JP2016537405A

JP2016537405A - シュードモナス感染症のファージ治療

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Publication number: JP2016537405A
Application number: JP2016549638A
Authority: JP
Inventors: プヨ，フラヴィ; ブロワ，エレーヌ
Original assignee: Pherecydes Pharma SA
Current assignee: Phaxiam Therapeutics SA
Priority date: 2013-10-25
Filing date: 2014-10-24
Publication date: 2016-12-01
Anticipated expiration: 2034-10-24
Also published as: PL3060226T3; LT3060226T; US10077431B2; AU2014338859B2; SI3060226T1; EP3060226A1; JP6745222B2; AU2014338859A1; CA2928540A1; US20160264941A1; DK3060226T3; US10260051B2; JP2020143119A; HUE053522T2; CN108697744B; JP7321970B2; US20190002840A1; PT3060226T; EP3060226B1; WO2015059298A1

Abstract

本発明は、バクテリオファージ治療に関する。より詳細には、本発明は、緑膿菌株に対して高い特異性を有する新規なバクテリオファージ、それらの製造、それらの構成成分、これを含む組成物、及びファージ治療におけるそれらの使用に関する。

Description

本発明は、新規なバクテリオファージ、これを含む組成物、それらの製造、及びそれらの使用に関する。本発明は、特に、哺乳動物における感染症の処置のために、及び被験者において菌叢を改変することにより、被験者の状態を改善するために適応される。

発明の背景
バクテリオファージ（又はファージ）は、細菌に感染し、それらを死滅させる能力を呈する小さなウイルスであるが、それらは、他生物由来の細胞には影響を及ぼさない。ほぼ１世紀前にWilliam Twortにより最初に記載されており、その直ぐ後にFelix d’Herelle により独立して発見され、６０００を上回る異なるバクテリオファージが今までに発見され、形態学的に記載されている（細菌性ウイルス及び古細菌ウイルスを含む）。これらのウイルスの大部分が有尾であるが、小さな割合が、多面体、糸状、又は多形性である。それらは、それらの形態、それらの遺伝的内容物（ＤＮＡであるかＲＮＡであるか）、それらの特異的な宿主、それらが住んでいる場所（海洋ウイルスであるか他の生育地であるか）、及びそれらの生活環に従って分類されうる。細菌細胞の細胞内寄生生物として、ファージは、細菌宿主内で異なる生活環を呈する：溶解性、溶原性、擬似溶原性、及び慢性感染症（非特許文献１、非特許文献２）。溶解性ファージは、それらの生活環の正常な部分として、宿主細菌細胞の溶解を起こす。溶原ファージ（溶原性ファージとも呼ばれる）は、溶解生活環により複製して宿主細菌の溶解を起こすことができるか、又は、それらは、宿主細菌ＤＮＡ中にそれらのＤＮＡを組み入れて非感染性プロファージになることができる。ファージの生活環の型を問わず、最初の工程は、ファージ物質が細菌に入りうる前での細菌細胞壁の受容体への付着である。この特異的なプロセスは、可能なファージ・細菌相互作用のスペクトルに影響する。

バクテリオファージは、実験室での実験において細菌を改変するための研究ツールとして一般に使用される。

それらの標的宿主細胞特異性のため、急性及び慢性の感染症を処置するための治療としてのファージの使用が、特に皮膚科、眼科、泌尿器科、口腔科、小児科、耳鼻科、又は外科において考慮されてきた。細菌感染症を処置するための、ファージの治療的使用のこの概念は、しかし、当初から高度に論争の的となり、公共又は医学界により広くは受け入れられなかった。初期の研究は、適切な対照の欠如及び一致しない結果のため、広く批判された。再現性の欠如及び種々の公表された研究において得られた多くの対立する結果は、Council on Pharmacy and Chemistry of the American Medical Associationが、溶解濾液の治療的価値の証拠は、大半の部分について、矛盾し、説得力がなく、その主張される利益を確認するための追加の研究が推奨されるとの結論付けを導いた。

１９４０年代における抗生物質の導入以来、特に西洋世界において、治療薬のこの分野にはほとんど注意は払われなかった。しかし、抗生物質の広範な使用は、世界中の抗生物質耐性菌の広範囲な出現及び広がりを導き、ますます深刻な問題を起こしている。従って、主要な多剤耐性微生物を処置するために残っている限られた治療選択肢を克服することが、主要な治療的課題となってきている。

加えて、多くの病原性微生物が、バイオフィルム内に存在し、そのバイオフィルムは、新たな抗微生物剤を設計する際、追加の問題を起こす。この点において、単細胞（「プランクトン様」）形態よりもむしろ、バイオフィルムとして成長する細菌が、抗微生物剤に特に耐性である傾向があり、宿主免疫系が適切な応答を与えることが特に困難な傾向がある。

１９世紀後半におけるその最初の発見以来（非特許文献３）、グラム陰性細菌である緑膿菌は、悪名高いヒト病原体のリストにおいて悪評の高い場所を得てきた（非特許文献４、非特許文献５）。抗生物質時代の到来は、健康な患者における急性感染症の以前の致命的な結果を大部分で緩和した。相対的な改善だけが、嚢胞性線維症若しくは重度の熱傷に苦しんでいる、又は免疫不全である個体において主に発生する慢性感染症の根絶において達成されている（非特許文献６、非特許文献７）。これらの患者における感染症の致命的な結果における２つの本質的に関連する因子は、不適切な抗生物質処置の迅速な処方及び多剤耐性株の発生又は獲得である。適切な抗生物質（単数又は複数）の使用が、緑膿菌感染症の根絶における必須の因子として報告されているが（非特許文献８、非特許文献９）、逆に、抗生物質の乱用が、そのような能力の獲得についての継続的で選択的な圧力を及ぼすことにより、耐性増加に有意に寄与する。抗生物質単独では、多剤耐性変異体の高い流行は説明されない：緑膿菌は、複数の、染色体にコードされる内因性の耐性機構（細胞エンベロープの低透過性及び多数の多剤排出ポンプを含む）を有する。この細菌の成功裏の侵襲挙動及び持続性を説明する、別の主要な因子は、その高い適応性であり、異なる環境での迅速なコロニー形成を可能にする。

更に、病原性細菌（例えば緑膿菌）は、バイオフィルムを形成することができ、それは、抗生物質に対するそれらの耐性増加に寄与する。そのようなバイオフィルムは、排出された細胞外マトリックスにより支持され囲まれた細菌の１を上回る型を含み、細菌が、種々の表面にコロニー形成することを支援しうる。バイオフィルムによって、細菌が表面に付着し、本来なら非支持可能であろう集団密度に達することが可能になり、抗生物質だけでなく、多くの環境ストレス（重金属などの毒素、漂白剤、及び他の洗浄剤を含む）に対する耐性増加を付与する。バイオフィルム内の細菌は、プランクトン形態で成長する同じ株の細菌よりも、抗生物質に１００〜１０００倍耐性でありうることが公知である。そのような耐性増加は、実験室での試験において抗生物質に見掛け上は感受性である細菌が、臨床設定において治療に耐性でありうることを意味する。一部が除去されている場合でさえ、バイオフィルムは、一旦抗生物質がもはや存在しない場合には、迅速なコロニー形成を可能にする耐性リザーバーを提供しうる。従って、バイオフィルムが、多くのヒト疾患において主要な因子であることは明白である。化学処理は、バイオフィルムに対する使用に適さない。なぜなら、これは、厳密には、それらが対抗するように進化してきたものであるからである。物理的な摩耗は、バイオフィルムを破壊する手段を提供する。残念なことに、バイオフィルムによって細菌の病原性が支持される多くの表面は、厳しい摩耗にあまり適さない（即ち、骨、関節、移植された医療デバイスなど）。例えば、創傷又は熱傷の表面は、極度に感受性で、繊細である。摩耗が適切であり、慣用的に使用される場合でさえ、バイオフィルムの除去は限られている。歯の表面上の口腔歯垢は、バイオフィルムであり、通常のブラッシングにより部分的には除去される。しかし、細菌は、ブラッシングされていない表面上（例えば、歯間の隙中）に維持され、除去された表面に、迅速かつ効果的に再コロニー形成することができる。このことから、バイオフィルムを除去するための既存のアプローチは有効性が限られていることは明らかである。

迅速な適応のための能力及びバイオフィルムを形成するそれらの能力が、日和見病原体として緑膿菌を同定する主な理由である。それらは、病院病原体の状態を獲得しており、創傷、痰、膀胱、尿道、膣、耳、眼、及び気道から採取した臨床サンプルから単離されうる。処置の間でさえ生じる、そのような臨床的な緑膿菌株における、最も強力な新たな抗生物質への耐性の出現によって、緑膿菌の病院病原体との戦いが、大きな問題となる。

更に、被験者の病理学的又は生理学的状態が、被験者の菌叢における微生物のバランスにより影響されることが報告されている。したがって、緑膿菌集団を破壊することにより、微生物叢を改変すること、又は前記バランスを改変すること、又は前記バランスを回復することも、被験者の状態を改善するための価値あるアプローチである。

Weinbauer, 2004 Drulis-Kawa, 2012 Fordos, 1859 Williams and al, 1894 Freeman and al, 1916 Gang et al, 1999 Jones and al, 2010 Kang and al, 2005 Micek and al, 2005

従って、細菌バイオフィルム中で組織化された場合でさえ、ヒト又は動物の治療における使用のために及び材料を除染するために適切である、緑膿菌株を破壊するために使用することができる新規な抗菌剤又は組成物についての大きな必要性がある。

発明の概要
本発明者らは、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に対して特異的な溶解活性を提示する新規なバクテリオファージを単離し、特徴付けており、それは、特に緑膿菌細菌感染症を処置するため、又は被験者における微生物バランスを改変するために、医薬的又は獣医学的製剤中の活性薬剤として使用することができる。本発明の新規なバクテリオファージは、強い溶解活性、高い選択性を示し、非常に大きなスペクトルの緑膿菌細胞の制御された破壊を誘導するために組み合わせることができる。

