CN105456300A - 抗菌噬菌体、噬菌体肽及其使用方法 - Google Patents

抗菌噬菌体、噬菌体肽及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于治疗和控制细菌感染的噬菌体治疗的领域。具体地，本发明涉及新的噬菌体F1245/05,F168/08,F170/08,F770/05,F197/08,F86/06,F87s/06和F91a/06，它们的分离的多肽，包含一种或多种所述新的噬菌体和/或分离的多肽的组合物，以及用于治疗和预防细菌感染的方法，所述方法是单独的或与其它抗菌治疗(例如抗生素或其它噬菌体治疗)相组合。

Description

抗菌噬菌体、噬菌体肽及其使用方法
本申请是申请日为2010年2月5日、申请号为201080011689.8、发明名称为“抗菌噬菌体、噬菌体肽及其使用方法”的发明专利申请的分案申请。
1.相关申请
本国际申请要求申请日为2009年2月6日、名称为"AntibacterialPhageandUsesThereof"的美国临时申请系列号61/150,585以及申请日为2009年6月18日、名称为"AntibacterialPhage,PhagePeptidesandMethodsofUseThereof"的美国临时申请系列号61/218,345的优先权。在允许的情况下，这些临时申请的主题和内容包括序列表通过引用方式全文并入本文。
2.技术领域
本申请涉及用于治疗和控制细菌感染的噬菌体治疗的领域。具体地，本发明涉及新的噬菌体F1245/05,F168/08,F170/08,F770/05,F197/08,F86/06,F87s/06和F91a/06，它们的分离的多肽，包含一种或多种所述新的噬菌体和/或分离的多肽的组合物，以及用于治疗和预防由下列引起的细菌感染的方法：鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、屎肠球菌(E.faecium)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和/或金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，所述方法是单独的或与其它抗菌治疗(例如抗生素或其它噬菌体治疗)相组合。
3.背景技术
噬菌体(噬菌体(Phage))是特异性感染并裂解细菌的病毒。噬菌体治疗是由Felixd’Herelle在二十世纪二十年代提出的使用完整的噬菌体病毒来治疗细菌感染性疾病的方法。最初，对噬菌体治疗进行了广泛的探究，并进行了大量的研究来评估噬菌体治疗对于治疗人类和动物中的细菌感染的潜在可能。早期的成功推动了多种商业上的噬菌体制备物的开发。例如，在1940年，EliLillyCompany生产了7种用于人类的噬菌体产品，包括用于治疗由葡萄球菌属(Staphylococcussp.)、大肠杆菌(E.coli)和其它致病细菌引起的不同疾病的噬菌体制备物。这些制备物被用于治疗引起脓肿、脓性创伤、阴道炎、急性慢性上呼吸道感染和乳突状感染的感染。
然而，随着二十世纪四十年代抗生素的发展，西方世界中对于基于噬菌体的治疗的兴趣下降了。导致这种下降的最重要的因素之一是缺乏标准化的测试程序和生产方法。由于未能建立用来测试噬菌体治疗的工业广泛标准，所以干扰了研究结果的文件记录，导致感觉缺乏功效以及关于噬菌体治疗的价值的可靠性的问题。此外，关于生产噬菌体样品/样本的问题使最初的研究和探究复杂化。最初，在尝试增加噬菌体治疗剂的存活性中，使用了各种稳定剂和防腐剂。但是，由于对噬菌体和各种稳定剂的生物学知之甚少，故在尝试延长噬菌体制备物的存活性时添加的很多成分被证明是对人类有毒的，或者是对长期保存具有不利影响。与噬菌体生产相关的另一个问题是这些病毒的商业制备物的纯度等级。那时候，噬菌体治疗制备物一般由经目标噬菌体处理的宿主细菌的粗裂解物组成。因此，很多制备物含有现在被认为是不希望的细菌成分的物质，例如内毒素。因此，所述制备物经常伴有副作用，尤其是在通过静脉内方式接受这些制备物的患者中。然而，在东欧和前苏联，对抗生素的获得是有限的，在那里，噬菌体治疗的开发和使用与抗生素持续并行，或取代抗生素。
然而，随着细菌的抗生素抗性株的出现，西方世界恢复了对于基于噬菌体的治疗的兴趣。虽然可能开发新类别的抗生素，但是，“细菌终将对新药物产生抗性”的展望已加强了对用于控制、预防和治疗细菌感染的非化疗方法的探寻。对于在临床环境中使用噬菌体治疗有3种主要的基于噬菌体的策略：1)施用有毒力的噬菌体；2)使用由噬菌体编码的内溶素或纯化的溶素；3)使用所鉴定的噬菌体的结构蛋白作为用于合成细菌肽多糖的关键性酶类的代谢抑制剂。
因此，需要开发新的噬菌体和噬菌体产品作为潜在治疗剂和预防剂，用于在体内清除致病细菌。具体地，需要能够裂解医院的细菌(包括鲍氏不动杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌)的噬菌体。由于目前所研究的大部分噬菌体和噬菌体肽显示出通常局限于它们所分离自的细菌的相关种或亚种的活性，所以新的基于噬菌体的治疗在医院环境中可具有特别的应用，选择性靶向医院病原体而不影响正常的周围菌群。
4.发明概述
本发明涉及用于治疗、预防或管理与由革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌引起的感染相关的病况的分离的噬菌体和噬菌体来源的分离的抗菌多肽。具体地，本发明的分离的噬菌体或多肽可被用在用于治疗、预防或管理由医院病原体引起的感染的药物组合物中，所述病原体为例如革兰氏阳性细菌，包括但不限于：粪肠球菌、屎肠球菌、希氏肠球菌(E.hirae)、鸟肠球菌(E.avium)、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、耳葡萄球菌(S.auricularis)、头葡萄球菌(S.capitis)、溶血性葡萄球菌(S.haemolyticus)、人葡萄球菌(S.hominis)、腐生性葡萄球菌(S.saprophyticus)、模仿葡萄球菌(S.simulans)和木糖葡萄球菌(S.xylosis)；和/或革兰氏阴性细菌，包括但不限于鲍氏不动杆菌和铜绿假单胞菌。在一些实施方式中，本发明的药物组合物用于治疗与由细菌的抗生素抗性株(例如金黄色葡萄球菌的甲氧西林抗性株(MRSA))引起的感染相关的病况。在具体的实施方式中，本发明的分离的噬菌体或多肽用于表面治疗有此需要的受试者中由医院病原体引起的感染。在其它实施方式中，本发明的分离的噬菌体或多肽用于诊断源自患者的样品(例如组织、血液、尿、痰样品)中的感染性试剂。在其它实施方式中，本发明的分离的噬菌体或多肽被用作用于制备固体表面(包括皮肤或其它表皮表面)的预防性消毒剂或抗感染剂。
在一些实施方式中，本发明提供了具有分别包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的核酸序列的基因组并显示出针对粪肠球菌和/或屎肠球菌的一种或多种菌株的抗菌活性的分离的噬菌体F168/08或F170/08。在其它实施方式中，本发明提供了具有包含SEQIDNO:3的核酸序列的基因组并显示出针对铜绿假单胞菌的一种或多种菌株的抗菌活性的分离的噬菌体F770/05。在其它实施方式中，本发明提供了具有分别包含SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6或SEQIDNO:7的核酸序列的基因组并显示出针对金黄色葡萄球菌的一种或多种菌株的抗菌活性的分离的噬菌体F197/08,F86/06,F87s/06或F91a/06。在其它实施方式中，本发明提供了具有包含SEQIDNO:760的核酸序列的基因组并显示出针对鲍氏不动杆菌的一种或多种菌株的抗菌活性的分离的噬菌体F1245/05。
本发明还包括经本发明的一种或多种噬菌体感染的分离的细菌。在具体的实施方式中，本发明提供了经噬菌体感染的分离的粪肠球菌，所述噬菌体具有包含SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:2的核酸序列的基因组或由SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:2的核酸序列组成的基因组。在其它实施方式中，本发明提供了经噬菌体感染的分离的屎肠球菌，所述噬菌体具有包含SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:2的核酸序列的基因组或由SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:2的核酸序列组成的基因组。在其它实施方式中，本发明提供了经噬菌体感染的分离的铜绿假单胞菌，所述噬菌体具有包含SEQIDNO:3的核酸序列的基因组或由SEQIDNO:3的核酸序列组成的基因组。在其它实施方式中，本发明提供了经一种或多种噬菌体感染的分离的金黄色葡萄球菌，所述一种或多种噬菌体具有包含SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6和/或SEQIDNO:7的核酸序列的基因组或由SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6和/或SEQIDNO:7的核酸序列组成的基因组。在其它实施方式中，本发明提供了经噬菌体感染的分离的鲍氏不动杆菌，所述噬菌体具有包含SEQIDNO:760的核酸序列的基因组或由SEQIDNO:760的核酸序列组成的基因组。
本发明包括分离自噬菌体F1245/05,F168/08,F170/08,F770/05,F197/08,F86/06,F87s/06和/或F91a/06的多肽，所述多肽显示出针对革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌(例如鲍氏不动杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌)的一个或多个种或菌株的抗菌活性。在具体的实施方式中，本发明的分离自或源自F168/08或F/170/08的多肽显示出至少针对粪肠球菌和/或屎肠球菌的抗菌或抗微生物活性(例如溶解杀灭活性)；分离自或源自F770/05的那些至少针对铜绿假单胞菌；分离自或源自F197/08,F86/06,F87s/06或F91a/06的那些至少针对金黄色葡萄球菌；分离自或源自F1245/05的那些至少针对鲍氏不动杆菌。
在一些实施方式中，本发明的多肽包含分离的内溶素或其片段(例如CHAP结构域)或由分离的内溶素或其片段组成，所述分离的内溶素或其片段显示出针对细菌(例如革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌，例如鲍氏不动杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌)的一个或多个种或菌株的抗菌活性。在具体的实施方式中，本发明的多肽是分离的溶素蛋白，例如内溶素或尾部溶素，其包含SEQIDNO:68,SEQIDNO:184,SEQIDNO:202,SEQIDNO:203,SEQIDNO:446,SEQIDNO:447,SEQIDNO:448,SEQIDNO:575,SEQIDNO:641或SEQIDNO:712的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。在其它实施方式中，本发明提供了包含选自SEQIDNO:761至SEQIDNO:816的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的多肽。
在其它实施方式中，本发明的多肽包含SEQIDNO:68,SEQIDNO:184,SEQIDNO:202,SEQIDNO:203,SEQIDNO:446,SEQIDNO:447,SEQIDNO:448,SEQIDNO:575,SEQIDNO:641或SEQIDNO:712的片段、变体或衍生物，其中所述片段、变体或衍生物具有针对粪肠球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌的一个或多个菌株的抗菌活性或抗微生物活性(例如溶解杀灭活性)。在根据该实施方式的具体实例中，SEQIDNO:68,SEQIDNO:184,SEQIDNO:202和/或SEQIDNO:203的氨基酸序列的变体、片段或衍生物显示出针对屎肠球菌和/或粪肠球菌的一个或多个菌株的抗细菌或抗微生物活性(例如溶解杀灭活性)。在根据该实施方式的其它实例中，SEQIDNO:446,SEQIDNO:447,SEQIDNO:448,SEQIDNO:575,SEQIDNO:641和/或SEQIDNO:712的氨基酸序列的变体、片段或衍生物显示出针对金黄色葡萄球菌的一个或多个菌株的抗细菌或抗微生物活性(例如溶解杀灭活性)。
在具体的实施方式中，本发明的分离的多肽包含SEQIDNO:68,SEQIDNO:446,SEQIDNO:575,SEQIDNO:641或SEQIDNO:712的CHAP结构域或由所述CHAP结构域组成。在一些实施方式中，分离的多肽包含SEQIDNO:68,SEQIDNO:446,SEQIDNO:575,SEQIDNO:641或SEQIDNO:712的CHAP结构域或由所述CHAP结构域组成，例如分别具有SEQIDNO:755,SEQIDNO:756,SEQIDNO:757,SEQIDNO:758或SEQIDNO:759的氨基酸序列。在其它实施方式中，本发明的多肽包含SEQIDNO:755,SEQIDNO:756,SEQIDNO:757,SEQIDNO:758或SEQIDNO:759的片段、变体或衍生物，其中所述片段、变体或衍生物具有针对粪肠球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌的至少一个或多个菌株的抗菌活性或抗微生物活性(例如溶解杀灭活性)。在其它实施方式中，本发明的多肽包含SEQIDNO:761至SEQIDNO:816的片段、变体或衍生物，其中所述片段、变体或衍生物具有针对鲍氏不动杆菌的至少一个或多个菌株的抗菌活性或抗微生物活性(例如溶解杀灭活性)。
在其它实施方式中，本发明的多肽包含分离的尾部长度带测定蛋白或尾部蛋白(例如尾部成分、尾部纤毛蛋白、吸附相关尾部蛋白)或其片段或由所述蛋白或其片段组成，其具有与其所源自的噬菌体相关的生物学功能，例如抗微生物或抗菌活性(例如溶解杀灭活性)，所述功能针对粪肠球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和/或鲍氏不动杆菌的至少一个或多个种或菌株。在具体的实施方式中，本发明的多肽是分离的尾部长度带测定蛋白或尾部蛋白，其包含下列氨基酸序列或由其组成：SEQIDNO:61,SEQIDNO:63,SEQIDNO:204,SEQIDNO:214,SEQIDNO:435,SEQIDNO:438,SEQIDNO:440,SEQIDNO:525,SEQIDNO:526,SEQIDNO:527,SEQIDNO:528,SEQIDNO:529,SEQIDNO:530,SEQIDNO:531,SEQIDNO:532,SEQIDNO:533,SEQIDNO:534,SEQIDNO:535,SEQIDNO:536,SEQIDNO:537,SEQIDNO:538,SEQIDNO:539,SEQIDNO:567,SEQIDNO:568,SEQIDNO:632,SEQIDNO:633,SEQIDNO:700,SEQIDNO:701,SEQIDNO:702,SEQIDNO:703,SEQIDNO:704或SEQIDNO:795。在其它实施方式中，本发明的多肽包含SEQIDNO:61,SEQIDNO:63,SEQIDNO:204,SEQIDNO:214,SEQIDNO:435,SEQIDNO:438,SEQIDNO:440,SEQIDNO:525,SEQIDNO:526,SEQIDNO:527,SEQIDNO:528,SEQIDNO:529,SEQIDNO:530,SEQIDNO:531,SEQIDNO:532,SEQIDNO:533,SEQIDNO:534,SEQIDNO:535,SEQIDNO:536,SEQIDNO:537,SEQIDNO:538,SEQIDNO:539,SEQIDNO:567,SEQIDNO:568,SEQIDNO:632,SEQIDNO:633,SEQIDNO:700,SEQIDNO:701,SEQIDNO:702,SEQIDNO:703,SEQIDNO:704或SEQIDNO:795的片段、变体或衍生物，其中所述片段、变体或衍生物显示出与其所源自的噬菌体相关的生物学功能，例如抗微生物或抗菌活性(例如溶解杀灭活性)，所述功能针对粪肠球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和/或鲍氏不动杆菌的一个或多个菌株。
在一些实施方式中，本发明包括SEQIDNO:61或SEQIDNO:63的氨基酸序列的变体、片段或衍生物，所述变体、片段或衍生物显示出与具有包含SEQIDNO:1的核酸序列或由SEQIDNO:1的核酸序列组成的基因组的噬菌体相关的生物学功能，例如抗微生物或抗菌活性(例如溶解杀灭活性)，所述功能针对粪肠球菌和/或屎肠球菌的一个或多个菌株。在其它实施方式中，本发明包括SEQIDNO:204或SEQIDNO:214的氨基酸序列的变体、片段或衍生物，所述变体、片段或衍生物显示出与具有包含SEQIDNO:2的核酸序列或由SEQIDNO:2的核酸序列组成的基因组的噬菌体相关的生物学功能，例如抗微生物或抗菌活性(例如溶解杀灭活性)，所述功能针对粪肠球菌和/或屎肠球菌的一个或多个菌株。
在一些实施方式中，本发明包括SEQIDNO:435或SEQIDNO:438的氨基酸序列的变体、片段或衍生物，所述变体、片段或衍生物显示出与具有包含SEQIDNO:3的核酸序列或由SEQIDNO:3的核酸序列组成的基因组的噬菌体相关的生物学功能，例如抗微生物或抗菌活性(例如溶解杀灭活性)，所述功能针对铜绿假单胞菌的一个或多个菌株。
在一些实施方式中，本发明包括SEQIDNO:440,SEQIDNO:525,SEQIDNO:526,SEQIDNO:527,SEQIDNO:528,SEQIDNO:529,SEQIDNO:530,SEQIDNO:531,SEQIDNO:532,SEQIDNO:533,SEQIDNO:534,SEQIDNO:535,SEQIDNO:536,SEQIDNO:537,SEQIDNO:538或SEQIDNO:539的氨基酸序列的变体、片段或衍生物，所述变体、片段或衍生物显示出与具有包含SEQIDNO:4的核酸序列或由SEQIDNO:4的核酸序列组成的基因组的噬菌体相关的生物学功能，例如抗微生物或抗菌活性(例如溶解杀灭活性)，所述功能针对金黄色葡萄球菌的一个或多个菌株。在其它实施方式中，本发明包括SEQIDNO:567或SEQIDNO:568的氨基酸序列的变体、片段或衍生物，所述变体、片段或衍生物显示出与具有包含SEQIDNO:5的核酸序列或由SEQIDNO:5的核酸序列组成的基因组的噬菌体相关的生物学功能，例如抗微生物或抗菌活性(例如溶解杀灭活性)，所述功能针对金黄色葡萄球菌的一个或多个菌株。在其它实施方式中，本发明包括SEQIDNO:632或SEQIDNO:633的氨基酸序列的变体、片段或衍生物，所述变体、片段或衍生物显示出与具有包含SEQIDNO:6的核酸序列或由SEQIDNO:6的核酸序列组成的基因组的噬菌体相关的生物学功能，例如抗微生物或抗菌活性(例如溶解杀灭活性)，所述功能针对金黄色葡萄球菌的一个或多个菌株。在其它实施方式中，本发明包括SEQIDNO:700,SEQIDNO:701,SEQIDNO:702,SEQIDNO:703或SEQIDNO:704的氨基酸序列的变体、片段或衍生物，所述变体、片段或衍生物显示出与具有包含SEQIDNO:7的核酸序列或由SEQIDNO:7的核酸序列组成的基因组的噬菌体相关的生物学功能，例如抗微生物或抗菌活性(例如溶解杀灭活性)，所述功能针对金黄色葡萄球菌的一个或多个菌株。
