplo, uma endolisina ou lisina da cauda, que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 68, ID SEQ NO: 184, ID SEQ NO: 202, ID SEQ NO: 203, ID SEQ NO: 446, ID SEQ NO: 447, ID SEQ NO: 448, ID SEQ NO: 575, ID SEQ NO: 641 ou ID SEQ NO: 712. Ainda noutras formas de realização, a invenção proporciona um polipeptídio que compreende ou consiste numa sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste na ID SEQ NO: 761 até à ID SEQ NO: 816.
[0012] Noutras formas de realização, um polipeptídio da invenção compreende um fragmento, variante ou derivado da ID SEQ NO: 68, ID SEQ NO: 184, ID SEQ NO: 202, ID SEQ NO: 203, ID SEQ NO: 446, ID SEQ NO: 447, ID SEQ NO: 448, ID SEQ NO: 575, ID SEQ NO: 641 ou ID SEQ NO: 712, em que o referido fragmento, variante ou derivado tem atividade antibacteriana ou atividade antimicrobiana, por exemplo, atividade de morte por lise, contra uma ou mais estirpes de E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa e/ou S. aureus. Em exemplos específicos de acordo com esta forma de realização, a variante, fragmento ou derivado da sequência de aminoácidos da ID SEQ NO: 68, ID SEQ NO: 184, ID SEQ NO: 202 e/ou ID SEQ NO: 203 exibe atividade antibacteriana ou antimicrobiana (por exemplo, atividade de morte por lise) contra uma ou mais estirpes de E. faecalis e/ou E. faecium. Noutros exemplos de acordo com esta forma de realização, a variante, fragmento ou derivado da sequência de aminoácidos da ID SEQ NO: 446, ID SEQ NO: 447, ID SEQ NO: 448, ID SEQ NO: 575, ID SEQ NO: 641 e/ou ID SEQ NO: 712 exibe atividade antibacteriana ou antimicrobiana (por exemplo, atividade de morte por lise) contra uma ou mais estirpes de S. aureus.
[0013] Em formas de realização específicas, o polipeptídio isolado da invenção compreende ou consiste no domínio CHAP da ID SEQ NO: 68, ID SEQ NO: 446, ID SEQ NO: 575, ID SEQ NO: 641 ou ID SEQ NO: 712. Em certas formas de realização, o polipeptídio isolado compreende ou consiste no domínio CHAP da ID SEQ NO: 68, ID SEQ NO: 446, ID SEQ NO: 575, ID SEQ NO: 641 ou ID SEQ NO: 712, por exemplo, com a sequência de aminoácidos da ID SEQ NO: 755, ID SEQ NO: 756, ID SEQ NO: 757, ID SEQ NO: 758 ou ID SEQ NO: 759, respectivamente. Noutras formas de realização, um polipeptídio da invenção compreende um fragmento, variante ou derivado da ID SEQ NO: 755, ID SEQ NO: 756, ID SEQ NO: 757, ID SEQ NO: 758 ou ID SEQ NO: 759, em que o referido fragmento, variante ou derivado tem atividade antibacteriana ou atividade antimicrobiana, por exemplo, atividade de morte por lise, contra pelo menos uma ou mais estirpes de E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa e/ou S. aureus. Ainda noutras formas de realização, um polipeptídio da invenção compreende um fragmento, variante ou derivado da ID SEQ NO: 761 até à ID SEQ NO: 816, em que o referido fragmento, variante ou derivado tem atividade antibacteriana ou atividade antimicrobiana, por exemplo, atividade de morte por lise, contra pelo menos uma ou mais estirpes de A. baumannii.
[0014] Noutras formas de realização, um polipeptídio da invenção compreende ou consiste numa proteína da medida do comprimento da cauda (“tail length tape measure protein”) ou proteína da cauda isolada (por exemplo, componente da cauda, proteína de fibras da cauda, proteína da cauda associada à adsorção), ou respectivo fragmento, que tem uma função biológica associada ao bacteriófago de onde é derivada, por exemplo, atividade antimicrobiana ou antibacteriana (por exemplo, atividade de morte por lise), cuja função é dirigida contra pelo menos uma ou mais espécies ou estirpes de E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa, S. aureus e/ou A. baumannii. Em formas de realização específicas, o polipeptídio da invenção é uma proteína da medida do comprimento da cauda ou proteínas da cauda isoladas que compreendem ou consistem nas sequências de aminoácidos ID SEQ NO: 61, ID SEQ NO: 63, ID SEQ NO: 204, ID SEQ NO: 214, ID SEQ NO: 435, ID SEQ NO: 438, ID SEQ NO: 440, ID SEQ NO: 525, ID SEQ NO: 526, ID SEQ NO: 527, ID SEQ NO: 528, ID SEQ NO: 529, ID SEQ NO: 530, ID SEQ NO: 531, ID SEQ NO: 532, ID SEQ NO: 533, ID SEQ NO: 534, ID SEQ NO: 535, ID SEQ NO: 536, ID SEQ NO: 537, ID SEQ NO: 538, ID SEQ NO: 539, ID SEQ NO: 567, ID SEQ NO: 568, ID SEQ NO: 632, ID SEQ NO: 633, ID SEQ NO: 700, ID SEQ NO: 701, ID SEQ NO: 702, ID SEQ NO: 703, ID SEQ NO: 704 ou ID SEQ NO: 795. Noutras formas de realização, um polipeptídio da invenção compreende um fragmento, variante ou derivado da ID SEQ NO: 61, ID SEQ NO: 63, ID SEQ NO: 204, ID SEQ NO: 214, ID SEQ NO: 435, ID SEQ NO: 438, ID SEQ NO: 440, ID SEQ NO: 525, ID SEQ NO: 526, ID SEQ NO: 527, ID SEQ NO: 528, ID SEQ NO: 529, ID SEQ NO: 530, ID SEQ NO: 531, ID SEQ NO: 532, ID SEQ NO: 533, ID SEQ NO: 534, ID SEQ NO: 535, ID SEQ NO: 536, ID SEQ NO: 537, ID SEQ NO: 538, ID SEQ NO: 539, ID SEQ NO: 567, ID SEQ NO: 568, ID SEQ NO: 632, ID SEQ NO: 633, ID SEQ NO: 700, ID SEQ NO: 701, ID SEQ NO: 702, ID SEQ NO: 703, ID SEQ NO: 704 ou ID SEQ NO: 795, em que o referido fragmento, variante ou derivado exibe uma função biológica associada ao bacteriófago de onde é derivado, por exemplo, atividade antimicrobiana ou antibacteriana (por exemplo, atividade de morte por lise), cuja função é dirigida contra uma ou mais estirpes de E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa, S. aureus e/ou A. baumannii.
[0015] Em certas formas de realização, a invenção abrange uma variante, fragmento ou derivado da sequência de aminoácidos da ID SEQ NO: 61 ou ID SEQ NO: 63 que exibe uma função biológica associada ao bacteriófago que tem um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico ID SEQ NO: 1, por exemplo, atividade antimicrobiana ou antibacteriana (por exemplo, atividade de morte por lise), cuja função é dirigida contra uma ou mais estirpes de E. faecalis e/ou E. faecium. Noutras formas de realização, a invenção abrange uma variante, fragmento ou derivado da sequência de aminoácidos da ID SEQ NO: 204 ou ID SEQ NO: 214, que exibe uma função biológica associada ao bacteriófago que tem um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico ID SEQ NO: 2, por exemplo, atividade antimicrobiana ou antibacteriana (por exemplo, atividade de morte por lise), cuja função é dirigida contra uma ou mais estirpes de E. faecalis e/ou E. faecium.
[0016] Em certas formas de realização, a invenção abrange uma variante, fragmento ou derivado da sequência de aminoácidos da ID SEQ NO: 435 ou ID SEQ NO: 438 que exibe uma função biológica associada ao bacteriófago que tem um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico ID SEQ NO: 3, por exemplo, atividade antimicrobiana ou antibacteriana (por exemplo, atividade de morte por lise), cuja função é dirigida contra uma ou mais estirpes de P. aeruginosa.
[0017] Em certas formas de realização, a invenção abrange uma variante, fragmento ou derivado da sequência de aminoácidos da ID SEQ NO: 440, ID SEQ NO: 525, ID SEQ NO: 526, ID SEQ NO: 527, ID SEQ NO: 528, ID SEQ NO: 529, ID SEQ NO: 530, ID SEQ NO: 531, ID SEQ NO: 532, ID SEQ NO: 533, ID SEQ NO: 534, ID SEQ NO: 535, ID SEQ NO: 536, ID SEQ NO: 537, ID SEQ NO: 538 ou ID SEQ NO: 539 que exibe uma função biológica associada ao bacteriófago que tem um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico ID SEQ NO: 4, por exemplo, atividade antimicrobiana ou antibacteriana (por exemplo, atividade de morte por lise), cuja função é dirigida contra uma ou mais estirpes de S. aureus. Noutras formas de realização, a invenção abrange uma variante, fragmento ou derivado da sequência de aminoácidos da ID SEQ NO: 567 ou ID SEQ NO: 568 que exibe uma função biológica associada ao bacteriófago que tem um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico ID SEQ NO: 5, por exemplo, atividade antimicrobiana ou antibacteriana (por exemplo, atividade de morte por lise), cuja função é dirigida contra uma ou mais estirpes de S. aureus. Ainda noutras formas de realização, a invenção abrange uma variante, fragmento ou derivado da sequência de aminoácidos da ID SEQ NO: 632 ou ID SEQ NO: 633 que exibe uma função biológica associada ao bacteriófago que tem um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico ID SEQ NO: 6, por exemplo, atividade antimicrobiana ou antibacteriana (por exemplo, atividade de morte por lise), cuja função é dirigida contra uma ou mais estirpes de S. aureus. Ainda noutras formas de realização, a invenção abrange uma variante, fragmento ou derivado da sequência de aminoácidos da ID SEQ NO: 700, ID SEQ NO: 701, ID SEQ NO: 702, ID SEQ NO: 703 ou ID SEQ NO: 704 que exibe uma função biológica associada ao bacteriófago que tem um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico ID SEQ NO: 7, por exemplo, atividade antimicrobiana ou antibacteriana (por exemplo, atividade de morte por lise), cuja função é dirigida contra uma ou mais estirpes de S. aureus.
[0018] Em certas formas de realização, a invenção abrange uma variante, fragmento ou derivado da sequência de aminoácidos das ID SEQ NOS: 761 - 816 que exibe uma função biológica associada ao bacteriófago que tem um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico ID SEQ NO: 760, por exemplo, atividade antimicrobiana ou antibacteriana (por exemplo, atividade de morte por lise), cuja função é dirigida contra uma ou mais estirpes de A. baumannii.
[0019] Em certas formas de realização, a invenção proporciona polipeptídios isolados que exibem atividade antimicrobiana ou antibacteriana (por exemplo, atividade de morte por lise) contra uma ou mais estirpes de bactérias (por exemplo, bactérias Gram-positivas (por exemplo, E. faecalis, E. faecium, S. aureus), bactérias Gram-negativas (por exemplo, A. baumannii, P. aeruginosa) ou bactérias não classificadas como sendo Gram-positivas ou Gram-negativas), em que os polipeptídios isolados têm uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequências com uma segunda sequência de aminoácidos do mesmo comprimento (isto é, que consiste no mesmo número de resíduos), cuja segunda sequência de aminoácidos é a ID SEQ NO: 61, ID SEQ NO: 63, ID SEQ NO: 68, ID SEQ NO: 184, ID SEQ NO: 202, ID SEQ NO: 203, ID SEQ NO: 204, ID SEQ NO: 214, ID SEQ NO: 435, ID SEQ NO: 438, ID SEQ NO: 440, ID SEQ NO: 446, ID SEQ NO: 447, ID SEQ NO: 448, ID SEQ NO: 525, ID SEQ NO: 526, ID SEQ NO: 527, ID SEQ NO: 528, ID SEQ NO: 529, ID SEQ NO: 530, ID SEQ NO: 531, ID SEQ NO: 532, ID SEQ NO: 533, ID SEQ NO: 534, ID SEQ NO: 535, ID SEQ NO: 536, ID SEQ NO: 537, ID SEQ NO: 538, ID SEQ NO: 539, ID SEQ NO: 567, ID SEQ NO: 568, ID SEQ NO: 575, ID SEQ NO: 632, ID SEQ NO: 633, ID SEQ NO: 641, ID SEQ NO: 700, ID SEQ NO: 701, ID SEQ NO: 702, ID SEQ NO: 703, ID SEQ NO: 704, ID SEQ NO: 712, ID SEQ NO: 755, ID SEQ NO: 756, ID SEQ NO: 757, ID SEQ NO: 758, ID SEQ NO: 759, SEQ ID NOS: 761 - 816 e/ou respectivo fragmento.
[0020] A invenção também proporciona polipeptídios isolados que compreendem ou consistem na sequência de aminoácidos de qualquer uma das ID SEQ NOS: 8-130, ID SEQ NOS: 131-343, ID SEQ NOS: 344-438, ID SEQ NOS: 439-553, ID SEQ NOS: 554-616, ID SEQ NOS: 617-681, ID SEQ NOS: 682-759 e ID SEQ NOS: 761-816. Noutras formas de realização, são proporcionados polipeptídios isolados da invenção fundidos de forma recombinante ou conjugados de forma química (por exemplo, conjugação covalente ou não covalente) a agentes terapêuticos (por exemplo, polipeptídios heterólogos ou moléculas pequenas).
[0021] A invenção também abrange polinucleotídeos que codificam os polipeptídios da invenção. Numa forma de realização específica, a invenção proporciona um ácido nucleico isolado que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídio de qualquer uma das ID SEQ NOS: 8-130, ID SEQ NOS: 131-343, ID SEQ NOS: 344-438, ID SEQ NOS: 439-553, ID SEQ NOS: 554-616, ID SEQ NOS: 617-681, ID SEQ NOS: 682-759 e SEQ ID NOS 761-816. Noutras formas de realização, a invenção proporciona um ácido nucleico isolado que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídio de qualquer uma das ID SEQ NO: 61, ID SEQ NO: 63, ID SEQ NO: 68, ID SEQ NO: 184, ID SEQ NO: 202, ID SEQ NO: 203, ID SEQ NO: 204, ID SEQ NO: 214, ID SEQ NO: 435, ID SEQ NO: 438, ID SEQ NO: 440, ID SEQ NO: 446, ID SEQ NO: 447, ID SEQ NO: 448, ID SEQ NO: 525, ID SEQ NO: 526, ID SEQ NO: 527, ID SEQ NO: 528, ID SEQ NO: 529, ID SEQ NO: 530, ID SEQ NO: 531, ID SEQ NO: 532, ID SEQ NO: 533, ID SEQ NO: 534, ID SEQ NO: 535, ID SEQ NO: 536, ID SEQ NO: 537, ID SEQ NO: 538, ID SEQ NO: 539, ID SEQ NO: 567, ID SEQ NO: 568, ID SEQ NO: 575, ID SEQ NO: 632, ID SEQ NO: 633, ID SEQ NO: 641, ID SEQ NO: 700, ID SEQ NO: 701, ID SEQ NO: 702, ID SEQ NO: 703, ID SEQ NO: 704, ID SEQ NO: 712, ID SEQ NO: 755, ID SEQ NO: 756, ID SEQ NO: 757, ID SEQ NO: 758, ID SEQ NO: 759, ID SEQ NOS 761-816, ou respectivo fragmento, variante ou derivado ativo, em que o referido polipeptídio ou fragmento, variante ou derivado ativo exibe uma função biológica associada ao bacteriófago de onde é isolado e/ou derivado, por exemplo, atividade antimicrobiana ou antibacteriana (por exemplo, atividade de morte por lise). A invenção também se refere a um vetor que compreende esse ácido nucleico. Numa forma de realização específica, esse vetor é um vetor de expressão. A invenção também proporciona células-hospedeiro que contêm um vetor compreendendo polinucleotídeos que codificam os polipeptídios da invenção.
[0022] A presente invenção abrange métodos para a produção de polipeptídios da invenção ou respectivos fragmentos ativos, em particular para utilização em composições farmacêuticas, isto é, composições antimicrobianas. Por exemplo, os polipeptídios da invenção podem ser isolados diretamente de culturas de células (por exemplo, culturas de células bacterianas) infectadas com o bacteriófago F1245/05, F168/08, F170/08, F770/05, F197/08, F86/06, F87s/06 ou F91a/06. Alternativamente, os polipeptídios da presente invenção podem ser derivados por meios recombinantes utilizando vetores de expressão que compreendem sequências de ácidos nucléicos codificadoras de polipeptídios da invenção, por exemplo, ID SEQ NO: 61, ID SEQ NO: 63, ID SEQ NO: 68, ID SEQ NO: 184, ID SEQ NO: 202, ID SEQ NO: 203, ID SEQ NO: 204, ID SEQ NO: 214, ID SEQ NO: 435, ID SEQ NO: 438, ID SEQ NO: 440, ID SEQ NO: 446, ID SEQ NO: 447, ID SEQ NO: 448, ID SEQ NO: 525, ID SEQ NO: 526, ID SEQ NO: 527, ID SEQ NO: 528, ID SEQ NO: 529, ID SEQ NO: 530, ID SEQ NO: 531, ID SEQ NO: 532, ID SEQ NO: 533, ID SEQ NO: 534, ID SEQ NO: 535, ID SEQ NO: 536, ID SEQ NO: 537, ID SEQ NO: 538, ID SEQ NO: 539, ID SEQ NO: 567, ID SEQ NO: 568, ID SEQ NO: 575, ID SEQ NO: 632, ID SEQ NO: 633, ID SEQ NO: 641, ID SEQ NO: 700, ID SEQ NO: 701, ID SEQ NO: 702, ID SEQ NO: 703, ID SEQ NO: 704, ID SEQ NO: 712, ID SEQ NO: 755, ID SEQ NO: 756, ID SEQ NO: 757, ID SEQ NO: 758, ID SEQ NO: 759, SEQ ID NOS: 761-816, ou respectivos fragmentos, derivados ou variantes ativos. Os polipeptídios da invenção, ou respectivos fragmentos, podem ser produzidos por qualquer método conhecido na área para a produção de um polipeptídio, em particular por síntese química ou por técnicas de expressão recombinante. Em formas de realização específicas, a invenção refere-se a um método de produção recombinante de uma proteína fágica, por exemplo, uma proteína lisina, proteína da cauda ou respectivo fragmento, variante ou derivado ativo, cujo método compreende: (i) cultivar, em condições adequadas para a expressão da referida proteína num meio, uma célula-hospedeiro que contém um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 61, ID SEQ NO: 63, ID SEQ NO: 68, ID SEQ NO: 184, ID SEQ NO: 202, ID SEQ NO: 203, ID SEQ NO: 204, ID SEQ NO: 214, ID SEQ NO: 435, ID SEQ NO: 438, ID SEQ NO: 440, ID SEQ NO: 446, ID SEQ NO: 447, ID SEQ NO: 448, ID SEQ NO: 525, ID SEQ NO: 526, ID SEQ NO: 527, ID SEQ NO: 528, ID SEQ NO: 529, ID SEQ NO: 530, ID SEQ NO: 531, ID SEQ NO: 532, ID SEQ NO: 533, ID SEQ NO: 534, ID SEQ NO: 535, ID SEQ NO: 536, ID SEQ NO: 537, ID SEQ NO: 538, ID SEQ NO: 539, ID SEQ NO: 567, ID SEQ NO: 568, ID SEQ NO: 575, ID SEQ NO: 632, ID SEQ NO: 633, ID SEQ NO: 641, ID SEQ NO: 700, ID SEQ NO: 701, ID SEQ NO: 702, ID SEQ NO: 703, ID SEQ NO: 704, ID SEQ NO: 712, ID SEQ NO: 755, ID SEQ NO: 756, ID SEQ NO: 757, ID SEQ NO: 758, ID SEQ NO: 759, ID SEQ NOS: 761- 816, ou respectivo fragmento, e (ii) recuperar a referida proteína do referido meio. Em certas formas de realização, a sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídio da invenção está operativamente ligada a um promotor heterólogo.