本発明の目的は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株に対する溶解活性を有する、少なくとも１つの、好ましくは少なくとも２つのバクテリオファージを含む抗菌性組成物を提供することであり、前記バクテリオファージは、配列番号１〜１３のいずれか１つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージより選択される。

本発明の更なる目的は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株に対する溶解活性を有し、そして、配列番号１〜１３のいずれか１つより選択されるヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９７%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージに関する。

本発明のバクテリオファージは、緑膿菌の多剤耐性株に対して、特に抗生物質耐性病原性株（例えばセファロスポリナーゼ、カルベニシリナーゼ、及び広域スペクトルβラクタマーゼ）（Strateva T. and Yordanov D. 2009）に対して溶解活性を示す。

別の局面において、本発明は、病原性緑膿株に対して溶解活性を有するバクテリオファージに関し、前記バクテリオファージは、緑膿菌に特異的であり、抗生物質耐性の緑膿菌株に対して活性であり、２０を下回る生産性溶解効果を有する。

本発明は、更に、本発明のバクテリオファージ中に含まれる単離核酸、好ましくは、配列番号１〜１３のいずれか１つより選択されるヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９７%の同一性を有する配列を含む単離核酸分子、並びに前記核酸によりコードされる単離ポリヌクレオチドに関する。

本発明の別の目的は、上で定義した核酸又はポリペプチドを含む組成物である。

本発明の組成物は、典型的には、更に、医薬的又は獣医学的に許容可能な賦形剤又は担体を含む。それらは、液体、半液体、固体又は凍結乾燥でありうる。

本発明の別の目的は、哺乳動物における感染症の処置で使用するための、哺乳動物における微生物叢を改変するための、物質を除染するための、及び／又は緑膿菌細菌を死滅させるための、或いは、細菌性バイオフィルムの完全性を損なわせるための、上で定義したバクテリオファージ、核酸、ポリペプチド、又は組成物に関する。

本発明は、また、被験者において微生物叢を改変することにより被験者の状態を改善するための、１つ又はいくつかの溶解性バクテリオファージの使用に関する。微生物叢は、前記菌叢における微生物の適当なバランスを補正、適応、又は回復させることにより改変されうる。

本発明は、また、上で定義した少なくとも１つのバクテリオファージ、核酸、ポリペプチド、又は組成物の、哺乳動物への投与を含む、哺乳動物において感染症を処置するための方法に関する。

本発明は、また、表面又は材料に、上で定義した少なくとも１つのバクテリオファージ、核酸、ポリペプチド、又は組成物を適用することを含む、緑膿菌細菌で汚染された疑いのある表面又は材料を処理するための方法に関する。表面又は材料は、任意のデバイス、容器又は実験材料、布などの表面でありうる。

本発明の更なる目的は、上で定義した組成物及び被験者又は表面にそれを適用するための手段を含むキットに関する。

本発明の別の目的は、被験者におけるバクテリオファージ治療の有効性を予測又は決定するための方法に関し、この方法は、前記被験者のサンプルからの緑膿菌に対する、本発明の１つ又は複数のバクテリオファージの溶解活性をインビトロで決定することを含み、前記サンプルからの少なくとも１つの緑膿菌株に対する、本発明の１つ又は複数のバクテリオファージの溶解活性は、効率的な処置を意味する。この方法は、更に、場合により、被験者を、前記被験者のサンプルからの緑膿菌株に対する溶解活性を有する少なくとも１つのバクテリオファージを用いて処置する工程を含む。

別の局面において、本発明は、被験者を選択するか、又は、被験者がバクテリオファージ治療から利益を得るのに感受性であるか否かを決定するための方法を提供し、この方法は、前記被験者のサンプルからの緑膿菌株に対する、本発明の１つ又は複数のバクテリオファージの溶解活性をインビトロで決定する工程を含み、少なくとも１つの緑膿菌株に対する、前記バクテリオファージの１つ又は複数の溶解活性は、応答被験者を意味する。

本発明は、任意の哺乳動物、好ましくはヒトにおいて使用してもよく、又は任意の材料（実験材料又は医療用デバイスを含む）を処理するために使用してもよい。

緑膿菌株の種々の組み合わせに対する、本発明のバクテリオファージのインビトロでの有効性。緑膿菌株の種々の組み合わせに対する、本発明のバクテリオファージのインビボでの有効性。Ｉｓ５８０緑膿菌株が媒介する感染症に対する、インビボでの本発明のバクテリオファージの有効性。

発明の詳細な説明
本発明は、特に、哺乳動物における感染症の処置のための、及び、被験者における微生物叢を改変することにより、被験者の状態を改善するための、新規なバクテリオファージ、それらの構成成分、それを含む組成物、それらの製造、及び抗菌剤としてのそれらの使用に関する。

定義
本発明の理解を促進するために、多数の用語を以下に定義する。

本明細書において使用するとおり、用語「バクテリオファージ」又は「ファージ」は、タンパク質性エンベロープ又はキャプシド中にパッケージングされた核酸ゲノムを含む、機能的なファージ粒子を指す。この用語は、また、実質的に同じ機能活性を提供する、バクテリオファージの部分（例えば、頭部を含む）、又は、ファージ構成成分の集合体を指す。

用語「表現型の特徴」は、より好ましくは、バクテリオファージの形態及び／又は宿主範囲を示す。バクテリオファージの表現型を決定するための方法は、その部分において、自体周知であり、例えば、特定の細菌株により産生されるバイオフィルムに対する細菌宿主の範囲及び／又は活性を決定することを含む。

本発明において使用する用語「溶解活性」は、細菌細胞の溶解を起こすための、バクテリオファージの特性を示す。バクテリオファージの溶解活性は、当技術分野において自体公知の技術に従って、緑膿菌株で試験することができる（実験の項も参照のこと）。

参照バクテリオファージの用語「変異体」は、参照バクテリオファージと同じ表現型の特徴を保持しながら、参照バクテリオファージと比較して、それによりコードされるゲノム配列及び／又はポリペプチド（単数又は複数）において変異（単数又は複数）を有するバクテリオファージを示す。変異体は、典型的には、例えば、サイレント変異、保存的変異、軽微な欠失、及び／又は遺伝物質の軽微な複製を含み、参照バクテリオファージの表現型の特徴を保持する。好ましい実施形態において、本発明の変異体は、本発明のバクテリオファージのゲノムに依存する、任意の観察可能な特徴又は特性、即ち、前記バクテリオファージの表現型の特徴及び／又は緑膿菌株に対する溶解活性を保持する。好ましい変異体は、参照バクテリオファージのゲノムと比較して、５%未満の核酸変異、更により好ましくは４%未満、より好ましくは２%未満を有する。或いは、又は組み合わせて、変異体は、参照バクテリオファージのポリペプチドと比較して、コードされるポリペプチド配列において、好ましくは５%未満のアミノ酸変異を有する。

核酸配列又はアミノ酸配列に関連する用語「%同一性」は、前記配列間の同一性又は相同性のレベルを示し、当技術分野において自体公知の技術により決定されうる。典型的には、２つの核酸配列又はアミノ酸配列間の%同一性は、コンピュータプログラム、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージ中で提供されるＧＡＰ（Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1996, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711）（Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453）、を用いて決定される。例えばＤＮＡ配列用に調節された設定（特に：５．０のＧＡＰ生成ペナルティ及び０．３のＧＡＰ伸長ペナルティ）を用いて、核酸分子は、ＧＣＧプログラムパッケージの一部として利用可能なＰｉｌｅｕｐアラインメントソフトウェアを使用して、互いに配列比較してもよい。２つの配列間の%同一性は、前記配列の全長にわたる同一性を示す。

核酸の用語「フラグメント」は、典型的には、前記核酸の少なくとも１０の連続ヌクレオチド、より好ましくは、前記核酸の少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０又はそれ以上の連続ヌクレオチドを有するフラグメントを示す。

ポリペプチドの用語「フラグメント」は、典型的には、前記ポリペプチドの少なくとも５つの連続アミノ酸、より好ましくは、前記ポリペプチドの少なくとも１０、１５、２０、３０、４０、５０又はそれ以上の連続アミノ酸を有するフラグメントを示す。

用語「ＥＳＢＬ緑膿菌株」は、セファロスポリナーゼ及び／又は広域スペクトルを指す。

βラクタマーゼ産生緑膿菌株（種々の形態の抗生物質耐性、例えばＡｍｐＣβラクタマーゼ又はクラスＡカルベニシリン加水分解βラクタマーゼなどを含む）。

バクテリオファージに関連する用語「特異的」又は「特異性」は、前記バクテリオファージが感染することができる宿主の型を指す。特異性は、通常、細胞上で発現される受容体との相互作用に関与する、バクテリオファージの尾部繊維により媒介される。緑膿菌に「特異的な」バクテリオファージは、より好ましくは、１つ又はいくつかの緑膿菌株に感染することができ、生理学的条件下で非緑膿菌細菌に感染することができないバクテリオファージを示す。

本明細書において使用するとおり、用語「ポリペプチド」は、任意のサイズのポリペプチド（例えば、５〜２０アミノ酸の小ペプチド、より長いポリペプチド、タンパク質又はそれらのフラグメントを含む）を指す。

用語「ＰＬＥ」又は「産生性溶解効果」は、所定のバクテリオファージのバーストサイズと産生性溶解時間との間の比率を示す。バーストサイズ及び産生性溶解時間は、ファージ・宿主相互作用を定義するパラメータであり、それぞれ、１つのファージによる１つの細菌の感染により産生されるバクテリオファージ粒子の平均収量に、及び、細菌細胞を溶解するために、遊離のバクテリオファージにより必要とされた時間に対応する。