在某些实施方式中，本发明包括SEQIDNO:761-816的氨基酸序列的变体、片段或衍生物，所述变体、片段或衍生物显示出与具有包含SEQIDNO:760的核酸序列或由SEQIDNO:760的核酸序列组成的基因组的噬菌体相关的生物学功能，例如抗微生物或抗菌活性(例如溶解杀灭活性)，所述功能针对鲍氏不动杆菌的一个或多个菌株。
在一些实施方式中，本发明提供了显示出针对细菌(例如革兰氏阳性细菌(例如粪肠球菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌)、革兰氏阴性细菌(例如鲍氏不动杆菌、铜绿假单胞菌)或未被分类为革兰氏阳性或革兰氏阴性的细菌)的一种或多种菌株的抗微生物或抗菌活性(例如溶解杀灭活性)的分离的多肽，其中所述分离的多肽具有与相同长度(即由相同数目的残基组成)的第二氨基酸序列至少60％,65％,70％,75％,80％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或更高的序列同一性的氨基酸序列，其中所述第二氨基酸序列是SEQIDNO:61,SEQIDNO:63,SEQIDNO:68,SEQIDNO:184,SEQIDNO:202,SEQIDNO:203,SEQIDNO:204,SEQIDNO:214,SEQIDNO:435,SEQIDNO:438,SEQIDNO:440,SEQIDNO:446,SEQIDNO:447,SEQIDNO:448,SEQIDNO:525,SEQIDNO:526,SEQIDNO:527,SEQIDNO:528,SEQIDNO:529,SEQIDNO:530,SEQIDNO:531,SEQIDNO:532,SEQIDNO:533,SEQIDNO:534,SEQIDNO:535,SEQIDNO:536,SEQIDNO:537,SEQIDNO:538,SEQIDNO:539,SEQIDNO:567,SEQIDNO:568,SEQIDNO:575,SEQIDNO:632,SEQIDNO:633,SEQIDNO:641,SEQIDNO:700,SEQIDNO:701,SEQIDNO:702,SEQIDNO:703,SEQIDNO:704,SEQIDNO:712,SEQIDNO:755,SEQIDNO:756,SEQIDNO:757,SEQIDNO:758,SEQIDNO:759,SEQIDNOS:761-816和/或其片段。
本发明还提供了包含SEQIDNOS:8-130,SEQIDNOS:131-343,SEQIDNOS:344-438,SEQIDNOS:439-553,SEQIDNOS:554-616,SEQIDNOS:617-681,SEQIDNOS:682-759和SEQIDNOS:761-816中任意项的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的分离的多肽。在其它实施方式中，提供了重组地融合或化学地缀合(例如共价或非共价缀合)至治疗剂(例如异源多肽或小分子)的本发明的分离的多肽。
本发明还包括编码本发明的多肽的多核苷酸。在具体的实施方式中，本发明体提供了包含编码SEQIDNOS:8-130,SEQIDNOS:131-343,SEQIDNOS:344-438,SEQIDNOS:439-553,SEQIDNOS:554-616,SEQIDNOS:617-681,SEQIDNOS:682-759和SEQIDNOS761-816中的任意项的多肽的核酸序列的分离的核酸。在其它实施方式中，本发明提供了包含编码NO:61,SEQIDNO:63,SEQIDNO:68,SEQIDNO:184,SEQIDNO:202,SEQIDNO:203,SEQIDNO:204,SEQIDNO:214,SEQIDNO:435,SEQIDNO:438,SEQIDNO:440,SEQIDNO:446,SEQIDNO:447,SEQIDNO:448,SEQIDNO:525,SEQIDNO:526,SEQIDNO:527,SEQIDNO:528,SEQIDNO:529,SEQIDNO:530,SEQIDNO:531,SEQIDNO:532,SEQIDNO:533,SEQIDNO:534,SEQIDNO:535,SEQIDNO:536,SEQIDNO:537,SEQIDNO:538,SEQIDNO:539,SEQIDNO:567,SEQIDNO:568,SEQIDNO:575,SEQIDNO:632,SEQIDNO:633,SEQIDNO:641,SEQIDNO:700,SEQIDNO:701,SEQIDNO:702,SEQIDNO:703,SEQIDNO:704,SEQIDNO:712,SEQIDNO:755,SEQIDNO:756,SEQIDNO:757,SEQIDNO:758,SEQIDNO:759,SEQIDNOS761-816中的任意项的多肽或其活性片段、变体或衍生物的核酸序列的分离的核酸，其中所述多肽或活性片段、变体或衍生物显示出与其所分离自和/或源自的噬菌体相关的生物学功能，例如抗微生物或抗菌活性(例如溶解杀灭活性)。本发明还涉及包含所述核酸的载体。在一个具体实施方式中，所述载体是表达载体。本发明还提供了含有包含编码本发明的多肽的多核苷酸的载体的宿主细胞。
本发明包括用于产生本发明的多肽或其活性片段(尤其是用于药物组合物即抗微生物组合物中)的方法。例如，本发明的多肽可以直接分离自经噬菌体F1245/05,F168/08,F170/08,F770/05,F197/08,F86/06,F87s/06或F91a/06感染的细胞培养物(例如细菌细胞培养物)。备选地，可以使用包含编码本发明的多肽例如SEQIDNO:61,SEQIDNO:63,SEQIDNO:68,SEQIDNO:184,SEQIDNO:202,SEQIDNO:203,SEQIDNO:204,SEQIDNO:214,SEQIDNO:435,SEQIDNO:438,SEQIDNO:440,SEQIDNO:446,SEQIDNO:447,SEQIDNO:448,SEQIDNO:525,SEQIDNO:526,SEQIDNO:527,SEQIDNO:528,SEQIDNO:529,SEQIDNO:530,SEQIDNO:531,SEQIDNO:532,SEQIDNO:533,SEQIDNO:534,SEQIDNO:535,SEQIDNO:536,SEQIDNO:537,SEQIDNO:538,SEQIDNO:539,SEQIDNO:567,SEQIDNO:568,SEQIDNO:575,SEQIDNO:632,SEQIDNO:633,SEQIDNO:641,SEQIDNO:700,SEQIDNO:701,SEQIDNO:702,SEQIDNO:703,SEQIDNO:704,SEQIDNO:712,SEQIDNO:755,SEQIDNO:756,SEQIDNO:757,SEQIDNO:758,SEQIDNO:759,SEQIDNOS:761-816或其活性片段、衍生物或变体的核酸序列的表达载体通过重组方式衍生本发明的多肽。可以通过本领域已知的用于产生多肽的任意方法、尤其是通过化学合成或通过重组表达技术来产生本发明的多肽或其片段。在具体的实施方式中，本发明涉及用于重组产生噬菌体蛋白例如溶素蛋白、尾部蛋白或其活性片段、变体或衍生物的方法，所述方法包括：(i)在适合于在培养基中表达所述蛋白的条件下培养含有包含编码SEQIDNO:61,SEQIDNO:63,SEQIDNO:68,SEQIDNO:184,SEQIDNO:202,SEQIDNO:203,SEQIDNO:204,SEQIDNO:214,SEQIDNO:435,SEQIDNO:438,SEQIDNO:440,SEQIDNO:446,SEQIDNO:447,SEQIDNO:448,SEQIDNO:525,SEQIDNO:526,SEQIDNO:527,SEQIDNO:528,SEQIDNO:529,SEQIDNO:530,SEQIDNO:531,SEQIDNO:532,SEQIDNO:533,SEQIDNO:534,SEQIDNO:535,SEQIDNO:536,SEQIDNO:537,SEQIDNO:538,SEQIDNO:539,SEQIDNO:567,SEQIDNO:568,SEQIDNO:575,SEQIDNO:632,SEQIDNO:633,SEQIDNO:641,SEQIDNO:700,SEQIDNO:701,SEQIDNO:702,SEQIDNO:703,SEQIDNO:704,SEQIDNO:712,SEQIDNO:755,SEQIDNO:756,SEQIDNO:757,SEQIDNO:758,SEQIDNO:759,SEQIDNOS:761-816的氨基酸序列或其片段的核酸序列的载体的宿主细胞；和(ii)从所述培养基中回收所述蛋白。在一些实施方式中，编码本发明的多肽的核酸序列可操作地与异源启动子连接。
本发明还包括用于诊断细菌感染的临床显现中的诱因剂的方法。本发明的分离的噬菌体或多肽可被用于通过建立样品中的细菌对于本发明的噬菌体和/或多肽的敏感性而辅助确定患者样品中的细菌的种。此类方法还包括评价本发明的分离的噬菌体和/或多肽的抗菌活性的方法。可以通过本领域已知的和/或本文描述的任何方法来评估本发明的噬菌体或多肽的抗菌活性，或未知样品对于此活性的敏感性。在一些实施方式中，通过根据标准技术(例如在液体培养物或在琼脂平板上)培养已知的细菌和/或患者组织、血液、流体或拭子样品、将培养物与本发明的噬菌体或多肽接触并监测在所述接触之后细胞的生长来评估抗菌活性和/或敏感性。例如，在液体培养物中，可以使细菌(例如鲍氏不动杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌)生长至代表培养物的指数生长中点的光密度(“OD”)；使培养物暴露于一种或多种浓度的本发明的一种或多种噬菌体和/或多肽，并相对于对照培养物监测OD。相对于对照培养物降低的OD表示噬菌体和/或多肽显示出针对测试样品或培养物中的细菌的种和/或菌株的抗菌活性(例如显示出溶解杀灭活性)。类似地，可以允许细菌菌落在琼脂平板上形成，使平板暴露于本发明的噬菌体或多肽，然后评价相对于对照平板的菌落生长情况。菌落的减小的大小或菌落的减少的总数目表示噬菌体和/或多肽具有针对测试样品和/或所培养的种或菌株的抗菌活性。
本发明还涉及包含噬菌体或由噬菌体组成的药物组合物，所述噬菌体具有包含SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6或SEQIDNO:7或SEQIDNO:760的核酸序列或由所述核酸序列组成的基因组。在一些实施方式中，本发明的药物组合物除了一种或多种其它噬菌体以外，还包含这样的噬菌体：其具有包含SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6或SEQIDNO:7或SEQIDNO:760的核酸序列或由所述核酸序列组成的基因组。所述一种或多种其它噬菌体可以是本发明的一种或多种噬菌体(例如具有包含SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6或SEQIDNO:7或SEQIDNO:760的核酸序列的基因组或由所述核酸序列组成的基因组)，其一种或多种菌株，或者可以是本领域已知的一种或多种噬菌体。此外，本发明的药物组合物中的一种或多种噬菌体可以靶向细菌的相同或不同的种或菌株。在一些实施方式中，包含本发明的一种或多种噬菌体的药物组合物进一步包含本发明的一种或多种多肽和/或本文描述的或本领域已知的其它噬菌体产品。
在一些实施方式中，本发明提供了包含多肽或其活性片段(特别是具有抗微生物和/或抗菌活性的那些)的药物组合物，所述多肽或其活性片段分离自具有包含SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6SEQIDNO:7和/或SEQIDNO:760的核酸序列或由所述核酸序列组成的基因组的噬菌体。在具体的实施方式中，本发明的药物组合物包含具有SEQIDNO:61,SEQIDNO:63,SEQIDNO:68,SEQIDNO:184,SEQIDNO:202,SEQIDNO:203,SEQIDNO:204,SEQIDNO:214,SEQIDNO:435,SEQIDNO:438,SEQIDNO:440,SEQIDNO:446,SEQIDNO:447,SEQIDNO:448,SEQIDNO:525,SEQIDNO:526,SEQIDNO:527,SEQIDNO:528,SEQIDNO:529,SEQIDNO:530,SEQIDNO:531,SEQIDNO:532,SEQIDNO:533,SEQIDNO:534,SEQIDNO:535,SEQIDNO:536,SEQIDNO:537,SEQIDNO:538,SEQIDNO:539,SEQIDNO:567,SEQIDNO:568,SEQIDNO:575,SEQIDNO:632,SEQIDNO:633,SEQIDNO:641,SEQIDNO:700,SEQIDNO:701,SEQIDNO:702,SEQIDNO:703,SEQIDNO:704,SEQIDNO:712,SEQIDNO:755,SEQIDNO:756,SEQIDNO:757,SEQIDNO:758,SEQIDNO:759或SEQIDNOS:761-816的氨基酸序列的一种或多种多肽。在其它实施方式中，本发明的药物组合物包含这样的多肽：所述多肽是SEQIDNO:61,SEQIDNO:63,SEQIDNO:68,SEQIDNO:184,SEQIDNO:202,SEQIDNO:203,SEQIDNO:204,SEQIDNO:214,SEQIDNO:435,SEQIDNO:438,SEQIDNO:440,SEQIDNO:446,SEQIDNO:447,SEQIDNO:448,SEQIDNO:525,SEQIDNO:526,SEQIDNO:527,SEQIDNO:528,SEQIDNO:529,SEQIDNO:530,SEQIDNO:531,SEQIDNO:532,SEQIDNO:533,SEQIDNO:534,SEQIDNO:535,SEQIDNO:536,SEQIDNO:537,SEQIDNO:538,SEQIDNO:539,SEQIDNO:567,SEQIDNO:568,SEQIDNO:575,SEQIDNO:632,SEQIDNO:633,SEQIDNO:641,SEQIDNO:700,SEQIDNO:701,SEQIDNO:702,SEQIDNO:703,SEQIDNO:704,SEQIDNO:712,SEQIDNO:755,SEQIDNO:756,SEQIDNO:757,SEQIDNO:758,SEQIDNO:759或SEQIDNOS:761-816的变体、衍生物或片段，其中所述变体、衍生物或片段保持其所衍生自的多肽的生物学功能，例如抗微生物或抗菌活性(例如溶解杀灭活性)，优选针对鲍氏不动杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌的一种或多种菌株。
本发明的药物组合物可以另外包含药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。在一些实施方式中，本发明的药物组合物是用于治疗、预防和/或缓解有此需要的受试者中与由细菌引起的感染相关的疾病或病症的症状的抗菌组合物(在于它们显示出抗菌活性)或治疗性组合物。在具体的实施方式中，本发明的药物组合物是用于治疗、预防和/或缓解与由鲍氏不动杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌引起的感染相关的疾病或病症的症状的抗菌组合物或治疗性组合物。在一些实施方式中，接受本发明的药物组合物的受试者是哺乳动物(例如牛、绵羊、山羊、马、灵长类(例如人)、啮齿类、兔类或禽类(例如鸡、鸭、鹅))。
本发明提供了用于治疗或预防细菌感染的方法，包括向有此需要的受试者施用包含一种或多种噬菌体或噬菌体产品(例如分离的噬菌体多肽或其活性片段、变体或衍生物)、以及任选地一种或多种如本文所描述的其它噬菌体或其它噬菌体产品的药物组合物。在本发明的上下文中，“治疗”是指治疗性处理和预防性(prophylactic)或预防性(preventative)措施，其中目标是消除、减轻、降低致病病况或病症的严重性、延缓致病病况或病症的进展，或者延迟或预防与致病病况或病症相关的症状或根本诱因(例如细菌感染)。本发明的药物组合物可被用于治疗或处理与任何细菌感染相关的感染，包括但不限于鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、耳葡萄球菌、头葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生性葡萄球菌、模仿葡萄球菌、木糖葡萄球菌、滕黄微球菌(M.luteus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、粪肠球菌、E.hirae,屎肠球菌、鸟肠球菌(E.avium)、铜绿假单胞菌及其组合。在一些实施方式中，药物组合物可被用于治疗与细菌感染相关的病况或病症，包括但不限于手术后眼内炎、心内膜炎、中枢神经系统感染、肺炎、骨髓炎、创伤感染(例如糖尿病性足溃疡)、乳腺炎、败血症、食物中毒和脑膜炎和/或与医院细菌感染相关的其它病况。
在一些实施方式中，本发明提供了噬菌体或分离的噬菌体产品(例如，分离的噬菌体多肽或其活性片段、变体或衍生物)作为单一试剂治疗的用途。在其它实施方式中，本发明提供了噬菌体或噬菌体产品(例如，分离的噬菌体多肽或其活性片段、变体或衍生物)与用于细菌感染的标准的或实验的治疗相组合的用途。此类组合治疗可以增强所述标准的或实验的治疗的功效。与本发明的多肽组合的特别有用的治疗剂的实例为：抗炎剂，标准化疗抗生素试剂(例如青霉素、合成的青霉素、杆菌肽、甲氧西林、头孢菌素、多粘菌素、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢孟多酯钠、头孢唑林、头孢克肟、头孢美唑、头孢尼西(cefonioid)、头孢哌酮、头孢雷特、cefotanme、头孢噻肟、头孢替坦、头孢西丁、头孢泊肟酯、头孢他啶、头孢唑肟、头孢曲松、头孢曲松拉氧头孢、头孢呋辛、头孢氨苄、头孢菌素C、头孢菌素C钠盐、头孢噻吩、头孢噻吩钠盐、头孢匹林、头孢拉定、头孢呋辛酯、二水头孢噻吩、拉氧头孢、氯碳头孢mafate和螯合剂)、局部麻醉剂和/或皮质类固醇。在另一个实施方式中，本发明的组合物可以与本领域已知的一种或多种噬菌体或噬菌体产品组合。本发明所包括的组合治疗可被配制为单一的药物组合物或者可作为单独的组合物、但是为整体治疗方案的一部分来施用。
本发明的药物组合物可以通过本领域已知的任何适合于施用抗菌化合物的方法来施用(例如，经口或肠胃外(例如吸入、肌肉内、静脉内或表皮))递送。在优选的实施方式中，本发明的药物组合物被表面施用，例如在表面制剂中。本发明的组合物可被表面地用于治疗和/或预防常见的医院感染，例如在手术切割位点处的感染或与导管或引流相关的感染。在其它实施方式中，本发明的组合物用于治疗皮肤或上真皮层的细菌感染(例如足的糖尿病性溃疡的感染)。
本发明的药物组合物还可用于传统的非治疗性应用，例如化妆品中的抗菌剂，或用于固体表面以防止细菌定殖的喷雾剂或溶液中的抗菌剂(即作为消毒剂)。
本发明还涉及用于就抗菌活性筛选肽的方法。在一个实施方式中，所述方法包括就抗菌活性筛选由核酸序列SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7或SEQIDNO:760的开放阅读框编码的长度为至少6、10、15、20或25个残基的连续氨基酸序列，所述抗菌活性由肽抑制琼脂或液体培养物中的细菌生长的能力来测定。
4.1定义