[0023] A invenção também abrange métodos para o diagnóstico do agente causador numa apresentação clínica de infecção bacteriana. Os bacteriófagos ou polipeptídios isolados da invenção podem ser utilizados para ajudar a determinar espécies de bactérias numa amostra de um paciente por determinação da susceptibilidade das bactérias presentes na amostra aos bacteriófagos e/ou polipeptídios da invenção. Esses métodos também abrangem métodos de avaliação da atividade antibacteriana dos bacteriófagos e/ou polipeptídios isolados da invenção. A atividade antibacteriana dos bacteriófagos ou dos polipeptídios da invenção, ou a susceptibilidade de uma amostra desconhecida a essa atividade, pode ser determinada por qualquer método conhecido na área e/ou descrito aqui. Em certas formas de realização, a atividade antibacteriana e/ou susceptibilidade é avaliada por cultura de bactérias conhecidas e/ou amostras de tecido, sangue, fluido ou esfregaço do paciente de acordo com técnicas comuns (por exemplo, em cultura líquida ou em placas de agar), contacto da cultura com bacteriófagos e/ou polipeptídios da invenção e monitorização do crescimento celular após esse contacto. Por exemplo, numa cultura líquida, as bactérias (por exemplo, A. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa, S. aureus) podem crescer até uma densidade óptica (“OD”) representativa de um ponto médio no crescimento exponencial da cultura; a cultura é exposta a uma ou mais concentrações de um ou mais bacteriófagos e/ou polipeptídios da invenção e a OD é monitorizada relativamente a uma cultura de controlo. Uma OD decrescida relativamente a uma cultura de controlo é representativa de um bacteriófago e/ou polipeptídio que exibe atividade antibacteriana (por exemplo, exibe atividade de morte por lise) contra a amostra testada ou espécie e/ou estirpe bacteriana na cultura. De modo semelhante, pode permitir-se a formação de colônias de bactérias numa placa de agar, a placa é exposta a um bacteriófago ou polipeptídio da invenção e o crescimento subsequente das colônias é avaliado relativamente a placas de controlo. Uma dimensão decrescida das colônias ou números totais decrescidos de colônias indicam um bacteriófago e/ou polipeptídio com atividade antibacteriana contra a amostra testada e/ou espécie ou estirpe cultivada.
[0024] A presente invenção também é dirigida a composições farmacêuticas compreendendo ou consistindo num bacteriófago que tem um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico ID SEQ NO: 1, ID SEQ NO: 2, ID SEQ NO: 3, ID SEQ NO: 4, ID SEQ NO: 5, ID SEQ NO: 6 ou ID SEQ NO: 7 ou ID SEQ NO: 760. Em certas formas de realização, a composição farmacêutica da invenção compreende um bacteriófago cujo genoma compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico ID SEQ NO: 1, ID SEQ NO: 2, ID SEQ NO: 3, ID SEQ NO: 4, ID SEQ NO: 5, ID SEQ NO: 6 ou ID SEQ NO: 7 ou ID SEQ NO: 760, para além de um ou mais bacteriófagos diferentes. O um ou mais bacteriófagos diferentes podem ser um ou mais bacteriófagos da invenção (por exemplo, com um genoma que compreende ou consiste numa sequência de ácido nucleico de ID SEQ NO: 1, ID SEQ NO: 2, ID SEQ NO: 3, ID SEQ NO: 4, ID SEQ NO: 5, ID SEQ NO: 6 ou ID SEQ NO: 7 ou ID SEQ NO: 760), uma ou mais estirpes respectivas, ou pode ser um ou mais bacteriófagos conhecidos na área. Além disso, o um ou mais bacteriófagos na composição farmacêutica da invenção podem abordar seletivamente espécies ou estirpes de bactérias iguais ou diferentes. Em certas formas de realização, as composições farmacêuticas que compreendem um ou mais bacteriófagos da invenção também compreendem um ou mais polipeptídios da invenção e/ou outros produtos fágicos descritos aqui ou conhecidos na área.
[0025] Em certas formas de realização, a invenção proporciona composições farmacêuticas compreendendo polipeptídios, ou respectivos fragmentos ativos, em particular os que têm atividade antimicrobiana e/ou antibacteriana, isolados de bacteriófagos com um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico ID SEQ NO: 1, ID SEQ NO: 2, ID SEQ NO: 3, ID SEQ NO: 4, ID SEQ NO: 5, ID SEQ NO: 6 ID SEQ NO: 7 e/ou ID SEQ NO: 760. Em formas de realização específicas, as composições farmacêuticas da invenção compreendem um ou mais polipeptídios com uma sequência de aminoácidos da ID SEQ NO: 61, ID SEQ NO: 63, ID SEQ NO: 68, ID SEQ NO: 184, ID SEQ NO: 202, ID SEQ NO: 203, ID SEQ NO: 204, ID SEQ NO: 214, ID SEQ NO: 435, ID SEQ NO: 438, ID SEQ NO: 440, ID SEQ NO: 446, ID SEQ NO: 447, ID SEQ NO: 448, ID SEQ NO: 525, ID SEQ NO: 526, ID SEQ NO: 527, ID SEQ NO: 528, ID SEQ NO: 529, ID SEQ NO: 530, ID SEQ NO: 531, ID SEQ NO: 532, ID SEQ NO: 533, ID SEQ NO: 534, ID SEQ NO: 535, ID SEQ NO: 536, ID SEQ NO: 537, ID SEQ NO: 538, ID SEQ NO: 539, ID SEQ NO: 567, ID SEQ NO: 568, ID SEQ NO: 575, ID SEQ NO: 632, ID SEQ NO: 633, ID SEQ NO: 641, ID SEQ NO: 700, ID SEQ NO: 701, ID SEQ NO: 702, ID SEQ NO: 703, ID SEQ NO: 704, ID SEQ NO: 712, ID SEQ NO: 755, ID SEQ NO: 756, ID SEQ NO: 757, ID SEQ NO: 758, ID SEQ NO: 759 ou ID SEQ NOS: 761- 816. Noutras formas de realização, as composições farmacêuticas da invenção compreendem um polipeptídio que é uma variante, derivado ou fragmento da ID SEQ NO: 61, ID SEQ NO: 63, ID SEQ NO: 68, ID SEQ NO: 184, ID SEQ NO: 202, ID SEQ NO: 203, ID SEQ NO: 204, ID SEQ NO: 214, ID SEQ NO: 435, ID SEQ NO: 438, ID SEQ NO: 440, ID SEQ NO: 446, ID SEQ NO: 447, ID SEQ NO: 448, ID SEQ NO: 525, ID SEQ NO: 526, ID SEQ NO: 527, ID SEQ NO: 528, ID SEQ NO: 529, ID SEQ NO: 530, ID SEQ NO: 531, ID SEQ NO: 532, ID SEQ NO: 533, ID SEQ NO: 534, ID SEQ NO: 535, ID SEQ NO: 536, ID SEQ NO: 537, ID SEQ NO: 538, ID SEQ NO: 539, ID SEQ NO: 567, ID SEQ NO: 568, ID SEQ NO: 575, ID SEQ NO: 632, ID SEQ NO: 633, ID SEQ NO: 641, ID SEQ NO: 700, ID SEQ NO: 701, ID SEQ NO: 702, ID SEQ NO: 703, ID SEQ NO: 704, ID SEQ NO: 712, ID SEQ NO: 755, ID SEQ NO: 756, ID SEQ NO: 757, ID SEQ NO: 758, ID SEQ NO: 759 ou ID SEQ NOS: 761-816, em que a variante, derivado ou fragmento retém uma função biológica do polipeptídio de onde é derivado, por exemplo, atividade antimicrobiana ou antibacteriana (por exemplo, atividade de morte por lise), preferivelmente contra uma ou mais estirpes de A. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa e/ou S. aureus.
[0026] As composições farmacêuticas da invenção podem adicionalmente compreender um transportador, excipiente ou estabilizador farmaceuticamente aceitável. Em certas formas de realização, as composições farmacêuticas da invenção são composições antibióticas (pois exibem atividade antibacteriana) ou composições terapêuticas para o tratamento, prevenção e/ou melhoria de sintomas de uma doença ou perturbação associada a infecção por bactérias num sujeito necessitado. Em formas de realização específicas, as composições farmacêuticas da invenção são composições antibacterianas ou composições terapêuticas para o tratamento, prevenção e/ou melhoria de sintomas de uma doença ou perturbação associada a infecção por A. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa e/ou S. aureus. Em certas formas de realização, o sujeito que recebe uma composição farmacêutica da invenção é um mamífero (por exemplo, bovino, ovino, caprino, equídeo, primata (por exemplo, humano), roedor, lagomorfo ou ave doméstica (por exemplo, galinha, pato, ganso)).
[0027] A presente invenção proporciona métodos para o tratamento ou prevenção de infecções bacterianas, que compreendem administrar a um sujeito necessitado uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais bacteriófagos ou produtos fágicos (por exemplo, um bacteriófago ou polipeptídio isolado ou respectivo fragmento, variante ou derivado ativo), opcionalmente para além de um ou mais bacteriófagos diferentes ou produtos fágicos diferentes, como descrito aqui. No contexto da presente invenção, “tratamento” refere-se a tratamento terapêutico e medidas profilácticas ou preventivas, em que o objetivo é eliminar, atenuar, diminuir a gravidade, abrandar a progressão ou retardar ou prevenir os sintomas ou causa subjacente (por exemplo, infecção bacteriana) associados ao estado ou perturbação patológica. As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser utilizadas no tratamento ou gestão de infecções associadas a qualquer infecção bacteriana, incluindo mas não se limitando a A. baumanni, S. aureus, S. epidermidis, S. auricularis, S. capitis, S. haemolyticus, S. hominis, S. saprophyticus, S. simulans, S. xylosis, M. luteus, B. subtilis, B. pumilus, E. faecalis, E. hirae, E. faecium, E. avium, P. aeruginosa e combinações destas. Em certas formas de realização, as composições farmacêuticas podem ser utilizadas para tratar estados ou perturbações associados a infecções bacterianas, incluindo mas não se limitando a endoftalmite pós-operatória, endocardite, infecções do sistema nervoso central, pneumonia, osteomielite, infecções associadas a feridas (por exemplo, úlceras diabéticas dos pés), mastite, septicemia, envenenamento alimentar e meningite e/ou outros estados associados a infecções bacterianas nosocomiais.
[0028] Em certas formas de realização, a invenção proporciona a utilização de um bacteriófago ou de um produto fágico isolado (por exemplo, um polipeptídio fágico isolado, ou respectivo fragmento, variante ou derivado ativo) como terapia com um único agente. Noutras formas de realização, a invenção proporciona a utilização de um bacteriófago ou produto fágico (por exemplo, um polipeptídio fágico isolado, ou respectivo fragmento, variante ou derivado ativo) em combinação com um tratamento padrão ou experimental para infecções causadas por bactérias. Essa terapia de combinação pode aumentar a eficácia do tratamento padrão ou experimental. Exemplos de agentes terapêuticos que são particularmente úteis em combinação com um polipeptídio da invenção são agentes anti-inflamatórios, agentes antibióticos quimioterapêuticos padrão (por exemplo, penicilina, penicilinas sintéticas, bacitracina, meticilina, cefalosporina, polimixina, cefaclor, Cefadroxil, nafato de cefamandole, cefazolina, cefixima, cefmetazole, cefonióide, cefoperazona, ceforanida, cefotanme, cefotaxima, cefotetano, cefoxitina, cefpodoxima proxetil, ceftazidima, ceftizoxima, ceftriaxona, cefriaxona moxalactama, cefuroxima, cefalexina, cefalosporina C, sal de sódio da cefalosporina C, cefalotina, sal de sódio da cefalotina, cefapirina, cefradina, cefuroxima axetil, cefalotina di-hidratada, moxalactama, loracarbefe mafato e agentes quelantes), agentes de anestesia local e/ou corticosteróides. Ainda noutra forma de realização, as composições da presente invenção podem ser combinadas com um ou mais bacteriófagos ou produtos fágicos conhecidos na área. As terapias de combinação abrangidas pela invenção podem ser formuladas numa única composição farmacêutica, ou podem ser administradas em composições separadas mas como parte de um regime de tratamento global.
[0029] As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas por qualquer método conhecido na área adequado para a administração de um composto antibacteriano (por exemplo, via oral ou parentérica (por exemplo, distribuição por inalação, intramuscular, intravenosa ou epidérmica)). Em formas de realização preferidas, as composições farmacêuticas da invenção são administradas topicamente, por exemplo, numa formulação tópica. As composições da invenção podem ser utilizadas topicamente para tratar e/ou prevenir infecções nosocomiais comuns, como infecções em sítios de incisão cirúrgica ou associadas a cateteres ou drenagens. Noutras formas de realização, as composições da invenção são utilizadas para tratar infecções bacterianas da pele ou camadas dérmicas superiores (por exemplo, infecções de úlceras diabéticas dos pés).
[0030] As composições farmacêuticas da presente invenção também podem ser utilizadas para aplicações tradicionalmente não terapêuticas, como agentes antibacterianos em cosméticos, ou em pulverizações ou soluções destinadas a utilização em superfícies sólidas para prevenir a colonização de bactérias (isto é, como desinfectantes).
[0031] A presente invenção também é dirigida a métodos de rastreio de peptídeos quanto a atividade antibacteriana. Numa forma de realização, o método compreende o rastreio de sequências de aminoácidos contíguos, de pelo menos 6, 10, 15, 20 ou 25 resíduos de comprimento, que são codificadas pelas fases de leitura aberta da sequência de ácido nucleico ID SEQ NO: 1, ID SEQ NO: 2, ID SEQ NO: 3, ID SEQ NO: 4, ID SEQ NO: 5, ID SEQ NO: 6, ID SEQ NO: 7 ou ID SEQ NO: 760, quanto a atividade antibacteriana, em que a referida atividade antibacteriana é medida pela capacidade dos peptídeos para inibirem o crescimento bacteriano em agar ou cultura líquida.
4.1 DEFINIÇÕES
[0032] Tal como é utilizado aqui, o termo “fragmento” refere-se a um peptídeo ou polipeptídio que compreende uma sequência de aminoácidos de pelo menos 5 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 10 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 15 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 20 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 25 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 40 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 50 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 60 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 70 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 80 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 90 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 100 resíduos de aminoácidos contíguos , pelo menos 125 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 150 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 175 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 200 resíduos de aminoácidos contíguos ou pelo menos 250 resíduos de aminoácidos contíguos da sequência de aminoácidos de uma proteína. Numa forma de realização específica, o fragmento é um fragmento funcional no sentido de que retém pelo menos uma função da proteína de onde é isolado (por exemplo, atividade antimicrobiana ou antibacteriana (por exemplo, morte de células por lise)).
[0033] Tal como são utilizados aqui, os termos “produtos bacteriofágicos ativos” e “produtos bacteriofágicos” referem-se a polipeptídios, ou respectivos fragmentos, variantes ou derivados, isolados de um bacteriófago da invenção, cujo polipeptídio, ou respectivo fragmento, variante ou derivado, exibe uma função ou atividade biológica associada ao bacteriófago de onde foi isolado ou derivado (por exemplo, atividade antimicrobiana ou antibacteriana (por exemplo, morte de células por lise)).
[0034] Tal como é utilizado aqui, o termo “isolado”, no contexto de um peptídeo, polipeptídio ou proteína de fusão, refere-se a um peptídeo, polipeptídio ou proteína de fusão que está substancialmente livre de material celular ou proteínas contaminadoras da fonte celular ou tecidual de onde é derivado, ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros químicos quando é sintetizado por via química. A expressão “substancialmente livre de material celular” inclui preparações de um peptídeo, polipeptídio ou proteína de fusão nas quais o peptídeo, polipeptídio ou proteína de fusão está separado de componentes celulares das células de onde é isolado ou produzido por via recombinante. Assim, um peptídeo, polipeptídio ou proteína de fusão que está substancialmente livre de material celular inclui preparações de um peptídeo, polipeptídio ou proteína de fusão com menos de cerca de 30%, 20%, 10% ou 5% (por peso seco) de proteínas heterólogas (também referidas aqui como “proteínas contaminadoras”). Quando o peptídeo, polipeptídio ou proteína de fusão é produzido por via recombinante, de preferência também está substancialmente livre de meio de cultura, isto é, o meio de cultura representa menos de cerca de 20%, 10% ou 5% do volume da preparação protéica. Quando o peptídeo, polipeptídio ou proteína de fusão é produzido por síntese química, de preferência está substancialmente livre de precursores químicos ou outros químicos, isto é, está separado de precursores químicos ou outros químicos que estão envolvidos na síntese do peptídeo, polipeptídio ou proteína de fusão. Em conformidade, essas preparações de um peptídeo, polipeptídio, proteína de fusão ou anticorpo têm menos de cerca de 30%, 20%, 10%, 5% (por peso seco) de precursores químicos ou compostos diferentes do peptídeo, polipeptídio ou proteína de fusão de interesse.
[0035] Tal como é utilizado aqui, o termo “isolado”, no contexto de moléculas de ácidos nucléicos, refere-se a uma molécula de ácido nucleico que está separada de outras moléculas de ácidos nucléicos que estão presentes na fonte natural da primeira molécula de ácido nucleico. Além disso, uma molécula de ácido nucleico “isolada”, como uma molécula de cDNA, está substancialmente livre de outro material celular ou meio de cultura quando produzida por técnicas recombinantes, ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros químicos quando sintetizada por via química, e pode estar livre de cDNA ou outras moléculas de DNA genómico, por exemplo, foi isolada de outros clones numa biblioteca de ácidos nucléicos.
[0036] O termo “purificado” significa que a concentração do peptídeo, polipeptídio, proteína de fusão ou molécula de ácido nucleico foi aumentada de forma mensurável por qualquer processo de purificação, incluindo mas não se limitando a cromatografia em coluna, HPLC, precipitação, eletroforese, etc., desse modo procedendo à remoção parcial, substancial ou completa de impurezas, como precursores, ou outros químicos envolvidos na preparação do peptídeo, polipeptídio, proteína de fusão ou molécula de ácido nucleico. O profissional considerará a quantidade necessária de purificação para uma dada aplicação. Por exemplo, proteínas isoladas destinadas a utilização em composições terapêuticas para administração a humanos têm habitualmente de exibir um grau elevado de pureza, de acordo com padrões regulamentadores e bons processos de fabrico.