本明細書の文脈において、用語「単離バクテリオファージ」は、それが天然に生じる、その本来の環境から取り除かれた物質を意味すると考えられるべきである。バクテリオファージに関連して、この用語は、特に、例えば、それが自然に置かれている環境から分離して生育、精製、及び／又は培養されたファージを示す。核酸又はポリペプチドと関連して、用語「単離」は、例えば、その自然環境の構成成分の少なくとも一部（例えば、タンパク質、脂質、及び／又は核酸）から分離された核酸分子又はポリペプチドを示す。

本明細書において使用する用語「医薬的及び獣医学的に許容可能な」は、哺乳動物の被験者における使用のために適合する、任意の物質（例えば、担体、賦形剤、又はビヒクル）を指す。そのようなものは、無害であるか、又は生物にいずれの有意な特異的又は非特異的な免疫反応も起こさないか、又は活性化合物の生物学的活性を無効にしない、生理学的に許容可能な溶液又はビヒクルを含む。液体製剤への組成物の製剤化のために、生理食塩水、滅菌水、リンゲル溶液、緩衝化した生理学的な生理食塩水、アルブミン輸液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、及びそれらの混合物が、医薬的又は獣医学的に許容可能な賦形剤又は担体として使用されうる。必要な場合、他の従来の添加剤（例えば増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤、酸化防止剤、及び静菌剤）を加えてもよい。更に、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、及び潤滑剤を、追加的に組成物に加えて、注射可能な製剤（例えば水性溶液、懸濁液、及びエマルジョン）、経口製剤（例えばピル、カプセル、顆粒剤、若しくは錠剤）、又は粉末製剤を調製してもよい。

本明細書において使用するとおり、「ＰＦＵ」は、それが、当技術分野において十分に定義されるとおり、プラーク形成単位を意味する。溶解性バクテリオファージは宿主細胞を溶解し、培養プレート上で透明の領域（すなわちプラーク）を生じる。理論的には、各々のプラークは、１つのファージにより形成され、希釈係数により乗じたプラークの数は、試験調製物中のファージの総数に等しい。

用語「処置」又は「治療」は、疾患の治癒的又は予防的処置を示す。治癒的処置は、疾患の治癒をもたらす処置、又は、疾患の症状、若しくは、それが直接的若しくは間接的に起こす苦痛を軽減、低下、安定化、若しくは排除するか、或いは、被験者の状態を改善させるか、又は疾患の進行を低下させる処置として定義される。予防的処置は、疾患の防止をもたらす処置及び疾患の発生又はその出現のリスクを低下及び／又は遅延させる処置の両方を含む。

用語「哺乳動物」は、ヒト被験者並びに非ヒト哺乳動物、例えばペット（例えば、イヌ、ネコ）、ウマ、反芻動物、ヒツジ、ヤギ、ブタなどを含む。

本明細書において使用する用語「バイオフィルム」は、種々の表面上で成長する異種性の細菌形成；好ましくは、固体の生物学的又は非生物学的な表面上に付着したエキソポリサッカライド・マトリックス中に埋め込まれて成長する細菌コミュニティを示す。

本明細書において使用する用語「損なう」は、完全性の任意の変化を指す。細菌性バイオフィルムを損なうことにより、それは、バクテリオファージによるバイオフィルムの浸透、バイオフィルム関連細菌の感染及び／又はその溶解及び／又はバイオフィルムの部分的若しくは全体的な除去（即ち、コロニー形成を停止させること、及び／又はバイオフィルムを破壊することによる）と理解される。

用語「サンプル」は、本明細書において使用するとおり、細胞を含む任意のサンプルを意味する。そのようなサンプルの例は、体液（例えば血液、血漿、唾液、又は尿）、並びに生検、器官、組織、又は細胞サンプルを含む。サンプルは、その使用に先立ち処理されうる。

本明細書において使用するとおり、用語「被験者」又は「患者」は、動物、好ましくは哺乳動物、更により好ましくはヒト（成人及び小児を含む）を指す。しかし、用語「被験者」は、また、非ヒト動物、特に哺乳動物、とりわけ、例えばイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、及び非ヒト霊長類などを包含する。

本明細書において使用する処置の用語「有効性」又はバクテリオファージ治療への「応答」は、処置前の緑膿菌株の数と比較した場合、バクテリオファージ処置後での被験者における緑膿菌株の数における減少をもたらす処置を指す。「良好な応答」被験者は、バクテリオファージ治療を用いて処置された場合、臨床的に有意な回復を示す、又は示すであろう被験者を指す。

バクテリオファージの用語「カクテル」又は組成物は、バクテリオファージの異なる型の組合せを示す。カクテル／組成物中のバクテリオファージは、好ましくは、一緒に（即ち、同じ容器又はパッケージ中に）製剤化されるが、それらは、バクテリオファージ（又はその一部）が別々に製剤化又はパッケージ化され、使用又は投与される際に組み合わされるパーツのキットとして使用されうる。

実施形態の説明
本発明は、新規なバクテリオファージ治療に関する。より詳細には、本発明は、緑膿菌株に対して高い特異性を有する新規なバクテリオファージ、それらの製造、それらの構成成分、それを含む組成物、及びファージ治療におけるそれらの使用に関する。

バクテリオファージ：
第１の局面において、本発明は、緑膿菌株に特異的である新規なバクテリオファージの単離及び特徴付けを開示し、単独又は組み合わせのいずれかで、溶解活性の顕著な宿主範囲のスペクトルを提示する。これらのバクテリオファージは、環境サンプルから選択され、単離、配列決定、及び特徴付される。示すとおり、バクテリオファージは、緑膿菌株に対して、個々に、及び組み合わせで活性である。それらは、病原性緑膿菌株、例えば抗生物質耐性緑膿菌株（例えばＥＳＢＬ緑膿菌株）に対して顕著に効果的である。更に、本発明のバクテリオファージは、２０未満、より好ましくは１５未満、更により好ましくは０．３と１５との間の顕著な産生性溶解効果（「ＰＬＥ」）を有する。更に、本発明のバクテリオファージは、緑膿菌株に特異的であり、即ち、それらは、非緑膿菌細菌の溶解を起こさない。更に例証するとおり、本発明は、これらのバクテリオファージを、医薬又は獣医薬としての使用のために適切な条件において組み合わせ、製剤化し、緑膿菌株の制御されたスペクトルに対して、標的化された、非常に強力な抗菌効果を示すことができることを示す。

より詳細には、以下のバクテリオファージを選択し、特徴付けた。それらの対応する核酸配列も示す。

これらのバクテリオファージの溶解プロファイルを、広範な数の緑膿菌株で決定した。これらのバクテリオファージを、以下の表において開示するとおり、それらの効力及び組み合わせの可能性について選択した。この表において、高い溶解能力を確認するために、参照及び病原体耐性株に対するバクテリオファージの溶解効果を示す。

本発明のバクテリオファージの顕著な活性プロファイル及びそれらの相補性が更に確認する、創傷又は熱傷からの高度耐性株での更なる結果を、以下に示す。

表２及び３から分かりうるとおり、ファージは、個々に、非常に強い溶解力を有し、これらのバクテリオファージの組み合わせ（又はカクテル）を産生してもよく、それらは、試験された緑膿菌株の全てを死滅させることができ、それにより、広域スペクトルの抗菌組成物が産生される。
例証として、本発明の全ての１３ファージのカクテルによって、表２及び表３中に列挙する全ての細菌を効果的に死滅させることができる。

更に、バクテリオファージの特異性を、多くの非緑膿菌株で試験した。より具体的には、実験の項では、本発明のバクテリオファージが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｂａｃｔｅｒｂａｕｍａｎｉｉ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エンテロバクター・アスブリエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｓｂｕｒｉａｅ）、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｃｌｏａｃａｅ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｏｒｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓａｕｒｅｕｓ）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌａ）、及び／又はセラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）より選択される任意の細菌に対して溶解効果を有さないことが実証されている。

従って、本発明の特定の目的は、緑膿菌株に対する溶解活性を有し、配列番号１〜１３のいずれか１つより選択されるヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９７%の同一性、好ましくは、それと少なくとも９８%又は９９%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージにある。

本発明のバクテリオファージは、以下により詳細に開示するとおり、培養し、生育させ、単離し、精製し、例えば、緑膿菌媒介性障害のファージ治療において使用してもよい。更に、当該バクテリオファージの表現型（例えば、特異性及び溶解活性）を保持する、これらのバクテリオファージの変異体を、当技術分野において自体公知の技術により産生及び／又は単離することができる。

本発明のバクテリオファージは、標準的な培養、単離、及び精製の方法により調製することができる。例えば、緑膿菌産生細菌を培養し、バクテリオファージのサンプルにより感染させ、次に、細菌細胞及びデブリを除くために処理される。濃縮バクテリオファージ溶液を、緑膿菌の埋め込み感受性宿主株を用いて、培地、例えば寒天培地に播種し、プラークを得ることができる。次に、単一のプラークを、その後のバクテリオファージの精製及び増幅のために取り出すことができる。本発明のバクテリオファージの選択的増幅の１又は複数のサイクルを、例えば、バクテリオファージをコンピテント緑膿菌と混合し、次いで、成長培地を添加し、選択した試験成長条件でインキュベーションすることによって、実施してもよい。遠心分離に続き、除去した増幅上清を、フィルターを通じて濾過し、選択的増幅の別のサイクルに供するか、又は溶解活性の存在について試験する。

本発明のバクテリオファージの懸濁液中でのファージの力価及びプラーク形態の可視化が、次に、公知の方法により、例えばプラークのカウントにより、評価されうる。加えて、短い、長い、凍結、又は任意の他の種類の保存のための種々の形態（液体、凍結乾燥など）への本発明のバクテリオファージのプロセシングを、当技術分野において周知であるとおり、任意の適切な方法により行うことができる（例えば、Clark, 1962を参照のこと）。