如本文所使用的，术语“片段”是指包含蛋白的氨基酸序列的至少5个连续氨基酸残基，至少10个连续氨基酸残基，至少15个连续氨基酸残基，至少20个连续氨基酸残基，至少25个连续氨基酸残基，至少40个连续氨基酸残基，至少50个连续氨基酸残基，至少60个连续氨基酸残基，至少70个连续氨基酸残基，至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基，至少100个连续氨基酸残基，至少125个连续氨基酸残基，至少150个连续氨基酸残基，至少175个连续氨基酸残基，至少200个连续氨基酸残基，或至少250个连续氨基酸残基的氨基酸序列的肽或多肽。在具体的实施方式中，所述片段是保持其所分离自的蛋白的至少一种功能的功能性片段(例如抗微生物或抗菌活性(例如溶解细胞杀灭))。
如本文所使用的，术语“活性噬菌体产品”和“噬菌体产品”是指分离自本发明的噬菌体的多肽，或其片段、变体或衍生物，所述多肽或其片段、变体或衍生物显示出与其所分离自或衍生自的噬菌体相关的生物学功能或活性(例如抗微生物或抗菌活性(例如溶解细胞杀灭))。
如本文所使用的，在肽、多肽或融合蛋白的上下文中，术语“分离的”是指实质上不含来自其所源自的细胞或组织来源的细胞材料或污染性蛋白的肽、多肽或融合蛋白；或者，当通过化学方式合成时，指实质上不含化学前体或其它化学物质的肽、多肽或融合蛋白。用语“实质上不含细胞材料”包括这样的肽、多肽或融合蛋白的制备物：其中肽、多肽或融合蛋白与其所分离自或重组产生自的细胞的细胞成分分离。因此，实质上不含细胞材料的肽、多肽或融合蛋白包括具有小于大约30％,20％,10％或5％(按干重计)的异源蛋白(在本文中也称作“污染性蛋白”)的肽、多肽或融合蛋白的制备物。当重组产生肽、多肽或融合蛋白时，优选地其实质上也不含培养基，即培养基少于蛋白制备物体积的大约20％,10％或5％。当通过化学合成来产生肽、多肽或融合蛋白时，其优选地实质上不含化学前体或其它化学物质，即其与参与肽、多肽或融合蛋白合成的化学前体或其它化学物质分离。因此，肽、多肽、融合蛋白或抗体的此类制备物具有小于大约30％,20％,10％,5％(按干重计)的除了目标肽、多肽或融合蛋白之外的化学前体或化合物。
如本文所使用的，在核酸分子的上下文中术语“分离的”是指与存在于第一核酸分子的天然来源中的其它核酸分子分离的核酸分子。此外，“分离的”核酸分子(例如cDNA分子)实质上不含其它细胞材料或培养基(当通过重组技术产生时)，或实质上不含化学前体或其它化学物质(当通过化学合成时)，并且可以不含cDNA或其它基因组DNA分子，例如，已经与核酸文库中的其它克隆分离。
术语“纯化的”意思是肽、多肽、融合蛋白或核酸分子已经通过任意纯化方法可测地增加了浓度(所述方法包括但不限于柱色谱、HPLC、沉淀、电泳等)从而部分地、实质地或完全地除掉杂质(例如在制备肽、多肽、融合蛋白或核酸分子中所涉及的前体或其它化学物质)。本领域技术人员将理解对于给定的用途所需的纯化的量。例如，意在用于旨在向人类施用的治疗性组合物中的分离的蛋白通常必须是符合管理标准和货物制备过程的高纯度的。
如本文所使用的，在多肽的上下文中，术语“衍生物”是指包含已经通过导入氨基酸残基置换、删除或添加而被改变的氨基酸序列的多肽。术语“衍生物”在本文中也用于指经过修饰(即通过将任意类型的分子与多肽共价结合)的多肽。例如但不限于，可以通过下列方式修饰多肽，例如：糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生、蛋白水解切割、连接至细胞配体或其它蛋白等。可以使用本领域技术人员已知的技术通过化学修饰产生衍生物多肽，所述技术包括但不限于：特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，衍生物多肽可以含有一个或多个非常规氨基酸。多肽衍生物具有与其所衍生自的多肽相似或相同的功能。在关于“衍生”自生物体的多肽时，术语“衍生”也可以指从所述生物体(例如细菌细胞或噬菌体)直接分离多肽。
如本文所使用的，术语“宿主细胞”是指以核酸分子转染的特定受试者细胞以及包含所述核酸分子或其染色体整合形式的此类细胞的后代或潜在后代。由于在后续世代中或核酸分子整合进入宿主细胞基因组时可能发生的突变或环境的影响，此类细胞的后代可能与经核酸分子转染的亲代细胞不完全相同。为了表达噬菌体蛋白和多肽，宿主细胞优选与噬菌体所分离自或培养自的种或菌株是不同的种或菌株。
如本文所使用的，“组合”是指使用多于一种预防和/或治疗剂。术语“组合”的使用不限制向具有疾病或病症的受试者施用的预防和/或治疗剂的顺序。可以在向具有疾病或病症的受试者施用第二预防剂或治疗剂(与第一预防剂或治疗剂不同)之前(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之前)，与之同时，或在其之后(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之后)施用第一预防剂或治疗剂。
如本文所使用的，术语“核酸”和“核苷酸序列”包括单链的和双链的DNA和/或RNA分子或其组合。如本文所使用的，术语“由核酸编码”是指使用如本领域熟知的标准遗传密码(即标准的三联体密码子)从参考核酸序列的正向、反向、互补或反向互补序列翻译而来的氨基酸序列。
如本文所使用的，术语“预防性试剂”是指本发明的噬菌体和/或多肽，其可用于预防、治疗、管理或缓解与由细菌引起的感染相关的一种或多种症状。
如本文所使用的，术语“治疗剂”是指本发明的噬菌体和/或多肽，其可用于预防、治疗、管理或缓解疾病或病症(尤其是与细菌感染相关的疾病或病症)的一种或多种症状。
如本文所使用的，术语“治疗上有效量”是指足以引起疾病或病症(尤其是与细菌感染相关的疾病或病症)的一种或多种症状的缓解的治疗剂的量。
如本文所使用的，术语“治疗”是指通过施用本发明的一种或多种噬菌体和/或多肽而引起的与细菌感染相关的一种或多种症状的缓解。如上所述，“治疗”以及相关的术语是指治疗性处理和预防性(prophylactic)或预防性(preventative)措施，其中目标是消除、减轻、降低致病病况或病症的严重性、延缓致病病况或病症的进展，或者延迟或防止与致病病况或病症相关的症状或根本诱因(例如细菌感染)。
当提及噬菌体、分离的噬菌体蛋白(或其变体、衍生物或片段)或噬菌体产品时，如本文所使用的，术语“抗菌活性”和“抗微生物活性”可互换地用于指杀死和/或抑制微生物(尤其是噬菌体所感染的种或菌株的细菌)的生长或繁殖的能力。在一些实施方式中，通过下列方式评估抗菌或抗微生物活性：根据标准技术(例如在液体培养物或在琼脂平板上)培养细菌(例如革兰氏阳性细菌(例如粪肠球菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌)、革兰氏阴性细菌(例如鲍氏不动杆菌、铜绿假单胞菌)或未被分类为革兰氏阳性或革兰氏阴性的细菌)，使培养物与本发明的噬菌体或多肽接触，和在所述接触之后监测细胞生长。例如，在液体培养物中，可以使细菌生长至代表培养物的指数生长中点的光密度(“OD”)；将培养物暴露于一种或多种浓度的本发明的一种或多种噬菌体或多肽，并相对于对照培养物监测OD。相对于对照培养物降低的OD表示噬菌体或多肽显示出抗菌活性(例如显示出溶解杀灭活性)。类似地，可以允许细菌菌落在琼脂平板上形成，使平板暴露于本发明的噬菌体或多肽，然后评价相对于对照平板的菌落生长情况。菌落的减小的大小或菌落的减少的总数目表示噬菌体或多肽具有抗菌活性。
如本文所使用的，“CHAP结构域”是指存在于数种噬菌体编码的肽聚糖水解酶中的保守性酰胺酶结构域，其表示“半胱氨酸、组氨酸依赖性氨基水解酶/肽酶(cysteine,histidine-dependentamidohydrolases/peptidases)”。参见例如RigdenD,et.al.,TrendsBiochemSci.2003May28(5):230-4。其存在于酰胺酶(包括GSP酰胺酶)和肽聚糖水解酶的超家族中。该家族包括至少两种不同类型的肽聚糖切割活性：L-胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶和D-丙氨酰-甘氨酰内肽酶活性。CHAP结构域一般包含保守性半胱氨酸和组氨酸残基并水解含有γ-谷氨酰的底物。相信这些半胱氨酸残基对于这些酰胺酶中的数种的活性是关键的，并且它们的巯基似乎在包含该结构域的所有酶的催化机制中作为亲核体发挥作用。CHAP结构域经常被发现与切割肽聚糖的其它结构域结合，例如以协作方式起作用而切割特定的底物。也参见BatemanA等人,TrendsBiochemSci.2003May28(5):234-7。
5.附图说明
图1：F168/08基因组的组织结构示意图，其包含SEQIDNO:1的核酸序列。基因组中所预测的开放阅读框(“ORF”)以箭头表示并以黑色编号。箭头的方向表示转录的方向。颜色编码：黑色–可以基于同源蛋白的已知功能为其产物进行功能分配的ORF(使用相同的数字标明并通过小写字母区分了编码显示出与相同或相似蛋白的同源性的产物的ORF)；灰色-编码类似于具有未知功能的蛋白的产物的ORF；白色或空白–编码与可获得的数据库中的蛋白没有显著同源性的蛋白的ORF。在图中也列出了按功能分配的ORF。图中的信息也包括在图2的表格形式中。
图2A-X：噬菌体F168/08基因组的特征，包括基因产物和推定功能的分配。图中包括基因组的ORF的列表并为每个ORF提供了(i)其在基因组中的位置；(ii)其编码的氨基酸序列；(iii)同源蛋白，和其编码的多肽内的保守性结构域的列表；和(iv)推定功能的分配。图2中列出的ORF1-116分别编码SEQIDNO:8-130的氨基酸序列。
图3A-B：通过分离自临床样品的105个粪肠球菌(EFS)(3A)和56个屎肠球菌(EFM)(3B)菌株中的斑点测试确定的F168/08的宿主范围。每个斑点包含5μl具有所示滴度的噬菌体悬浮液(从CsCl纯化的裂解物制备而来)。基于混浊(+)至清晰(++++)范围内裂解色圈的相对等级评价每个菌株对于噬菌体的敏感性。对噬菌体感染的抗性被标记为(-)。
图4：F170/08基因组的组织结构示意图，其包含SEQIDNO:2的核酸序列。基因组中所预测的ORF以箭头表示并以黑色编号。箭头的方向表示转录的方向。颜色编码：黑色–可以基于同源蛋白的已知功能为其产物进行功能分配的ORF(使用相同的数字标明并通过小写字母区分了编码显示出与相同或相似蛋白的同源性的产物的ORF)；灰色-编码类似于具有未知功能的蛋白的产物的ORF；白色或空白–编码与可获得的数据库中的蛋白没有显著同源性的蛋白的ORF。在图中也列出了按功能分配的ORF。图中的信息也包括在图5A-AU的表格形式中。
图5A-AU：噬菌体F170/08基因组的特征，包括基因产物和推定功能的分配。图中包括基因组的ORF的列表并为每个ORF提供了(i)其在基因组中的位置；(ii)其编码的氨基酸序列；(iii)同源蛋白，和其编码的多肽内的保守性结构域的列表；和(iv)推定功能的分配。图5A-AU中列出的ORF1-213分别编码SEQIDNO:131-343的氨基酸序列。
图6A-B：通过分离自临床样品的105个粪肠球菌(EFS)(6A)和56个屎肠球菌(EFM)(6B)菌株中的斑点试验确定的F170/08的宿主范围。每个斑点包含5μl具有标明的滴度的噬菌体悬浮液(从CsCl纯化的裂解物制备而来)。基于混浊(+)至清晰(++++)范围内的裂解色圈的相对等级评价每个菌株对于噬菌体的敏感性。对噬菌体感染的抗性标记为(-)。
图7：F770/05基因组的组织结构示意图，其包含SEQIDNO:3的核酸序列。基因组中的预测的ORF以箭头表示并以黑色编号。箭头的方向表示转录的方向。颜色编码：黑色–可以基于同源蛋白的已知功能为其产物进行功能分配的ORF(使用相同的数字标明并通过小写字母区分了编码显示出与相同或相似蛋白的同源性的产物的ORF)；灰色-编码类似于具有未知功能的蛋白的产物的ORF；白色或空白–编码与可获得的数据库中的蛋白没有显著同源性的蛋白的ORF。在图中也列出了按功能分配的ORF。图中的信息也包括在图8A-AE的表格形式中。
图8A-AE：噬菌体F770/05基因组的特征，包括基因产物和推定功能的分配。图中包括基因组的ORF的列表并为每个ORF提供了(i)其在基因组中的位置；(ii)其编码的氨基酸序列；(iii)同源蛋白，和其编码的多肽内的保守性结构域的列表；和(iv)推定功能的分配。图8A-AE中列出的ORF1-95分别编码SEQIDNO:344-438的氨基酸序列。
图9：通过分离自临床样品的100个铜绿假单胞菌(PSA)菌株中的斑点试验确定的F770/05的宿主范围。每个斑点包含5μl具有标明的滴度的噬菌体悬浮液(从CsCl纯化的裂解物制备而来)。基于混浊(+)至清晰(++++)范围内裂解色圈的相对等级评价每个菌株对于噬菌体的敏感性。对噬菌体感染的抗性标记为(-)。
图10：F197/08基因组的组织结构示意图，其包含SEQIDNO:4的核酸序列。基因组中所预测的ORF以箭头表示并以黑色编号。箭头的方向表示转录的方向。颜色编码：黑色–可以基于同源蛋白的已知功能为其产物进行功能分配的ORF(使用相同的数字标明并通过小写字母区分了编码显示出与相同或相似蛋白的同源性的产物的ORF)；灰色-编码类似于具有未知功能的蛋白的产物的ORF；白色或空白–编码与可获得的数据库中的蛋白没有显著同源性的蛋白的ORF。在图中也列出了按功能分配的ORF。图中的信息也包括在图11的表格形式中。
图11A-AA：噬菌体F197/08基因组的特征，包括基因产物和推定功能的分配。图中包括基因组的ORF的列表并为每个ORF提供了(i)其在基因组中的位置；(ii)其编码的氨基酸序列；(iii)同源蛋白，和其编码的多肽内的保守性结构域的列表；和(iv)推定功能的分配。图11中列出的ORF1-66分别编码SEQIDNO:439-553的氨基酸序列。
图12：通过分离自临床样品的100个金黄色葡萄球菌(STA)菌株中的斑点试验确定的F197/08的宿主范围。每个斑点包含5μl具有标明的滴度的噬菌体悬浮液(从CsCl纯化的裂解物制备而来)。基于混浊(+)至清晰(++++)范围内裂解色圈的相对等级评价每个菌株对于噬菌体的敏感性。对噬菌体感染的抗性标记为(-)。
图13：F86/06基因组的组织结构示意图，其包含SEQIDNO:5的核酸序列。基因组中所预测的ORF以箭头表示并以黑色编号。箭头的方向表示转录的方向。颜色编码：黑色–可以基于同源蛋白的已知功能为其产物进行功能分配的ORF(使用相同的数字标明并通过小写字母区分了编码显示出与相同或相似蛋白的同源性的产物的ORF)；灰色-编码类似于具有未知功能的蛋白的产物的ORF；白色或空白–编码与可获得的数据库中的蛋白没有显著同源性的蛋白的ORF。在图中也列出了按功能分配的ORF。图中的信息也包括在图14A-U的表格形式中。
图14A-U：噬菌体F86/06基因组的特征，包括基因产物和推定功能的分配。图中包括基因组的ORF的列表并为每个ORF提供了(i)其在基因组中的位置；(ii)其编码的氨基酸序列；(iii)同源蛋白，和其编码的多肽内的保守性结构域的列表；和(iv)推定的功能的分配。图14A-U中列出的ORF1-63分别编码SEQIDNO:554-616的氨基酸序列。
图15：通过分离自临床样品的100个金黄色葡萄球菌(STA)菌株中的斑点试验确定的F86/06的宿主范围。每个斑点包含5μl具有标明的滴度的噬菌体悬浮液(从CsCl纯化的裂解物制备而来)。基于混浊(+)至清晰(++++)范围内裂解色圈的相对等级评价每个菌株对于噬菌体的敏感性。对噬菌体感染的抗性标记为(-)。
图16：F87s/06基因组的组织结构示意图，其包含SEQIDNO:6的核酸序列。基因组中所预测的ORF以箭头表示并以黑色编号。箭头的方向表示转录的方向。颜色编码：黑色–可以基于同源蛋白的已知功能为其产物进行功能分配的ORF(使用相同的数字标明并通过小写字母区分了编码显示出与相同或相似蛋白的同源性的产物的ORF)；灰色-编码类似于具有未知功能的蛋白的产物的ORF；白色或空白–编码与可获得的数据库中的蛋白没有显著同源性的蛋白的ORF。在图中也列出了按功能分配的ORF。图中的信息也包括在图17A-V的表格形式中。
图17A-V：噬菌体F87s/06基因组的特征，包括基因产物和推定功能的分配。图中包括基因组的ORF的列表并为每个ORF提供了(i)其在基因组中的位置；(ii)其编码的氨基酸序列；(iii)同源蛋白，和其编码的多肽内的保守性结构域的列表；和(iv)推定功能的分配。图17A-V中列出的ORF1-61分别编码SEQIDNO:617-681的氨基酸序列。
图18：通过分离自临床样品的100个金黄色葡萄球菌(STA)菌株中的斑点试验确定的F87s/06的宿主范围。每个斑点包含5μl具有标明的滴度的噬菌体悬浮液(从CsCl纯化的裂解物制备而来)。基于混浊(+)至清晰(++++)范围内裂解色圈的相对等级评价每个菌株对于噬菌体的敏感性。对噬菌体感染的抗性标记为(-)。
图19：F91a/06基因组的组织结构示意图，其包含SEQIDNO:7的核酸序列。基因组中所预测的ORF以箭头表示并以黑色编号。箭头的方向表示转录的方向。颜色编码：黑色–可以基于同源蛋白的已知功能为其产物进行功能分配的ORF(使用相同的数字标明并通过小写字母区分了编码显示出与相同或相似蛋白的同源性的产物的ORF)；灰色-编码类似于具有未知功能的蛋白的产物的ORF；白色或空白–编码与可获得的数据库中的蛋白没有显著同源性的蛋白的ORF。在图中也列出了按功能分配的ORF。图中的信息也包括在图20的表格形式中。
图20A-U：噬菌体F91a/06基因组的特征，包括基因产物和推定功能的分配。图中包括基因组的ORF的列表并为每个ORF提供了(i)其在基因组中的位置；(ii)其编码的氨基酸序列；(iii)同源蛋白，和其编码的多肽内的保守性结构域的列表；和(iv)推定功能的分配。图20中列出的ORF1-64分别编码SEQIDNO:682-754的氨基酸序列。
图21：通过分离自临床样品的100个金黄色葡萄球菌(STA)菌株中的斑点试验确定的F91a/06的宿主范围。每个斑点包含5μl具有标明的滴度的噬菌体悬浮液(从CsCl纯化的裂解物制备而来)。基于混浊(+)至清晰(++++)范围内裂解色圈的相对等级评价每个菌株对于噬菌体的敏感性。对噬菌体感染的抗性标记为(-)。
图22：F1245/05基因组的组织结构示意图，其包含SEQIDNO:760的核酸序列。43kb基因组中所预测的ORF以箭头表示并以黑色编号。对于按功能分配的ORF，将数字替换为所预测的功能。箭头的方向表示转录的方向。颜色编码：黑色–可以基于同源蛋白为其产物进行功能分配的ORF；灰色-编码类似于具有未知功能的蛋白的产物的ORF；条纹–具有基于其相对基因组位置以及基于编码的产物中推定的跨膜结构域的存在而分配的功能的ORF；空白箭头–编码与数据中的蛋白没有显著同源性的蛋白的ORF。
图23A-O：噬菌体F1245/05基因组的特征，包括基因产物并提供了推定功能的分配。
图24A-E：提供了通过分离自临床样品的100个鲍氏不动杆菌菌株中的斑点测试确定的F1245/05的宿主范围。每个斑点包含5μl具有标明的滴度的噬菌体悬浮液(从CsCl纯化的裂解物制备而来)。基于混浊(+)至清晰(++++)范围内裂解色圈的相对等级评价对于噬菌体的敏感性。对噬菌体感染的抗性标记为(-)。
6.发明详述
本发明涉及具有针对医院病原体鲍氏不动杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的一个或多个种或菌株的抗菌活性的分离的噬菌体及其分离的多肽产物。在一个实施方式中，提供了显示出针对金黄色葡萄球菌的甲氧西林抗性株(MRSA)的抗微生物和/或抗菌活性的分离的噬菌体或多肽。另外，本发明的噬菌体和多肽可以显示出针对致病细菌的一个或多个种或菌株的抗菌或抗微生物活性，所述致病细菌包括但不限于表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、耳葡萄球菌(S.auricularis)、头葡萄球菌(S.capitis)、溶血性葡萄球菌(S.haemolyticus)、人葡萄球菌(S.hominis)、腐生性葡萄球菌(S.saprophyticus)、模仿葡萄球菌(S.simulans)、木糖葡萄球菌(S.xylosis)、滕黄微球菌(Micrococcusluteus)、枯草芽孢杆菌(Bacilussubtilis)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、E.hirae和鸟肠球菌(E.avium)。