[0037] Tal como é utilizado aqui, o termo “derivado”, no contexto de polipeptídios, refere-se a um polipeptídio que compreende uma sequência de aminoácidos que foi alterada por introdução de substituições, deleções ou adições de resíduos de aminoácidos. O termo “derivado”, tal como utilizado aqui, também se refere a um polipeptídio que foi modificado, isto é, pelo acoplamento covalente de qualquer tipo de molécula ao polipeptídio. Por exemplo, mas sem limitação, um polipeptídio pode ser modificado, por exemplo, por glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos protetores/bloqueadores conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligando celular ou outra proteína, etc. Um polipeptídio derivado pode ser produzido por modificações químicas utilizando técnicas conhecidas dos profissionais, incluindo mas não se limitando a clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, etc. Além disso, um polipeptídio derivado pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos. Um derivado polipeptídico possui uma função semelhante ou idêntica à do polipeptídio de onde foi derivado. O termo “derivado”, utilizado relativamente a um polipeptídio “derivado” de um organismo, também pode referir-se ao isolamento de um polipeptídio diretamente desse organismo (por exemplo, células bacterianas ou fagos).
[0038] Tal como é utilizado aqui, o termo “célula- hospedeiro” refere-se à célula particular em questão transfectada com uma molécula de ácido nucleico e à progenitura ou progenitura potencial dessa célula que contém a molécula de ácido nucleico, ou sua versão integrada por via cromossômica. A progenitura dessa célula pode não ser idêntica à célula paterna transfectada com a molécula de ácido nucleico, devido a mutações ou influências ambientais que podem ocorrer em gerações sucessivas ou integração da molécula de ácido nucleico no genoma da célula-hospedeiro. Para a expressão de proteínas e polipeptídios bacteriofágicos, preferivelmente a célula-hospedeiro não é da mesma espécie ou estirpe de onde o bacteriófago foi isolado ou cultivado.
[0039] Tal como é utilizado aqui, o termo “em combinação” refere-se à utilização de mais do que um agente profiláctico e/ou terapêutico. A utilização do termo “em combinação” não restringe a ordem pela qual os agentes profilácticos e/ou terapêuticos são administrados a um sujeito com uma doença ou perturbação. Um primeiro agente profiláctico ou terapêutico pode ser administrado antes (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas antes), de modo concomitante ou subsequente (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas após) à administração de um segundo agente profiláctico ou terapêutico (diferente do primeiro agente profiláctico ou terapêutico) a um sujeito com uma doença ou perturbação.
[0040] Tal como são utilizados aqui, os termos “ácidos nucléicos” e “sequências de nucleotídeos” incluem moléculas de DNA de filamentação simples e filamentação dupla e/ou de RNA, ou suas combinações. Tal como é utilizado aqui, o termo “codificado pelo ácido nucleico” refere-se a uma sequência de aminoácidos resultante da tradução da sequência direta, reversa, complementar ou reversa-complementar da sequência de ácido nucleico referenciada utilizando o código genético comum (isto é, tripletos de códons comuns) como é bem conhecido na área.
[0041] Tal como são utilizados aqui, os termos “agente profiláctico” e “agentes profilácticos” referem-se a bacteriófagos e/ou polipeptídios da invenção que podem ser utilizados na prevenção, tratamento, gestão ou melhoria de um ou mais sintomas associados a infecção causada por uma bactéria.
[0042] Tal como são utilizados aqui, os termos “agente terapêutico” e “agentes terapêuticos” referem-se a bacteriófagos e/ou polipeptídios da invenção que podem ser utilizados na prevenção, tratamento, gestão ou melhoria de um ou mais sintomas de uma doença ou perturbação, em particular uma doença ou perturbação associada a uma infecção bacteriana.
[0043] Tal como é utilizado aqui, o termo “quantidade terapeuticamente eficaz” refere-se àquela quantidade de um agente terapêutico suficiente para originar melhoria de um ou mais sintomas de uma doença ou perturbação, em particular uma doença ou perturbação associada a uma infecção bacteriana.
[0044] Tal como são utilizados aqui, os termos “tratar” e “tratamento” referem-se à melhoria de um ou mais sintomas associados a uma infecção bacteriana resultante da administração de um ou mais bacteriófagos e/ou polipeptídios da invenção. Como notado acima, “tratamento” e termos relacionados referem-se ao tratamento terapêutico e medidas profilácticas ou preventivas, em que o objetivo é eliminar, atenuar, diminuir a gravidade, abrandar a progressão ou retardar ou prevenir os sintomas ou causa subjacente (por exemplo, infecção bacteriana) associados ao estado ou perturbação patológica.
[0045] Tal como são utilizados aqui, os termos “atividade antibacteriana” e “atividade antimicrobiana”, relativamente a um bacteriófago, proteína bacteriofágica isolada (ou respectiva variante, derivado ou fragmento) ou produto bacteriofágico, são utilizados de forma intermutável para referir a capacidade para matar e/ou inibir o crescimento ou reprodução de um microrganismo, em particular as bactérias da espécie ou estirpe infectada pelo bacteriófago. Em certas formas de realização, a atividade antibacteriana ou antimicrobiana é avaliada por cultura de bactérias (por exemplo, bactérias Gram-positivas (por exemplo, E. faecalis, E. faecium, S. aureus), bactérias Gram- negativas (por exemplo, A. baumannii, P. aeruginosa) ou bactérias não classificadas como sendo Gram-positivas ou Gram-negativas) de acordo com técnicas comuns (por exemplo, em cultura líquida ou em placas de agar), contacto da cultura com um bacteriófago ou polipeptídio da invenção e monitorização do crescimento celular após esse contacto. Por exemplo, numa cultura líquida, as bactérias podem crescer até uma densidade óptica (“OD”) representativa de um ponto médio no crescimento exponencial da cultura; a cultura é exposta a uma ou mais concentrações de um ou mais bacteriófagos ou polipeptídios da invenção, e a OD é monitorizada relativamente a uma cultura de controlo. Uma OD decrescida relativamente a uma cultura de controlo é representativa de um bacteriófago ou polipeptídio que exibe atividade antibacteriana (por exemplo, exibe atividade de morte por lise). De modo semelhante, pode permitir-se a formação de colônias de bactérias numa placa de agar, a placa é exposta a um bacteriófago ou polipeptídio da invenção e o crescimento subsequente das colônias é avaliado relativamente a placas de controlo. Uma dimensão decrescida das colônias ou números totais decrescidos de colônias indicam um bacteriófago ou polipeptídio com atividade antibacteriana.
[0046] Tal como é utilizado aqui, um “domínio CHAP” refere-se a um domínio de amidase conservado presente em várias hidrolases de peptidoglicanos codificadas por fagos e designa “amido-hidrolases/peptidases dependentes de cisteína, histidina”. Ver, por exemplo, Rigden D, et al., Trends Biochem. Sci. Maio de 2003 2 8(5): 230-4. Encontra-se numa superfamília de amidases, incluindo GSP amidase e hidrolases de peptidoglicanos. A família inclui pelo menos dois tipos diferentes de atividades de clivagem de peptidoglicanos: atividade de L-muramoíl-L-alanina amidase e D-alanil-glicil endopeptidase. Os domínios CHAP contêm geralmente resíduos cisteína e histidina conservados e hidrolisam substratos que contêm Y-glutamilo. Crê-se que estes resíduos cisteína são essenciais para a atividade de várias destas amidases, e os seus grupos tiol parecem atuar como nucleófilos nos mecanismos catalíticos de todas as enzimas que contêm este domínio. Os domínios CHAP estão muitas vezes associados a outros domínios que procedem à clivagem de peptidoglicanos, por exemplo, cooperam na clivagem de substratos especializados. Ver também Bateman A, et al., Trends Biochem. Sci. Maio de 2003 2 8 (5): 234-7.
5. DESCRIÇÃO BREVE DAS FIGURAS
[0047] FIG. 1: Representação esquemática da organização do genoma de F168/08, compreendendo a sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 1. As fases de leitura aberta (“ORFs”) previstas no genoma estão representadas por setas e numeradas a preto. A direção de uma seta indica a direção da transcrição. Código de cores: Preto — ORFs para cujos produtos foi possível fazer uma atribuição funcional com base nas funções conhecidas de proteínas homólogas (as ORFs que codificam produtos que exibem homologia com as mesmas proteínas ou proteínas semelhantes estão indicadas usando o mesmo número e diferenciadas por minúsculas); Cinzento - ORFs que codificam para produtos que são semelhantes a proteínas de função desconhecida; Branco ou Vazio - ORFs que codificam para proteínas que não partilham homologia significativa com proteínas em bases de dados disponíveis. As ORFs atribuídas funcionalmente também estão listadas na figura. As informações da figura também estão incluídas em forma de tabela na FIG. 2.
[0048] FIGS. 2A-X: Características do genoma do bacteriófago F168/08, incluindo produtos genéticos e atribuição de funções putativas. A figura inclui uma listagem das ORFs do genoma e indica para cada ORF (i) a sua posição no genoma, (ii) a sequência de aminoácidos codificada, (iii) uma listagem de proteínas homólogas e domínios conservados no seu polipeptídio codificado e (iv) uma atribuição da função putativa. As ORFs 1-116 listadas na FIG. 2 codificam as sequências de aminoácidos das ID SEQ NOs: 8-130, respectivamente.
[0049] FIGS. 3A-B: A gama de hospedeiros de F168/08 determinada pelo teste de manchas em 105 estirpes de Enterococcus faecalis (EFS) (3A) e 56 estirpes de Enterococcus faecium (EFM) (3B) isoladas de amostras clínicas. Cada mancha continha 5 μL de suspensão do bacteriófago com os títulos indicados (preparada do lisato purificado com CsCl). Avaliou-se a sensibilidade de cada estirpe ao fago com base numa escala relativa que variou desde halos de lise turvos (+) até límpidos (++++). A resistência a infecção pelo fago está indicada como (-).
[0050] FIG. 4: Representação esquemática da organização do genoma de F170/08, compreendendo a sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 2. As ORFs previstas no genoma estão representadas por setas e numeradas a preto. A direção de uma seta indica a direção da transcrição. Código de cores: Preto - ORFs para cujos produtos foi possível fazer uma atribuição funcional com base nas funções conhecidas de proteínas homólogas (as ORFs que codificam produtos que exibem homologia com as mesmas proteínas ou proteínas semelhantes estão indicadas usando o mesmo número e diferenciadas por minúsculas); Cinzento - ORFs que codificam para produtos que são semelhantes a proteínas de função desconhecida; Branco ou Vazio - ORFs que codificam para proteínas que não partilham homologia significativa com proteínas em bases de dados disponíveis. As ORFs atribuídas funcionalmente também estão listadas na figura. As informações da figura também estão incluídas em forma de tabela na FIG. 5.
[0051] FIGS. 5A-AR: Características do genoma do bacteriófago F170/08, incluindo produtos genéticos e atribuição de funções putativas. A figura inclui uma listagem das ORFs do genoma e indica para cada ORF (i) a sua posição no genoma, (ii) a sequência de aminoácidos codificada, (iii) uma listagem de proteínas homólogas e domínios conservados no seu polipeptídio codificado e (iv) uma atribuição da função putativa. As ORFs 1-213 listadas na FIG. 5 codificam as sequências de aminoácidos das ID SEQ NOs: 131-343, respectivamente.
[0052] FIGS. 6A-B: A gama de hospedeiros de F170/08 determinada pelo teste de manchas em 105 estirpes de Enterococcus faecalis (EFS) (6A) e 56 estirpes de Enterococcus faecium (EFM) (6B) isoladas de amostras clínicas. Cada mancha continha 5 μL de suspensão do bacteriófago com os títulos indicados (preparada do lisato purificado com CsCl). Avaliou-se a sensibilidade de cada estirpe ao fago com base numa escala relativa que variou desde halos de lise turvos (+) até límpidos (++++). A resistência a infecção pelo fago está indicada como (-).
[0053] FIG. 7: Representação esquemática da organização do genoma de F770/05, compreendendo a sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 3. As ORFs previstas no genoma estão representadas por setas e numeradas a preto. A direção de uma seta indica a direção da transcrição. Código de cores: Preto - ORFs para cujos produtos foi possível fazer uma atribuição funcional com base nas funções conhecidas de proteínas homólogas (as ORFs que codificam produtos que exibem homologia com as mesmas proteínas ou proteínas semelhantes estão indicadas usando o mesmo número e diferenciadas por minúsculas); Cinzento - ORFs que codificam para produtos que são semelhantes a proteínas de função desconhecida; Branco ou Vazio - ORFs que codificam para proteínas que não partilham homologia significativa com proteínas em bases de dados disponíveis. As ORFs atribuídas funcionalmente também estão listadas na figura. As informações da figura também estão incluídas em forma de tabela na FIG. 8.
[0054] FIGS. 8A-AC: Características do genoma do bacteriófago F770/05, incluindo produtos genéticos e atribuição de funções putativas. A figura inclui uma listagem das ORFs do genoma e indica para cada ORF (i) a sua posição no genoma, (ii) a sequência de aminoácidos codificada, (iii) uma listagem de proteínas homólogas e domínios conservados no seu polipeptídio codificado e (iv) uma atribuição da função putativa. As ORFs 1-95 listadas na FIG. 8 codificam as sequências de aminoácidos das ID SEQ NOs: 344-438, respectivamente.
[0055] FIG. 9: A gama de hospedeiros de F770/05 determinada pelo teste de manchas em 100 estirpes de Pseudomonas aeruginosa (PSA) isoladas de amostras clínicas. Cada mancha continha 5 μL de suspensão do bacteriófago com os títulos indicados (preparada do lisato purificado com CsCl). Avaliou-se a sensibilidade de cada estirpe ao fago com base numa escala relativa que variou desde halos de lise turvos (+) até límpidos (++++). A resistência a infecção pelo fago está indicada como (-).
[0056] FIG. 10: Representação esquemática da organização do genoma de F197/08, compreendendo a sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 4. As ORFs previstas no genoma estão representadas por setas e numeradas a preto. A direção de uma seta indica a direção da transcrição. Código de cores: Preto - ORFs para cujos produtos foi possível fazer uma atribuição funcional com base nas funções conhecidas de proteínas homólogas (as ORFs que codificam produtos que exibem homologia com as mesmas proteínas ou proteínas semelhantes estão indicadas usando o mesmo número e diferenciadas por minúsculas); Cinzento - ORFs que codificam para produtos que são semelhantes a proteínas de função desconhecida; Branco ou Vazio - ORFs que codificam para proteínas que não partilham homologia significativa com proteínas em bases de dados disponíveis. As ORFs atribuídas funcionalmente também estão listadas na figura. As informações da figura também estão incluídas em forma de tabela na FIG. 11.
[0057] FIGS. 11A-AA: Características do genoma do bacteriófago F197/08, incluindo produtos genéticos e atribuição de funções putativas. A figura inclui uma listagem das ORFs do genoma e indica para cada ORF (i) a sua posição no genoma, (ii) a sequência de aminoácidos codificada, (iii) uma listagem de proteínas homólogas e domínios conservados no seu polipeptídio codificado e (iv) uma atribuição da função putativa. As ORFs 1-66 listadas na FIG. 11 codificam as sequências de aminoácidos das ID SEQ NOs: 439-553, respectivamente.
[0058] FIG. 12: A gama de hospedeiros de F197/08 determinada pelo teste de manchas em 100 estirpes de Staphylococcus aureus (STA) isoladas de amostras clínicas. Cada mancha continha 5 μL de suspensão do bacteriófago com os títulos indicados (preparada do lisato purificado com CsCl). Avaliou-se a sensibilidade de cada estirpe ao fago com base numa escala relativa que variou desde halos de lise turvos (+) até límpidos (++++). A resistência a infecção pelo fago está indicada como (-).
[0059] FIG. 13: Representação esquemática da organização do genoma de F86/06, compreendendo a sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 5. As ORFs previstas no genoma estão representadas por setas e numeradas a preto. A direção de uma seta indica a direção da transcrição. Código de cores: Preto - ORFs para cujos produtos foi possível fazer uma atribuição funcional com base nas funções conhecidas de proteínas homólogas (as ORFs que codificam produtos que exibem homologia com as mesmas proteínas ou proteínas semelhantes estão indicadas usando o mesmo número e diferenciadas por minúsculas); Cinzento - ORFs que codificam para produtos que são semelhantes a proteínas de função desconhecida; Branco ou Vazio - ORFs que codificam para proteínas que não partilham homologia significativa com proteínas em bases de dados disponíveis. As ORFs atribuídas funcionalmente também estão listadas na figura. As informações da figura também estão incluídas em forma de tabela na FIG. 14.
[0060] FIGS. 14A-S: Características do genoma do bacteriófago F86/06, incluindo produtos genéticos e atribuição de funções putativas. A figura inclui uma listagem das ORFs do genoma e indica para cada ORF (i) a sua posição no genoma, (ii) a sequência de aminoácidos codificada, (iii) uma listagem de proteínas homólogas e domínios conservados no seu polipeptídio codificado e (iv) uma atribuição da função putativa. As ORFs 1-63 listadas na FIG. 14 codificam as sequências de aminoácidos das ID SEQ NOs: 554-616, respectivamente.
[0061] FIG. 15: A gama de hospedeiros de F86/06 determinada pelo teste de manchas em 100 estirpes de Staphylococcus aureus (STA) isoladas de amostras clínicas. Cada mancha continha 5 μL de suspensão do bacteriófago com os títulos indicados (preparada do lisato purificado com CsCl). Avaliou-se a sensibilidade de cada estirpe ao fago com base numa escala relativa que variou desde halos de lise turvos (+) até límpidos (++++). A resistência a infecção pelo fago está indicada como (-).
[0062] FIG. 16: Representação esquemática da organização do genoma de F87s/06, compreendendo a sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 6. As ORFs previstas no genoma estão representadas por setas e numeradas a preto. A direção de uma seta indica a direção da transcrição. Código de cores: Preto - ORFs para cujos produtos foi possível fazer uma atribuição funcional com base nas funções conhecidas de proteínas homólogas (as ORFs que codificam produtos que exibem homologia com as mesmas proteínas ou proteínas semelhantes estão indicadas usando o mesmo número e diferenciadas por minúsculas); Cinzento - ORFs que codificam para produtos que são semelhantes a proteínas de função desconhecida; Branco ou Vazio - ORFs que codificam para proteínas que não partilham homologia significativa com proteínas em bases de dados disponíveis. As ORFs atribuídas funcionalmente também estão listadas na figura. As informações da figura também estão incluídas em forma de tabela na FIG. 17.
[0063] FIGS. 17A-U: Características do genoma do bacteriófago F87s/06, incluindo produtos genéticos e atribuição de funções putativas. A figura inclui uma listagem das ORFs do genoma e indica para cada ORF (i) a sua posição no genoma, (ii) a sequência de aminoácidos codificada, (iii) uma listagem de proteínas homólogas e domínios conservados no seu polipeptídio codificado e (iv) uma atribuição da função putativa. As ORFs 1-61 listadas na FIG. 17 codificam as sequências de aminoácidos das ID SEQ NOs: 617-681, respectivamente.
[0064] FIG. 18: A gama de hospedeiros de F87s/06 determinada pelo teste de manchas em 100 estirpes de Staphylococcus aureus (STA) isoladas de amostras clínicas. Cada mancha continha 5 μL de suspensão do bacteriófago com os títulos indicados (preparada do lisato purificado com CsCl). Avaliou-se a sensibilidade de cada estirpe ao fago com base numa escala relativa que variou desde halos de lise turvos (+) até límpidos (++++). A resistência a infecção pelo fago está indicada como (-).