本発明のバクテリオファージの活性を、当技術分野において周知の方法、例えば二重寒天法としても知られているプラークアッセイ（潜在的な宿主細菌を用いたバクテリオファージの成長、次いで、宿主細菌細胞を死滅させるそれらの能力の評価に基づく）により評価することができる。プラークアッセイ方法において、バクテリオファージは、軟寒天培地でのインキュベーション期間後に、標的緑膿菌株の溶解を誘導し、プレート上に、プラークとして知られる透明領域をもたらす。

特定の実施形態において、本発明は、ＢＰ１３８４バクテリオファージ、又はその任意の変異体に関する。ＢＰ１３８４バクテリオファージ、又はその任意の変異体は、例えば、緑膿菌ＰＡＯ１株において産生又は生育させることができる。ＢＰ１３８４、又はその任意の変異体は特異的であり、ＬＭＧ２４８８２株、ＬＭＧ２４８８３株、ＬＭＧ２４８８６株、ＬＭＧ２４８９１株、ＬＭＧ２４８９２株、ＬＭＧ２４８９３株、ＬＭＧ２４８９６株、ＬＭＧ２４８９８株、及び／又はＬＭＧ２４９０９株に対して溶解活性を有する。ＢＰ１３８４は、配列番号１において示すか又は配列番号１と少なくとも８０%の同一性、より好ましくは少なくとも８５%の同一性、更により好ましくは９０%、９２%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有する配列を含むゲノムを含む。また、ＢＰ１３８４バクテリオファージ、又はその変異体からの単離核酸配列が提供される。本発明は、また、ＢＰ１３８４バクテリオファージ、又はその変異体によりコードされるか、又は、本発明のＢＰ１３８４バクテリオファージからの単離核酸配列によりコードされる、単離ポリペプチドを包含する。本発明のＢＰ１３８４バクテリオファージは、また、２０未満、より好ましくは１５未満、更により好ましくはおよそ６．２のＰＬＥにより特徴付けられる。

別の特定の実施形態において、本発明は、ＢＰ１４２９バクテリオファージ、又はその任意の変異体に関する。ＢＰ１４２９バクテリオファージ、又はその任意の変異体は、例えば、緑膿菌ＰＡＯ１株において産生又は生育させることができる。ＢＰ１４２９、又はその任意の変異体は、特異的であり、ＬＭＧ２４８８２株、ＬＭＧ２４８９１株、ＬＭＧ２４８９２株、ＬＭＧ２４８９３株、ＬＭＧ２４８９６株、ＬＭＧ２４８９８株、及び／又はＬＭＧ２４９１６株に対する溶解活性を有する。ＢＰ１４２９は、配列番号２において示すか又は配列番号２と少なくとも８０%の同一性、より好ましくは少なくとも８５%の同一性、更により好ましくは９０%、９２%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有する配列を含むゲノムを含む。また、ＢＰ１４２９バクテリオファージ、又はその変異体からの単離核酸配列が提供される。本発明は、また、ＢＰ１４２９バクテリオファージ、又はその変異体によりコードされるか、又は、本発明のＢＰ１４２９バクテリオファージからの単離核酸配列によりコードされる、単離ポリペプチドを包含する。本発明のＢＰ１４２９バクテリオファージは、また、２０未満、より好ましくは１５未満、更により好ましくはおよそ０．７０のＰＬＥにより特徴付けられる。

更に別の局面において、本発明は、Ｂ１４３０バクテリオファージ、又はその任意の変異体に関する。Ｂ１４３０バクテリオファージ、又はその任意の変異体は、例えば、緑膿菌ＰＡＯ１株において産生又は生育させることができる。Ｂ１４３０、又はその任意の変異体は、特異的であり、ＬＭＧ２４８８２株、ＬＭＧ２４８８３株、ＬＭＧ２４８９１株、ＬＭＧ２４８９２株、ＬＭＧ２４８９３株、ＬＭＧ２４８９６株、ＬＭＧ２４８９８株、ＬＭＧ２４９０１株、及び／又はＬＭＧ２４９１８株に対する溶解活性を有する。Ｂ１４３０は、配列番号３において示す又は配列番号３と少なくとも８０%の同一性、より好ましくは少なくとも８５%の同一性、更により好ましくは９０%、９２%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有する配列を含むゲノムを含む。また、Ｂ１４３０バクテリオファージ、又はその変異体からの単離核酸配列が提供される。本発明は、また、Ｂ１４３０バクテリオファージ、又はその変異体によりコードされるか、又は、本発明のＢ１４３０バクテリオファージからの単離核酸配列によりコードされる、単離ポリペプチドを包含する。本発明のＢ１４３０バクテリオファージは、また、２０未満、より好ましくは１５未満、更により好ましくはおよそ３のＰＬＥにより特徴付けられる。

別の局面において、本発明は、ＢＰ１４３３バクテリオファージ、又はその任意の変異体に関する。ＢＰ１４３３バクテリオファージ、又はその任意の変異体は、例えば、緑膿菌ＰＡＯ１株において産生又は生育させることができる。ＢＰ１４３３、又はその任意の変異体は、特異的であり、ＬＭＧ２４８８２株、ＬＭＧ２４８８３株、ＬＭＧ２４８８６株、ＬＭＧ２４８８７株、ＬＭＧ２４８９１株、ＬＭＧ２４８９２株、ＬＭＧ２４８９３株、ＬＭＧ２４８９６株、ＬＭＧ２４８９６株、ＬＭＧ２４９０５株、ＬＭＧ２４９０９株、及び／又はＬＭＧ２４９１６株に対する溶解活性を有する。ＢＰ１４３３は、配列番号４において示す又は配列番号４と少なくとも８０%の同一性、より好ましくは少なくとも８５%の同一性、更により好ましくは９０%、９２%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有する配列を含むゲノムを含む。また、ＢＰ１４３３バクテリオファージ、又はその変異体からの単離核酸配列が提供される。本発明は、また、ＢＰ１４３３バクテリオファージ、又はその変異体によりコードされるか、又は、本発明のＢＰ１４３３バクテリオファージからの単離核酸配列によりコードされる、単離ポリペプチドを包含する。本発明のＢＰ１４３３バクテリオファージは、また、２０未満、より好ましくは１５未満、更により好ましくはおよそ４のＰＬＥにより特徴付けられる。

別の特定の実施形態において、本発明は、ＢＰ１４５０バクテリオファージ、又はその任意の変異体に関する。ＢＰ１４５０バクテリオファージ、又はその任意の変異体は、例えば、緑膿菌ＰＡＯ１株において産生又は生育させることができる。ＢＰ１４５０、又はその任意の変異体は、特異的であり、ＬＭＧ２４８８２株、ＬＭＧ２４８８３株、ＬＭＧ２４８８６株、ＬＭＧ２４８８７株、ＬＭＧ２４８９１株、ＬＭＧ２４８９２株、ＬＭＧ２４８９３株、ＬＭＧ２４８９６株、ＬＭＧ２４８９８株、ＬＭＧ２４９０３株、ＬＭＧ２４９０４株、ＬＭＧ２４９０５株、ＬＭＧ２４９０９株、及び／又はＬＭＧ２４９１３株に対する溶解活性を有する。ＢＰ１４５０は、配列番号５において示す又は配列番号５と少なくとも８０%の同一性、より好ましくは少なくとも８５%の同一性、更により好ましくは９０%、９２%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有する配列を含むゲノムを含む。また、ＢＰ１４５０バクテリオファージ、又はその変異体からの単離核酸配列が提供される。本発明は、また、ＢＰ１４５０バクテリオファージ、又はその変異体によりコードされるか、又は、本発明のＢＰ１４５０バクテリオファージからの単離核酸配列によりコードされる、単離ポリペプチドを包含する。本発明のＢＰ１４５０バクテリオファージは、また、２０未満、より好ましくは１５未満、更により好ましくはおよそ２のＰＬＥにより特徴付けられる。

更に別の局面において、本発明は、ＢＰ１６４４バクテリオファージ、又はその任意の変異体に関する。ＢＰ１６４４バクテリオファージ、又はその任意の変異体は、例えば、緑膿菌ＰＡＯ１株において産生又は生育させることができる。ＢＰ１６４４、又はその任意の変異体は、特異的であり、ＬＭＧ２４８８２株、ＬＭＧ２４８８３株、ＬＭＧ２４８８６株、ＬＭＧ２４８９１株、ＬＭＧ２４８９２株、ＬＭＧ２４８９３株、ＬＭＧ２４８９６株、ＬＭＧ２４８９８株、ＬＭＧ２４９０５株、及び／又はＬＭＧ２４９０９株に対する溶解活性を有する。ＢＰ１６４４は、配列番号６において示す又は配列番号６と少なくとも８０%の同一性、より好ましくは少なくとも８５%の同一性、更により好ましくは９０%、９２%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有する配列を含むゲノムを含む。また、ＢＰ１６４４バクテリオファージ、又はその変異体からの単離核酸配列が提供される。本発明は、また、ＢＰ１６４４バクテリオファージ、又はその変異体によりコードされるか、又は、本発明のＢＰ１６４４バクテリオファージからの単離核酸配列によりコードされる、単離ポリペプチドを包含する。本発明のＢＰ１６４４バクテリオファージは、また、２０未満、より好ましくは１５未満、更により好ましくはおよそ１．５のＰＬＥにより特徴付けられる。