在一个实施方式中，本发明提供了具有包含SEQIDNO:1的核酸序列或由SEQIDNO:1的核酸序列组成的基因组的噬菌体。根据该实施方式的具体实例是分离的噬菌体F168/08，其靶向粪肠球菌和屎肠球菌的多种菌株。在图2中提供了F168/08基因组中的开放阅读框(ORF)，由所述ORF编码的氨基酸序列和所编码的氨基酸序列(即所编码的蛋白和/或多肽)的推定功能的分配(还提供了氨基酸序列SEQIDNO:8-130)。
肠球菌属是革兰氏阳性的球形菌，其以组或链形成菌落。其被发现是很多哺乳动物(包括人类)中的消化道菌群的一部分。肠球菌属感染占所有医院感染的12％。肠球菌属感染可以引起复杂的腹部感染、皮肤和皮肤结构感染、尿道感染和血流的感染，这些可能是难于治疗的，尤其是在所涉及的菌株产生了针对数种抗生素的抗性的情况下。在这样的情况下，感染可能危及生命，尤其是当患者已经是免疫缺损的时候。
粪肠球菌构成主要的肠球菌属感染，并且是位于人类和其它哺乳动物的胃肠道中的革兰氏阳性的共生细菌。其是非能动和兼性厌氧的。粪肠球菌可以引起人类中的心内膜炎，以及膀胱、前列腺和附睾感染，包括危及生命的感染，尤其是在医院环境中。粪肠球菌对于很多通常使用的抗微生物试剂(例如，氨基糖苷类、氨曲南、头孢菌素、氯洁霉素、半合成的青霉素萘夫西林和苯唑西林、三甲氧苄氨嘧啶—磺胺甲异噁唑等)有抗性。
已知屎肠球菌对于数种类型的抗生素(包括喹诺酮类和氨基糖苷类)具有抗性。屎肠球菌的万古霉素抗性菌株也是已知的。对于数种抗生素的抗性和对于不利条件的耐受使得屎肠球菌成为医学界的一个主要担忧，这使得该微生物获得了“超级细菌”的称号。在另一个实施方式中，本发明提供了具有包含SEQIDNO:2的核酸序列或由SEQIDNO:2的核酸序列组成的基因组的噬菌体。根据该实施方式的具体实例是分离的噬菌体F170/08，其靶向粪肠球菌和屎肠球菌的多种菌株。在图5中提供了F170/08基因组中的开放阅读框(ORF)，由所述ORF编码的氨基酸序列和所编码的氨基酸序列(即编码的蛋白和/或多肽)的推定功能的分配(还提供了氨基酸序列SEQIDNO:131-343)。
在另一个实施方式中，本发明提供了具有包含SEQIDNO:3的核酸序列或由SEQIDNO:3的核酸序列组成的基因组的噬菌体。根据该实施方式的具体实例是分离的噬菌体F770/05，其靶向铜绿假单胞菌的多种菌株。在图8中提供了F770/05基因组中的开放阅读框(ORF)，由所述ORF编码的氨基酸序列和所编码的氨基酸序列(即编码的蛋白和/或多肽)的推定功能的分配(还提供了氨基酸序列SEQIDNO:344-438)。
铜绿假单胞菌是常见的革兰氏阴性的棒状细菌，其存在于土壤、水、皮肤菌群和多数人造环境中。其不仅在正常大气中茁壮成长，而且在极少的氧的情况下作为兼性厌氧微生物茁壮成长，并且其可以感染受损的组织或免疫缺损的个体。当此类定殖发生于关键的身体器官例如肺、尿道和肾中时，结果可以是致命的。由于其在表面上茁壮成长，所以该细菌也存在于医学设备(包括导管)之上和之内，引起医院和诊所中的交叉感染。铜绿假单胞菌是最相关的机会性、医院的病原体之一，据估计10例在医院中获得的感染中有1例是来自假单胞菌属。铜绿假单胞菌也是烧伤感染的最常见的诱因，以及医学设备(例如导管)的最常见的定殖者。
在另一个实施方式中，本发明提供了具有包含SEQIDNO:4的核酸序列或由SEQIDNO:4的核酸序列组成的基因组的噬菌体。根据该实施方式的具体实例是分离的噬菌体F197/08，其靶向金黄色葡萄球菌的多种菌株。在图11中提供了F197/08基因组中的开放阅读框(ORF)，由所述ORF编码的氨基酸序列和所编码的氨基酸序列(即编码的蛋白和/或多肽)的推定功能的分配(还提供了氨基酸序列SEQIDNO:439-553)。
在另一个实施方式中，本发明提供了具有包含SEQIDNO:5的核酸序列或由SEQIDNO:5的核酸序列组成的基因组的噬菌体。根据该实施方式的具体实例是分离的噬菌体F86/06，其靶向金黄色葡萄球菌的多种菌株。在图14中提供了F86/06基因组中的开放阅读框(ORF)，由所述ORF编码的氨基酸序列和所编码的氨基酸序列(即编码的蛋白和/或多肽)的推定功能的分配(还提供了氨基酸序列SEQIDNO:554-616)。
在另一个实施方式中，本发明提供了具有包含SEQIDNO:6的核酸序列或由SEQIDNO:6的核酸序列组成的基因组的噬菌体。根据该实施方式的具体实例是分离的噬菌体F87s/06，其靶向金黄色葡萄球菌的多种菌株。在图17中提供了F87s/06基因组中的开放阅读框(ORF)，由所述ORF编码的氨基酸序列和所编码的氨基酸序列(即编码的蛋白和/或多肽)的推定功能的分配(还提供了氨基酸序列SEQIDNO:617-681)。
在另一个实施方式中，本发明提供了具有包含SEQIDNO:7的核酸序列或由SEQIDNO:7的核酸序列组成的基因组的噬菌体。根据该实施方式的具体实例是分离的噬菌体F91a/06，其靶向金黄色葡萄球菌的多种菌株。在图20中提供了F91a/06基因组中的开放阅读框(ORF)，由所述ORF编码的氨基酸序列和所编码的氨基酸序列(即编码的蛋白和/或多肽)的推定功能的分配(还提供了氨基酸序列SEQIDNO:682-754)。
金黄色葡萄球菌是球形的、兼性厌氧的、革兰氏阳性细菌，通常是存在于鼻子中和皮肤上的皮肤菌群的一部分。金黄色葡萄球菌可以引起多种疾病，既有小的皮肤感染(例如丘疹)，又有肠胃炎，还有危及生命的疾病，例如肺炎、脑膜炎、骨髓炎、心内膜炎、中毒性休克综合征(TSS)、菌血症和败血症。其是医院感染的5种最常见的诱因之一，并且经常是手术后创伤感染的诱因。目前，金黄色葡萄球菌已经对很多常用的抗生素产生了抗性，据估计，仅有2％的金黄色葡萄球菌分离体对于青霉素是敏感的。开发了第二代青霉素，例如甲氧西林、苯唑西林、氯唑西林和氟氯西林，以治疗青霉素抗性的金黄色葡萄球菌。甲氧西林是该类别中第一个被使用的抗生素，但是仅仅2年后就报道了甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌(MRSA)的第一例。从二十世纪九十年代开始，在医院中爆发了MRSA的流行，其现在被认为是地方性流行。
在另一个实施方式中，本发明提供了具有包含SEQIDNO:760的核酸序列或由SEQIDNO:760的核酸序列组成的基因组的噬菌体。根据该实施方式的具体实例是分离的噬菌体F1245/05，其靶向鲍氏不动杆菌的多种菌株。在图23中提供了F1245/05基因组中的开放阅读框(ORF)，由所述ORF编码的氨基酸序列和所编码的氨基酸序列(即编码的蛋白和/或多肽)的推定功能的分配(还提供了氨基酸序列SEQIDNO:761-816)。
鲍氏不动杆菌是引起(尤其是在具有缺陷的免疫系统的个体中)多种严重的临床感染的细菌种类。鲍氏不动杆菌是多形的需氧的革兰氏阴性细菌，其通常分离自医院环境和住院的患者。该细菌通常进入身体的开放性伤口、导管或呼吸管。鲍氏不动杆菌通常定殖于含水的环境，并且通常培养自住院患者的痰或呼吸分泌物、伤口和尿。在医院环境中，鲍氏不动杆菌通常定殖于灌洗液和静脉内溶液。还已知其对于多种抗生素有抗性，近年来由鲍氏不动杆菌引起的医院感染的数目增加了。
在一些实施方式中，本发明的噬菌体包含与SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7或SEQIDNO:760的核酸序列具有至少85％,90％,95％,96％,97％,98％或至少99％序列同一性的基因组或由其组成，所述噬菌体显示出噬菌体F168/08,F170/08,F770/05,F197/08,F86/06,F87s/06,F91a/06和F1245/05中的一种或多种的至少一个生物学(例如抗微生物或抗菌)活性(例如溶解杀灭活性)。备选地或另外，本发明的噬菌体可以具有包含SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7或SEQIDNO:760的核酸序列的功能性片段(包括图2、5、8、11、14、17、20和23中描述的任意开放阅读框的序列)的基因组。
本发明还提供了经本发明的一种或多种噬菌体感染的分离的细菌。在一些实施方式中，本发明提供了经具有包含SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:2的核酸序列或由所述核酸序列组成的基因组的噬菌体感染的分离的粪肠球菌或屎肠球菌。在其它实施方式中，本发明提供了经具有包含SEQIDNO:3的核酸序列或由SEQIDNO:3的核酸序列组成的基因组的噬菌体感染的分离的铜绿假单胞菌。在其它实施方式中，本发明提供了经具有包含SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6和/或SEQIDNO:7的核酸序列或由所述核酸序列组成的基因组的噬菌体感染的分离的金黄色葡萄球菌。在其它实施方式中，本发明提供了经具有包含SEQIDNO:760的核酸序列或由SEQIDNO:760的核酸序列组成的基因组的噬菌体感染的分离的鲍氏不动杆菌。
本发明提供了产生和分离噬菌体的方法，所述噬菌体具有包含SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7或SEQIDNO:760的核酸序列或由所述核酸序列组成的基因组。在一些实施方式中，本发明提供了生产和/或分离噬菌体的方法，所述噬菌体具有包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的核酸序列或由所述核酸序列组成的基因组，所述方法包括：(i)获得粪肠球菌或屎肠球菌的培养物；(ii)用具有包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的核酸序列或由所述核酸序列组成的基因组的噬菌体感染所述培养物；(iii)培养，直至观察到培养物的显著裂解；和(iv)从培养物中分离噬菌体。在其它实施方式中，本发明提供了生产和/或分离噬菌体的方法，所述噬菌体具有包含SEQIDNO:3的核酸序列或由SEQIDNO:3的核酸序列组成的基因组，所述方法包括：(i)获得铜绿假单胞菌的培养物；(ii)用具有包含SEQIDNO:3的核酸序列或由SEQIDNO:3的核酸序列组成的基因组的噬菌体感染所述培养物；(iii)培养，直至观察到培养物的显著裂解；和(iv)从培养物中分离噬菌体。在其它实施方式中，本发明提供了生产和/或分离噬菌体的方法，所述噬菌体具有包含SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6或SEQIDNO:7的核酸序列或由所述核酸序列组成的基因组，所述方法包括：(i)获得金黄色葡萄球菌的培养物；(ii)用具有包含SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6或SEQIDNO:7的核酸序列或由所述核酸序列组成的基因组的噬菌体感染所述培养物；(iii)培养，直至观察到培养物的显著裂解；和(iv)从培养物中分离噬菌体。在其它实施方式中，本发明提供了生产和/或分离噬菌体方法，所述噬菌体具有包含SEQIDNO:760的核酸序列或由SEQIDNO:760的核酸序列组成的基因组，所述方法包括：(i)获得鲍氏不动杆菌的培养物；(ii)用具有包含SEQIDNO:760的核酸序列或由SEQIDNO:760的核酸序列组成的基因组的噬菌体感染所述培养物；(iii)培养，直至观察到培养物的显著裂解；和(iv)从培养物中分离噬菌体。
可以使用本文所描述的或本领域已知的任意方法从细菌样品中分离噬菌体(见，例如Carlson,“Workingwithbacteriophages:commontechniquesandmethodologicalapproaches,”In,Kutter和Sulakvelidze(Eds)Bacteriophages:BiologyandApplications,5thed.CRCPress(2005)；通过引用方式全文并入本文)。
本发明还提供了分离自本发明的噬菌体的多肽。所述分离的多肽可以是全长噬菌体蛋白或者可以是噬菌体蛋白的片段、变体或衍生物，条件是所述片段、变体或衍生物显示出与其所衍生自的噬菌体或多肽相关的至少一种生物学活性。在一些实施方式中，本发明的多肽分离自噬菌体F1245/05(其通常感染鲍氏不动杆菌)、F168/08或F170/08(它们通常感染粪肠球菌和/或屎肠球菌)、噬菌体F770/05(其通常感染铜绿假单胞菌)或噬菌体F197/08,F86/06,F87s/06或F91a/06(它们通常感染金黄色葡萄球菌)。
在具体的实施方式中，本发明的多肽是分离自噬菌体的内溶素或溶素，所述噬菌体具有包含SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7或SEQIDNO:760或由所述序列组成的基因组(例如分别是噬菌体F168/08,F170/08,F197/08,F86/06,F87s/06,F91a/06或F1245/05)。在具体的实施方式中，本发明的多肽是内溶素或溶素，其具有包含SEQIDNO:797,SEQIDNO:68,SEQIDNO:184,SEQIDNO:202,SEQIDNO:203,SEQIDNO:446,SEQIDNO:447,SEQIDNO:448,SEQIDNO:575,SEQIDNO:641或SEQIDNO:712的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。在其它实施方式中，本发明的分离的多肽是分离自本发明的噬菌体的内溶素或溶素的片段、变体或衍生物，所述片段、变体或衍生物显示出其所分离自或衍生自的内溶素、溶素或噬菌体的至少一种生物学活性，优选为抗菌活性(例如溶解杀灭活性)。因此，在一些实施方式中，本发明提供了分离的多肽，其是分离自本发明的噬菌体的内溶素或溶素的片段、变体或衍生物，所述片段、变体或衍生物显示出针对鲍氏不动杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌或金黄色葡萄球菌中的一种或多种的抗菌或抗微生物活性(例如溶解杀灭活性)。在其它实施方式中，所述分离的多肽是分离自本发明的噬菌体的内溶素或溶素的片段、变体或衍生物，其显示出针对鲍氏不动杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌或金黄色葡萄球菌之外的一种或多种细菌(例如铜绿假单胞菌)的抗菌或抗微生物活性(例如溶解杀灭活性)。在一些实施方式中，本发明的多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:68,SEQIDNO:184,SEQIDNO:202或SEQIDNO:203或其片段、变体或衍生物，或由所述氨基酸序列或其片段、变体或衍生物组成，所述多肽显示出针对粪肠球菌或屎肠球菌的抗菌或抗微生物活性。在其它实施方式中，本发明的多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:446,SEQIDNO:447,SEQIDNO:448,SEQIDNO:575,SEQIDNO:641或SEQIDNO:712或其片段、变体或衍生物，或由所述氨基酸序列或其片段、变体或衍生物组成，所述多肽显示出针对金黄色葡萄球菌的抗菌或抗微生物活性。在其它实施方式中，本发明的多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:797或其片段、变体或衍生物，或由所述氨基酸序列或其片段、变体或衍生物组成，所述多肽显示出针对鲍氏不动杆菌的抗菌或抗微生物活性。
在一些实施方式中，本发明的多肽包含分离自噬菌体F168/08,F170/08,F770/05,F197/08,F86/06,F87s/06或F91a/06的内溶素或溶素的CHAP结构域或由所述CHAP结构域组成。已经证明所述分离的CHAP结构域保留其所衍生自的内溶素或溶素的抗菌活性，例如溶解杀灭活性；可以通过本领域的常规方法鉴定并分离CHAP结构域(见，例如Rigden等人,2003,TrendsBiochem.Sci.28:230-234；Bateman等人,2003,TrendsBiochem.Sci.28:234-237,其各自通过引用方式全文并入本文)。在具体的实施方式中，本发明的多肽包含分离自具有SEQIDNO:68,SEQIDNO:184,SEQIDNO:202,SEQIDNO:203,SEQIDNO:446,SEQIDNO:447,SEQIDNO:448,SEQIDNO:575,SEQIDNO:641或SEQIDNO:712的氨基酸序列的多肽的CHAP结构域或由所述CHAP结构域组成。在具体的实施方式中，本发明提供了分离的多肽，其包含源自具有SEQIDNO:68,SEQIDNO:446,SEQIDNO:575,SEQIDNO:641或SEQIDNO:712的氨基酸序列的第二多肽的CHAP结构域或由所述CHAP结构域组成，其中所述CHAP结构域分别具有SEQIDNO:755,SEQIDNO:756,SEQIDNO:757,SEQIDNO:758或SEQIDNO:759的氨基酸序列。即，SEQIDNO:755对应于源自具有SEQIDNO:68的氨基酸序列的多肽的CHAP结构域；SEQIDNO:756对应于源自具有SEQIDNO:446的氨基酸序列的多肽的CHAP结构域，以此类推。在其它实施方式中，本发明提供了分离自噬菌体F168/08,F170/08,F770/05,F197/08,F86/06,F87s/06或F91a/06的内溶素或溶素的CHAP结构域的片段、变体或衍生物，所述片段、变体或衍生物显示出其所衍生自的CHAP结构域的至少一种生物学活性，例如溶解细胞杀灭，并且其中所述CHAP结构域具有SEQIDNO:755,SEQIDNO:756,SEQIDNO:757,SEQIDNO:758或SEQIDNO:759的氨基酸序列。表1中提供了SEQIDNO:755-SEQIDNO:759的氨基酸序列。
表1：分离自本发明的噬菌体的CHAP结构域的氨基酸序列