[0065] FIG. 19: Representação esquemática da organização do genoma de F91a/06, compreendendo a sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 7. As ORFs previstas no genoma estão representadas por setas e numeradas a preto. A direção de uma seta indica a direção da transcrição. Código de cores: Preto - ORFs para cujos produtos foi possível fazer uma atribuição funcional com base nas funções conhecidas de proteínas homólogas (as ORFs que codificam produtos que exibem homologia com as mesmas proteínas ou proteínas semelhantes estão indicadas usando o mesmo número e diferenciadas por minúsculas); Cinzento - ORFs que codificam para produtos que são semelhantes a proteínas de função desconhecida; Branco ou Vazio - ORFs que codificam para proteínas que não partilham homologia significativa com proteínas em bases de dados disponíveis. As ORFs atribuídas funcionalmente também estão listadas na figura. As informações da figura também estão incluídas em forma de tabela na FIG. 20.
[0066] FIGS. 20A-U: Características do genoma do bacteriófago F91a/06, incluindo produtos genéticos e atribuição de funções putativas. A figura inclui uma listagem das ORFs do genoma e indica para cada ORF (i) a sua posição no genoma, (ii) a sequência de aminoácidos codificada, (iii) uma listagem de proteínas homólogas e domínios conservados no seu polipeptídio codificado e (iv) uma atribuição da função putativa. As ORFs 1-64 listadas na FIG. 20 codificam as sequências de aminoácidos das ID SEQ NOs: 682-754, respectivamente.
[0067] FIG. 21: A gama de hospedeiros de F91a/06 determinada pelo teste de manchas em 100 estirpes de Staphylococcus aureus (STA) isoladas de amostras clínicas. Cada mancha continha 5 μL de suspensão do bacteriófago com os títulos indicados (preparada do lisato purificado com CsCl). Avaliou-se a sensibilidade de cada estirpe ao fago com base numa escala relativa que variou desde halos de lise turvos (+) até límpidos (++++). A resistência a infecção pelo fago está indicada como (-).
[0068] FIG. 22: Organização esquemática do genoma de F1245/05, compreendendo a sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 760. As ORFs previstas no genoma de 43 kb estão representadas por setas e numeradas a preto. Para as ORFs atribuídas funcionalmente, o número está substituído pela função prevista. A direção de uma seta indica a direção da transcrição. Código de cores: Preto - ORFs para cujos produtos foi possível fazer uma atribuição funcional com base em proteínas homólogas; Cinzento - ORFs que codificam para produtos que são semelhantes a proteínas de função desconhecida; Listrado - ORFs com uma função atribuída com base na sua posição relativa no genoma e na presença de domínios transmembranares putativos no produto codificado; Setas brancas - ORFs que codificam para proteínas que não partilham homologia significativa com proteínas em bases de dados.
[0069] FIGS. 23A-I: Características do genoma do bacteriófago F1245/05, incluindo produtos genéticos e atribuição de funções putativas.
[0070] FIG. 24A-E: A gama de hospedeiros de F1245/05 determinada pelo teste de manchas em 100 estirpes de Acinetobacter baumannii isoladas de amostras clínicas. Cada mancha continha 5 μL de suspensões do bacteriófago com os títulos indicados (preparada do lisato purificado com CsCl). A sensibilidade ao fago está apresentada numa escala que varia desde halos de lise turvos (+) até límpidos (++++). A resistência a infecção pelo fago está indicada como (-).
6. DESCRIÇÃO PORMENORIZADA
[0071] A presente invenção é dirigida a bacteriófagos isolados e seus produtos polipeptídicos isolados com atividade antibacteriana contra uma ou mais espécies ou estirpes dos patogenes nosocomiais A. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa e S. aureus. Numa forma de realização, são proporcionados bacteriófagos ou polipeptídios isolados que exibem atividade antimicrobiana e/ou antibacteriana contra estirpes resistentes a meticilina de S. aureus (MRSA). Adicionalmente, os bacteriófagos e polipeptídios da invenção podem exibir atividade antibacteriana ou antimicrobiana contra uma ou mais espécies ou estirpes de bactérias patogênicas, incluindo mas não se limitando a S. epidermidis, S. auricularis, S. capitis, S. haemolyticus, S. hominis, S. saprophyticus, S. simulans, S. xylosis, Micrococcus luteus, Bacilus subtilis, B. pumilus, E. hirae e E. avium.
[0072] Numa forma de realização, a invenção proporciona um bacteriófago com um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 1. Um exemplo específico de acordo com esta forma de realização é o bacteriófago isolado F168/08, que aborda seletivamente algumas estirpes de E. faecalis e E. faecium. Fases de leitura aberta (ORFs) no genoma do F168/08, as sequências de aminoácidos codificadas pelas ORFs e a atribuição de funções putativas das sequências de aminoácidos codificadas (isto é, proteínas e/ou polipeptídios codificados) são apresentados na FIG. 2 (que também apresenta as sequências de aminoácidos ID SEQ NOS: 8-130).
[0073] Os Enterococcisão bactérias esféricas gram- positivas que formam colônias em grupos ou cadeias. Fazem parte da flora do trato digestivo em muitos mamíferos, incluindo humanos. As infecções por Enterococcussão responsáveis por 12% de todas as infecções nosocomiais. Uma infecção por Enterococcus pode causar infecções abdominais complicadas, infecções na pele e estrutura da pele, infecções do trato urinário e infecções da corrente sanguínea, que podem ser difíceis de tratar, particularmente em casos em que a estirpe envolvida desenvolveu resistência a vários antibióticos. Nesses casos, a infecção pode ser letal, especialmente quando o paciente já tem imunodeficiências.
[0074] Enterococcus faecalisé responsável pela maioria das infecções por Enterococci e é uma bactéria parasita Gram-positiva que habita nos tratos gastrointestinais de humanos e outros mamíferos. Não tem motilidade e é facultativamente anaeróbica. E. faecalis pode causar endocardite, bem como infecções na bexiga, próstata e epididimais, incluindo infecções letais em humanos, especialmente no ambiente nosocomial. E. faecalisé resistente a muitos agentes antimicrobianos habitualmente utilizados (tais como, por exemplo, aminoglicosídeos, aztreonam, cefalosporinas, clindamicina, as penicilinas semi-sintéticas nafcilina e oxacilina, trimetoprim sulfametoxazol, e afins).
[0075] É conhecido que Enterococcus faecium tem resistência a vários tipos de antibióticos, incluindo quinolonas e aminoglicosídeos. Também são conhecidas estirpes de E. faecium resistentes à vancomicina. A resistência a vários antibióticos e tolerância para estados adversos tornam E. faecium numa grande preocupação para a comunidade médica, que apelidou este micróbio de “supergerme”. Noutra forma de realização, a invenção proporciona um bacteriófago com um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 2. Um exemplo específico de acordo com esta forma de realização é o bacteriófago isolado F170/08, que aborda seletivamente algumas estirpes de E. faecalis e E. faecium. Fases de leitura aberta (ORFs) no genoma do F178/08, as sequências de aminoácidos codificadas pelas ORFs e a atribuição de funções putativas das sequências de aminoácidos codificadas (isto é, proteínas e/ou polipeptídios codificados) são apresentados na FIG. 5 (que também apresenta as sequências de aminoácidos ID SEQ NOS: 131-343).
[0076] Ainda noutra forma de realização, a invenção proporciona um bacteriófago com um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 3. Um exemplo específico de acordo com esta forma de realização é o bacteriófago isolado F770/05, que aborda seletivamente algumas estirpes de P. aeruginosa. Fases de leitura aberta (ORFs) no genoma do F770/05, as sequências de aminoácidos codificadas pelas ORFs e a atribuição de funções putativas das sequências de aminoácidos codificadas (isto é, proteínas e/ou polipeptídios codificados) são apresentados na FIG. 8 (que também apresenta as sequências de aminoácidos ID SEQ NOS: 344-438).
[0077] Pseudomonas aeruginosaé uma bactéria comum com forma de bastonete Gram-negativa presente no solo, água, flora da pele e na maior parte dos ambientes construídos pelo homem. Sobrevive não só em atmosferas normais mas também com pouco oxigênio na forma de um anaeróbio facultativo, e pode infectar tecidos danificados ou indivíduos imunocomprometidos. Quando essas colonizações ocorrem em órgãos críticos do corpo, como os pulmões, o trato urinário e rins, os resultados podem ser fatais. Uma vez que sobrevive em superfícies, esta bactéria também se encontra sobre e no interior de equipamento médico, incluindo cateteres, originando infecções cruzadas em hospitais e clínicas. P. aeruginosaé um dos patogenes nosocomiais oportunistas mais relevantes, tendo sido estimado que uma em dez infecções contraídas em hospitais é causada por Pseudomonas. P. aeruginosatambém é a causa mais comum de infecções causadas por lesões de queimaduras e o colonizador mais frequente de dispositivos médicos, como cateteres.
[0078] Ainda noutra forma de realização, a invenção proporciona um bacteriófago com um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 4. Um exemplo específico de acordo com esta forma de realização é o bacteriófago isolado F197/08, que aborda seletivamente algumas estirpes de S. aureus. Fases de leitura aberta (ORFs) no genoma do F197/08, as sequências de aminoácidos codificadas pelas ORFs e a atribuição de funções putativas das sequências de aminoácidos codificadas (isto é, proteínas e/ou polipeptídios codificados) são apresentados na FIG. 11 (que também apresenta as sequências de aminoácidos ID SEQ NOS: 439-553).
[0079] Ainda noutra forma de realização, a invenção proporciona um bacteriófago com um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 5. Um exemplo específico de acordo com esta forma de realização é o bacteriófago isolado F86/06, que aborda seletivamente algumas estirpes de S. aureus. Fases de leitura aberta (ORFs) no genoma do F86/06, as sequências de aminoácidos codificadas pelas ORFs e a atribuição de funções putativas das sequências de aminoácidos codificadas (isto é, proteínas e/ou polipeptídios codificados) são apresentados na FIG. 14 (que também apresenta as sequências de aminoácidos ID SEQ NOS: 554-616).
[0080] Ainda noutra forma de realização, a invenção proporciona um bacteriófago com um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 6. Um exemplo específico de acordo com esta forma de realização é o bacteriófago isolado F87s/06, que aborda seletivamente algumas estirpes de S. aureus. Fases de leitura aberta (ORFs) no genoma do F87s/06, as sequências de aminoácidos codificadas pelas ORFs e a atribuição de funções putativas das sequências de aminoácidos codificadas (isto é, proteínas e/ou polipeptídios codificados) são apresentados na FIG. 17 (que também apresenta as sequências de aminoácidos ID SEQ NOS: 617-681).
[0081] Ainda noutra forma de realização, a invenção proporciona um bacteriófago com um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 7. Um exemplo específico de acordo com esta forma de realização é o bacteriófago isolado F91a/06, que aborda seletivamente algumas estirpes de S. aureus. Fases de leitura aberta (ORFs) no genoma do F91a/06, as sequências de aminoácidos codificadas pelas ORFs e a atribuição de funções putativas das sequências de aminoácidos codificadas (isto é, proteínas e/ou polipeptídios codificados) são apresentados na FIG. 20 (que também apresenta as sequências de aminoácidos ID SEQ NOS: 682-754).
[0082] S. aureusé uma bactéria Gram-positiva esférica, facultativamente anaeróbica, que muitas vezes faz parte da flora da pele presente no nariz e em pele. S. aureus pode causar uma gama de doenças, desde pequenas infecções na pele, como borbulhas, até gastroenterite, até doenças letais, como pneumonia, meningite, osteomielite, endocardite, síndrome do choque tóxico (TSS), bacteremia e sepsia. É uma das cinco causas mais comuns de infecções nosocomiais e muitas vezes é causadora de infecções de feridas pós-cirúrgicas. Hoje em dia, S. aureus tornou-se resistente a muitos antibióticos habitualmente utilizados, tendo sido estimado que apenas 2% de todos os isolados de S. aureussão sensíveis à penicilina. As penicilinas de segunda geração, como meticilina, oxacilina, cloxacilina e flucloxacilina, foram desenvolvidas para tratar S. aureus resistente à penicilina. A meticilina foi o primeiro antibiótico desta classe a ser utilizado, mas apenas dois anos mais tarde foi relatado o primeiro caso de S. aureus resistente à meticilina (MRSA). Desde a década de 1990 tem havido uma explosão na predominância de MRSA em hospitais, onde é agora considerada endêmica.
[0083] Ainda noutra forma de realização, a invenção proporciona um bacteriófago com um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 760. Um exemplo específico de acordo com esta forma de realização é o bacteriófago isolado F1245/05, que aborda seletivamente algumas estirpes de A. baumannii. Fases de leitura aberta (ORFs) no genoma do F1245/05, as sequências de aminoácidos codificadas pelas ORFs e a atribuição de funções putativas das sequências de aminoácidos codificadas (isto é, proteínas e/ou polipeptídios codificados) são apresentados na FIG. 23 (que também apresenta as sequências de aminoácidos ID SEQ NOS: 761-816).
[0084] Acinetobacter baumanniié uma espécie de bactéria que causa algumas infecções clínicas graves, particularmente em indivíduos com sistemas imunológicos comprometidos. Acinetobacter baumanniié um bacilo Gram- negativo aeróbico pleiomórfico que é habitualmente isolado do ambiente hospitalar e de pacientes hospitalizados. A bactéria entra muitas vezes em feridas abertas do corpo, cateteres ou tubos respiratórios. Acinetobacter baumannii coloniza habitualmente ambientes aquáticos e é muitas vezes cultivada a partir da expectoração ou secreções respiratórias, feridas e urina de pacientes hospitalizados. No cenário hospitalar, Acinetobacter baumannii coloniza habitualmente soluções de irrigação e soluções intravenosas. Também é conhecido que é resistente a múltiplos antibióticos, e o número de infecções nosocomiais causadas por A. baumannii tem aumentado em anos recentes.
[0085] Em certas formas de realização, o bacteriófago da invenção compreende ou consiste num genoma que tem uma identidade de sequências de 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou pelo menos 99% com a sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 1, ID SEQ NO: 2, ID SEQ NO: 3, ID SEQ NO: 4, ID SEQ NO: 5, ID SEQ NO: 6, ID SEQ NO: 7 ou ID SEQ NO: 760, cujo bacteriófago exibe pelo menos uma atividade biológica, por exemplo, antimicrobiana ou antibacteriana (por exemplo, atividade de morte por lise), de um ou mais dos bacteriófagos F168/08, F170/08, F770/05, F197/08, F86/06, F87s/06, F91a/06 e F1245/05. Alternativamente ou adicionalmente, o bacteriófago da invenção pode ter um genoma que compreende um fragmento funcional da sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 1, ID SEQ NO: 2, ID SEQ NO: 3, ID SEQ NO: 4, ID SEQ NO: 5, ID SEQ NO: 6, ID SEQ NO: 7 ou ID SEQ NO: 760, incluindo as sequências de qualquer uma das fases de leitura aberta descritas nas FIGS. 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20 e 23.
[0086] A invenção também proporciona bactérias isoladas infectadas com um ou mais dos bacteriófagos da invenção. Em certas formas de realização, a invenção proporciona E. faecalis ou E. faecium isolada infectada com um bacteriófago que tem um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 1 e/ou ID SEQ NO: 2. Noutras formas de realização, a invenção proporciona P. aeruginosa isolada infectada com um bacteriófago que tem um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 3. Ainda noutras formas de realização, a invenção proporciona S. aureus isolada infectada com um bacteriófago que tem um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 4, ID SEQ NO: 5, ID SEQ NO: 6 e/ou ID SEQ NO: 7. Ainda noutras formas de realização, a invenção proporciona A. baumannii isolada infectada com um bacteriófago que tem um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 760.
[0087] A invenção proporciona métodos de produção e isolamento de um bacteriófago que tem um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 1, ID SEQ NO: 2, ID SEQ NO: 3, ID SEQ NO: 4, ID SEQ NO: 5, ID SEQ NO: 6, ID SEQ NO: 7 ou ID SEQ NO: 760. Em certas formas de realização, a invenção proporciona um método de produção e/ou isolamento de um bacteriófago que tem um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 1 ou ID SEQ NO: 2, que compreende (i) obter uma cultura de E. faecalis ou E. faecium, (ii) infectá- la com o bacteriófago que tem um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 1 ou ID SEQ NO: 2, (iii) cultivá-la até se observar lise significativa da cultura e (iv) isolar o bacteriófago da cultura. Noutras formas de realização, a invenção proporciona um método de produção e/ou isolamento de um bacteriófago que tem um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 3, que compreende (i) obter uma cultura de P. aeruginosa, (ii) infectá-la com o bacteriófago que tem um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 3, (iii) cultivá-la até se observar lise significativa da cultura e (iv) isolar o bacteriófago da cultura. Ainda noutras formas de realização, a invenção proporciona um método de produção e/ou isolamento de um bacteriófago que tem um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 4, ID SEQ NO: 5, ID SEQ NO: 6 ou ID SEQ NO: 7, que compreende (i) obter uma cultura de S. aureus, (ii) infectá- la com o bacteriófago que tem um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 4, ID SEQ NO: 5, ID SEQ NO: 6 ou ID SEQ NO: 7, (iii) cultivá-la até se observar lise significativa da cultura e (iv) isolar o bacteriófago da cultura. Ainda noutras formas de realização, a invenção proporciona um método de produção e/ou isolamento de um bacteriófago que tem um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 760, que compreende (i) obter uma cultura de A. baumannii, (ii) infectá-la com o bacteriófago que tem um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 760, (iii) cultivá-la até se observar lise significativa da cultura e (iv) isolar o bacteriófago da cultura.
[0088] Os bacteriófagos podem ser isolados de uma amostra bacteriana utilizando qualquer método descrito aqui ou conhecido na área (ver, por exemplo, Carlson, “Working with bacteriophages: common techniques and methodological approaches” Em Kutter e Sulakvelidze (Editores) “Bacteriophages: Biology and Applications”, 5a edição, CRC Press (2005); aqui incorporado por referência na sua totalidade).
[0089] A invenção também proporciona polipeptídios isolados de bacteriófagos da invenção. Os polipeptídios isolados podem ser proteínas bacteriofágicas completas ou podem ser fragmentos, variantes ou derivados das proteínas bacteriofágicas, desde que o fragmento, variante ou derivado exiba pelo menos uma atividade biológica associada ao bacteriófago ou polipeptídio de onde é derivado. Em certas formas de realização, os polipeptídios da invenção são isolados do bacteriófago F1245/05 (que tipicamente infecta A. baumannii), F168/08 ou F170/08 (que tipicamente infecta E. faecalis e/ou E. faecium), bacteriófago F770/05 (que tipicamente infecta P. aeruginosa) ou bacteriófago F197/08, F86/06, F87s/06 ou F91a/06 (que tipicamente infectam S. aureus).