別の特定の実施形態において、本発明は、ＢＰ１６４７バクテリオファージ、又はその任意の変異体に関する。ＢＰ１６４７バクテリオファージ、又はその任意の変異体は、例えば、緑膿菌ＰＡＯ１株において産生又は生育させることができる。ＢＰ１６４７、又はその任意の変異体は、特異的であり、ＬＭＧ２４８８２株、ＬＭＧ２４８８３株、ＬＭＧ２４８９１株、ＬＭＧ２４８９２株、ＬＭＧ２４８９３株、ＬＭＧ２４８９６株、ＬＭＧ２４８９８株、ＬＭＧ２４９０３株、及び／又はＬＭＧ２４９１６株に対する溶解活性を有する。ＢＰ１６４７は、配列番号７において示す又は配列番号７と少なくとも８０%の同一性、より好ましくは少なくとも８５%の同一性、更により好ましくは９０%、９２%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有する配列を含むゲノムを含む。また、ＢＰ１６４７バクテリオファージ、又はその変異体からの単離核酸配列が提供される。本発明は、また、ＢＰ１６４７バクテリオファージ、又はその変異体によりコードされるか、又は、本発明のＢＰ１６４７バクテリオファージからの単離核酸配列によりコードされる、単離ポリペプチドを包含する。本発明のＢＰ１６４７バクテリオファージは、また、２０未満、より好ましくは１５未満、更により好ましくはおよそ０．４のＰＬＥにより特徴付けられる。

別の特定の実施形態において、本発明は、ＢＰ１６４８バクテリオファージ、又はその任意の変異体に関する。ＢＰ１６４８バクテリオファージ、又はその任意の変異体は、例えば、緑膿菌ＰＡＯ１株において産生又は生育させることができる。ＢＰ１６４８、又はその任意の変異体は、特異的であり、ＬＭＧ２４８８２株、ＬＭＧ２４８８３株、ＬＭＧ２４８９１株、ＬＭＧ２４８９３株、ＬＭＧ２４８９６株、ＬＭＧ２４８９８株、及び／又はＬＭＧ２４９０９株に対する溶解活性を有する。ＢＰ１６４８は、配列番号８において示す又は配列番号８と少なくとも８０%の同一性、より好ましくは少なくとも８５%の同一性、更により好ましくは９０%、９２%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有する配列を含むゲノムを含む。また、ＢＰ１６４８バクテリオファージ、又はその変異体からの単離核酸配列が提供される。本発明は、また、ＢＰ１６４８バクテリオファージ、又はその変異体によりコードされるか、又は、本発明のＢＰ１６４８バクテリオファージからの単離核酸配列によりコードされる、単離ポリペプチドを包含する。本発明のＢＰ１６４８バクテリオファージは、また、２０未満、より好ましくは１５未満、更により好ましくはおよそ２のＰＬＥにより特徴付けられる。

別の局面において、本発明は、ＢＰ１６４９バクテリオファージ、又はその任意の変異体に関する。ＢＰ１６４９バクテリオファージ、又はその任意の変異体は、例えば、緑膿菌ＰＡＯ１株において産生又は生育させることができる。ＢＰ１６４９、又はその任意の変異体は、特異的であり、ＬＭＧ２４８８２株、ＬＭＧ２４８８３株、ＬＭＧ２４８８６株、ＬＭＧ２４８８７株、ＬＭＧ２４８９１株、ＬＭＧ２４８９２株、ＬＭＧ２４８９３株、ＬＭＧ２４８９６株、ＬＭＧ２４８９８株、ＬＭＧ２４９０５株、ＬＭＧ２４９０９株、及び／又はＬＭＧ２４９１３株に対する溶解活性を有する。ＢＰ１６４９は、配列番号９において示す又は配列番号９と少なくとも８０%の同一性、より好ましくは少なくとも８５%の同一性、更により好ましくは９０%、９２%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有する配列を含むゲノムを含む。また、ＢＰ１６４９バクテリオファージ、又はその変異体からの単離核酸配列が提供される。本発明は、また、ＢＰ１６４９バクテリオファージ、又はその変異体によりコードされるか、又は、本発明のＢＰ１６４９バクテリオファージからの単離核酸配列によりコードされる、単離ポリペプチドを包含する。本発明のＢＰ１１５５バクテリオファージは、また、２０未満、より好ましくは１５未満、更により好ましくはおよそ３．５のＰＬＥにより特徴付けられる。

別の特定の実施形態において、本発明は、ＢＰ１６５０バクテリオファージ、又はその任意の変異体に関する。ＢＰ１６５０バクテリオファージ、又はその任意の変異体は、例えば、緑膿菌ＰＡＯ１株において産生又は生育させることができる。ＢＰ１６５０、又はその任意の変異体は、特異的であり、ＬＭＧ２４８８２株、ＬＭＧ２４８９３株、ＬＭＧ２４８９６株、ＬＭＧ２４８９８株、ＬＭＧ２４９０５株、及び／又はＬＭＧ２４９０９株に対する溶解活性を有する。ＢＰ１６５０は、配列番号１０において示す又は配列番号１０と少なくとも８０%の同一性、より好ましくは少なくとも８５%の同一性、更により好ましくは９０%、９２%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有する配列を含むゲノムを含む。また、ＢＰ１６５０バクテリオファージ、又はその変異体からの単離核酸配列が提供される。本発明は、また、ＢＰ１６５０バクテリオファージ、又はその変異体によりコードされるか、又は、本発明のＢＰ１６５０バクテリオファージからの単離核酸配列によりコードされる、単離ポリペプチドを包含する。本発明のＢＰ１６５０バクテリオファージは、また、２０未満、より好ましくは１５未満、更により好ましくはおよそ１４のＰＬＥにより特徴付けられる。

更に別の局面において、本発明は、ＢＰ１６５８バクテリオファージ、又はその任意の変異体に関する。ＢＰ１６５８バクテリオファージ、又はその任意の変異体は、例えば、緑膿菌ＰＡＯ１株において産生又は生育させることができる。ＢＰ１６５８、又はその任意の変異体は、特異的であり、ＬＭＧ２４８８２株、ＬＭＧ２４８８７株、ＬＭＧ２４８９１株、ＬＭＧ２４８９３株、ＬＭＧ２４８９６株、及び／又はＬＭＧ２４８９８株に対する溶解活性を有する。ＢＰ１６５８は、配列番号１１において示す又は配列番号１１と少なくとも８０%の同一性、より好ましくは少なくとも８５%の同一性、更により好ましくは９０%、９２%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有する配列を含むゲノムを含む。また、ＢＰ１６５８バクテリオファージ、又はその変異体からの単離核酸配列が提供される。本発明は、また、ＢＰ１６５８バクテリオファージ、又はその変異体によりコードされるか、又は、本発明のＢＰ１６５８バクテリオファージからの単離核酸配列によりコードされる、単離ポリペプチドを包含する。本発明のＢＰ１６５８バクテリオファージは、また、２０未満、より好ましくは１５未満、更により好ましくはおよそ３のＰＬＥにより特徴付けられる。

別の局面において、本発明は、ＢＰ１６６１バクテリオファージ、又はその任意の変異体に関する。ＢＰ１６６１バクテリオファージ、又はその任意の変異体は、例えば、緑膿菌ＰＡＯ１株において産生又は生育させることができる。ＢＰ１６６１、又はその任意の変異体は、特異的であり、ＬＭＧ２４８８２株、ＬＭＧ２４８８３株、ＬＭＧ２４８８６株、ＬＭＧ２４８９１株、ＬＭＧ２４８９２株、ＬＭＧ２４８９３株、ＬＭＧ２４８９６株、ＬＭＧ２４８９８株、及び／又はＬＭＧ２４９０９株に対する溶解活性を有する。ＢＰ１６６１は、配列番号１２において示す又は配列番号１２と少なくとも８０%の同一性、より好ましくは少なくとも８５%の同一性、更により好ましくは９０%、９２%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有する配列を含むゲノムを含む。また、ＢＰ１６６１バクテリオファージ、又はその変異体からの単離核酸配列が提供される。本発明は、また、ＢＰ１６６１バクテリオファージ、又はその変異体によりコードされるか、又は、本発明のＢＰ１６６１バクテリオファージからの単離核酸配列によりコードされる、単離ポリペプチドを包含する。本発明のＢＰ１６６１バクテリオファージは、また、２０未満、より好ましくは１５未満、更により好ましくはおよそ４のＰＬＥにより特徴付けられる。

更に別の局面において、本発明は、ＢＰ１６６２バクテリオファージ、又はその任意の変異体に関する。ＢＰ１６６２バクテリオファージ、又はその任意の変異体は、例えば、緑膿菌ＰＡＯ１株において産生又は生育させることができる。ＢＰ１６６２、又はその任意の変異体は、特異的であり、ＬＭＧ２４８８３株、ＬＭＧ２４８９１株、ＬＭＧ２４８９２株、ＬＭＧ２４８９３株、ＬＭＧ２４８９６株、ＬＭＧ２４８９８株、及び／又はＬＭＧ２４９１６株に対する溶解活性を有する。ＢＰ１６６２は、配列番号１３において示す又は配列番号１３と少なくとも８０%の同一性、より好ましくは少なくとも８５%の同一性、更により好ましくは９０%、９２%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有する配列を含むゲノムを含む。また、ＢＰ１６６２バクテリオファージ、又はその変異体からの単離核酸配列が提供される。本発明は、また、ＢＰ１６６２バクテリオファージ、又はその変異体によりコードされるか、又は、本発明のＢＰ１６６２バクテリオファージからの単離核酸配列によりコードされる、単離ポリペプチドを包含する。本発明のＢＰ１６６２バクテリオファージは、また、２０未満、より好ましくは１５未満、更により好ましくはおよそ１のＰＬＥにより特徴付けられる。

核酸及びポリペプチド
本発明は、本発明のバクテリオファージ中に含まれる核酸、又はそのような核酸の任意のフラグメントに関する。用語フラグメントは、より好ましくは、オープンリーディングフレームを含む（又は、それからなる）フラグメントを示す。核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡ（一本鎖又は二本鎖）でありうる。