在一些实施方式中，本发明的多肽包含尾部长度带测量蛋白或尾部蛋白(例如尾部成分、尾部纤毛蛋白、吸附相关的尾部蛋白)或其片段，或由所述蛋白或其片段组成，所述尾部长度带测量蛋白或尾部蛋白分离自具有包含SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7或SEQIDNO:760或由其组成的基因组的噬菌体(例如，分别是噬菌体F168/08,F170/08,F770/05,F197/08,F86/06,F87s/06,F91a/06或F1245/05)，其中所述尾部长度带测量蛋白或尾部蛋白或其片段具有与其所衍生自的噬菌体相关的生物学功能，例如抗微生物或抗菌活性(例如溶解杀灭活性)。在具体的实施方式中，尾部长度带测量蛋白或尾部蛋白的抗微生物或抗菌活性针对鲍氏不动杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌的至少一个或多个种或菌株。在具体的实施方式中，本发明的多肽是尾部带测量蛋白或尾部蛋白，其具有包含SEQIDNO:61,SEQIDNO:63,SEQIDNO:204,SEQIDNO:214,SEQIDNO:435,SEQIDNO:438,SEQIDNO:440,SEQIDNO:525,SEQIDNO:526,SEQIDNO:527,SEQIDNO:528,SEQIDNO:529,SEQIDNO:530,SEQIDNO:531,SEQIDNO:532,SEQIDNO:533,SEQIDNO:534,SEQIDNO:535,SEQIDNO:536,SEQIDNO:537,SEQIDNO:538,SEQIDNO:539,SEQIDNO:567,SEQIDNO:568,SEQIDNO:632,SEQIDNO:633,SEQIDNO:700,SEQIDNO:701,SEQIDNO:702,SEQIDNO:703,SEQIDNO:704或SEQIDNO:795或由其组成的氨基酸序列。在其它实施方式中，本发明的分离的多肽是SEQIDNO:61,SEQIDNO:63,SEQIDNO:204,SEQIDNO:214,SEQIDNO:435,SEQIDNO:438,SEQIDNO:440,SEQIDNO:525,SEQIDNO:526,SEQIDNO:527,SEQIDNO:528,SEQIDNO:529,SEQIDNO:530,SEQIDNO:531,SEQIDNO:532,SEQIDNO:533,SEQIDNO:534,SEQIDNO:535,SEQIDNO:536,SEQIDNO:537,SEQIDNO:538,SEQIDNO:539,SEQIDNO:567,SEQIDNO:568,SEQIDNO:632,SEQIDNO:633,SEQIDNO:700,SEQIDNO:701,SEQIDNO:702,SEQIDNO:703,SEQIDNO:704,或SEQIDNO:795的氨基酸序列的片段、变体或衍生物,所述片段、变体或衍生物显示出其所分离自或衍生自的噬菌体的至少一种生物学活性或功能，例如抗微生物或抗菌活性(例如溶解杀灭活性)。在优选的实施方式中，所述片段、变体或衍生物的所述至少一种生物学活性或功能是针对粪肠球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和/或鲍氏不动杆菌的一个或多个菌株的。
在一些实施方式中，本发明的分离的多肽是噬菌体多肽的变体，所述变体包含与相同长度(即由相同数目的残基组成)的第二氨基酸序列具有至少60％,65％,70％,75％,80％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或更高的序列同一性的氨基酸序列或由其组成，所述第二氨基酸序列是SEQIDNO:61,SEQIDNO:63,SEQIDNO:68,SEQIDNO:184,SEQIDNO:202,SEQIDNO:203,SEQIDNO:204,SEQIDNO:214,SEQIDNO:435,SEQIDNO:438,SEQIDNO:440,SEQIDNO:446,SEQIDNO:447,SEQIDNO:448,SEQIDNO:525,SEQIDNO:526,SEQIDNO:527,SEQIDNO:528,SEQIDNO:529,SEQIDNO:530,SEQIDNO:531,SEQIDNO:532,SEQIDNO:533,SEQIDNO:534,SEQIDNO:535,SEQIDNO:536,SEQIDNO:537,SEQIDNO:538,SEQIDNO:539,SEQIDNO:567,SEQIDNO:568,SEQIDNO:575,SEQIDNO:632,SEQIDNO:633,SEQIDNO:641,SEQIDNO:700,SEQIDNO:701,SEQIDNO:702,SEQIDNO:703,SEQIDNO:704,SEQIDNO:712,SEQIDNO:755,SEQIDNO:756,SEQIDNO:757,SEQIDNO:758,SEQIDNO:759,SEQIDNO:795或SEQIDNO:797，和/或其片段，并且其中所述变体显示出其所衍生自的噬菌体的针对细菌(例如革兰氏阳性细菌(例如粪肠球菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌)、革兰氏阴性细菌(例如铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌)或未被分类为革兰氏阳性或革兰氏阴性的细菌)的一种或多种菌株的至少一种生物学功能或活性(例如抗微生物或抗菌活性(例如溶解杀灭活性))。
在一些实施方式中，本发明提供了具有SEQIDNOS:2-124,SEQIDNOS:126-338,SEQIDNOS:340-434,SEQIDNOS:436-550,SEQIDNOS:552-614,SEQIDNOS:616-680,SEQIDNOS:682-759,SEQIDNOS:761-816中的任意项的氨基酸序列的分离的多肽，及其活性生物学片段。在优选的实施方式中，本发明的变体多肽显示出与其所分离自或衍生自的多肽或噬菌体相关的针对粪肠球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和/或鲍氏不动杆菌的至少一种或多种菌株的至少一种生物学活性。
在其它实施方式中，本发明提供了编码SEQIDNOS:8-130,SEQIDNOS:131-343,SEQIDNOS:344-438,SEQIDNOS:439-553,SEQIDNOS:554-616,SEQIDNOS:617-681,SEQIDNOS:682-759,SEQIDNOS:761-816中的一项的氨基酸序列的分离的核酸序列，及其活性片段。在其它实施方式中，本发明提供了在图2、5、8、11、14、17、20和23中所识别的任何开放阅读框的核酸序列。
在一些实施方式中，本发明的多肽重组融合至或化学缀合(包括共价和非共价缀合)至治疗剂(例如异源多肽或小分子)，以产生融合蛋白或嵌合多肽。融合无需是直接的，而是可以通过连接体序列或通过化学缀合而发生。可以与本发明的多肽缀合的治疗剂的非限制性实例是肽或非肽细胞毒素(包括抗微生物剂和/或抗生素)、示踪剂/标记物分子(例如放射性核素和荧光团)以及本领域已知的其它抗生素或抗菌化合物。
6.1抗生素组合物
本发明的分离的噬菌体或多肽可以单独施用或掺入药物组合物中施用，以用于治疗或预防细菌感染，例如由以下细菌引起的感染，包括但不限于：鲍氏不动杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。所述多肽可以与药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂组合。药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂的实例包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸、柠檬酸和其它有机酸；抗氧化物，包括抗坏血酸；低分子量的多肽；蛋白质，例如血清白蛋白和明胶；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨醇；成盐反离子，例如钠；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。本发明的药物组合物(例如抗菌组合物)除了以上成分之外还可以包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂。
本发明的噬菌体和/或多肽还可以与本申请所述的和/或本领域已知的用于治疗细菌感染的一种或多种治疗性和/或预防性试剂(例如一种或多种溶素)相组合。因此，本发明的药物组合物可以包含两种或更多种本发明的分离的噬菌体(具有针对相同或不同细菌的种或菌株的抗菌活性)，本发明的噬菌体和多肽的组合，或本发明的噬菌体和/或多肽与本领域已知的噬菌体和/或治疗性多肽的组合。在具体的实施方式中，组合中的治疗成分靶向细菌的两个或更多个种或菌株，或者显示出不同的酶活性。例如，一般而言，溶素显示出下列中的一种活性：酰胺酶、内肽酶、胞壁酸酶或氨基葡萄糖苷酶。因此，显示出不同活性的溶素的组合可以为本发明的药物组合物的治疗活性提供协同性的增强。
可与本发明的多肽组合使用的其它治疗剂的实例包括但不限于：标准的抗生素试剂、抗炎试剂、抗病毒试剂、局部麻醉试剂和皮质类固醇。
可与包含本发明的多肽的药物组合物一起使用的标准抗生素包括但不限于：阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、巴龙霉素、rhodostreptomycin、链霉素、妥布霉素、安普霉素、利福霉素、萘霉素、莫匹罗星、格尔德霉素、安丝菌素、碳头孢烯类、亚胺培南、美罗培南、厄他培南、法罗培南、多利培南、帕尼培南/倍他米隆、比阿培南、PZ-601、头孢菌素类、头孢乙腈、头孢羟氨苄、头孢氨苄、头孢来星、头孢洛宁、头孢噻啶、头孢噻吩、头孢匹林、头孢曲嗪、头孢氮氟、头孢西酮、头孢唑林、头孢拉定、头孢沙定、头孢替唑、头孢克洛、头孢尼西、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢唑南、头孢美唑、头孢替坦、头孢西丁、头孢卡品、头孢达肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢他美、头孢克肟、头孢甲肟、头孢特仑、头孢布烯、头孢噻呋、头孢噻林、头孢唑肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶拉氧头孢、头孢林定、头孢吡肟、头孢瑞南、头孢噻利、头孢唑兰、头孢匹罗、头孢喹肟、氟氧头孢、头孢比普、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素、罗红霉素、氨曲南、青霉素和青霉素衍生物、放线菌素、杆菌肽、黏菌素、多粘菌素B、西诺沙星、氟甲喹、萘啶酸、奥索利酸、吡洛米酸、吡哌酸、罗索沙星、环丙沙星、依诺沙星、氟罗沙星、洛美沙星、那氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、芦氟沙星、巴洛沙星、加替沙星、格帕沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、帕珠沙星、司帕沙星、替马沙星、托氟沙星、克林沙星、加雷沙星、吉米沙星、stifloxacin、trovalfloxacin、普卢利沙星、乙酰唑胺、苯唑拉胺、布美他尼、塞来昔布、氯噻酮、氯帕胺、双氯非那胺、多佐胺、乙氧苯唑胺、呋塞米、氢氯噻嗪、吲达帕胺、mafendide、美夫西特、美托拉宗、丙磺舒、磺胺醋酰、磺胺地索辛、磺胺多辛、氨苯磺胺类、磺胺甲噁唑、柳氮磺吡啶、舒噻美、舒马普坦、希帕胺、四环素、金霉素、土霉素、多西环素、赖甲环素、甲氯环素、美他环素、米诺环素、罗利环素，以及它们按照有效地加和或协同增强本发明的噬菌体或多肽对于给定感染的治疗效应的量的任意组合。
可用于本发明的药物组合物中的局部麻醉剂包括：丁卡因、盐酸丁卡因、利多卡因、盐酸利多卡因、盐酸二甲异喹、地布卡因、盐酸地布卡因、苦味酸氨苯丁酯和盐酸普莫卡因。局部麻醉剂的示例性浓度是总组合物的重量的大约0.025％至大约5％。
可用于与本发明的多肽、噬菌体和/或药物组合物相组合的皮质类固醇包括倍他米松、二丙酸盐、肤轻松、锕系元素、戊酸倍他米松、曲安西龙锕系元素、丙酸氯倍他索、去羟米松、双醋二氟拉松、安西奈德、丙酮缩氟氢羟龙、戊酸氢化可的松、丁酸氢化可的松和地奈德。皮质类固醇的示例性浓度是总组合物的重量的大约0.01％至大约1％。
在一些实施方式中，包含本发明的噬菌体和/或多肽的制剂还包含SM缓冲剂(0.05MTris-HCl(pH7.4-7.5)；0.1MNaCl；10mMMgSO4)。在其它实施方式中，所述制剂还包含SM缓冲剂和10mMMgCl2。在其它实施方式中，所述制剂还包含SM缓冲剂和大约20％或大约30％的乙醇。
包含本发明的噬菌体和/或多肽的药物组合物可以被配制为单元剂量或多剂制剂。合适的制剂可以选自：膏、溶液、悬浮液或乳液、提取物、粉末、粒、喷雾剂、锭剂、片或胶囊，并另外包括分散剂或稳定剂。
本发明的药物组合物可以通过以下方式施用：吸入，以栓剂或阴道环的形式，表面(例如以洗液、溶液、霜、膏或散粉的形式)，表皮或透皮(例如使用皮贴)，经口(例如作为片剂，其可以含有赋形剂例如淀粉或乳糖)，作为胶囊、胚珠制剂(ovule)、酏剂、溶液或悬浮液(每种任选地包含调味剂、着色剂和/或赋形剂)，或者可以通过肠胃外方式注射它们(例如静脉内、肌内或皮下)。对于肠胃外施用，最好是以无菌水溶液的形式使用所述组合物，所述溶液中可以包含其它物质，例如足以使溶液与血液等渗的盐或单糖。对于含服或舌下施用，可以以片剂或锭剂的形式施用所述组合物，其可以以常规方式配制。在优选的实施方式中，以单一试剂或与本文所述的或本领域已知的其它抗生素治疗联合而局部施用本发明的噬菌体和/或多肽。
本发明的噬菌体和/或多肽还可以经皮肤或透皮施用。对于向皮肤的表面施用，本发明的噬菌体和/或多肽可以与一种载体或组合的载体相组合，所述载体包括但不限于含水液体、基于醇的液体、水溶性凝胶、洗液、膏、非水性液体基底、矿物油基底、矿物油与矿脂的混合、羊毛脂、脂质体、蛋白质载体，例如血清白蛋白或凝胶，粉末化纤毛素carmel，及其组合。局部递送模式可以包括涂、喷、定时释放贴、液体吸收擦(liquidabsorbedwipe)，及其组合。可以直接或在一种载体中将本发明的噬菌体和/或多肽应用至贴剂或绷带中。贴剂可以是湿的或干的，其中噬菌体和/或多肽(例如溶素)以冻干的形式存在于贴剂上。局部组合物的载体可以包括半固体的和凝胶样介质，其包括聚合物增稠剂、水、防腐剂、活性表面活性剂或乳化剂、抗氧化物、防晒剂和溶剂或混合的溶剂系统。美国专利5,863,560公开了多种不同的载体组合，其可辅助皮肤暴露于药物，该专利的内容被并入本文。
对于鼻内或通过吸入方式施用，本发明的噬菌体和/或多肽方便地以干粉吸入剂的形式或来自加压的容器、泵、喷雾器或雾化器的气雾喷雾剂方式递送，伴以使用合适的助推剂，例如二氯二氟甲烷，三氯氟代甲烷，二氯四氟乙烷，氢氟烷助推剂，例如，1,1,1,2-四氟乙烷(HFA134A.TM.)或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(HFA227EA.TM.)，二氧化碳或其它合适的气体。在加压的气雾剂的情况下，可以通过提供用于递送计量的量的阀门来确定单元剂量。加压的容器、泵、喷雾器或雾化器可以含有活性化合物的溶液或悬浮液，例如使用乙醇和助推剂的混合物作为溶剂，其可以另外含有润滑剂，例如去水山梨糖醇三油酸酯。用于吸入器或吹入器中的胶囊和药筒(由例如明胶制成)可以被配制为含有本发明的噬菌体和/或多肽与合适的粉末基底(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
对于以栓剂或阴道环形式的施用，治疗性组合物可以以凝胶、水凝胶、洗液、溶液、霜、膏或散粉的形式被表面地施用。也可以通过经眼睛的途径施用本发明的组合物。对于眼睛的应用，本发明的组合物可以被配制为等渗的、pH经调节的、无菌盐水中的微粉化的悬浮液，或优选被配制为等渗的、pH经调节的、无菌盐水中的溶液，任选地与防腐剂(例如苯扎氯铵)相组合。备选地，可以将它们配制在膏(例如矿脂)内。
本发明的药物组合物的剂量和需要的药物浓度可以根据特定的用途而变化。确定合适的剂量或施用途径完全在常规医师的技能范围内。动物实验可以提供用于确定人类治疗中的有效剂量的可靠指导。本领域普通技术人员可以根据Mordenti,J.andChappell,W.“Theuseofinterspeciesscalingintoxicokinetics”inToxicokineticsandNewDrugDevelopment,Yacobi等人,Eds.,PergamonPress,NewYork1989,pp42-96中描述的原理进行有效剂量的物种间缩放(scaling)。
6.2治疗性应用
本发明的噬菌体和多肽具有针对粪肠球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和/或鲍氏不动杆菌的多种菌株的活性，如图3A-B,6A-B,9,12,15,18,21和23中所描述的。因此，本发明的组合物可用于预防和治疗人类和动物中与粪肠球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和/或鲍氏不动杆菌相关的感染的方法。在其它实施方式中，本发明的组合物可用于治疗与这些细菌的相关的种或菌株相关的感染，包括但不限于表皮葡萄球菌、耳葡萄球菌、头葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生性葡萄球菌、模仿葡萄球菌、木糖葡萄球菌、滕黄微球菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、E.hirae和/或鲍氏不动杆菌的一种或多种菌株，例如图24中所描述的一种或多种菌株。
在具体的实施方式中，接受本发明的药物组合物的受试者是哺乳动物(例如牛、绵羊、山羊、马、灵长类(例如人)、啮齿类、兔类或禽类(例如鸡、鸭、鹅))。在本发明的上下文中，“治疗”是指治疗性处理，其目标是消除、减轻、降低致病病况或病症的严重性，缓解、延缓致病病况或病症的进展，或预防与致病病况或病症相关的症状或根本诱因(例如细菌感染)。“治疗”既指治疗性的处理，也指预防性(prophylactic)或预防性(preventative)的措施，其中目标是消除、减轻、降低致病病况或病症的严重性，延缓致病病况或病症的进展，或者延迟或预防与致病病况或病症相关的症状或根本诱因(例如细菌感染)。还设想到的是，本发明的噬菌体和/或多肽作为预防性(prophylactic)或预防性(preventative)措施，预防由一种或多种细菌引起的感染的发生。
鲍氏不动杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌引起很多严重的机会性感染，尤其是在具有缺损的免疫系统的个体中。设想到本发明的药物组合物用于治疗与鲍氏不动杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌相关的任何感染，或与细菌的其它的种或菌株相关的任何感染，包括但不限于：皮肤的感染(包括但不限于皮肤溃疡、褥疮和糖尿病性足溃疡)、伤口内和伤口周围的感染、手术后感染、与导管和手术引流相关的感染以及血液的感染。
鲍氏不动杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌还与涉及具有高流体含量的器官系统的感染相关，设想了本发明的噬菌体和/或多肽在预防和治疗这些感染上具有治疗性用途。例如，本发明的药物组合物可用于预防或治疗呼吸道、脑脊髓液、腹膜液和尿道的感染。本发明的组合物还可用于预防和/或治疗医院肺炎、与连续性不卧床腹膜透析(CAPD)相关的感染，导管相关的细菌尿和医院脑膜炎。
在优选的实施方式中，本发明的噬菌体和/或多肽预防性地用于医院环境中，尤其是用于预防与伤口、溃疡和由于插导管导致的皮肤开口，以及任何其它医学程序或设备相关的感染。
在一些实施方式中，本发明的噬菌体和/或多肽用作单一试剂用于治疗或预防与鲍氏不动杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌或其它细菌物种相关的感染。在本发明的其它实施方式中，本发明的噬菌体和/或多肽与其它试剂(包括其它噬菌体(例如，靶向细菌的不同种或菌株的))，或与靶向相同或不同种类的细菌(包括选自下列的细菌：任意革兰氏阳性细菌、任意革兰氏阴性细菌和任意其它组的未被分类为革兰氏阳性或革兰氏阴性的细菌)的抗生素组合使用。本发明的组合物还可以与本领域技术人员已知的治疗细菌感染的任何其它方式组合使用。