[0090] Em formas de realização específicas, o polipeptídio da invenção é uma endolisina ou lisina isolada de um bacteriófago com um genoma que compreende ou consiste na ID SEQ NO: 1, ID SEQ NO: 2, ID SEQ NO: 4, ID SEQ NO: 5, ID SEQ NO: 6, ID SEQ NO: 7 ou ID SEQ NO: 760 (por exemplo, bacteriófago F168/08, F170/08, F197/08, F86/06, F87s/06, F91a/06 ou F1245/05, respectivamente). Em formas de realização específicas, o polipeptídio da invenção é uma endolisina ou lisina com a sequência de aminoácidos que compreende ou consiste na ID SEQ NO: 797, ID SEQ NO: 68, ID SEQ NO: 184, ID SEQ NO: 202, ID SEQ NO: 203, ID SEQ NO: 446, ID SEQ NO: 447, ID SEQ NO: 448, ID SEQ NO: 575, ID SEQ NO: 641 ou ID SEQ NO: 712. Noutras formas de realização, o polipeptídio isolado da invenção é um fragmento, variante ou derivado de uma endolisina ou lisina isolada de um bacteriófago da invenção, cujo fragmento, variante ou derivado exibe pelo menos uma atividade biológica, preferivelmente atividade antibacteriana (por exemplo, atividade de morte por lise), da endolisina, lisina ou bacteriófago de onde é isolado ou derivado. Em conformidade, em certas formas de realização, a invenção proporciona polipeptídios isolados que são fragmentos, variantes ou derivados de endolisinas ou lisinas isoladas de bacteriófagos da invenção, cujos fragmentos, variantes ou derivados exibem atividade antibacteriana ou antimicrobiana (por exemplo, atividade de morte por lise) contra uma ou mais de A. baumannii, E. faecalis, E. faecium ou S. aureus. Noutras formas de realização, os polipeptídios isolados que são fragmentos, variantes ou derivados de endolisinas ou lisinas isoladas de bacteriófagos da invenção que exibem atividade antibacteriana ou antimicrobiana (por exemplo, atividade de morte por lise) contra uma ou mais espécies de bactérias diferentes de A. baumannii, E. faecalis, E. faecium ou S. aureus (por exemplo, P. aeruginosa). Em certas formas de realização, o polipeptídio da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 68, ID SEQ NO: 184, ID SEQ NO: 202 ou ID SEQ NO: 203 ou respectivo fragmento, variante ou derivado, cujo polipeptídio exibe atividade antibacteriana ou antimicrobiana contra E. faecalis ou E. faecium. Noutras formas de realização, o polipeptídio da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 446, ID SEQ NO: 447, ID SEQ NO: 448, ID SEQ NO: 575, ID SEQ NO: 641 ou ID SEQ NO: 712 ou respectivo fragmento, variante ou derivado, cujo polipeptídio exibe atividade antibacteriana ou antimicrobiana contra S. aureus. Ainda noutras formas de realização, o polipeptídio da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos ID SEQ NO: 797 ou respectivo fragmento, variante ou derivado, cujo polipeptídio exibe atividade antibacteriana ou antimicrobiana contra A. baumanni.
[0091] Em certas formas de realização, o polipeptídio da invenção compreende ou consiste num domínio CHAP isolado de uma endolisina ou lisina do bacteriófago F168/08, F170/08, F770/05, F197/08, F86/06, F87s/06 ou F91a/06. Foi demonstrado que domínios CHAP isolados retêm a atividade antibacteriana, por exemplo, atividade de morte por lise, da endolisina ou lisina de onde são derivados; os domínios CHAP podem ser identificados e isolados por métodos de rotina na área (ver, por exemplo, Rigden et al., 2003, Trends Biochem. Sci. 28: 230-234; Bateman et al., 2003, Trends Biochem. Sci. 28: 234-237, cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade). Em formas de realização específicas, o polipeptídio da invenção compreende ou consiste num domínio CHAP isolado de um polipeptídio que tem uma sequência de aminoácidos da ID SEQ NO: 68, ID SEQ NO: 184, ID SEQ NO: 202, ID SEQ NO: 203, ID SEQ NO: 446, ID SEQ NO: 447, ID SEQ NO: 448, ID SEQ NO: 575, ID SEQ NO: 641 ou ID SEQ NO: 712. Em formas de realização específicas, a invenção proporciona um polipeptídio isolado que compreende ou consiste no domínio CHAP derivado de um segundo polipeptídio que tem a sequência de aminoácidos da ID SEQ NO: 68, ID SEQ NO: 446, ID SEQ NO: 575, ID SEQ NO: 641 ou ID SEQ NO: 712, em que o domínio CHAP tem a sequência de aminoácidos da ID SEQ NO: 755, ID SEQ NO: 756, ID SEQ NO: 757, ID SEQ NO: 758 ou ID SEQ NO: 759, respectivamente. Isto é, a ID SEQ NO: 755 corresponde a um domínio CHAP derivado do polipeptídio que tem a sequência de aminoácidos da ID SEQ NO: 68; a ID SEQ NO: 756 corresponde a um domínio CHAP derivado do polipeptídio que tem a sequência de aminoácidos da ID SEQ NO: 446, e assim por diante. Noutras formas de realização, a invenção proporciona um fragmento, variante ou derivado de um domínio CHAP isolado de uma endolisina ou lisina do bacteriófago F168/08, F170/08, F770/05, F197/08, F86/06, F87s/06 ou F91a/06, cujo fragmento, variante ou derivado exibe pelo menos uma atividade biológica, por exemplo, morte celular por lise, do domínio CHAP de onde foi derivado, e em que o referido domínio CHAP tem uma sequência de aminoácidos da ID SEQ NO: 755, ID SEQ NO: 756, ID SEQ NO: 757, ID SEQ NO: 758 ou ID SEQ NO: 759. As sequências de aminoácidos da ID SEQ NO: 755 - ID SEQ NO: 759 estão apresentadas na Tabela 1. Tabela 1: Sequências de aminoácidos de domínios CHAP isolados de bacteriófagos da invenção
Figure img0001
Figure img0002
[0092] Em certas formas de realização, um polipeptídio da invenção compreende ou consiste numa proteína da medida do comprimento da cauda ou proteína da cauda (por exemplo, componente da cauda, proteína de fibras da cauda, proteína da cauda associada à adsorção), ou respectivo fragmento, isolada de um bacteriófago que tem um genoma que compreende ou consiste na ID SEQ NO: 1, ID SEQ NO: 2, ID SEQ NO: 3, ID SEQ NO: 4, ID SEQ NO: 5, ID SEQ NO: 6, ID SEQ NO: 7 ou ID SEQ NO: 760 (por exemplo, o bacteriófago F168/08, F170/08, F770/05, F197/08, F86/06, F87s/06, F91a/06 ou F1245/05, respectivamente), em que a proteína da medida do comprimento da cauda ou proteína da cauda, ou respectivo fragmento, tem uma função biológica associada ao bacteriófago de onde é derivada, por exemplo, atividade antimicrobiana ou antibacteriana (por exemplo, atividade de morte por lise). Em formas de realização específicas, a atividade antimicrobiana ou antibacteriana da proteína da medida do comprimento da cauda ou proteína da cauda é dirigida contra pelo menos uma ou mais espécies ou estirpes de A. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa e/ou S. aureus. Em formas de realização específicas, o polipeptídio da invenção é uma proteína da medida da cauda ou proteína da cauda que tem a sequência de aminoácidos que compreende ou consiste na ID SEQ NO: 61, ID SEQ NO: 63, ID SEQ NO: 204, ID SEQ NO: 214, ID SEQ NO: 435, ID SEQ NO: 438, ID SEQ NO: 440, ID SEQ NO: 525, ID SEQ NO: 526, ID SEQ NO: 527, ID SEQ NO: 528, ID SEQ NO: 529, ID SEQ NO: 530, ID SEQ NO: 531, ID SEQ NO: 532, ID SEQ NO: 533, ID SEQ NO: 534, ID SEQ NO: 535, ID SEQ NO: 536, ID SEQ NO: 537, ID SEQ NO: 538, ID SEQ NO: 539, ID SEQ NO: 567, ID SEQ NO: 568, ID SEQ NO: 632, ID SEQ NO: 633, ID SEQ NO: 700, ID SEQ NO: 701, ID SEQ NO: 702, ID SEQ NO: 703, ID SEQ NO: 704 ou ID SEQ NO: 795. Noutras formas de realização, o polipeptídio isolado da invenção é um fragmento, variante ou derivado da sequência de aminoácidos da ID SEQ NO: 61, ID SEQ NO: 63, ID SEQ NO: 204, ID SEQ NO: 214, ID SEQ NO: 435, ID SEQ NO: 438, ID SEQ NO: 440, ID SEQ NO: 525, ID SEQ NO: 526, ID SEQ NO: 527, ID SEQ NO: 528, ID SEQ NO: 529, ID SEQ NO: 530, ID SEQ NO: 531, ID SEQ NO: 532, ID SEQ NO: 533, ID SEQ NO: 534, ID SEQ NO: 535, ID SEQ NO: 536, ID SEQ NO: 537, ID SEQ NO: 538, ID SEQ NO: 539, ID SEQ NO: 567, ID SEQ NO: 568, ID SEQ NO: 632, ID SEQ NO: 633, ID SEQ NO: 700, ID SEQ NO: 701, ID SEQ NO: 702, ID SEQ NO: 703, ID SEQ NO: 704 ou ID SEQ NO: 795, cujo fragmento, variante ou derivado exibe pelo menos uma atividade ou função biológica do bacteriófago de onde é isolado ou derivado, por exemplo, atividade antimicrobiana ou antibacteriana (por exemplo, atividade de morte por lise). Em formas de realização preferidas, a pelo menos uma atividade ou função biológica do fragmento, variante ou derivado é dirigida contra uma ou mais estirpes de E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa, S. aureus e/ou A. baumannii.
[0093] Em certas formas de realização, o polipeptídio isolado da invenção é uma variante de um polipeptídio bacteriofágico, cuja variante compreende ou consiste numa sequência de aminoácidos que tem pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequências com uma segunda sequência de aminoácidos do mesmo comprimento (isto é, que consiste no mesmo número de resíduos), em que a referida segunda sequência de aminoácidos é a ID SEQ NO: 61, ID SEQ NO: 63, ID SEQ NO: 68, ID SEQ NO: 184, ID SEQ NO: 202, ID SEQ NO: 203, ID SEQ NO: 204, ID SEQ NO: 214, ID SEQ NO: 435, ID SEQ NO: 438, ID SEQ NO: 440, ID SEQ NO: 446, ID SEQ NO: 447, ID SEQ NO: 448, ID SEQ NO: 525, ID SEQ NO: 526, ID SEQ NO: 527, ID SEQ NO: 528, ID SEQ NO: 529, ID SEQ NO: 530, ID SEQ NO: 531, ID SEQ NO: 532, ID SEQ NO: 533, ID SEQ NO: 534, ID SEQ NO: 535, ID SEQ NO: 536, ID SEQ NO: 537, ID SEQ NO: 538, ID SEQ NO: 539, ID SEQ NO: 567, ID SEQ NO: 568, ID SEQ NO: 575, ID SEQ NO: 632, ID SEQ NO: 633, ID SEQ NO: 641, ID SEQ NO: 700, ID SEQ NO: 701, ID SEQ NO: 702, ID SEQ NO: 703, ID SEQ NO: 704, ID SEQ NO: 712, ID SEQ NO: 755, ID SEQ NO: 756, ID SEQ NO: 757, ID SEQ NO: 758, ID SEQ NO: 759, ID SEQ NO: 795 ou ID SEQ NO: 797, e/ou respectivo fragmento, e em que a variante exibe pelo menos uma função ou atividade biológica do bacteriófago de onde foi derivada (por exemplo, atividade antimicrobiana ou antibacteriana (por exemplo, atividade de morte por lise)) contra uma ou mais estirpes de bactérias (por exemplo, bactérias Gram-positivas (por exemplo, E. faecalis, E. faecium, S. aureus), bactérias Gram-negativas (por exemplo, P. aeruginosa, A. baumannii) ou bactérias não classificadas como sendo Gram-positivas ou Gram-negativas).
[0094] Em certas formas de realização, a invenção proporciona um polipeptídio isolado que tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das ID SEQ NOS: 2-124, ID SEQ NOS: 126-338, ID SEQ NOS: 340-434, ID SEQ NOS: 436-550, ID SEQ NOS: 552-614, ID SEQ NOS: 616-680, ID SEQ NOS: 682-759, ID SEQ NOS: 761-816, e respectivos fragmentos biológicos ativos. Em formas de realização preferidas, o polipeptídio variante da invenção exibe pelo menos uma atividade biológica, associada ao polipeptídio ou bacteriófago de onde foi isolado ou derivado, dirigida contra pelo menos uma ou mais estirpes de E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa, S. aureus e/ou A. baumannii.
[0095] Noutras formas de realização, a invenção proporciona uma sequência de ácido nucleico isolado que codifica a sequência de aminoácidos de uma das ID SEQ NOS: 8-130, ID SEQ NOS: 131-343, ID SEQ NOS: 344-438, ID SEQ NOS: 439-553, ID SEQ NOS: 554-616, ID SEQ NOS: 617-681, ID SEQ NOS: 682-759, ID SEQ NOS: 761-816, e respectivos fragmentos ativos. Noutras formas de realização, a invenção proporciona a sequência de ácido nucleico de qualquer uma das fases de leitura aberta identificadas nas FIGS. 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20 e 23.
[0096] Em certas formas de realização, os polipeptídios da presente invenção são fundidos de forma recombinante ou conjugados de forma química (incluindo conjugações covalentes e não covalentes) a agentes terapêuticos, por exemplo, polipeptídios heterólogos ou moléculas pequenas, para gerar proteínas de fusão ou polipeptídios quiméricos. Não é necessário que a fusão seja direta, podendo ocorrer por intermédio de sequências de ligação ou por conjugação química. Exemplos não limitativos de agentes terapêuticos aos quais podem ser conjugados os polipeptídios da invenção são citotoxinas peptídicas ou não peptídicas (incluindo antimicrobianos e/ou antibióticos), moléculas traçadoras/ marcadoras (por exemplo, radionuclidos e fluoróforos) e outros compostos antibióticos ou antibacterianos conhecidos na área.
6.1 COMPOSIÇÕES ANTIBIÓTICAS
[0097] Os bacteriófagos ou polipeptídios isolados da presente invenção podem ser administrados isoladamente ou incorporados numa composição farmacêutica para utilização no tratamento ou profilaxia de infecções bacterianas, por exemplo, infecções causadas por bactérias incluindo mas não se limitando a A. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa e S. aureus. Os polipeptídios podem ser combinados com um transportador, excipiente ou estabilizador farmaceuticamente aceitável. Exemplos de transportadores, excipientes e estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis incluem mas não se limitam a tampões, como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico; polipeptídios de baixo peso molecular; proteínas, tais como albumina do soro e gelatina; polímeros hidrófilos, como polivinil-pirrolidona; aminoácidos, como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono, incluindo glucose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, como EDTA; alcoóis de açúcares, como manitol ou sorbitol; contra-íons formadores de sais, como sódio, e/ou surfactantes não iónicos, como TWEEN™, polietilenoglicol (PEG) e PLURONICS™. A composição farmacêutica da presente invenção (por exemplo, composição antibacteriana) também pode incluir, para além dos ingredientes acima, um lubrificante, um agente umedecedor, um edulcorante, um agente aromatizante, um emulsionante, um agente de suspensão e um conservante.
[0098] Os bacteriófagos e/ou polipeptídios da presente invenção também podem ser combinados com um ou mais agentes terapêuticos e ou profilácticos úteis para o tratamento de infecções bacterianas como descrito aqui e/ou conhecido na área (por exemplo, uma ou mais lisinas). Em consequência, as composições farmacêuticas da invenção podem compreender dois ou mais bacteriófagos isolados da invenção (com atividade antibacteriana contra espécies ou estirpes bacterianas iguais ou diferentes), a combinação de um bacteriófago e um polipeptídio da invenção ou a combinação de um bacteriófago e/ou polipeptídio da invenção e um bacteriófago e/ou polipeptídio terapêutico conhecido na área. Em formas de realização específicas, os componentes terapêuticos de uma combinação abordam seletivamente duas ou mais espécies ou estirpes de bactérias ou exibem atividades enzimáticas diferentes. Por exemplo, as lisinas, em geral, exibem uma atividade de amidase, endopeptidase, muramidase ou glucosamidase. Em conformidade, a combinação de lisinas exibindo diferentes atividades pode proporcionar um reforço sinergético da atividade terapêutica da composição farmacêutica da invenção.
[0099] Exemplos de outros agentes terapêuticos que podem ser utilizados em combinação com o polipeptídio da invenção incluem, mas não se limitam a agentes comuns de entre agentes antibióticos, agentes anti-inflamatórios, agentes antivirais, agentes de anestesia local e corticosteróides.
[0100] Os antibióticos comuns que podem ser utilizados com composições farmacêuticas compreendendo polipeptídios da invenção incluem mas não se limitam a amicacina, gentamicina, canamicina, neomicina, netilmicina, paromomicina, rodostreptomicina, estreptomicina, tobramicina, apramicina, rifamicina, naftomicina, mupirocina, geldanamicina, ansamitocina, carbacefeme, imipeneme, meropeneme, ertapeneme, faropeneme, doripeneme, panipeneme/betamiprona, biapeneme, PZ-601, cefalosporinas, cefacetril, cefadroxil, cefalexina, cefaloglicina, cefalónio, cefaloridina, cefalotina, cefapirina, cefatrizina, cefazaflur, cefazedona, cefazolina, cefradina, cefroxadina, ceftezol, cefaclor, cefonicida, cefprozil, cefuroxima, cefuzonam, cefmetazole, cefotetano, cefoxitina, cefcapeno, cefdaloxima, cefdinir, cefditoreno, cefetamet, cefixima, cefmenoxima, cefteram, ceftibuteno, ceftiofur, ceftioleno, ceftizoxima, ceftriaxona, cefoperazona, ceftazidima latamoxef, cefclidina, cefepima, cefluprenam, cefoselis, cefozoprano, cefpiroma, cefquinoma, flomoxefe, ceftobiprole, azitromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, roxitromicina, aztreonam, penicilina e derivados da penicilina, actinomicina, bacitracina, colistina, polimixina B, cinoxacina, flumequina, ácido nalidíxico, ácido oxolínico, ácido piromídico, ácido pipemídico, rosoxacina, ciprofloxacina, enoxacina, fleroxacina, lomefloxacina, nadifloxacina, norfloxacina, ofloxacina, pefloxacina, rufloxacina, balofloxacina, gatifloxacina, grepafloxacina, levofloxacina, moxifloxacina, pazufloxacina, esparfloxacina, temafloxacina, tosufloxacina, clinafloxacina, garenoxacina, gemifloxacina, estifloxacina, trovafloxacina, prulifloxacina, acetazolamida, benzolamida, bumetanida, celecoxib, clortalidona, clopamida, diclorfenamida, dorzolamida, etoxizolamida, furosemida, hidroclorotiazida, indapamida, mafenida, mefrusida, metolazona, probenecida, sulfacetamida, sulfadimetoxina, sulfadoxina, sulfanilamidas, sulfametoxazol, sulfasalazina, sultiame, sumatriptano, xipamida, tetraciclina, clorotetraciclina, oxitetraciclina, doxiciclina, limeciclina, meclociclina, metaciclina, minociclina, rolitetraciclina, e qualquer combinação destes em quantidades eficazes para reforçar de modo aditivo ou sinergético o efeito terapêutico do bacteriófago ou polipeptídeo da invenção para uma dada infecção.