核酸は、沈着バクテリオファージから単離するか、又は、当技術分野において自体公知の一般的な技術に従って、組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニング）、酵素的又は化学的合成、又はそれらの組み合わせを使用して産生することができる。また、相同配列及びそれらのフラグメント（天然対立遺伝子変異体、並びにヌクレオチドが挿入、欠失、置換、及び／又は逆位されている改変核酸配列を含むが、これらに限定されない）が含まれる。

特定の実施形態において、本発明は、配列番号１〜１３のいずれか１つより選択される配列、又は、配列番号１〜１３のいずれか１つと少なくとも９５%、９６%、９７%、９８%、９９%又はそれ以上の配列同一性を有する配列を含む核酸に関する。

別の特定の実施形態において、本発明は、配列番号１〜１３のいずれか１つより選択される配列のフラグメント、又は、配列番号１〜１３のいずれか１つと少なくとも９５%、９６%、９７%、９８%、９９%又はそれ以上の配列同一性を有する配列のフラグメントの配列を含む核酸に関し、前記フラグメントは、オープンリーディングフレーム又は調節エレメント（例えばプロモーター）を含む。

本発明の核酸は、遊離形態でありうるか、又はベクター中にクローニングすることができる。

更なる局面において、本発明は、また、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１３より選択される核酸配列によりコードされる単離ポリペプチドに関する。ポリペプチドは、当技術分野において自体公知の技術、例えば合成、組換え技術、又はこれらの組み合わせにより産生されうる。ポリペプチドは、単離又は精製されてもよく、抗菌剤として、又はインビトロ分析用の試薬として使用されうる。

本発明の組成物
本発明の一局面は、上に記載するとおりの少なくとも１つのバクテリオファージ、より好ましくは、少なくとも２つ又はそれ以上、場合により、医薬的又は獣医学的に許容可能な賦形剤を含む組成物に関する。記載したとおり、本発明のバクテリオファージは、緑膿菌株に対して非常に強力な溶解活性を有する。これらのバクテリオファージの組み合せを産生し、宿主スペクトルを拡大させ、非常に効果的な抗菌組成物を産生しうる。

更に詳細には、本発明は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株に対する溶解活性を有する少なくとも２つのバクテリオファージを含む抗菌性組成物に関し、前記の少なくとも２つのバクテリオファージは、配列番号１〜１３のいずれか１つのヌクレオチド配列、或いは、それと少なくとも９０%の同一性、好ましくはそれと少なくとも９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージより選択される。

好ましい実施形態において、本発明の組成物は、配列番号１〜１３のいずれか１つのヌクレオチド配列、或いは、それと少なくとも９０%の同一性、好ましくはそれと少なくとも９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージより選択される少なくとも３つの、更により好ましくは少なくとも４つの別個のバクテリオファージを含む。本発明の組成物は、上に開示するとおり、バクテリオファージの１３の異なる型の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１１、１２、又は全てを含んでもよい。

本発明の一局面は、ＢＰ１３８４、ＢＰ１４２９、ＢＰ１４３０、ＢＰ１４３３、ＢＰ１４５０、ＢＰ１６４４、ＢＰ１６４７、ＢＰ１６４８、ＢＰ１６４９、ＢＰ１６５０、ＢＰ１６５８、ＢＰ１６６１、及び／又はＢＰ１６６２、或いはそれらの変異体より選択される少なくとも１つのバクテリオファージを含む組成物に関する。

本発明は、また、ＢＰ１３８４、ＢＰ１４２９、ＢＰ１４３０、ＢＰ１４３３、ＢＰ１４５０、ＢＰ１６４４、ＢＰ１６４７、ＢＰ１６４８、ＢＰ１６４９、ＢＰ１６５０、ＢＰ１６５８、ＢＰ１６６１、及び／又はＢＰ１６６２、或いはそれらの変異体より選択される少なくとも２つの別個のバクテリオファージを含む組成物に関する。

特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＢＰ１４２９、ＢＰ１４３０、ＢＰ１４３３、ＢＰ１４５０、又はＢＰ１６４４より選択される少なくとも１つの更なるバクテリオファージと組み合わせて、ＢＰ１３８４を含む。

別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＢＰ１４５０及びＢＰ１６４７より選択される少なくとも１つの更なるバクテリオファージと組み合わせて、ＢＰ１３８４を含む。

別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＢＰ１４５０、ＢＰ１６４４、ＢＰ１６４９、及びＢＰ１６６１より選択される少なくとも１つの更なるバクテリオファージと組み合わせて、ＢＰ１４３０を含む。

別の特定の実施形態において、組成物は、ＢＰ１４５０、ＢＰ１６４７、ＢＰ１６４８、ＢＰ１６５０、及びＢＰ１６５８より選択される少なくとも１つの更なるバクテリオファージと組み合わせて、ＢＰ１４３３を含む。

別の好ましい実施形態において、組成物は、ＢＰ１４２９、ＢＰ１６４７、ＢＰ１６４９、及びＢＰ１６６２より選択される少なくとも１つの更なるバクテリオファージと組み合わせて、ＢＰ１３８４を含む。

本発明は、また、バクテリオファージＢＰ１３８４、ＢＰ１４２９、ＢＰ１４３０、ＢＰ１４３３、ＢＰ１４５０、ＢＰ１６４４、ＢＰ１６４７、ＢＰ１６４８、ＢＰ１６４９、ＢＰ１６５０、ＢＰ１６５８、ＢＰ１６６１、及び／又はＢＰ１６６２、或いはそれらの変異体の全ての組み合わせを含む組成物に関する。

本発明の組成物の具体的な例は、以下を含む：
− 配列番号１のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号４のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
− 配列番号１のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号５のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
− 配列番号３のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号９のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
− 配列番号３のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号４のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
− 配列番号３のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号１０のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
− 配列番号１のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号３のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号４のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
− 配列番号１のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号３のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号５のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；或いは
− 配列番号１のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号３のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ、及び配列番号９のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ。

本発明の具体的な実施形態は、以下を含む組成物に関する：
− 配列番号１のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
− 配列番号２のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
− 配列番号３のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
− 配列番号４のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
− 配列番号５のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
− 配列番号６のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
− 配列番号７のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
− 配列番号８のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
− 配列番号９のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
− 配列番号１０のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
− 配列番号１１のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；
− 配列番号１２のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ；及び
− 配列番号１３のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージ。

本発明の組成物は、追加の抗菌剤、特に、別個の宿主特異性を有する他のバクテリオファージを更に含みうる。

本発明の好ましい組成物は、抗生物質耐性緑膿菌株に対して溶解性である。

本発明の更に好ましい組成物は、周知のＢＣＣＭ／ＬＭＧ細菌コレクションから得られた、ＬＭＧコレクションの全ての菌株の９０%超に対して溶解性である。このコレクションは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｂｒｉ．ｏｒｇ／ＣＡＢＲＩ／ｓｒｓ−ｄｏｃ／ｂｃｃｍ＿ｌｍｇ．ｉｎｆｏ．ｈｔｍｌのウェブサイトを介してアクセス可能である。

本発明の抗菌性組成物は、種々の形態、例えば液体、半液体、固体、又は凍結乾燥製剤でありうる。

本発明の組成物は、選択されたバクテリオファージ（単数又は複数）の任意の効果的な量を含んでもよい。好ましくは、それらは、前記各バクテリオファージの１０^ｅ４と１０^ｅ１２との間のＰＦＵ、好ましくは１０^ｅ５と１０^ｅ１０との間のＰＦＵを含む。本発明の組成物中のバクテリオファージの各々の型の相対量は、当業者により調整されうる。典型的には、抗菌組成物が、上で定義するとおりの、いくつか（ｎ）の別個のバクテリオファージを含む場合、組成物中の各バクテリオファージの全相対量%Ａは、より好ましくは、%Ａ＝（１００／ｎ_ｉ）ｘＶであり、式中、ｎ_ｉは、バクテリオファージの別個の型の数を表し、Ｖは、０．２と５との間に含まれる変動係数である。最も好ましくは、Ｖは、０．３と３との間に、更により好ましくは０．５と２との間に、一般的には、０．８と１．５との間に含まれる。好ましい典型的な実施形態において、バクテリオファージの各々の型は、本発明の組成物中で、ほぼ等しい相対量で存在する。

本発明の組成物は、好ましくは、適切な希釈剤又は担体、例えば医薬的又は獣医学的に許容可能な賦形剤又は担体を含む。本発明に係る組成物は、選ばれたバクテリオファージ（単数又は複数）に加えて、任意の賦形剤又は担体、例えば増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤などを含んでもよい。そのようなものは、無害であるか、又は生物にいずれの有意な特異的又は非特異的な免疫反応を起こさないか或いはバクテリオファージの生物学的活性を抑止しない、生理学的に許容可能な溶液又は溶媒を含む。液体製剤については、生理食塩水、滅菌水、リンゲル溶液、緩衝化した生理学的な生理食塩水、アルブミン輸液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、及びそれらの混合物が、医薬的又は獣医学的に許容可能な賦形剤又は担体として使用されうる。適切な場合、他の従来の添加剤（例えば、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤、酸化防止剤、及び静菌剤）を加えてもよい。更に、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、及び潤滑剤を、追加的に組成物に加えて、注射可能な製剤（例えば、水性溶液、懸濁液、及びエマルジョン）、経口製剤（例えば、ピル、カプセル、顆粒剤、又は錠剤）、又は粉末製剤を調製してもよい。局所投与用の製剤は、バンドエイド、包帯、パッチ、フィルム、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、タンポン、生理用ナプキン、液体、及び粉末を含みうる。除染用の製剤又は医学的使用のための製剤は、また、エアゾール又はスプレーを含みうる。