本发明还设想到了预防和治疗由细菌(包括但不限于粪肠球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和/或鲍氏不动杆菌)引起的感染的方法，所述方法包括向有此需要的哺乳动物施用包含溶素的组合物，所述溶素包含SEQIDNO:68,SEQIDNO:184,SEQIDNO:202,SEQIDNO:203,SEQIDNO:446,SEQIDNO:447,SEQIDNO:448,SEQIDNO:575,SEQIDNO:641,I.D.NO:712和/或SEQIDNO:797的氨基酸序列或其片段、变体或衍生物或由其组成，其中所述片段、变体或衍生物显示出针对亲本噬菌体所分离自的细菌的种的抗菌或抗微生物活性。在根据该实施方式的具体实例中，本发明提供了预防或治疗由细菌(包括但不限于粪肠球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和/或鲍氏不动杆菌)引起的感染的方法，所述方法包括向有此需要的哺乳动物施用包含溶素的分离的CHAP结构域、或其片段、变体或衍生物的组合物，所述片段、变体或衍生物显示出其所分离自的CHAP结构域的至少一种生物学活性(例如溶解细胞杀灭)。在一些实施方式中，分离的CHAP结构域包含SEQIDNO:755,SEQIDNO:756,SEQIDNO:757,SEQIDNO:758或SEQIDNO:759的氨基酸序列或由其组成。在其它实施方式中，本发明提供了预防和治疗由细菌(包括但不限于粪肠球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和/或鲍氏不动杆菌)引起的感染的方法，所述方法包括向有此需要的哺乳动物施用包含尾部带测定蛋白或尾部蛋白的组合物，所述尾部带测定蛋白或尾部蛋白包含SEQIDNO:61,SEQIDNO:63,SEQIDNO:204,SEQIDNO:214,SEQIDNO:435,SEQIDNO:438,SEQIDNO:440,SEQIDNO:525,SEQIDNO:526,SEQIDNO:527,SEQIDNO:528,SEQIDNO:529,SEQIDNO:530,SEQIDNO:531,SEQIDNO:532,SEQIDNO:533,SEQIDNO:534,SEQIDNO:535,SEQIDNO:536,SEQIDNO:537,SEQIDNO:538,SEQIDNO:539,SEQIDNO:567,SEQIDNO:568,SEQIDNO:632,SEQIDNO:633,SEQIDNO:700,SEQIDNO:701,SEQIDNO:702,SEQIDNO:703,SEQIDNO:704和/或SEQIDNO:795的氨基酸序列或其片段、变体或衍生物或由之组成，其中所述片段、变体或衍生物显示出与亲本噬菌体相关的生物学活性。在其它实施方式中，本发明提供了预防和治疗由细菌(包括但不限于粪肠球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和/或鲍氏不动杆菌)引起的感染的方法，所述方法包括向有此需要的哺乳动物施用包含噬菌体的组合物，所述噬菌体具有包含SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7和/或SEQIDNO:760的核酸序列或由所述核酸序列组成的基因组。还设想到了溶素(或如上文所描述的其片段、变体或衍生物)与尾部带测定蛋白或尾部蛋白(或如上文描述的其片段、变体或衍生物)，任选地与本发明的一种或多种噬菌体或与其它治疗(例如抗生素)的组合，以及使用本文所描述的一种或多种组合治疗和预防细菌感染的方法。
如本文所使用的，术语“组合”是指使用多于一种预防剂和/或治疗剂。术语“组合”的使用不限制向具有疾病或病症的受试者施用预防剂和/或治疗剂的顺序。可以在向具有疾病或病症的受试者施用第二预防剂或治疗剂(与第一预防剂或治疗剂不同)之前(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之前)，与之同时，或在其之后(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之后)施用第一预防剂或治疗剂。
6.3消毒剂和抗感染性用途
细菌病原体最经常感染粘膜位点(例如上呼吸道和下呼吸道、肠、泌尿生殖的和眼睛的)。粘膜自身通常是在环境中发现的很多致病细菌(例如肺炎双球菌、葡萄球菌和链球菌)的贮库，有时是唯一的贮库。有极少的被设计为控制致病细菌的载体状态的抗感染剂。然而，已经有研究表明，通过减少或消除环境(例如医院和疗养院)中的这种贮库，将大大降低由这些细菌引起的感染的发生率。
本发明的噬菌体和/或多肽可用于用来控制细菌(例如革兰氏阳性细菌(例如粪肠球菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌)、革兰氏阴性细菌(例如铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌)或未被分类为革兰氏阳性或革兰氏阴性的细菌)生长的抗感染组合物中，以预防或减少严重感染的发生率。除了用于向粘膜的施用的组合物中之外，本发明的噬菌体和/或多肽还可以被掺入到制剂中，例如凝胶、霜、膏或喷雾剂，以用于控制或预防细菌在体表(例如皮肤和粘膜)(例如，用于对手术区域或者医护工作者和/或患者的手及暴露的皮肤进行灭菌)和其它固体表面(例如，器械、台面、尤其是医院的设备)上的定殖。
6.4诊断方法
本发明还包括用于确定细菌感染的诱因剂的诊断方法。在一些实施方式中，通过下列进行对细菌感染的呈现中的诱因剂的诊断：(i)根据标准技术培养患者的组织、血液或流体样品；(ii)将培养物与一种或多种本发明的噬菌体和/或多肽接触；和(iii)监测所述接触之后的细胞生长和裂解的证据。由于噬菌体和/或它们的分离的产物(例如多肽或其生物学活性片段、变体或衍生物)的活性倾向于是种或菌株特异性的，所以对于一种或多种本发明的噬菌体和/或多肽的敏感性或缺乏敏感性可以指示感染性细菌的种或菌株。例如，与具有包含核酸序列SEQIDNO:1或SEQIDNO:2或由核酸序列SEQIDNO:1或SEQIDNO:2组成的基因组的噬菌体接触，或与其分离的多肽产物接触之后，测试培养物的减少的生长可以指示包含粪肠球菌或屎肠球菌的测试样品。类似地，具有包含核酸序列SEQIDNO:3或由其组成的基因组的噬菌体，或其分离的多肽产物可用于鉴别由铜绿假单胞菌引起的感染；具有包含核酸序列SEQIDNO:760或由其组成的基因组的噬菌体，或其分离的多肽产物可用于鉴别由鲍氏不动杆菌引起的感染；而具有包含核酸序列SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6或SEQIDNO:7或由所述核酸序列组成的基因组的噬菌体，或其分离的多肽产物可用于鉴别由金黄色葡萄球菌引起的感染。
6.5氨基酸变体
可以产生本发明的多肽的氨基酸序列变体，从而它们是置换性、插入性或缺失性的变体。缺失性变体缺少天然蛋白中对于功能(例如抗微生物或抗菌活性)不是必需的一个或多个残基。插入性突变体通常包括在多肽的非末端点添加物质。置换性变体通常在蛋白内的一个或多个位点含有一个氨基酸与另一个的交换，并且可以被设计为调节所述多肽的一个或多个性质(例如针对蛋白水解切割的稳定性)而不丧失其它功能或性质。这种类型的置换优选是保守性的，即，一个氨基酸被置换为具有相似形状和电荷的氨基酸。保守性置换是本领域熟知的，包括例如下列改变：丙氨酸变为丝氨酸；精氨酸变为赖氨酸；天冬酰胺变为谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸变为谷氨酸；半胱氨酸变为丝氨酸；谷氨酰胺变为天冬酰胺；谷氨酸变为天冬氨酸；甘氨酸变为脯氨酸；组氨酸变为天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸变为亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸变为缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸变为精氨酸；甲硫氨酸变为亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸变为酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸变为苏氨酸；苏氨酸变为丝氨酸；色氨酸变为酪氨酸；酪氨酸变为色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸变为异亮氨酸或亮氨酸。
一旦基因的一般区域被鉴别为编码如本文所描述的特定溶素蛋白，则可以使用点诱变来特征性鉴别哪些氨基酸残基对于抗菌活性而言是重要的。因此，本领域技术人员将能够产生DNA链中的单一碱基变化以产生改变的密码子和错义突变。
优选地，蛋白的氨基酸突变产生等同的、甚至是改进的第二代分子。例如，蛋白结构中的一些氨基酸可以被替换为其它氨基酸而无可检测的功能(例如抗菌或抗微生物活性)损失。在进行这些改变时，可以考虑氨基酸的亲水性指数(hydropathicindex)。氨基酸的亲水性指数在赋予蛋白交互性生物功能上的重要性在本领域中是通常被理解的。被接受的是，氨基酸的相对亲水性特性促成所产生的蛋白的次级结构，此次级结构继而又确定了蛋白与其它分子的相互作用，例如，与革兰氏阳性细菌的外包被内的肽聚糖的相互作用。已经基于氨基酸的疏水性和电荷特性为每种氨基酸分配了亲水性指数，例如：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本领域还理解：可以基于亲水性有效进行类似氨基酸的置换。与疏水性类似，已经为每种氨基酸分配了亲水性的值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0+1)；谷氨酸(+3.0+1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5+1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。可以通过将一个氨基酸替换为另一个氨基酸(它们的亲水性指数在彼此的+2之内，优选在彼此的+1之内，或最优选在彼此的+5之内)来获得等同分子。在一些实施方式中，本发明包括这样的分离的肽：其相对于本文公开的氨基酸序列包含1,2,3,4,5,6,7,8,9或10或更多个氨基酸修饰(例如插入、置换、缺失等)。在优选的实施方式中，所进行的突变使得保留了特定多肽的生物学活性。例如，本发明包括分离自噬菌体F1245/05,F168/08,F170/08,F770/05,F197/08,F86/06,F87s/06和/或F91a/06的多肽，它们被突变为相对于本文所列的氨基酸序列包含1,2,3,4,5,6,7,8,9或10或更多个氨基酸修饰，并且它们显示出针对革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌(例如鲍氏不动杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌)的一个或多个种或菌株的抗菌活性。在具体的实施方式中，源自F168/08或F/170/08的本发明的多肽显示出至少针对粪肠球菌和/或屎肠球菌的抗菌或抗微生物活性(例如溶解杀灭活性)；源自F770/05的多肽显示出至少针对铜绿假单胞菌的活性；源自F197/08,F86/06,F87s/06或F91a/06的多肽显示出至少针对金黄色葡萄球菌的活性；源自F1245/05的多肽显示出至少针对鲍氏不动杆菌的活性。
6.6编码本发明的多肽的多核苷酸
本发明提供了包含编码本发明的多肽的核苷酸序列的多核苷酸。本发明还包括在高度严紧、中等严紧或低严紧杂交条件(例如上文定义的)下与编码本发明的多肽和编码具有抗菌和/或其它生物学活性的修饰的多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸。
可以通过本领域已知的任意方法获得所述多核苷酸并确定所述多核苷酸的核苷酸序列。例如，可以从来自适当来源(例如噬菌体F1245/05,F168/08,F170/08,F770/05,F197/08,F197/08,F86/06,F87s/06或F91a/06)的核酸产生编码本发明的多肽的多核苷酸。可以通过本领域已知的常规方法从噬菌体基因组分离核苷酸序列(见，例如Carlson,“Workingwithbacteriophages:commontechniquesandmethodologicalapproaches,”见KutterandSulakvelidze(编)Bacteriophages:BiologyandApplications,5thed.CRCPress(2005)；通过引用方式全文并入本文)。如果含有编码特定多肽的来源是不可获得的，但是本发明的多肽的氨基酸序列是已知的，则可以化学地合成编码所述多肽的核酸并使用本领域熟知的任何方法克隆到可复制的克隆载体中。
一旦确定了本发明的多肽的核苷酸序列，则可以使用本领域熟知的用于操作核苷酸序列的方法(例如重组DNA技术、定点诱变、PCR等)(见，例如描述于下列文献中的技术：Sambrook等人,1990,MolecularCloning,ALaboratoryManual,2dEd.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY和Ausubel等人编,1998,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NY,二者通过引用方式全文并入本文)来操作所述多肽的核苷酸序列，以产生具有不同氨基酸序列的多肽，例如产生氨基酸置换、缺失和/或插入。
在本发明的另一个实施方式中，提供了下列核苷酸序列：SEQIDNO:760的核苷酸1至核苷酸85的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸87至核苷酸584的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸594至核苷酸767的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸724至核苷酸1035的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸1005至核苷酸1823的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸1816至核苷酸2130的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸2132至核苷酸2383的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸2383至核苷酸3690的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸3687至4469的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸4466至核苷酸5458的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸5632至核苷酸7956的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸8010至核苷酸8912的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸8915至核苷酸9262的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸9252至核苷酸10223的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸10213至核苷酸10782的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸10769至核苷酸11218的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸11202至核苷酸11420的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸11413至核苷酸12342的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸12339至核苷酸12515的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸12512至核苷酸13165的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸13170至核苷酸15599的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸15609至核苷酸15872的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸15979至核苷酸16173的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸16175至核苷酸16482的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸16494至核苷酸18059的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸18072至核苷酸18815的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸18857至核苷酸19879的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸19930至核苷酸20178的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸20180至核苷酸20545的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸20646至核苷酸21203的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸21212至核苷酸23506的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸23506至核苷酸24186的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸24201至核苷酸27068的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸27084至核苷酸30212的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸30214至核苷酸32505的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸32515至核苷酸32880的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸32873至核苷酸33460的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸33460至核苷酸33816的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸33825至核苷酸35777的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸35774至核苷酸35872的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸35869至核苷酸36027的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸36038至核苷酸36193的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸36916至核苷酸36788的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸37209至核苷酸37427的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸37868至核苷酸38386的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸38383至核苷酸38586的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸38912至核苷酸39406的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸39406至核苷酸39915的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸39917至核苷酸40021的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸40018至核苷酸40101的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸40101至核苷酸40670的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸40720至核苷酸41838的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸41822至核苷酸42127的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸42105至核苷酸42308的核苷酸序列；SEQIDNO:760的核苷酸42382至核苷酸42912的核苷酸序列；和SEQIDNO:760的核苷酸42896至核苷酸43015的核苷酸序列。