[0101] Anestésicos locais que podem ser utilizados em composições farmacêuticas da presente invenção incluem tetracaína, cloridrato de tetracaína, lidocaína, cloridrato de lidocaína, cloridrato de dimetisoquina, dibucaína, cloridrato de dibucaína, picrato de butamben e cloridrato de pramoxina. Uma concentração exemplificativa de um anestésico local é cerca de 0,025% até cerca de 5% por peso da composição total.
[0102] Corticosteróides que podem ser úteis em combinação com os polipeptídeos, fagos e/ou composições farmacêuticas da invenção incluem betametasona, dipropionato, fluocinolona, actinido, valerato de betametasona, actinido de triamcinolona, propionato de clobetasol, desoximetasona, diacetato de diflorasona, amcinonida, flurandrenolida, valerato de hidrocortisona, butirato de hidrocortisona e desonida. Uma concentração exemplificativa de corticosteróides é cerca de 0,01% até cerca de 1% por peso da composição total.
[0103] Em certas formas de realização, uma formulação compreendendo um bacteriófago e/ou polipeptídeo da invenção também compreende tampão SM (Tris-HCl 0,05 M (pH 7,4 — 7,5); NaCl 0,1 M; MgSO4 10 mM). Noutras formas de realização, a formulação também compreende tampão SM e MgCl2 10 mM. Ainda noutras formas de realização, a formulação também compreende tampão SM e etanol cerca de 20% ou etanol cerca de 30%.
[0104] As composições farmacêuticas que compreendem um bacteriófago e/ou polipeptídeo da presente invenção podem ser formuladas numa formulação de dose unitária ou de múltiplas doses. As formulações adequadas podem ser selecionadas do grupo que consiste em unguentos, soluções, suspensões ou emulsões, extratos, pós, grânulos, pulverizações, rebuçados, comprimidos ou cápsulas, e incluem adicionalmente um agente dispersante ou um agente estabilizador.
[0105] As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas por inalação, na forma de um supositório ou pessário, por via tópica (por exemplo, na forma de uma loção, solução, creme, unguento ou pó de empoeiramento), por via epi- ou transdérmica (por exemplo, utilizando um emplastro a ser aplicado na pele), por via oral (por exemplo, na forma de um comprimido, que pode conter excipientes como amido ou lactose), na forma de uma cápsula, óvulo, elixires, soluções ou suspensões (cada um contendo, opcionalmente, agentes aromatizantes, corantes e/ou excipientes), ou podem ser injetadas por via parentérica (por exemplo, intravenosa, intramuscular ou subcutânea). Para administração parentérica, as composições podem ser melhor utilizadas na forma de uma solução aquosa esterilizada que pode conter outras substâncias, por exemplo, uma quantidade suficiente de sais ou monossacáridos para tornar a solução isotônica com o sangue. Para administração bucal ou sublingual, as composições podem ser administradas na forma de comprimidos ou rebuçados, que podem ser formulados de modo convencional. Numa forma de realização preferida, um bacteriófago e/ou polipeptídeo da presente invenção é administrado topicamente, quer na forma de um único agente quer em combinação com outros tratamentos antibióticos como descrito aqui ou conhecidos na área.
[0106] Um bacteriófago e/ou polipeptídeo da presente invenção também pode ser administrado por via dérmica ou transdérmica. Para aplicação tópica na pele, os bacteriófagos e/ou polipeptídeos da presente invenção podem ser combinados com um ou com uma combinação de transportadores, que incluem mas não se limitam a um líquido aquoso, um líquido à base de álcool, um gel solúvel em água, uma loção, um unguento, uma base líquida não aquosa, uma base de óleo mineral, uma combinação de óleo mineral e petrolatum, lanolina, lipossomas, transportadores protéicos, como albumina do soro ou gelatina, “carmel” de celulose em pó e combinações destes. Um modo de distribuição tópico pode incluir um esfregaço, uma pulverização, um emplastro de libertação temporal, um agente de fricção com um líquido absorvido e combinações destes. O bacteriófago e/ou polipeptídeo da invenção pode ser aplicado num emplastro ou penso diretamente ou num dos transportadores. Os emplastros podem ser úmidos ou secos, em que o fago e/ou polipeptídeo (por exemplo, uma lisina) está presente no emplastro numa forma liofilizada. Os transportadores de composições tópicas podem compreender veículos semi-sólidos e do tipo gel que incluem um espessante polimérico, água, conservantes, surfactantes ativos ou emulsionantes, antioxidantes, protetores solares e um solvente ou sistema solvente misto. A Patente U.S. N° 5,863,560 divulga algumas combinações de transportadores diferentes que podem auxiliar a exposição da pele a um medicamento, e o seu conteúdo é incorporado aqui.
[0107] Para administração intranasal ou por inalação, o bacteriófago e/ou polipeptídeo da invenção é convenientemente distribuído na forma de um inalador de pó seco ou uma apresentação de pulverização de aerossol a partir de um recipiente pressurizado, bomba, pulverizador ou nebulizador utilizando um impulsor adequado, por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, um hidrofluoroalcano, como 1,1,1,2- tetrafluoroetano (HFA 134A.TM.) ou 1,1,1,2,3,3,3- heptafluoropropano (HFA 227EA.TM.), dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada proporcionando uma válvula para distribuir uma quantidade medida. O recipiente pressurizado, bomba, pulverizador ou nebulizador pode conter uma solução ou suspensão do composto ativo, por exemplo, utilizando uma mistura de etanol e do impulsor como solvente, que adicionalmente pode conter um lubrificante, por exemplo, trioleato de sorbitano. Cápsulas e cartuchos (feitos, por exemplo, de gelatina) para utilização num inalador ou insuflador podem ser formulados de modo a conter uma mistura em pó do bacteriófago e/ou polipeptídeo da invenção e uma base de pó adequada, como lactose ou amido.
[0108] Para administração na forma de um supositório ou pessário, as composições terapêuticas podem ser aplicadas topicamente na forma de um gel, hidrogel, loção, solução, creme, unguento ou pó de empoeiramento. As composições da invenção também podem ser administradas pela via ocular. Para utilização oftálmica, as composições da invenção podem ser formuladas como suspensões micronizadas em solução salina esterilizada isotônica de pH ajustado ou, preferivelmente, como soluções em solução salina esterilizada isotônica de pH ajustado, opcionalmente em combinação com um conservante, como cloreto de benzalcônio. Alternativamente, podem ser formuladas num unguento, como petrolatum.
[0109] As dosagens e concentrações desejadas do fármaco das composições farmacêuticas da presente invenção podem variar, dependendo da utilização particular. A determinação da dosagem ou via de administração apropriada pertence ao âmbito médico. Experiências em animais podem fornecer diretrizes fiáveis para a determinação de doses eficazes em terapia humana. O escalamento inter-espécies de doses eficazes pode ser feito pelo profissional seguindo os princípios descritos por Mordenti, J. e Chappell, W. “The use of interspecies scaling in toxicokinetics” em “Toxicokinetics and New Drug Development”, Yacobi et al., Editores, Pergamon Press, Nova Iorque 1989, páginas 42-96.
6.2 UTILIZAÇÃO TERAPÊUTICA
[0110] Os bacteriófagos e polipeptídeos da presente invenção têm atividade contra uma pluralidade de estirpes de E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa, S. aureus e/ou A. baumannii, como descrito nas FIGS. 3A-B, 6A-B, 9, 12, 15, 18, 21 e 23. Em consequência, as composições da presente invenção podem ser utilizadas em métodos de prevenção e tratamento de infecções associadas a E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa, S. aureus e/ou A. baumannii em humanos e animais. Noutras formas de realização, as composições da presente invenção podem ser utilizadas para tratar infecções associadas a espécies ou estirpes relacionadas destas bactérias, incluindo mas não se limitando a S. epidermidis, S. auricularis, S. capitis, S. haemolyticus, S. hominis, S. saprophyticus, S. simulans, S. xylosis, Micrococcus luteus, Bacilus subtilis, B. pumilus, E. hirae e/ou uma ou mais das estirpes de A. baumannii, por exemplo, uma ou mais das estirpes descritas na FIG. 24.
[0111] Em formas de realização específicas, o sujeito que recebe uma composição farmacêutica da invenção é um mamífero (por exemplo, bovino, ovino, caprino, equídeo, primata (por exemplo, humano), roedor, lagomorfo ou ave doméstica (por exemplo, galinha, pato, ganso)). No contexto da presente invenção, “tratamento” refere-se a tratamento terapêutico e em que o objetivo é eliminar, atenuar, diminuir a gravidade, melhorar, abrandar a progressão ou prevenir os sintomas ou causa subjacente (por exemplo, infecção bacteriana) associada ao estado ou perturbação patológica. “Tratamento” refere-se a tratamento terapêutico e medidas profilácticas ou preventivas, em que o objetivo é eliminar, atenuar, diminuir a gravidade, abrandar a progressão ou retardar ou prevenir os sintomas ou causa subjacente (por exemplo, infecção bacteriana) associados ao estado ou perturbação patológica. Também é contemplado que um bacteriófago e/ou polipeptídeo da invenção atue como medida profilática ou preventiva, prevenindo o surgimento de infecção causada por uma ou mais bactérias.
[0112] A. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa e S. aureussão responsáveis por muitas infecções oportunistas graves, particularmente em indivíduos com sistemas imunológicos comprometidos. As composições farmacêuticas da presente invenção são contempladas para o tratamento de qualquer infecção associada a A. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa ou S. aureus, ou associada a outras espécies ou estirpes de bactérias, incluindo mas não se limitando a infecções da pele (incluindo mas não se limitando a úlceras da pele, escaras de decúbito e úlceras diabéticas dos pés), infecções no interior e em redor de feridas, infecções pós-operatórias, infecções associadas a cateteres e drenagens cirúrgicas e infecções do sangue.
[0113] A. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa e S. aureustambém estão associadas a infecções que envolvem sistemas de órgãos com elevado teor de fluidos, e é contemplado que os bacteriófagos e/ou polipeptídeos da invenção tenham aplicação terapêutica na prevenção e tratamento destas infecções. Por exemplo, as composições farmacêuticas da invenção podem ser utilizadas para a prevenção ou tratamento de infecções do trato respiratório, do fluido cerebrospinal ou fluido peritoneal e do trato urinário. As composições da invenção também podem ser utilizadas para prevenir e/ou tratar pneumonia nosocomial, infecções associadas a diálise peritoneal contínua ambulatória (CAPD), bacteriúria associada a cateteres e meningite nosocomial.
[0114] Numa forma de realização preferida, um bacteriófago e/ou polipeptídeo da invenção é utilizado de modo profiláctico no cenário hospitalar, particularmente para prevenir infecções associadas a feridas, úlceras e aberturas na pele devido a cateterização, e quaisquer outros procedimentos ou dispositivos médicos.
[0115] Em certas formas de realização, um bacteriófago e/ou polipeptídeo da invenção é utilizado como único agente para o tratamento ou prevenção de infecções associadas a A. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa, S. aureus ou outras espécies bacterianas. Noutras formas de realização da invenção, um bacteriófago e/ou polipeptídeo da invenção é utilizado em combinação com outros agentes, incluindo outros bacteriófagos (por exemplo, que abordam seletivamente uma espécie ou estirpe diferente de bactérias), ou com antibióticos que abordam seletivamente tipos de bactérias iguais ou diferentes, incluindo bactérias selecionadas de quaisquer bactérias gram-positivas, quaisquer bactérias gram-negativas e quaisquer outros grupos de bactérias não classificadas como sendo gram-positivas ou gram-negativas. As composições da invenção também podem ser utilizadas em combinação com quaisquer outros meios conhecidos dos profissionais de tratamento de infecções bacterianas.
[0116] Também são contemplados pela invenção métodos de prevenção e métodos de tratamento de uma infecção causada por bactérias, incluindo mas não se limitando a E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa, S. aureus e/ou A. baumannii, que compreendem administrar, a um mamífero necessitado, uma composição compreendendo uma lisina que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da ID SEQ NO: 68, ID SEQ NO: 184, ID SEQ NO: 202, ID SEQ NO: 203, ID SEQ NO: 446, ID SEQ NO: 447, ID SEQ NO: 448, ID SEQ NO: 575, ID SEQ NO: 641, I.D. NO:712 e/ou ID SEQ NO: 797, ou respectivo fragmento, variante ou derivado, em que o fragmento, variante ou derivado exibe atividade antibacteriana ou antimicrobiana contra a espécie de bactéria de onde foi isolado o bacteriófago paterno. Num exemplo específico de acordo com esta forma de realização, a invenção proporciona métodos de prevenção ou tratamento de uma infecção causada por uma bactéria que inclui mas não se limita a E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa, S. aureus e/ou A. baumannii, que compreendem administrar, a um mamífero necessitado, uma composição compreendendo um domínio CHAP isolado de uma lisina, ou respectivo fragmento, variante ou derivado, que exibe pelo menos uma atividade biológica do domínio CHAP de onde foi isolado (por exemplo, morte de células por lise). Em certas formas de realização, o domínio CHAP isolado compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da ID SEQ NO: 755, ID SEQ NO: 756, ID SEQ NO: 757, ID SEQ NO: 758 ou ID SEQ NO: 759. Noutras formas de realização, a invenção proporciona métodos de prevenção e tratamento de uma infecção causada por bactérias que incluem mas não se limitam a E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa, S. aureus e/ou A. baumannii, que compreendem administrar, a um mamífero necessitado, uma composição compreendendo uma proteína da medida da cauda ou proteína da cauda que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da ID SEQ NO: 61, ID SEQ NO: 63, ID SEQ NO: 204, ID SEQ NO: 214, ID SEQ NO: 435, ID SEQ NO: 438, ID SEQ NO: 440, ID SEQ NO: 525, ID SEQ NO: 526, ID SEQ NO: 527, ID SEQ NO: 528, ID SEQ NO: 529, ID SEQ NO: 530, ID SEQ NO: 531, ID SEQ NO: 532, ID SEQ NO: 533, ID SEQ NO: 534, ID SEQ NO: 535, ID SEQ NO: 536, ID SEQ NO: 537, ID SEQ NO: 538, ID SEQ NO: 539, ID SEQ NO: 567, ID SEQ NO: 568, ID SEQ NO: 632, ID SEQ NO: 633, ID SEQ NO: 700, ID SEQ NO: 701, ID SEQ NO: 702, ID SEQ NO: 703, ID SEQ NO: 704 e/ou ID SEQ NO: 795, ou respectivo fragmento, variante ou derivado, em que o fragmento, variante ou derivado exibe uma atividade biológica associada ao bacteriófago paterno. Ainda noutras formas de realização, a invenção proporciona métodos de prevenção e tratamento de uma infecção causada por bactérias incluindo mas não se limitando a E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa, S. aureus e/ou A. baumannii, que compreendem administrar, a um mamífero necessitado, uma composição compreendendo um bacteriófago com um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 1, ID SEQ NO: 2, ID SEQ NO: 3, ID SEQ NO: 4, ID SEQ NO: 5, ID SEQ NO: 6, ID SEQ NO: 7 e/ou ID SEQ NO: 760. Também são contempladas combinações das lisinas (ou respectivos fragmentos, variantes ou derivados, como descrito acima) e de proteínas da medida da cauda ou proteínas da cauda (ou respectivos fragmentos, variantes ou derivados, como descrito acima), opcionalmente com um ou mais bacteriófagos da invenção ou com outros tratamentos, como antibióticos, bem como métodos de tratamento e métodos de prevenção de uma infecção bacteriana utilizando uma ou mais das combinações aqui descritas.
[0117] Tal como é utilizado aqui, o termo “em combinação” refere-se à utilização de mais do que um agente profiláctico e/ou terapêutico. A utilização do termo “em combinação” não restringe a ordem pela qual os agentes profilácticos e/ou terapêuticos são administrados a um sujeito com uma doença ou perturbação. Um primeiro agente profiláctico ou terapêutico pode ser administrado antes (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas antes), de modo concomitante ou subsequente (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas após) à administração de um segundo agente profiláctico ou terapêutico (diferente do primeiro agente profiláctico ou terapêutico) a um sujeito com uma doença ou perturbação.
6.3 UTILIZAÇÃO DESINFECTANTE E ANTI-INFECCIOSA
[0118] Os patogenes bacterianos, a maior parte das vezes, infectam num sítio de uma membrana mucosa (por exemplo, respiratória superior e inferior, intestinal, urogenital e ocular). As próprias membranas mucosas são muitas vezes o reservatório, por vezes o único reservatório, de muitas bactérias patogênicas presentes no ambiente (por exemplo, pneumococos, estafilococos e estreptococos). Há muito poucos agentes anti-infecciosos concebidos para controlar o estado transportador de bactérias patogênicas. No entanto, estudos mostraram que ao reduzir ou eliminar este reservatório em ambientes como hospitais e infantários, a incidência de infecções causadas por estas bactérias será acentuadamente reduzida.
[0119] Os bacteriófagos e/ou polipeptídios da presente invenção podem ser utilizados em composições anti- infecciosas para controlar o crescimento de bactérias (por exemplo, bactérias Gram-positivas (por exemplo, E. faecalis, E. faecium, S. aureus), bactérias Gram-negativas (por exemplo, P. aeruginosa, A. baumannii) ou bactérias não classificadas como sendo Gram-positivas ou Gram-negativas) para prevenir ou reduzir a incidência de infecções graves. Para além da utilização em composições para aplicação em membranas mucosas, um bacteriófago e/ou polipeptídio da presente incorporação também pode ser incorporado em formulações como géis, cremes, unguentos ou pulverizações para controlar ou prevenir a colonização de bactérias em superfícies do corpo (por exemplo, pele e membranas mucosas) (por exemplo, para esterilização de áreas cirúrgicas ou das mãos e pele exposta de funcionários do sector da saúde e/ou pacientes) e outras superfícies sólidas (por exemplo, acessórios, bancadas e, em particular, equipamento hospitalar).
6.4 MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO
[0120] A presente invenção também abrange métodos de diagnóstico para a determinação do agente causador numa infecção bacteriana. Em certas formas de realização, o diagnóstico do agente causador numa apresentação de infecção bacteriana é efetuado por (i) cultura de amostras de tecido, sangue ou fluido de um paciente de acordo com técnicas comuns; (ii) contacto da cultura com um ou mais bacteriófagos e/ou polipeptídios da invenção, e (iii) monitorização do crescimento celular e evidências de lise após esse contacto. Uma vez que a atividade dos bacteriófagos e/ou seus produtos isolados (por exemplo, polipeptídios, ou respectivos fragmentos, variantes ou derivados biologicamente ativos) tende a ser específica para a espécie ou estirpe, a susceptibilidade, ou ausência de susceptibilidade, a um ou mais bacteriófagos e/ou polipeptídios da invenção pode ser indicadora da espécie ou estirpe de bactérias infecciosas. Por exemplo, o crescimento decrescido de culturas de teste após o contacto com um bacteriófago que tem um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico ID SEQ NO: 1 ou ID SEQ NO: 2, ou com um respectivo produto polipeptídico isolado, pode ser indicador de a amostra de teste compreender E. faecalis ou E. faecium. De modo semelhante, um bacteriófago com um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico ID SEQ NO: 3, ou respectivo produto polipeptídico isolado, pode ser utilizado para identificar infecção causada por P. aeruginosa; um bacteriófago com um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico ID SEQ NO: 760, ou respectivo produto polipeptídico isolado, pode ser utilizado para identificar infecção causada por A. baumannii, ao passo que um bacteriófago com um genoma que compreende ou consiste na sequência de ácido nucleico ID SEQ NO: 4, ID SEQ NO: 5, ID SEQ NO: 6 ou ID SEQ NO: 7, ou respectivo produto polipeptídico isolado, pode ser utilizado para identificar infecção causada por S. aureus.