本発明の組成物は、例えば、哺乳動物における感染症の処置のために、又は被験者の状態を改善するために、医学的分野（ヒト医学領域又は獣医学領域を含む）において使用してもよい。組成物は、感染症を処置するために、生物における緑膿菌細菌を死滅させるために使用してもよい。組成物は、また、前記哺乳動物における微生物叢を改変することにより、哺乳動物の状態を改善するために使用してもよい。特に、本発明の組成物は、哺乳動物の皮膚又は粘膜上の緑膿菌株を特異的に除きうるので、その微生物叢を改変し、適切なバランスを回復することができる。

特定の実施形態において、本発明は、また、哺乳動物への、上で定義する組成物又はバクテリオファージ又は核酸又はポリヌクレオチドの投与を含む、哺乳動物において感染症を処置するための方法に関する。特定の実施形態において、本方法は、ＢＰ１３８４、ＢＰ１４２９、ＢＰ１４３０、ＢＰ１４３３、ＢＰ１４５０、ＢＰ１６４４、ＢＰ１６４７、ＢＰ１６４８、ＢＰ１６４９、ＢＰ１６５０、ＢＰ１６５８、ＢＰ１６６１、及び／又はＢＰ１６６２、或いはそれらの変異体より選択される、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、更により好ましくは少なくとも３つのバクテリオファージを投与することを含む。

本発明は、また、哺乳動物における感染症を処置するための医薬の製造のための、又は哺乳動物において微生物叢を回復するための、記載された組成物、バクテリオファージ、核酸、又はポリペプチドの使用に関する。

本発明の組成物又は薬剤は、任意の便利な経路（静脈内、経口、経皮、皮下、粘膜、筋肉内、肺内、鼻内、非経口、直腸、膣、及び局所を含む）により投与してもよい。好ましい実施形態において、バクテリオファージ又は組成物を、局所経路により、例えば被験者の皮膚上に適用することにより、投与する。組成物は、直接的又は間接的に（例えば、支持体を介して）投与してもよい。この点において、組成物を、例えば、罹患部位に適用又は噴霧してもよい。本発明の組成物は、また、経口又は非経口経路により投与することができる。本発明の組成物を適用、噴霧、又は投与するために適切な投薬量は、種々の因子（製剤、投与の様式、年齢、体重、性別、状態、投与時での処置されている哺乳動物の食事、投与の経路、及び反応感度を含む）に依存して、当業者により調整できる。当技術分野における通常の技術を有する医師は、要求される組成物の有効量を容易に決定し、処方することができる。

投薬は、また、抗生物質耐性緑膿菌株に対する溶解活性が得られるように、当業者により調整できる。インビボで溶解活性を得るための効率的な用量は、典型的には、投与経路に従って、少なくとも１０^ｅ２ＰＦＵ/ml、好ましくは約１０^ｅ２〜１０^ｅ１２ＰＦＵ/mlの濃度を含む。投与は、１回だけ実施しても、必要な場合、繰り返してもよい。

本発明の組成物は、典型的には、気道、尿路、熱傷、創傷、耳、皮膚、若しくは軟組織の緑膿菌感染症、又は胃腸感染症若しくは術後感染症を処置するために投与してもよい。
実験の項において示すとおり、本発明のバクテリオファージ及び組成物は、インビトロ又はインビボで緑膿菌細菌を選択的に死滅させることができる。組成物は、インビボでさえ、低い投与量でさえ、異なる緑膿菌細菌の混合物を破壊することができる。更に、本発明の組成物は、バイオフィルム中に埋め込まれた細菌を死滅させるのに有効であり、それは、病原性細菌について特に重要である。また、本発明の組成物及びバクテリオファージは、厳密には、哺乳動物細胞に影響することができず、従って、特異的であり、インビボでの副作用を欠いている。

本発明は、また、物質を除染するための、本発明の組成物、バクテリオファージ、核酸、又はポリペプチドの使用に関する。それらの強力な抗菌効果、及び、更には細菌性バイオフィルムの完全性を損なうそれらの能力のため、本発明の組成物は、物質上の細菌数を排除する、又は、少なくともその低下を起こすために、除染剤として使用することができる。そのような方法は、医学的及び非医学的の両方の文脈において、種々の生物学的表面又は非生物学的表面（固体物質又はデバイスを含み、例えば、コンタクトレンズ、身体中に移植されるデバイスの表面、パイプ、管、実験容器、繊維など）の処置のために適用してもよい。

本発明の診断／予測試験：
本発明は、また、被験者におけるバクテリオファージ治療の有効性を予測又は決定するための方法に関し、この方法は、前記被験者からのサンプルからの緑膿菌株に対する、ＢＰ１３８４、ＢＰ１４２９、ＢＰ１４３０、ＢＰ１４３３、ＢＰ１４５０、ＢＰ１６４４、ＢＰ１６４７、ＢＰ１６４８、ＢＰ１６４９、ＢＰ１６５０、ＢＰ１６５８、ＢＰ１６６１、及び／又はＢＰ１６６２より選択される１つ又は複数のバクテリオファージの溶解活性を決定する工程を含み、そのような溶解活性は、効率的な処置を示す。好ましい局面において、この方法は、更に、場合により、前記被験者のサンプルからの緑膿菌株に対する溶解活性を有する１つ又は複数のバクテリオファージにより、前記被験者を処置する工程を含む。

別の局面において、本発明は、被験者を選択するか、又は被験者がバクテリオファージ治療から利益を得るのに感受性であるか否かを決定するための方法を提供し、この方法は、前記被験者のサンプルからの緑膿菌株に対する、ＢＰ１３８４、ＢＰ１４２９、ＢＰ１４３０、ＢＰ１４３３、ＢＰ１４５０、ＢＰ１６４４、ＢＰ１６４７、ＢＰ１６４８、ＢＰ１６４９、ＢＰ１６５０、ＢＰ１６５８、ＢＰ１６６１、及び／又はＢＰ１６６２より選択される１つ又は複数のバクテリオファージの溶解活性を決定する工程を含み、少なくとも１つの緑膿菌株に対する、本発明の１つ又は複数のバクテリオファージの溶解活性は、応答被験者を示す。

本発明の別の目的は、バクテリオファージ治療への被験者の応答を予測するための方法に関し、この方法は、前記被験者のサンプルからの緑膿菌株に対する、ＢＰ１３８４、ＢＰ１４２９、ＢＰ１４３０、ＢＰ１４３３、ＢＰ１４５０、ＢＰ１６４４、ＢＰ１６４７、ＢＰ１６４８、ＢＰ１６４９、ＢＰ１６５０、ＢＰ１６５８、ＢＰ１６６１、及び／又はＢＰ１６６２より選択される１つ又は複数のバクテリオファージの溶解活性を決定する工程を含み、少なくとも１つの緑膿菌株に対する、本発明の１つ又は複数のバクテリオファージの溶解活性は、前記治療への良好な応答を示す。

本発明の更なる局面及び利点を、以下の実験の項において開示するが、それは例示のみである。

材料及び方法
ファージの単離及び調製
ＭＤＲ緑膿菌細菌を、環境水から各々の病原性バクテリオファージを単離し、濃縮するために使用した。環境サンプルとＬｕｒｉａＢｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）中の細菌の一晩培養物とを混合し、震盪しながら３７℃で２４時間インキュベートし、特定のバクテリオファージを濃縮した。インキュベーションの終了時、クロロホルムの液滴を培養物に加えた。培養物を、１１，０００gで５分間スピンダウンし、細菌細胞及びデブリを除いた。上清を、０．２μmフィルターに供し、残留細菌細胞を取り除いた。濃縮されたファージ溶液を、埋め込まれた緑膿菌を含むＬＢ寒天培地上にプレーティングした。プラークが、３７℃での２４時間のインキュベーション後、プレート上に形成した。単一のプラークを、その後のファージの精製及び増幅のために取り出した。ファージを、次に、ＬＢブロス又は生理食塩水の懸濁液中で４℃で保存した。
懸濁液中でのファージの力価は、プラークカウントにより推定した（Postic, 1961）。懸濁液の１０倍希釈物を、増殖する株の乾燥した菌叢上に送達した。プレートを、一晩のインキュベート後に読み取った。また、プラークカウント法によりプラーク形態の可視化が可能になった。

宿主範囲の決定
バクテリオファージの宿主範囲を、ＬＭＧコレクションからの２０の緑膿菌のコレクションの間で決定した。１０^９個の細菌細胞を、溶融寒天と混合し、この混合物を固体寒天上に注ぎ、二重層寒天プレートを作製した。固化後、単離バクテリオファージストック溶液を、異なる細菌株とともに、各々のプレート上にスポットした。２０分間でスポットを吸収させた後、プレートを反転させ、溶解度を記録する前に、３７℃で２４時間インキュベートし、その後、溶解の程度を記録した（Postic, 1961; Yang, 2010）。

電子顕微鏡観察
各々のファージの電子顕微鏡写真は、透過型電子顕微鏡を用いて撮った。

ファージゲノムの配列決定、分析、及びアノテーション
ファージＤＮＡを単離するために、ファージを、上に記載するとおりに増殖させた。ファージＤＮＡを、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１、Ｖ／Ｖ）を用いた抽出、エタノール沈殿、及び水中での分解により単離した。全ゲノム配列決定を行い、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、National Center for Biotechnology Information［ＮＣＢＩ］データベース中に記載される遺伝子との類似性を決定した。ゲノムを、潜在的なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）についてスキャンした。