6.7本发明的分子的重组表达
一旦获得编码本发明的分子(例如多肽)的核酸序列，可以使用本领域熟知的技术通过重组DNA技术来产生用于产生所述分子的载体。可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建包含编码本发明的分子和合适的转录和翻译控制信号的的序列的表达载体。这些方法包括例如：体外重组DNA技术、合成技术以及体内遗传重组(见例如，描述于Sambrook等人,1990,MolecularCloning,ALaboratoryManual,2dEd.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY和Ausubel等人eds.,1998,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NY中的技术)。
本发明提供了编码本发明的多肽的表达载体。包含通过本发明的方法鉴别的分子的核苷酸序列的表达载体可以通过常规技术(例如电穿孔、脂质体转染和磷酸钙沉淀)被转移至宿主细胞内，然后可以通过常规技术培养经转染的细胞以产生本发明的分子。在优选的实施方式中，宿主细胞是除了包含所述序列的噬菌体所源自的亲本细菌之外的种。在具体的实施方式中，通过组成型、可诱导的或组织特异性启动子来调节本发明的分子的表达。在具体的实施方式中，表达载体是pQE-30(Qiagen)或pET-29(a)(Novagen)。
用于表达通过本发明的方法鉴别的分子的宿主细胞可以是细菌细胞(对于本发明的噬菌体蛋白或其片段不敏感的)，例如大肠杆菌。可以使用多种宿主表达载体系统来表达通过本发明的方法所鉴别的分子。此类宿主表达系统代表了介质，通过所述介质可以产生本发明的分子的编码序列并随后将其纯化；所述宿主表达系统也代表了这样的细胞：当用合适的编码序列的核苷酸转化或转染所述细胞时，其原位表达本发明的分子。这些包括但不限于：微生物，例如，以重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的、对于本发明的噬菌体蛋白或其片段不敏感的细菌(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)，所述表达载体包含编码通过本发明的方法鉴别的分子的序列；以包含编码通过本发明的方法鉴别的分子的序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如毕赤酵母(SaccharomycesPichia))；以包含编码通过本发明的方法鉴别的分子的序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；以包含编码通过本发明的方法鉴别的分子的序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)和烟草花叶病毒(TMV))或重组质粒表达载体(例如Ti质粒)感染或转化的植物细胞系统；或携带含有源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS,CHO,BHK,293,293T,3T3细胞，淋巴细胞(见例如美国专利号5,807,715),PerC.6细胞(由Crucell开发的人视网膜细胞)。
在对于本发明噬菌体蛋白或片段不敏感的细菌系统中，可以有利地基于对所表达的分子期望的用途来选择多个表达载体。例如，当要产生大量的此类蛋白以用于产生多肽的药物组合物时，指导容易被纯化的融合蛋白产物的高水平表达的载体可能是所需要的。此类载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等人,1983,EMBOJ.2:1791)，其中蛋白质序列可以单独地被连接到该载体中、与lacZ编码区同框，从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye&Inouye,1985,NucleicAcidsRes.13:3101-3109；VanHeeke&Schuster,1989,J.Biol.Chem.24:5503-5509)等等。pGEX载体也可用于表达外源多肽，例如含有谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。一般地，此类融合蛋白是可溶的，并且可以通过吸附和结合至基质谷胱甘肽-琼脂糖珠子、然后在存在游离谷胱甘肽的情况下洗脱而容易地从裂解的细胞中被纯化。pGEX载体被设计为包含凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，从而被克隆的靶基因产物可以从GST部分被释放。
在昆虫系统中，使用苜宿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)作为载体来表达外源基因。该病毒生长于草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞中。可以将编码多肽的序列单独地克隆到该病毒的非必需区域(例如多角体基因)中并置于AcNPV启动子(例如多角体启动子)的控制下。
一旦重组表达了本发明的分子(即多肽)，可以通过本领域已知的用于纯化多肽的任何方法(例如通过色谱法(例如离子交换色谱、亲和色谱和尺寸柱色谱)，离心，差别溶解性)或通过任何其它用于纯化多肽或抗体的标准技术对其进行纯化。
在阅读了以上描述之后本领域技术人员将认识到一些修饰和改进。应该理解，为了简洁和易读，本文中删除了所有此类修饰和改进，但是它们恰当地落在以下权利要求的范围内。
7.实施例
要理解：本文描述的以下实施例和实施方式仅是为了解释目的，其各种修饰或改变对于本领域技术人员将是启发性的，并且包括在本申请的精神和范围以及随附的权利要求的范围内。本文引用的所有公开物、专利和专利申请为了所有目的通过引用方式全文并入本文。
除非另有指明，否则根据以下方法分离、处理和分析本发明的噬菌体。
7.1方法
7.1.1噬菌体的纯化
根据Carlson,“Workingwithbacteriophages:commontechniquesandmethodologicalapproaches,”In,KutterandSulakvelidze(Eds)Bacteriophages:BiologyandApplications,5thed.CRCPress(2005)(“Carlson,”通过引用方式全文并入本文)中描述的方法准备分离自临床样品的噬菌体的储备制备物。
根据Carlson和Yamamoto等人,2004,PNAS101:6415-6420描述的程序通过使用PEG沉淀来浓缩噬菌体的储备制备物。简而言之，将储备制备物在4℃在1MNaCl中搅拌温育1小时。然后，逐渐加入PEG8000(AppliChem,Cheshire,MA)至10％(w/v)的终浓度。将组合物在4℃温育过夜。温育期之后，将组合物在10000xg下、在4℃离心30分钟。然后将沉淀物重悬于含有1％w/v的明胶的SM缓冲液(0.05MTris-HCL、pH7.4,0.1MNaCl,10mMMgSO4)中，并再次以1000rpm在4℃离心10分钟。保存含有悬浮的噬菌体的上清液以进行进一步纯化。根据Carlson的方法使用CsCl梯度纯化上清液。
通过透析从经纯化并浓缩的噬菌体中除掉CsCl。根据生产商的说明书制备透析膜Cellu.SepH1HighGradeRegeneratedCelluloseTubularMembrane(Cellu.Sep,RiverStreet,USA)。透析由下列组成：首先在100mMTris-HCl和3MNaCl(pH7.4)中在4℃温育30分钟；然后在100mMTris-HCl和0.3MNaCl(pH7.4)中在4℃第二次温育30分钟；透析之后，从透析袋内部取出悬浮的噬菌体并储存于4℃。
7.1.2噬菌体DNA的提取
向5ml经纯化并浓缩的噬菌体样品中加入pH为8.0的20mMEDTA，0.5％(p/v)的SDS和终浓度为40μg/ml的蛋白酶K。将该混合物在56℃温育1小时。用25:24:1比例的苯酚:氯仿:醇进行连续提取，直至水相和有机相之间的界面变得清晰。然后以等体积的氯仿处理水相并以13,0000xg在4℃离心10分钟。再次除掉水相，通过加入2倍体积的无水乙醇并在20℃温育30分钟使DNA沉淀。然后将样品以11,000xg在4℃离心30分钟。在室温以70％的乙醇洗涤沉淀物并重悬于50μl超纯水(Gibco,California)中。通过在ND-1000分光光度计中测定在260nm处的吸光度来确定DNA的浓度。通过1％的琼脂糖凝胶电泳来分析分离的噬菌体DNA的完整性。
7.1.3噬菌体基因组的分析
噬菌体基因组的测序允许鉴别基因组内的潜在的开放阅读框(ORF)。使用BLASTN程序(见，例如Zhang等人,2000,J.Comput.Biol.7:203-214)，使用噬菌体的推定的ORF就同源DNA序列搜索NCBI核苷酸收集数据库。
7.2实施例1：噬菌体F168/08
噬菌体F168/08基因组的推定的ORF与NCBI核苷酸数据库中的序列的比较揭示了：仅有小部分的基因组(<1％)显示出与已知序列的同源性。图2中提供了F168/08ORF、它们编码的氨基酸序列和已知的同源蛋白。通过整合使用GeneMark.hmm和MetaGeneAnnotator程序(Besemer,J.andBorodovsky,M.1999.NucleicAcidsRes.,27:3911-3920；Noguchi,H.等人,2008.DNARes.,15:387-396)获得的结果进行了orf的预测。使用BLASTP程序(Alschul,S.F.等人,1997.NucleicAcidsRes.,25:3389-33402)，使用NCBI非冗余蛋白质序列数据库进行蛋白质同源性搜索。使用NCBI专门化的BLAST(Marchler-Bauer,A.等人,2007.NucleicAcidsRes.35:237-240)预测蛋白的保守性结构域。在图2中以相同数字外加小写字母标示了其产物与相同的蛋白显示出同源性的orf。使用tRNAscan-SE程序(Lowe,T.M.等人,1997.NucleicAcidsRes.,25:955-964)进行推定的转运RNA基因(tRNA)的鉴别。
图3A-B提供了斑点试验的结果，其测定了噬菌体F168/08针对分离自临床样品的105个粪肠球菌(A)和56个屎肠球菌(B)菌株的活性。每个斑点由5μl具有标明的滴度的噬菌体悬浮液(从CsCl纯化的裂解物制备而来)组成。对于噬菌体的敏感性表示为混浊(+)至清晰(++++)范围内裂解色圈的等级。对噬菌体感染的抗性标记为(-)。
7.3实施例2：噬菌体F170/08
噬菌体F170/08基因组的推定的ORF与NCBI核苷酸数据库中的序列的比较揭示了：其基因组的约94％与肠球菌噬菌体ΦEF24C高度相似，单个ORF的同一性在80％到100％的范围内。图5中提供了F170/08ORF、它们编码的氨基酸序列和已知的同源蛋白。通过整合使用GeneMark.hmm和MetaGeneAnnotator程序(Besemer,J.andBorodovsky,M.1999.NucleicAcidsRes.,27:3911-3920；Noguchi,H.等人,2008.DNARes.,15:387-396)获得的结果进行orf的预测。使用BLASTP程序(Alschul,S.F.等人,1997.NucleicAcidsRes.,25:3389-33402)，使用NCBI非冗余蛋白质序列数据库进行蛋白质同源性搜索。使用NCBI专门化的BLAST(Marchler-Bauer,A.等人,2007.NucleicAcidsRes.35:237-240)预测蛋白的保守性结构域。在图5中以相同数字外加小写字母标示了其产物与相同的蛋白显示出同源性的orf。使用tRNAscan-SE程序(Lowe,T.M.等人,1997.NucleicAcidsRes.,25:955-964)进行推定的转运RNA基因(tRNA)的鉴别。
图6A-B提供了斑点试验的结果，其测定了噬菌体F170/08针对分离自临床样品的105个粪肠球菌(A)和56个屎肠球菌(B)菌株的活性。每个斑点由5μl具有标明的滴度的噬菌体悬浮液(从CsCl纯化的裂解物制备而来)组成。对于噬菌体的敏感性表示为混浊(+)至清晰(++++)范围内裂解色圈的等级。对噬菌体感染的抗性标记为(-)。
7.4实施例3：噬菌体F770/05
噬菌体F770/05基因组的推定的ORF与NCBI核苷酸数据库中的序列的比较揭示了：仅有小部分的基因组(<1％)显示出与已知序列的同源性。图8中提供了F170/05ORF、它们编码的氨基酸序列和已知的同源蛋白。通过整合使用GeneMark.hmm和MetaGeneAnnotator程序(Besemer,J.andBorodovsky,M.1999.NucleicAcidsRes.,27:3911-3920；Noguchi,H.等人,2008.DNARes.,15:387-396)获得的结果进行orf的预测。使用BLASTP程序(Alschul,S.F.等人,1997.NucleicAcidsRes.,25:3389-33402)，使用NCBI非冗余蛋白质序列数据库进行蛋白质同源性搜索。使用NCBI专门化的BLAST(Marchler-Bauer,A.等人,2007.NucleicAcidsRes.35:237-240)预测蛋白的保守性结构域。
图9提供了斑点试验的结果，其测定了噬菌体F170/05针对分离自临床样品的100个铜绿假单胞菌菌株的活性。每个斑点由5μl具有标明的滴度的噬菌体悬浮液(从CsCl纯化的裂解物制备而来)组成。对于噬菌体的敏感性表示为混浊(+)至清晰(++++)范围内裂解色圈的等级。对噬菌体感染的抗性标记为(-)。
7.5实施例4：噬菌体F197/08
噬菌体F197/08基因组的推定的ORF与NCBI核苷酸数据库中的序列的比较揭示了：基因组与多个葡萄球菌噬菌体基因组是高度同源的。特别地，大约90％的F197/08基因组与葡萄球菌噬菌体phiSauS-IPLA35的基因组高度相似，单个ORF的同一性在80％至98％的范围内。图11中提供了F197/08ORF、它们编码的氨基酸序列和已知的同源蛋白。通过整合使用GeneMark.hmm和MetaGeneAnnotator程序(Besemer,J.andBorodovsky,M.1999.NucleicAcidsRes.,27:3911-3920；Noguchi,H.等人,2008.DNARes.,15:387-396)获得的结果进行orf的预测。使用BLASTP程序(Alschul,S.F.等人,1997.NucleicAcidsRes.,25:3389-33402)，使用NCBI非冗余蛋白质序列数据库进行蛋白质同源性搜索。使用NCBI专门化的BLAST(Marchler-Bauer,A.等人,2007.NucleicAcidsRes.35:237-240)预测蛋白的保守性结构域。在图11中以相同数字外加小写字母标示了其产物与相同的蛋白显示出同源性的orf。
图12提供了斑点试验的结果，其测定了噬菌体F197/08针对分离自临床样品的100个金黄色葡萄球菌菌株的活性。每个斑点由5μl具有标明的滴度的噬菌体悬浮液(从CsCl纯化的裂解物制备而来)组成。对于噬菌体的敏感性表示为混浊(+)至清晰(++++)范围内裂解色圈的等级。对噬菌体感染的抗性标记为(-)。
7.6实施例5：噬菌体F86/06
噬菌体F86/06基因组的推定的ORF与NCBI核苷酸数据库中的序列的比较揭示了：基因组与多个葡萄球菌噬菌体基因组是高度同源的。特别地，大约80％的F86/06基因组与葡萄球菌噬菌体tp310-1的基因组高度相似，单个ORF的同一性在85％至100％的范围内。图14中提供了F86/06ORF、它们编码的氨基酸序列和已知的同源蛋白。通过整合使用GeneMark.hmm和MetaGeneAnnotator程序(Besemer,J.andBorodovsky,M.1999.NucleicAcidsRes.,27:3911-3920；Noguchi,H.等人,2008.DNARes.,15:387-396)获得的结果进行orf的预测。使用BLASTP程序(Alschul,S.F.等人,1997.NucleicAcidsRes.,25:3389-33402)，使用NCBI非冗余蛋白质序列数据库进行蛋白质同源性搜索。使用NCBI专门化的BLAST(Marchler-Bauer,A.等人,2007.NucleicAcidsRes.35:237-240)预测蛋白的保守性结构域。
图15提供了斑点试验的结果，其测定了噬菌体F86/06针对分离自临床样品的100个金黄色葡萄球菌菌株的活性。每个斑点由5μl具有标明的滴度的噬菌体悬浮液(从CsCl纯化的裂解物制备而来)组成。对于噬菌体的敏感性表示为混浊(+)至清晰(++++)范围内裂解色圈的等级。对噬菌体感染的抗性标记为(-)。
7.7实施例6：噬菌体F87s/06
噬菌体F87s/06基因组的推定的ORF与NCBI核苷酸数据库中的序列的比较揭示了：基因组与多个葡萄球菌噬菌体基因组是高度同源的。特别地，大约82％的F87s/06基因组与葡萄球菌噬菌体ΦNM3的基因组高度相似，单个ORF的同一性在90％至100％的范围内。图17中提供了F86/06ORF、它们编码的氨基酸序列和已知的同源蛋白。通过整合使用GeneMark.hmm和MetaGeneAnnotator程序(Besemer,J.andBorodovsky,M.1999.NucleicAcidsRes.,27:3911-3920；Noguchi,H.等人,2008.DNARes.,15:387-396)获得的结果进行orf的预测。使用BLASTP程序(Alschul,S.F.等人,1997.NucleicAcidsRes.,25:3389-33402)，使用NCBI非冗余蛋白质序列数据库进行蛋白质同源性搜索。使用NCBI专门化的BLAST(Marchler-Bauer,A.等人,2007.NucleicAcidsRes.35:237-240)预测蛋白的保守性结构域。在图17中以相同数字外加小写字母标示了其产物与相同的蛋白显示出同源性的orf。