6.5 VARIANTES DE AMINOÁCIDOS
[0121] Podem ser criadas variantes de sequências de aminoácidos dos polipeptídios da invenção de modo a serem variantes de substituição, inserção ou deleção. As variantes de deleção não têm um ou mais resíduos da proteína nativa que não são essenciais para a função (por exemplo, atividade antimicrobiana ou antibacteriana). Os mutantes de inserção envolvem tipicamente a adição de material num ponto não terminal do polipeptídio. As variantes de substituição contêm tipicamente a troca de um aminoácido por outro num ou mais sítios da proteína, e podem ser concebidas para modular uma ou mais propriedades do polipeptídio, como estabilidade contra clivagem proteolítica, sem perda de outras funções ou propriedades. As substituições deste tipo são preferivelmente conservativas, isto é, um aminoácido é substituído por outro de forma e carga semelhantes. As substituições conservativas são bem conhecidas na área e incluem, por exemplo, as trocas de: alanina por serina; arginina por lisina; asparagina por glutamina ou histidina; aspartato por glutamato; cisteína por serina; glutamina por asparagina; glutamato por aspartato; glicina por prolina; histidina por asparagina ou glutamina; isoleucina por leucina ou valina; leucina por valina ou isoleucina; lisina por arginina; metionina por leucina ou isoleucina; fenilalanina por tirosina, leucina ou metionina; serina por treonina; treonina por serina; triptofano por tirosina; tirosina por triptofano ou fenilalanina, e valina por isoleucina ou leucina.
[0122] Depois de identificadas as áreas gerais do gene que codificam a proteína lisina particular como descrito aqui, pode empregar-se metagênese pontual para identificar particularmente quais os resíduos de aminoácidos que são importantes nas atividades antibacterianas. Assim, o profissional conseguirá gerar alterações de uma única base no filamento de DNA para dar origem a um códon alterado e a uma mutação de sequência trocada.
[0123] Preferivelmente, a mutação dos aminoácidos de uma proteína cria uma molécula de segunda geração equivalente ou mesmo melhorada. Por exemplo, certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos numa estrutura protéica sem perda detectável da função (por exemplo, atividade antibacteriana ou antimicrobiana). Ao fazer essas alterações pode considerar-se o índice hidropático dos aminoácidos. A importância do índice hidropático dos aminoácidos para conferir uma função biológica interativa a uma proteína é geralmente entendida na área. É aceite que o caráter hidropático relativo do aminoácido contribui para a estrutura secundária da proteína resultante, que por sua vez define a interação da proteína com outras moléculas, por exemplo, interação com um peptidoglicano no revestimento externo de uma bactéria gram-positiva. A cada aminoácido foi atribuído um índice hidropático com base na sua hidrofobicidade e características de carga, por exemplo: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (0,9); tirosina (-1,3); prolina (- 1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9), e arginina (-4,5).
[0124] Também é entendido na área que a substituição de aminoácidos semelhantes pode ser feita eficazmente com base na hidrofilicidade. Tal como com a hidrofobicidade, a cada aminoácido foram atribuídos valores de hidrofilicidade: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 + 1); glutamato (+3,0 + 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (- 0,5 + 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5), e triptofano (-3,4). Podem obter-se moléculas equivalentes por substituição de um aminoácido por outro em que os seus índices de hidrofilicidade estão num intervalo ± 2, preferivelmente ± 1 ou muito preferivelmente ± 5 um do outro. Em certas formas de realização, a invenção abrange peptídeos isolados que compreendem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, inserção, substituição, deleção, etc.) relativamente a uma sequência de aminoácidos divulgada aqui. Em formas de realização preferidas, a(s) mutação(mutações) é(são) feita(s) de modo a ser retida a atividade biológica do polipeptídio particular. Por exemplo, a presente invenção abrange polipeptídios isolados dos bacteriófagos F1245/05, F168/08, F170/08, F770/05, F197/08, F86/06, F87s/06 e/ou F91a/06, que são mutados de modo a compreenderem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais modificações de aminoácidos relativamente a uma sequência de aminoácidos listada aqui e que exibem atividade antibacteriana contra uma ou mais espécies ou estirpes de bactérias Gram-positivas ou Gram-negativas, por exemplo, A. baumannii, E. faecalis, E. faecium, P. aeruginosa e/ou S. aureus. Em formas de realização específicas, os polipeptídios da invenção derivados de F168/08 ou F/170/08 exibem atividade antibacteriana ou antimicrobiana, por exemplo, atividade de morte por lise, contra pelo menos E. faecalis e/ou E. faecium; os derivados de F770/05 contra pelo menos P. aeruginosa; os derivados de F197/08, F86/06, F87s/06 ou F91a/06 contra pelo menos S. aureus, e os derivados de F1245/05 contra pelo menos A. baumannii.
6.6 POLINUCLEOTÍDEOS QUE CODIFICAM POLIPEPTÍDEOS DA INVENÇÃO
[0125] A invenção proporciona polinucleotídeos compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídio da invenção. A invenção também abrange polinucleotídeos que hibridizam, em condições de hibridização de restrição elevada, restrição intermédia ou baixa, por exemplo, como definido supra, para polinucleotídeos que codificam um polipeptídio da invenção e que codificam polipeptídios modificados que têm atividade antibiótica e/ou outras atividades biológicas.
[0126] Os polinucleotídeos podem ser obtidos e a sequência de nucleotídeos dos polinucleotídeos pode ser determinada por qualquer método conhecido na área. Por exemplo, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídio da invenção pode ser gerado a partir do ácido nucleico de uma fonte adequada (por exemplo, o bacteriófago F1245/05, F168/08, F170/08, F770/05, F197/08, F197/08, F86/06, F87s/06 ou F91a/06). Sequências de nucleotídeos podem ser isoladas de genomas fágicos por métodos de rotina conhecidos na área (ver, por exemplo, Carlson, “Working with bacteriophages: common techniques and methodological approaches,” Em Kutter e Sulakvelidze (Editores) “Bacteriophages: Biology and Applications”, 5a edição CRC Press (2005); aqui incorporado por referência na sua totalidade). Se não estiver disponível uma fonte contendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídio particular mas se for conhecida a sequência de aminoácidos do polipeptídio da invenção, um ácido nucleico que codifica o polipeptídio pode ser sintetizado quimicamente e clonado em vetores de clonagem replicáveis utilizando qualquer método bem conhecido na área.
[0127] Depois de determinada a sequência de nucleotídeos do polipeptídeo da invenção, a sequência de nucleotídeos do polipeptídeo pode ser manipulada utilizando métodos bem conhecidos na área para a manipulação de sequências de nucleotídeos, por exemplo, técnicas de DNA recombinante, metagênese dirigida a sítios, PCR, etc. (ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al., 1990, “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, e Ausubel et al., editores, 1998, “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, NY, ambos aqui incorporados por referência na sua totalidade), para gerar polipeptídeos com uma sequência de aminoácidos diferente, por exemplo, para criar substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos.
[0128] Ainda noutra forma de realização da invenção são proporcionadas as seguintes sequências de nucleotídeos: a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 1 até ao nucleotídeo 85 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 87 até ao nucleotídeo 584 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 594 até ao nucleotídeo 767 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 724 até ao nucleotídeo 1035 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 1005 até ao nucleotídeo 1823 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 1816 até ao nucleotídeo 2130 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 2132 até ao nucleotídeo 2383 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 2383 até ao nucleotídeo 3690 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 3687 to 4469 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 4466 até ao nucleotídeo 5458 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 5632 até ao nucleotídeo 7956 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 8010 até ao nucleotídeo 8912 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 8915 até ao nucleotídeo 9262 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 9252 até ao nucleotídeo 10223 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 10213 até ao nucleotídeo 10782 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 10769 até ao nucleotídeo 11218 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 11202 até ao nucleotídeo 11420 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 11413 até ao nucleotídeo 12342 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 12339 até ao nucleotídeo 12515 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 12512 até ao nucleotídeo 13165 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 13170 até ao nucleotídeo 15599 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 15609 até ao nucleotídeo 15872 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 15979 até ao nucleotídeo 16173 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 16175 até ao nucleotídeo 16482 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 16494 até ao nucleotídeo 18059 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 18072 até ao nucleotídeo 18815 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 18857 até ao nucleotídeo 19879 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 19930 até ao nucleotídeo 20178 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 20180 até ao nucleotídeo 20545 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 20646 até ao nucleotídeo 21203 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 21212 até ao nucleotídeo 23506 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 23506 até ao nucleotídeo 24186 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 24201 até ao nucleotídeo 27068 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 27084 até ao nucleotídeo 30212 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 30214 até ao nucleotídeo 32505 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 32515 até ao nucleotídeo 32880 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 32873 até ao nucleotídeo 33460 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 33460 até ao nucleotídeo 33816 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 33825 até ao nucleotídeo 35777 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 35774 até ao nucleotídeo 35872 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 35869 até ao nucleotídeo 36027 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 36038 até ao nucleotídeo 36193 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 36916 até ao nucleotídeo 36788 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 37209 até ao nucleotídeo 37427 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 37868 até ao nucleotídeo 38386 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 38383 até ao nucleotídeo 38586 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 38912 até ao nucleotídeo 39406 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 39406 até ao nucleotídeo 39915 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 39917 até ao nucleotídeo 40021 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 40018 até ao nucleotídeo 40101 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 40101 até ao nucleotídeo 40670 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 40720 até ao nucleotídeo 41838 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 41822 até ao nucleotídeo 42127 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 42105 até ao nucleotídeo 42308 da ID SEQ NO: 760; a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 42382 até ao nucleotídeo 42912 da ID SEQ NO: 760, e a sequência de nucleotídeos desde o nucleotídeo 42896 até ao nucleotídeo 43015 da ID SEQ NO: 760.
6.7 EXPRESSÃO RECOMBINANTE DE MOLÉCULAS DA INVENÇÃO
[0129] Depois de obtida uma sequência de ácido nucleico que codifica uma molécula da invenção (por exemplo, um polipeptídeo), o vetor para a produção das moléculas pode ser produzido por tecnologia de DNA recombinante utilizando técnicas bem conhecidas na área. Podem utilizar-se métodos bem conhecidos dos profissionais para construir vetores de expressão que contêm sequências codificadoras para as moléculas da invenção e sinais apropriados de controlo da transcrição e tradução. Estes métodos incluem, por exemplo, técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação genética in vivo. (Ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al., 1990, “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, e Ausubel et al. editores, 1998, “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, NY).
[0130] A presente invenção proporciona vetores de expressão que codificam os polipeptídeos da invenção. Um vetor de expressão compreendendo a sequência de nucleotídeos de uma molécula identificada pelos métodos da invenção pode ser transferido para uma célula-hospedeiro por técnicas convencionais (por exemplo, eletroporação, transfecção lisossômica e precipitação com fosfato de cálcio), e as células transfectadas são então cultivadas por técnicas convencionais para produzir as moléculas da invenção. Em formas de realização preferidas, a célula-hospedeiro é diferente da espécie da bactéria paterna de onde foi derivado o bacteriófago compreendendo a sequência. Em formas de realização específicas, a expressão das moléculas da invenção é regulada por um promotor constitutivo, um promotor indutível ou um promotor específico para tecidos. Em formas de realização específicas, o vetor de expressão é pQE-30 (Qiagen) ou pET-29(a) (Novagen).
[0131] As células-hospedeiro utilizadas para expressar as moléculas identificadas pelos métodos da invenção podem ser células bacterianas (não susceptíveis à proteína bacteriofágica, ou respectivo fragmento, da invenção), como Escherichia coli. Pode utilizar-se uma variedade de sistemas hospedeiro-vetor de expressão para expressar as moléculas identificadas pelos métodos da invenção. Esses sistemas hospedeiro-expressão representam veículos pelos quais as sequências codificadoras das moléculas da invenção podem ser produzidas e subsequentemente purificadas, mas também representam células que, quando transformadas ou transfectadas com as sequências codificadoras de nucleotídeos apropriadas, podem expressar as moléculas da invenção in situ. Estes incluem mas não se limitam a microrganismos como bactérias que não são susceptíveis à proteína bacteriofágica, ou respectivo fragmento, da invenção (por exemplo, E. coli e B. subtilis) transformados com vetores de expressão recombinante de DNA bacteriofágico, DNA plasmídico ou DNA cosmídico contendo sequências codificadoras para as moléculas identificadas pelos métodos da invenção; leveduras (por exemplo, Saccharomyces Pichia) transformadas com vetores de expressão recombinante de leveduras contendo sequências codificadoras das moléculas identificadas pelos métodos da invenção; sistemas de células de insetos infectados com vetores de expressão recombinante de vírus (por exemplo, baculovírus) contendo sequências codificadoras das moléculas identificadas pelos métodos da invenção; sistemas de células de plantas infectados com vetores de expressão recombinante de vírus (por exemplo, vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) e vírus do mosaico do tabaco (TMV)) ou transformados com vetores de expressão recombinante plasmídicos (por exemplo, plasmídeo Ti) contendo sequências codificadoras das moléculas identificadas pelos métodos da invenção, ou sistemas de células de mamíferos (por exemplo, células COS, CHO, BHK, 293, 293T, 3T3, células linfóticas (ver U.S. 5,807,715), células Per C.6 (células retinianas humanas desenvolvidas pela Crucell) que albergam construções de expressão recombinante contendo promotores derivados do genoma de células de mamífero (por exemplo, o promotor da metalotioneína) ou de vírus de mamíferos (por exemplo, o promotor tardio de adenovírus; o promotor 7.5K do vírus vacínia).
[0132] Em sistemas bacterianos não susceptíveis à proteína bacteriofágica, ou fragmento, da invenção, alguns vetores de expressão podem ser vantajosamente selecionados dependendo da utilização pretendida para a molécula a ser expressa. Por exemplo, quando se pretender produzir uma grande quantidade dessa proteína para gerar composições farmacêuticas de um polipeptídeo, poderão ser desejáveis vetores que dirigem a expressão de níveis elevados de produtos protéicos de fusão facilmente purificáveis. Esses vetores incluem mas não se limitam ao vetor de expressão de E. coli pUR278 (Ruther et al. , 1983, EMBO J. 2: 1791), no qual a sequência protéica pode ser ligada individualmente no vetor na estrutura com a região codificadora lac Z, de modo a ser produzida uma proteína de fusão; vetores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24: 5503-5509), e afins. Os vetores pGEX também podem ser utilizados para expressar polipeptídeos estranhos na forma de proteínas de fusão com glutationa S-transferase (GST). Em geral, essas proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas de células submetidas a lise por adsorção e ligação a uma matriz de esférulas de glutationa-agarose, seguido de eluição na presença de glutationa livre. Os vetores pGEX são concebidos de modo a incluírem sítios de clivagem por proteases de trombina ou fator Xa de modo que o produto genético alvo clonado possa ser libertado da fração de GST.
[0133] Num sistema de inseto, o vírus da poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) é utilizado como vetor para expressar genes estranhos. O vírus cresce em células de Spodoptera frugiperda. A sequência codificadora do polipeptídio pode ser clonada individualmente em regiões não essenciais (por exemplo, o gene da poliedrina) do vírus e colocada sob o controlo de um promotor do AcNPV (por exemplo, o promotor da poliedrina).
[0134] Depois de uma molécula da invenção (isto é, polipeptídios) ter sido expressa de modo recombinante, pode ser purificada por qualquer método conhecido na área para a purificação de polipeptídios, por exemplo, por cromatografia (por exemplo, cromatografia em coluna de permuta iônica, afinidade e dimensionamento), centrifugação, solubilidade diferencial, ou por qualquer outra técnica comum para a purificação de polipeptídios ou anticorpos.
[0135] Certas modificações e aperfeiçoamentos ocorrerão aos profissionais ao lerem a descrição anterior. Deve entender-se que todas essas modificações e aperfeiçoamentos foram deletados aqui para fins de concisão e facilidade de leitura, mas pertencem apropriadamente ao âmbito das reivindicações seguintes.
7. EXEMPLOS
[0136] Deve entender-se que os exemplos e formas de realização seguintes descritos aqui se destinam apenas a fins ilustrativos, e que várias modificações ou alterações à sua luz serão sugeridas aos profissionais, e pretende-se que estejam incluídas no espírito e alcance deste requerimento e no âmbito das reivindicações adjuntas. Todas as publicações, patentes e requerimentos de patentes citados aqui são incorporados aqui por referência na sua totalidade para todas as finalidades.
[0137] A menos que indicado em contrário, os bacteriófagos da invenção foram isolados, processados e analisados de acordo com os métodos seguintes.
7.1 MÉTODOS 7.1.1 PURIFICAÇÃO DE FAGOS
[0138] Lotes de preparações de bacteriófagos isolados de amostras clínicas foram preparados de acordo com protocolos descritos em Carlson, “Working with bacteriophages: common techniques and methodological approaches,” Em Kutter e Sulakvelidze (Editores) “Bacteriophages: Biology and Applications”, 5a edição CRC Press (2005) (“Carlson,” incorporado aqui por referência na sua totalidade).
[0139] Os lotes de preparações de bacteriófagos foram concentrados por precipitação com PEG de acordo com o protocolo descrito por Carlson e Yamamoto et al., 2004, PNAS 101: 6415-6420. Em resumo, o lote de preparação foi incubado em NaCl 1 M durante uma hora a 4°C com agitação. Em seguida, adicionou-se gradualmente PEG 8000 (AppliChem, Cheshire, MA) para uma concentração final de 10% (p/v). A composição foi então incubada durante a noite a 4°C. Após o período de incubação, a composição foi centrifugada a 10000 x g durante 30 minutos a 4°C. Nessa altura, o sedimento foi novamente suspenso em tampão SM (Tris-HCl 0,05 M a pH 7,4, NaCl 0,1 M, MgSO4 10 mM) com gelatina a 1% p/v e foi novamente centrifugado a 1000 rpm a 4°C durante 10 minutos. O sobrenadante que continha o fago suspenso foi guardado para purificação suplementar. O sobrenadante foi purificado utilizando um gradiente de CsCl de acordo com os métodos em Carlson.
[0140] O CsCl foi removido do lote fágico purificado e concentrado por diálise. Preparou-se uma membrana de diálise, Membrana Tubular de Celulose Regenerada de Alta Qualidade Cellu.Sep H1 (Cellu.Sep, River Street, E.U.A.), de acordo com as instruções do fabricante. A diálise consistiu numa primeira incubação de 30 minutos em Tris-HCl 100 mM e NaCl 3 M (pH 7,4) a 4°C. Seguiu-se uma segunda incubação de 30 minutos em Tris-HCl 100 mM e NaCl 0,3 M (pH 7,4) a 4°C. Após a diálise, o fago suspenso foi removido do interior do saco de diálise e foi armazenado a 4°C.