実施例１：バクテリオファージ−宿主の特徴及び動態
一工程の成長実験を、以前の記載に従って行い、最初に産生性溶解時間、吸着速度、次にファージバーストサイズを決定した。吸着速度を決定するために、サンプルを、異なる時間間隔で採取し、溶液中の遊離ファージ粒子を分析した。産生時間及びファージバーストサイズの決定のために、緑膿菌細菌をファージ溶液と混合し、ファージを１５分間吸着させた。混合物を直ちに５０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離に供し、遊離ファージ粒子を取り除いた。ペレットを５新鮮ＬＢ培地中に再懸濁し、培養物を継続的に３７℃でインキュベートした。サンプルを３分間隔で採取し、ファージ力価を決定した。これらの結果によって、細菌当たりに産生されたファージの数（バーストサイズ）、産生時間、及び産生性溶解効果（ＰＬＥ）を算出することが可能になった（下の表５に示すとおり）。

これらの結果は、全てのファージが、強力なウイルス産生能力及び吸収速度を有することを示す。大半のファージが、７を下回るＰＬＥを有し、それは、顕著なプロファイルを実証する。ファージ１４２９及び１６４７は、この点において特に効果的である。加えて、異なるＰＬＥ及び吸着時間によって、選択された変動を伴うカクテルを作製することが可能になる。

実施例２：カクテル組成物の調製
以下のカクテル組成物を構成し、各々が、１０〜９と１０〜１１ｐｆｕとの間の各バクテリオファージを含む：

種々のファージの全てを含む、以下の追加の２つのカクテル組成物を構成し、これは、緑膿菌種の最も重要な多様性をカバーする：

実施例３：本発明のバクテリオファージカクテルに対する細菌の感受性
細菌の種々の株を、２．１０^９個のバクテリオファージ/mlで、本発明のバクテリオファージカクテルを用いて試験した。異なる細菌濃度を、２．１０^９個のバクテリオファージ/mlでバクテリオファージカクテル上にプレーティングし、３７℃で２４時間インキュベートした。

カクテルを、表２及び３に列挙されている２２の別個の緑膿菌細菌で試験する。カクテルに感受性である細菌種の%を、下の表６に列挙する：

細菌を数え、耐性率（インキュベーション後の細菌数／プレーティングした細菌の数）の算出に使用した。１３の異なる型のバクテリオファージを含むカクテルを用いた耐性率を、以下の表７に示す：

全ての試験した細菌が、本発明の組成物に感受性である。

実施例４：カクテルの特異性
カクテルの特異性を、１０の細菌種（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｂａｃｔｅｒｂａｕｍａｎｉｉ）、エンテロバクター・アエロゲネスＣ（ＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓＣ）、エンテロバクター・アスブリエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｓｂｕｒｉａｅ）、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｃｌｏａｃａｅ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｏｒｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓａｕｒｅｕｓ）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌａ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）を含む）での試験により確認した。

上の表は、緑膿菌株以外の細菌で溶解活性が生じなかったことを明らかに示す。従って、本発明のバクテリオファージ及びカクテルは、緑膿菌株に高度に特異的である。

実施例５：インビトロでの緑膿菌株に対するバクテリオファージの有効性
ＬＭＧコレクションのいくつかの株を、緑膿菌の遺伝的多様性及び抗生物質耐性の種々の形態を表すために選んだ。株は、１つ又はいくつかの抗生物質に感受性又は耐性のいずれかであった（表９に記載するとおり）。それらは、個々に、又は２〜８株との組み合わせにおいて成長させた。バクテリオファージカクテルを、１〜１０^ｅ−６のＭＯＩで、即ち、１対１００万の希釈率（細菌／ファージ）で加えた。

結果を、図１及び以下の表１０に示す。

本発明の組成物は、緑膿菌細菌の８の別個の菌株の混合物を一緒に死滅させることができる。カクテルは、１／１０００の希釈で８株に対して効果的なままである。

実施例６：インビボでの緑膿菌株に対するバクテリオファージの有効性
単離Ｉｓ５８０株（１９９７年に熱傷患者で回収された）を、以下の実験のために使用した。
Ｉｓ５８０株は、アンピシリン、ＡＭＣ、ＰＩＰ、ＣＥＦ、ＣＸＭ、アキセチルＣＸＭ、ＦＯＸ、ＣＰＤ、ＣＴＸ、ＣＡＺ、ＧＥＮ、ＴＯＢ、ＯＦＸ、ＮＩＴ、ＳＸＴに耐性である。
ＳＫＨ１マウス（又はヘアレスマウス）を、緑膿菌感染症のマウスモデルとして使用した。

手順：（下の表１１を参照のこと）
− マウスは、感染前の−３日目から２日毎に、１．５mgのシクロホスファミド（Ｃｙ）の３回のＩＰ注射により免疫抑制した。
− マウスは、３０mg/kgでの２μlの液体イペリットにより、皮膚上を熱傷させた。
− 熱傷部位における細菌懸濁液の皮下注射による熱傷後２日目の感染症。

カクテル組成物を、実施例１に従って調製し、１０^ｅ７のファージ/mlでバクテリオファージカクテルを浸漬した湿布を０日目に適用した。

種々の濃度の緑膿菌株を、１００μlのバクテリオファージカクテルを用いて試験した。図２に示すとおり、全ての緑膿菌株が、治療後６時間目に死滅された。

ＳＫＨ１マウスへの皮下注射によるＩｓ５８０緑膿菌株の投与時、マウスの３５%だけが、更なる処置の非存在下で生存した。上の表１０に示すバクテリオファージカクテルの注射により処置されたマウスにおいて、顕著な生存率が観察された（図３を参照のこと）：感染後１６日目、皮下処置されたＳＫＨ１マウスについて１００%生存。比較により、５０%生存率が、感染後２日目に抗生物質により処置されたＳＫＨ１マウスについて観察された。

したがって、本発明の組成物は、インビボで感染症を処置することができ、感染症マウスにおいて１００%生存率を誘導することができる。

参考文献

Claims

緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株に対する溶解活性を有する少なくとも２つの別個のバクテリオファージを含む抗菌組成物であって、該少なくとも２つの別個のバクテリオファージが、配列番号１〜１３のいずれか１つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージより選択される、抗菌組成物。
配列番号１〜１３のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９０%の同一性を有する配列を含むゲノムを有するバクテリオファージより選択される、少なくとも３つの、より好ましくは少なくとも４つの別個のバクテリオファージを含む、請求項１記載の組成物。
配列番号１〜１３のヌクレオチド配列をそれぞれ含む、バクテリオファージＢＰ１３８４、ＢＰ１４２９、ＢＰ１４３０、ＢＰ１４３３、ＢＰ１４５０、ＢＰ１６４４、ＢＰ１６４７、ＢＰ１６４８、ＢＰ１６４９、ＢＰ１６５０、ＢＰ１６５８、ＢＰ１６６１及びＢＰ１６６２の全てのうちの組み合わせを含む、請求項１又は２記載の組成物。
抗生物質耐性緑膿菌株に対して溶解性である、請求項１〜３のいずれか一項記載の組成物。
ＬＭＧコレクションの細菌株の全てのうちの９０%超に対して溶解性である、請求項１〜４のいずれか一項記載の組成物。
医薬的に許容可能な賦形剤又は担体を更に含む、請求項１〜５のいずれか一項記載の組成物。
液体、半液体、固体又は凍結乾燥の製剤である、請求項１〜６のいずれか一項記載の組成物。
１０^ｅ４ＰＦＵと１０^ｅ１２ＰＦＵとの間の各バクテリオファージを含む、先行する請求項のいずれか一項記載の組成物。
哺乳動物における感染症の処置における使用のための、請求項１〜８のいずれか一項記載の組成物。
前記哺乳動物において微生物叢を改変することによる、哺乳動物の状態を改善させるために使用するための、請求項１〜８のいずれか一項記載の組成物。
物質を除染するために使用するための、請求項１〜８のいずれか一項記載の組成物。
前記の１つ又は複数のバクテリオファージを別々に産生すること、及び、該バクテリオファージを、適切な担体又は賦形剤と組み合わせることを含む、請求項１〜８のいずれか一項記載の組成物を調製するための方法。
被験者におけるバクテリオファージ治療の有効性を予測又は決定するための方法であって、該被験者のサンプルからの緑膿菌株に対する、請求項１〜８のいずれか一項に記載される１つ又は複数のバクテリオファージの溶解活性をインビトロで決定する工程を含む方法であって、該被験者の該サンプルからの少なくとも１つの緑膿菌株に対する、該バクテリオファージのうちの１つ又は複数の溶解活性が、効率的な処置を意味する、方法。
前記被験者のサンプルからの緑膿菌株に対する溶解活性を有する前記バクテリオファージのうちの１つ又は複数により被験者を処置する工程を更に含む、請求項１３記載の方法。
被験者を選択するか、又は、被験者が、バクテリオファージ治療から利益を得るのに感受性であるか否かを決定するための方法であって、該被験者のサンプルからの緑膿菌株に対する、請求項１〜８のいずれか一項に記載される１つ又は複数のバクテリオファージの溶解活性を決定する工程を含む方法であって、該バクテリオファージのうちの１つ又は複数の溶解活性の存在が、応答被験者を意味する、方法。
緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株に対する溶解活性を有し、そして、配列番号１〜１３のいずれか１つより選択されるヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９７%の同一性を有する配列を含むゲノムを有する、バクテリオファージ。
病原性緑膿菌株に対する溶解活性を有するバクテリオファージであって、（ｉ）緑膿菌株に特異的であり、（ｉｉ）抗生物質耐性緑膿菌株に対して活性であり、及び（ｉｉｉ）２０未満、より好ましくは１５未満、更により好ましくは０．３と１５との間の産生性溶解効果（「ＰＬＥ」）を有する、バクテリオファージ。
配列番号１〜１３のいずれか１つより選択されるヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９７%の同一性を有する配列を含む単離核酸。
請求項１６〜１７のいずれか一項記載のバクテリオファージにより又は請求項１８記載の核酸によりコードされる単離ポリペプチド。
哺乳動物における感染症の処置で使用のための、請求項１６〜１９のいずれか一項記載のバクテリオファージ、核酸、又はポリペプチド。