图18提供了斑点试验的结果，其测定了噬菌体F87s/06针对分离自临床样品的100个金黄色葡萄球菌菌株的活性。每个斑点由5μl具有标明的滴度的噬菌体悬浮液(从CsCl纯化的裂解物制备而来)组成。对于噬菌体的敏感性表示为混浊(+)至清晰(++++)范围内裂解色圈的等级。对噬菌体感染的抗性标记为(-)。
7.8实施例7：噬菌体F91a/06
噬菌体F91a/06基因组的推定的ORF与NCBI核苷酸数据库中的序列的比较揭示了：基因组与多个葡萄球菌噬菌体基因组是高度同源的。特别地，大约82％的F91a/06基因组与葡萄球菌噬菌体ΦNM3的基因组高度相似，单个ORF的同一性在86％至99％的范围内。图20中提供了F91a/06ORF、它们编码的氨基酸序列和已知的同源蛋白。通过整合使用GeneMark.hmm和MetaGeneAnnotator程序(Besemer,J.andBorodovsky,M.1999.NucleicAcidsRes.,27:3911-3920；Noguchi,H.等人,2008.DNARes.,15:387-396)获得的结果进行orf的预测。使用BLASTP程序(Alschul,S.F.等人,1997.NucleicAcidsRes.,25:3389-33402)，使用NCBI非冗余蛋白质序列数据库进行蛋白质同源性搜索。使用NCBI专门化的BLAST(Marchler-Bauer,A.等人,2007.NucleicAcidsRes.35:237-240)预测蛋白的保守性结构域。在图20中以相同数字外加小写字母标示了其产物与相同的蛋白显示出同源性的orf。
图21提供了斑点试验的结果，其测定了噬菌体F91a/06针对分离自临床样品的100个金黄色葡萄球菌菌株的活性。每个斑点由5μl具有标明的滴度的噬菌体悬浮液(从CsCl纯化的裂解物制备而来)组成。对于噬菌体的敏感性表示为混浊(+)至清晰(++++)范围内裂解色圈的等级。对噬菌体感染的抗性标记为(-)。
7.9实施例8：噬菌体F1245/05
图23A-I中提供了F1245/05ORF、它们编码的氨基酸序列和已知的同源蛋白。通过整合使用GeneMark.hmm和MetaGeneAnnotator程序(Besemer,J.andBorodovsky,M.1999.NucleicAcidsRes.,27:3911-3920；Noguchi,H.等人,2008.DNARes.,15:387-396)获得的结果进行orf的预测。使用BLASTP程序(Alschul,S.F.等人,1997.NucleicAcidsRes.,25:3389-33402)，使用NCBI非冗余蛋白质序列数据库进行蛋白质同源性搜索。使用NCBI专门化的BLAST(Marchler-Bauer,A.等人,2007.NucleicAcidsRes.35:237-240)预测蛋白的保守性结构域。基于对应基因的基因组定位和所编码的产物的推定的跨膜结构域的存在来预测蛋白的功能(TMHMMserverv.2.0；Krogh,A.等人,2001.J.Mol.Biol.,305:567-580)。
图24A-E提供了斑点试验的结果，其测定了噬菌体F1245/05针对分离自临床样品的100个鲍氏不动杆菌菌株的活性。每个斑点由5μl具有标明的滴度的噬菌体悬浮液(从CsCl纯化的裂解物制备而来)组成。对于噬菌体的敏感性表示为混浊(+)至清晰(++++)范围内裂解色圈的等级。对噬菌体感染的抗性标记为(-)。
优选的实施方式：
1.分离的噬菌体，其具有包含SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7或SEQIDNO:760的核酸序列的基因组。
2.药物组合物，其包含项目1的噬菌体和药学上可接受的载体。
3.项目2的药物组合物，其包含：具有包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的核酸序列的基因组的噬菌体；还包含：有效抵抗粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)或屎肠球菌(Enterococcusfaecium)的一种或多种其它噬菌体。
4.项目2的药物组合物，其包含：具有包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的核酸序列的基因组的噬菌体；还包含：有效抵抗粪肠球菌或屎肠球菌之外的细菌的一种或多种其它噬菌体。
5.项目2的药物组合物，其包含：具有包含SEQIDNO:3的核酸序列的基因组的噬菌体；还包含：有效抵抗铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的一种或多种其它噬菌体。
6.项目2的药物组合物，其包含：具有包含SEQIDNO:3的核酸序列的基因组的噬菌体；还包含：有效抵抗铜绿假单胞菌之外的细菌的一种或多种其它噬菌体。
7.项目2的药物组合物，其包含：具有包含SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6或SEQIDNO:7的核酸序列的基因组的噬菌体；还包含：有效抵抗金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的一种或多种其它噬菌体。
8.项目2的药物组合物，其包含：具有包含SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6或SEQIDNO:7的核酸序列的基因组的噬菌体；还包含：有效抵抗金黄色葡萄球菌之外的细菌的一种或多种其它噬菌体。
9.项目2的药物组合物，其包含：具有包含SEQIDNO:760的核酸序列的基因组的噬菌体；还包含：有效抵抗鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)的一种或多种其它噬菌体。
10.项目2的药物组合物，其包含：具有包含SEQIDNO:760的核酸序列的基因组的噬菌体；还包含：有效抵抗鲍氏不动杆菌之外的细菌的一种或多种其它噬菌体。
11.来自噬菌体F1245/05,F168/08,F170/08,F197/08,F86/06,F87s/06或F91a/06的分离的溶素蛋白或其片段、变体或衍生物，具有针对鲍氏不动杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌和金黄色葡萄球菌中的一种或多种的抗菌或抗微生物活性。
12.项目11的分离的溶素蛋白，所述蛋白具有SEQIDNO:68,SEQIDNO:184,SEQIDNO:202,SEQIDNO:203,SEQIDNO:446,SEQIDNO:447,SEQIDNO:448,SEQIDNO:575,SEQIDNO:641,SEQIDNO:712,SEQIDNO:797的氨基酸序列，或其片段、变体或衍生物，其中所述片段、变体或衍生物具有针对粪肠球菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌和鲍氏不动杆菌中的一种或多种的抗菌或抗微生物活性。
13.与相同大小的第二蛋白具有至少85％序列同一性的分离的第一蛋白，其中所述第一蛋白具有针对鲍氏不动杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌和金黄色葡萄球菌中的一种或多种的抗菌或抗微生物活性，并且所述第二蛋白具有SEQIDNO:797,SEQIDNO:68,SEQIDNO:184,SEQIDNO:202,SEQIDNO:203,SEQIDNO:446,SEQIDNO:447,SEQIDNO:448,SEQIDNO:575,SEQIDNO:641,SEQIDNO:712的氨基酸序列或其片段。
14.项目13的分离的第一蛋白，其与所述第二蛋白具有至少95％的序列同一性。
15.项目11的片段，其中所述片段是分离自具有SEQIDNO:68,SEQIDNO:184,SEQIDNO:202,SEQIDNO:203,SEQIDNO:446,SEQIDNO:447,SEQIDNO:448,SEQIDNO:575,SEQIDNO:641或SEQIDNO:712的氨基酸序列的多肽的CHAP结构域。
16.项目15的片段，其中所述片段具有SEQIDNO:755,SEQIDNO:756,SEQIDNO:757,SEQIDNO:758或SEQIDNO:759的氨基酸序列。
17.来自噬菌体F168/08,F170/08,F770/05,F197/08,F86/06,F87s/06,F91a/06或F1245/05的分离的尾部带测定蛋白或尾部蛋白，或其片段、变体或衍生物，其具有与其所分离自的噬菌体相关的生物学活性。
18.项目17的分离的尾部带测定蛋白或尾部蛋白，所述蛋白具有SEQIDNO:61,SEQIDNO:63,SEQIDNO:204,SEQIDNO:214,SEQIDNO:435,SEQIDNO:438,SEQIDNO:440,SEQIDNO:525,SEQIDNO:526,SEQIDNO:527,SEQIDNO:528,SEQIDNO:529,SEQIDNO:530,SEQIDNO:531,SEQIDNO:532,SEQIDNO:533,SEQIDNO:534,SEQIDNO:535,SEQIDNO:536,SEQIDNO:537,SEQIDNO:538,SEQIDNO:539,SEQIDNO:567,SEQIDNO:568,SEQIDNO:632,SEQIDNO:633,SEQIDNO:700,SEQIDNO:701,SEQIDNO:702,SEQIDNO:703,SEQIDNO:704,SEQIDNO:795的氨基酸序列，或其片段、变体或衍生物，其中所述片段、变体或衍生物具有与其所分离自或衍生自的噬菌体相关的生物学活性。
19.与相同大小的第二蛋白具有至少85％序列同一性的分离的第一蛋白，其中所述第一蛋白具有与噬菌体F168/08,F170/08,F770/05,F197/08,F86/06,F87s/06,F91a/06或F1245/05相关的生物学活性，并且所述第二蛋白具有SEQIDNO:61,SEQIDNO:63,SEQIDNO:204,SEQIDNO:214,SEQIDNO:435,SEQIDNO:438,SEQIDNO:440,SEQIDNO:525,SEQIDNO:526,SEQIDNO:527,SEQIDNO:528,SEQIDNO:529,SEQIDNO:530,SEQIDNO:531,SEQIDNO:532,SEQIDNO:533,SEQIDNO:534,SEQIDNO:535,SEQIDNO:536,SEQIDNO:537,SEQIDNO:538,SEQIDNO:539,SEQIDNO:567,SEQIDNO:568,SEQIDNO:632,SEQIDNO:633,SEQIDNO:700,SEQIDNO:701,SEQIDNO:702,SEQIDNO:703,SEQIDNO:704,SEQIDNO:795的氨基酸序列或其片段。
20.项目19的分离的第一蛋白，其与所述第二蛋白具有至少95％的序列同一性。
21.药物组合物，其包含项目11或17的分离的蛋白和药学上可接受的载体。
22.项目21的药物组合物，其包含：具有SEQIDNO:61,SEQIDNO:63,SEQIDNO:68,SEQIDNO:184,SEQIDNO:202,SEQIDNO:203,SEQIDNO:204或SEQIDNO:214的氨基酸序列的分离的蛋白，或其具有针对粪肠球菌或屎肠球菌的抗菌或抗微生物活性的片段、变体或衍生物；还包含：有效抵抗粪肠球菌或屎肠球菌的一种或多种噬菌体或其它蛋白。
23.项目21的药物组合物，其包含：具有SEQIDNO:61,SEQIDNO:63,SEQIDNO:68,SEQIDNO:184,SEQIDNO:202,SEQIDNO:203,SEQIDNO:204或SEQIDNO:214的氨基酸序列的分离的蛋白，或其具有针对粪肠球菌或屎肠球菌的抗菌或抗微生物活性的片段、变体或衍生物；还包含：有效抵抗粪肠球菌或屎肠球菌之外的细菌的一种或多种噬菌体或其它蛋白。
24.项目21的药物组合物，其包含：具有SEQIDNO:435或SEQIDNO:438的氨基酸序列的分离的蛋白，或其具有针对铜绿假单胞菌的抗菌或抗微生物活性的片段、变体或衍生物；还包含：有效抵抗铜绿假单胞菌的一种或多种噬菌体或其它蛋白。
25.项目21的药物组合物，其包含：具有SEQIDNO:435或SEQIDNO:438的氨基酸序列的分离的蛋白，或其具有针对铜绿假单胞菌的抗菌或抗微生物活性的片段、变体或衍生物；还包含：有效抵抗铜绿假单胞菌之外的细菌的一种或多种噬菌体或其它蛋白。
26.项目21的药物组合物，其包含：具有SEQIDNO:440,SEQIDNO:525,SEQIDNO:526,SEQIDNO:527,SEQIDNO:528,SEQIDNO:529,SEQIDNO:530,SEQIDNO:531,SEQIDNO:532,SEQIDNO:533,SEQIDNO:534,SEQIDNO:535,SEQIDNO:536,SEQIDNO:537,SEQIDNO:538,SEQIDNO:539,SEQIDNO:567,SEQIDNO:568,SEQIDNO:632,SEQIDNO:633,SEQIDNO:700,SEQIDNO:701,SEQIDNO:702,SEQIDNO:703,SEQIDNO:704的氨基酸序列的分离的蛋白，或其具有针对金黄色葡萄球菌的抗菌或抗微生物活性的片段、变体或衍生物；还包含有效抵抗金黄色葡萄球菌的一种或多种噬菌体或其它蛋白。
27.项目21的药物组合物，其包含：具有SEQIDNO:440,SEQIDNO:525,SEQIDNO:526,SEQIDNO:527,SEQIDNO:528,SEQIDNO:529,SEQIDNO:530,SEQIDNO:531,SEQIDNO:532,SEQIDNO:533,SEQIDNO:534,SEQIDNO:535,SEQIDNO:536,SEQIDNO:537,SEQIDNO:538,SEQIDNO:539,SEQIDNO:567,SEQIDNO:568,SEQIDNO:632,SEQIDNO:633,SEQIDNO:700,SEQIDNO:701,SEQIDNO:702,SEQIDNO:703,SEQIDNO:704的氨基酸序列的分离的蛋白，或其具有针对金黄色葡萄球菌的抗菌或抗微生物活性的片段、变体或衍生物；还包含有效抵抗金黄色葡萄球菌之外的细菌的一种或多种噬菌体或其它蛋白。
28.项目21的药物组合物，其包含：具有SEQIDNOS:761-816的氨基酸序列的分离的蛋白，或其具有针对鲍氏不动杆菌的抗菌或抗微生物活性的片段、变体或衍生物；还包含有效抵抗鲍氏不动杆菌的一种或多种噬菌体或其它蛋白。
29.项目21的药物组合物，其包含：具有SEQIDNOS:761-816的氨基酸序列的分离的蛋白，或其具有针对鲍氏不动杆菌的抗菌或抗微生物活性的片段、变体或衍生物；还包含有效抵抗鲍氏不动杆菌之外的细菌的一种或多种噬菌体或其它蛋白。
30.分离的核酸，其包含编码项目11或17的蛋白的核苷酸序列。
31.治疗或预防有此需要的受试者中的细菌感染的方法，包括向所述受试者施用治疗量的项目2或21的药物组合物。
32.项目31的方法，其中所述细菌感染是由鲍氏不动杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌中的一种或多种引起的感染。
33.项目31的方法，其中所述细菌感染是由鲍氏不动杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌之外的细菌引起的感染。
34.项目31的方法，其中所述感染是医院感染。
35.项目31的方法，其中所述组合物被表面地施用。
36.项目31的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
37.项目36的方法，其中所述哺乳动物是人。
38.项目31的方法，其中所治疗的感染是皮肤的感染。
39.项目38的方法，其中所述皮肤的感染是与糖尿病性足溃疡相关的感染。
40.用于诊断细菌感染的诱因剂的方法，包括：
(i)培养来自患者的组织样品；
(ii)将步骤(i)的培养物与项目1、11或17的噬菌体或蛋白接触；
(iii)就培养物裂解或生长的证据进行监测，
其中培养物裂解的证据指示该培养物包含已知对于步骤(ii)中所使用的噬菌体或多肽敏感的细菌的种或菌株。
41.项目40的方法，其中所述组织样品是收集自所述患者的血液、流体、组织活检、或拭子样品。
42.用于减少或抑制细菌在表面上的定殖或生长的方法，包括使所述表面与项目1、11或17的噬菌体或多肽接触。
43.项目42的方法，其中所述表面是哺乳动物的皮肤或粘膜。
44.项目43的方法，其中所述哺乳动物是人。
45.项目42的方法，其中所述表面是医院器械或医院设备的表面。
46.项目45的方法，其中所述器械或设备是手术器械或手术设备。

Claims (10)

1.分离的噬菌体，其具有包含SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7或SEQIDNO:760的核酸序列的基因组。
2.药物组合物，其包含权利要求1的噬菌体和药学上可接受的载体。
3.权利要求2的药物组合物，其包含：具有包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的核酸序列的基因组的噬菌体；还包含：有效抵抗粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)或屎肠球菌(Enterococcusfaecium)的一种或多种其它噬菌体。
4.权利要求2的药物组合物，其包含：具有包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的核酸序列的基因组的噬菌体；还包含：有效抵抗粪肠球菌或屎肠球菌之外的细菌的一种或多种其它噬菌体。
5.权利要求2的药物组合物，其包含：具有包含SEQIDNO:3的核酸序列的基因组的噬菌体；还包含：有效抵抗铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的一种或多种其它噬菌体。
6.权利要求2的药物组合物，其包含：具有包含SEQIDNO:3的核酸序列的基因组的噬菌体；还包含：有效抵抗铜绿假单胞菌之外的细菌的一种或多种其它噬菌体。
7.权利要求2的药物组合物，其包含：具有包含SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6或SEQIDNO:7的核酸序列的基因组的噬菌体；还包含：有效抵抗金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的一种或多种其它噬菌体。
8.权利要求2的药物组合物，其包含：具有包含SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6或SEQIDNO:7的核酸序列的基因组的噬菌体；还包含：有效抵抗金黄色葡萄球菌之外的细菌的一种或多种其它噬菌体。
9.权利要求2的药物组合物，其包含：具有包含SEQIDNO:760的核酸序列的基因组的噬菌体；还包含：有效抵抗鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)的一种或多种其它噬菌体。
10.权利要求2的药物组合物，其包含：具有包含SEQIDNO:760的核酸序列的基因组的噬菌体；还包含：有效抵抗鲍氏不动杆菌之外的细菌的一种或多种其它噬菌体。
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