7.1.2 EXTRACÇÃO DE DNA FÁGICO
[0141] A 5 mL das amostras bacteriofágicas purificadas e concentradas adicionaram-se EDTA 20 mM a pH 8,0, SDS a 0,5% (p/v) e Proteinase K a uma concentração final de 40 μg/mL. A mistura foi incubada a 56°C durante uma hora. Realizaram-se extrações sucessivas em fenol:clorofórmio:álcool nas proporções 25:24:1 até a interface entre as fases aquosa e orgânica estar límpida. Seguidamente, a fase aquosa foi tratada com um volume igual de clorofórmio e foi centrifugada a 13 0000 x g durante 10 minutos a 4°C. A fase aquosa foi novamente removida e o DNA foi precipitado por adição de dois volumes de etanol absoluto e foi incubado durante trinta minutos a 20°C. Depois as amostras foram centrifugadas a 11 000 x g durante 30 minutos a 4°C. O grânulo foi lavado com etanol a 70% à temperatura ambiente e foi novamente suspenso em 50 μL de água ultrapura (Gibco, Califórnia). Determinou-se a concentração de DNA medindo a absorvância a 260 nm num Espectrofotômetro ND- 1000. Analisou-se a integridade do DNA fágico isolado por eletroforese num gel de agarose 1%.
7.1.3 ANÁLISE DE GENOMAS BACTERIOFÁGICOS
[0142] A sequenciação dos genomas bacteriofágicos permitiu identificar nos genomas fases de leitura aberta (ORFs) potenciais. As ORFs putativas dos bacteriófagos foram utilizadas para pesquisar a base de dados da coleção de nucleotídeos do NCBI quanto a sequências de DNA homólogas utilizando o programa BLASTN (ver, por exemplo, Zhang et al., 2000, J. Comput. Biol. 7: 203-214).
7.2 EXEMPLO 1: Bacteriófago F168/08
[0143] A comparação das ORFs putativas do genoma do bacteriófago F168/08 com as sequências da base de dados de nucleotídeos do NCBI revelou que apenas pequenas porções do genoma (< 1%) exibiram homologia com sequências conhecidas. As ORFs do F168/08, as suas sequências de aminoácidos codificadas e proteínas homólogas conhecidas estão apresentadas na FIG. 2. A previsão das orfs foi feita integrando os resultados obtidos com os programas GeneMark.hmm e MetaGeneAnnotator (Besemer, J. e Borodovsky, M. 1999. Nucleic Acids Res., 27: 3911-3920; Noguchi, H. et al., 2008. DNA Res., 15: 387-396). As pesquisas de homologia de proteínas foram efetuadas com o programa BLASTP (Alschul, S.F. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 3389-33402) utilizando a base de dados de sequências protéicas não redundantes do NCBI. Os domínios protéicos conservados foram previstos utilizando BLAST especializado do NCBI (Marchler- Bauer, A. et al., 2007. Nucleic Acids Res. 35: 237-240). As orfs cujos produtos apresentaram homologia com a(s) mesma(s) proteína(s) estão indicadas com o mesmo número mais uma letra em minúsculas na FIG. 2. A identificação de genes putativos de RNA de transferência (tRNA) foi efetuada utilizando o programa tRNAscan-SE (Lowe, T.M. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 955-964).
[0144] As FIGS. 3A-B apresentam os resultados de testes de manchas que avaliaram a atividade do bacteriófago F168/08 contra 105 estirpes de Enterococcus faecalis (A) e 56 estirpes de Enterococcus faecium (B) isoladas de amostras clínicas. Cada mancha consistiu em 5 μL de suspensão do bacteriófago com os títulos indicados, preparada de um lisato purificado com CsCl. A sensibilidade ao fago está representada numa escala que varia desde halos de lise turvos (+) até límpidos (++++). A resistência a infecção pelo fago está indicada como (-).
7.3 EXEMPLO 2: Bacteriófago F170/08
[0145] A comparação das ORFs putativas do genoma do bacteriófago F170/08 com as sequências da base de dados de nucleotídeos do NCBI revelou que cerca de 94% do seu genoma era altamente semelhante ao do fago de Enterococcus ΦEF24C, com identidades de ORFs individuais variando desde 80 até 100%. As ORFs do F170/08, as suas sequências de aminoácidos codificadas e proteínas homólogas conhecidas estão apresentadas na FIG. 5. A previsão das orfs foi feita integrando os resultados obtidos com os programas GeneMark.hmm e MetaGeneAnnotator (Besemer, J. e Borodovsky, M. 1999. Nucleic Acids Res., 27 : 3911-3920; Noguchi, H. et al., 2008. DNA Res., 15: 387-396). As pesquisas de homologia de proteínas foram efetuadas com o programa BLASTP (Alschul, S.F. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 3389-33402) utilizando a base de dados de sequências protéicas não redundantes do NCBI. Os domínios protéicos conservados foram previstos utilizando BLAST especializado do NCBI (Marchler- Bauer, A. et al., 2007. Nucleic Acids Res. 35: 237-240). As orfs cujos produtos apresentaram homologia com a(s) mesma(s) proteína(s) estão indicadas com o mesmo número mais uma letra em minúsculas na FIG. 5. A identificação de genes putativos de RNA de transferência (tRNA) foi efetuada utilizando o programa tRNAscan-SE (Lowe, T.M. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 955-964).
[0146] As FIGS. 6A-B apresentam os resultados de testes de manchas que avaliaram a atividade do bacteriófago F170/08 contra 105 estirpes de Enterococcus faecalis (A) e 56 estirpes de Enterococcus faecium (B) isoladas de amostras clínicas. Cada mancha consistiu em 5 μL de suspensão do bacteriófago com os títulos indicados, preparada de um lisato purificado com CsCl. A sensibilidade ao fago está representada numa escala que varia desde halos de lise turvos (+) até límpidos (++++). A resistência a infecção pelo fago está indicada como (-).
7.4 EXEMPLO 3: Bacteriófago F770/05
[0147] A comparação das ORFs putativas do genoma do bacteriófago F770/05 com as sequências da base de dados de nucleotídeos do NCBI revelou que apenas pequenas porções do genoma (< 1%) exibiram homologia com sequências conhecidas. As ORFs do F170/05, as suas sequências de aminoácidos codificadas e proteínas homólogas conhecidas estão apresentadas na FIG. 8. A previsão das orfs foi feita integrando os resultados obtidos com os programas GeneMark.hmm e MetaGeneAnnotator (Besemer, J. e Borodovsky, M. 1999. Nucleic Acids Res., 27 : 3911-3920; Noguchi, H. et al., 2008. DNA Res., 15: 387-396). As pesquisas de homologia de proteínas foram efetuadas com o programa BLASTP (Alschul, S.F. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 3389-33402) utilizando a base de dados de sequências protéicas não redundantes do NCBI. Os domínios protéicos conservados foram previstos utilizando BLAST especializado do NCBI (Marchler- Bauer, A. et al., 2007. Nucleic Acids Res. 35: 237-240).
[0148] A FIG. 9 apresenta os resultados de testes de manchas que avaliaram a atividade do bacteriófago F170/05 contra 100 estirpes de Pseudomonas aeruginosa isoladas de amostras clínicas. Cada mancha consistiu em 5 μL de suspensão do bacteriófago com os títulos indicados, preparada de um lisato purificado com CsCl. A sensibilidade ao fago está representada numa escala que varia desde halos de lise turvos (+) até límpidos (++++). A resistência a infecção pelo fago está indicada como (-).
7.5 EXEMPLO 4: Bacteriófago 197/08
[0149] A comparação das ORFs putativas do genoma do bacteriófago F197/08 com as sequências da base de dados de nucleotídeos do NCBI revelou que o genoma era altamente homólogo a múltiplos genomas fágicos de estafilococos. Em particular, cerca de 90% do genoma do F197/08 é altamente semelhante ao do bacteriófago de Staphylococcus phiSauS- IPLA35, com identidades de ORFs individuais variando desde 80 até 98%. As ORFs do F197/08, as suas sequências de aminoácidos codificadas e proteínas homólogas conhecidas estão apresentadas na FIG. 11. A previsão das orfs foi feita integrando os resultados obtidos com os programas GeneMark.hmm e MetaGeneAnnotator (Besemer, J. e Borodovsky, M. 1999. Nucleic Acids Res., 27 : 3911-3920; Noguchi, H. et al., 2008. DNA Res., 15: 387-396). As pesquisas de homologia de proteínas foram efetuadas com o programa BLASTP (Alschul, S.F. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 3389-33402) utilizando a base de dados de sequências protéicas não redundantes do NCBI. Os domínios protéicos conservados foram previstos utilizando BLAST especializado do NCBI (Marchler- Bauer, A. et al., 2007. Nucleic Acids Res. 35: 237-240). As orfs cujos produtos apresentaram homologia com a(s) mesma(s) proteína(s) está/estão indicadas com o mesmo número mais uma letra em minúsculas na FIG. 11.
[0150] A FIG. 12 apresenta os resultados de testes de manchas que avaliaram a atividade do bacteriófago F197/08 contra 100 estirpes de Staphylococcus aureus isoladas de amostras clínicas. Cada mancha consistiu em 5 μL de suspensão do bacteriófago com os títulos indicados, preparada de um lisato purificado com CsCl. A sensibilidade ao fago está representada numa escala que varia desde halos de lise turvos (+) até límpidos (++++). A resistência a infecção pelo fago está indicada como (-).
7.6 EXEMPLO 5: Bacteriófago F86/06
[0151] A comparação das ORFs putativas do genoma do bacteriófago F86/06 com as sequências da base de dados de nucleotídeos do NCBI revelou que o genoma era altamente homólogo a múltiplos genomas fágicos de estafilococos. Em particular, cerca de 80% do genoma do F86/06 é altamente semelhante ao do bacteriófago de Staphylococcus tp310-1, com identidades de ORFs individuais variando desde 85 até 100%. As ORFs do F86/06, as suas sequências de aminoácidos codificadas e proteínas homólogas conhecidas estão apresentadas na FIG. 14. A previsão das orfs foi feita integrando os resultados obtidos com os programas GeneMark.hmm e MetaGeneAnnotator (Besemer, J. e Borodovsky, M. 1999. Nucleic Acids Res., 27 : 3911-3920; Noguchi, H. et al., 2008. DNA Res., 15: 387-396). As pesquisas de homologia de proteínas foram efetuadas com o programa BLASTP (Alschul, S.F. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 3389-33402) utilizando a base de dados de sequências protéicas não redundantes do NCBI. Os domínios protéicos conservados foram previstos utilizando BLAST especializado do NCBI (Marchler- Bauer, A. et al., 2007. Nucleic Acids Res. 35: 237-240).
[0152] A FIG. 15 apresenta os resultados de testes de manchas que avaliaram a atividade do bacteriófago F86/06 contra 100 estirpes de Staphylococcus aureus isoladas de amostras clínicas. Cada mancha consistiu em 5 μL de suspensão do bacteriófago com os títulos indicados, preparada de um lisato purificado com CsCl. A sensibilidade ao fago está representada numa escala que varia desde halos de lise turvos (+) até límpidos (++++). A resistência a infecção pelo fago está indicada como (-).
7.7 EXEMPLO 6: Bacteriófago F87s/06
[0153] A comparação das ORFs putativas do genoma do bacteriófago F87s/06 com as sequências da base de dados de nucleotídeos do NCBI revelou que o genoma era altamente homólogo a múltiplos genomas fágicos de estafilococos. Em particular, cerca de 82% do genoma do F87s/06 é altamente semelhante ao do bacteriófago de Staphylococcus ΦNM3, com identidades de ORFs individuais variando desde 90 até 100%. As ORFs do F86/06, as suas sequências de aminoácidos codificadas e proteínas homólogas conhecidas estão apresentadas na FIG. 17. A previsão das orfs foi feita integrando os resultados obtidos com os programas GeneMark.hmm e MetaGeneAnnotator (Besemer, J. e Borodovsky, M. 1999. Nucleic Acids Res., 27: 3911-3920; Noguchi, H. et al., 2008. DNA Res., 15: 387-396). As pesquisas de homologia de proteínas foram efetuadas com o programa BLASTP (Alschul, S.F. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 3389-33402) utilizando a base de dados de sequências protéicas não redundantes do NCBI. Os domínios protéicos conservados foram previstos utilizando BLAST especializado do NCBI (Marchler- Bauer, A. et al., 2007. Nucleic Acids Res. 35: 237-240). As orfs cujos produtos apresentaram homologia com a(s) mesma(s) proteína(s) está/estão indicadas com o mesmo número mais uma letra em minúsculas na FIG. 17.
[0154] A FIG. 18 apresenta os resultados de testes de manchas que avaliaram a atividade do bacteriófago F87s/06 contra 100 estirpes de Staphylococcus aureus isoladas de amostras clínicas. Cada mancha consistiu em 5 μL de suspensão do bacteriófago com os títulos indicados, preparada de um lisato purificado com CsCl. A sensibilidade ao fago está representada numa escala que varia desde halos de lise turvos (+) até límpidos (++++). A resistência a infecção pelo fago está indicada como (-).
7.8 : EXEMPLO 7: Bacteriófago F91a/06
[0155] A comparação das ORFs putativas do genoma do bacteriófago F91a/06 com as sequências da base de dados de nucleotídeos do NCBI revelou que o genoma era altamente homólogo a múltiplos genomas fágicos de estafilococos. Em particular, cerca de 82% do genoma do F91a/06 é altamente semelhante ao do bacteriófago de Staphylococcus ΦNM3, com identidades de ORFs individuais variando desde 86 até 99%. As ORFs do F91a/06, as suas sequências de aminoácidos codificadas e proteínas homólogas conhecidas estão apresentadas na FIG. 20. A previsão das orfs foi feita integrando os resultados obtidos com os programas GeneMark.hmm e MetaGeneAnnotator (Besemer, J. e Borodovsky, M. 1999. Nucleic Acids Res., 27: 3911-3920; Noguchi, H. et al., 2008. DNA Res., 15: 387-396). As pesquisas de homologia de proteínas foram efetuadas com o programa BLASTP (Alschul, S.F. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 3389-33402) utilizando a base de dados de sequências protéicas não redundantes do NCBI. Os domínios protéicos conservados foram previstos utilizando BLAST especializado do NCBI (Marchler- Bauer, A. et al., 2007. Nucleic Acids Res. 35: 237-240). As orfs cujos produtos apresentaram homologia com a(s) mesma(s) proteína(s) está/estão indicadas com o mesmo número mais uma letra em minúsculas na FIG. 20.
[0156] A FIG. 21 apresenta os resultados de testes de manchas que avaliaram a atividade do bacteriófago F91a/06 contra 100 estirpes de Staphylococcus aureus isoladas de amostras clínicas. Cada mancha consistiu em 5 μL de suspensão do bacteriófago com os títulos indicados, preparada de um lisato purificado com CsCl. A sensibilidade ao fago está representada numa escala que varia desde halos de lise turvos (+) até límpidos (++++). A resistência a infecção pelo fago está indicada como (-).
7.9 EXEMPLO 8: Bacteriófago F1245/05
[0157] As ORFs do F1245/05, as suas sequências de aminoácidos codificadas e proteínas homólogas conhecidas estão apresentadas nas FIGS. 23A-I. A previsão das orfs foi feita integrando os resultados obtidos com os programas GeneMark.hmm e MetaGeneAnnotator (Besemer, J. e Borodovsky, M. 1999. Nucleic Acids Res., 27 : 3911-3920; Noguchi, H. et al., 2008. DNA Res., 15: 387-396). As pesquisas de homologia de proteínas foram efetuadas com o programa BLASTP (Alschul, S.F. et al., 1997. Nucleic Acids Res., 25: 3389-33402) utilizando a base de dados de sequências protéicas não redundantes do NCBI. Os domínios protéicos conservados foram previstos utilizando BLAST especializado do NCBI (Marchler- Bauer, A. et al., 2007. Nucleic Acids Res. 35: 237-240). A função protéica foi prevista com base na localização no genoma do gene correspondente e na presença de domínios transmembranares putativos do produto codificado (servidor TMHMM versão 2.0; Krogh, A. et al., 2001. J. Mol. Biol., 305: 567-580).
[0158] As FIGS. 24 A-E apresentam os resultados de testes de manchas que avaliaram a atividade do bacteriófago F1245/05 contra 100 estirpes de Acinetobacter baumannii isoladas de amostras clínicas. Cada mancha consistiu em 5 μL de suspensão do bacteriófago com os títulos indicados, preparada de um lisato purificado com CsCl. A sensibilidade ao fago está representada numa escala que varia desde halos de lise turvos (+) até límpidos (++++). A resistência a infecção pelo fago está indicada como (-).

Claims (19)

1. Bacteriófago com um genoma caracterizado pelo fato de que compreende uma identidade de sequência de 99% com a sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 3, e atividade antibacteriana contra uma ou mais estirpes de Pseudomonas aeruginosa.
2. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o bacteriófago conforme definido na reivindicação 1 e um transportador farmaceuticamente aceitável.
3. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que compreende o bacteriófago com o genoma que compreende a sequência de ácido nucleico da ID SEQ NO: 3.
4. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que compreende ainda pelo menos um bacteriófago adicional eficaz contra Pseudomonas aeruginosa.
5. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma infecção bacteriana num sujeito necessitado por administração ao mesmo, em que a referida infecção bacteriana é uma infecção causada por Pseudomonas aeruginosa.
6. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a infecção é uma infecção nosocomial.
7. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é administrada topicamente.
8. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de o sujeito é um mamífero, preferencialmente um humano.
9. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de a infecção é uma infecção da pele, preferencialmente uma infeccção associada a uma queimadura ou a uma úlcera diabética dos pés.
10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é administrada topicamente.
11. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a infecção é uma infecção dos pulmões.
12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é administrada por inalação, preferencialmente em que a referida admninistração é por bomba, pulverizador ou nebulizador; e/ou prerencialmente em que a composição farmacêutica para ser administrada por inalação compreende um inalador de pó seco ou um pulverizador de aerossol.
13. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a infecção é uma infecção do trato urinário ou dos rins.
14. Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é administrada topicamente.
15. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a referida composição farmacêutica compreende adicionalmente pelo menos um de: (i) um antibiotico contra Pseudomonas aeruginosa; e (ii) um bacteriófago adicional conhecido por ter atividade antibacteriana contra Pseudomonas aeruginosa.
16. Método de diagnóstico do agente causador de uma infecção bacteriana, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) cultivar uma amostra de tecido de um paciente; (ii) contatar a cultura da etapa (i) com o bacteriófago de acordo com a reivindicação 1; (iii) monitorizar quanto a evidências de crescimento ou lise da cultura em que evidências de lise da cultura indicam que a cultura compreende uma espécie ou estirpe de Pseudomonas aeruginosa que se sabe ser suscetível ao bacteriófago ou polipeptídio utilizado na etapa (ii).
17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a referida amostra de tecido é uma amostra de sangue, urina, expectoração, fluido, biopsia de tecido, ou esfregaço recolhida do referido paciente.
18. Uso do bacteriófago, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para reduzir ou inibir a colonização ou crescimento de bactérias numa superfície contatada com aquele.
19. Uso, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a referida superfície é a pele ou uma membrana mucosa de um mamífero, a pele ou uma membrana mucosa de um humano, a superfície de um aparato hospitalar ou uma peça de equipamento hospitalar, ou a superfície de um aparato cirúrgico ou peça de equipamento cirúrgico.
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