CN108697744B - 假单胞菌感染的噬菌体疗法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及噬菌体疗法。更具体来说，本发明涉及具有针对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株的高特异性的新噬菌体、它们的制造、其组分、包含它们的组合物及其在噬菌体疗法中的用途。

Description

假单胞菌感染的噬菌体疗法
技术领域
本发明涉及新的噬菌体、包含所述噬菌体的组合物、它们的制造及其用途。本发明特别适用于治疗哺乳动物中的感染和通过改良对象中的菌群来改善所述对象的状况。
背景技术
噬菌体是表现出侵染并杀死细菌的能力的小病毒，同时它们不影响来自于其他生物体的细胞。噬菌体最初在几乎一个世纪之前由William Twort描述，并在其后不久被Félix d’Herelle独立地发现，迄今为止已发现并在形态学上描述了超过6000种不同噬菌体，包括细菌和古菌(archeal)的病毒。这些病毒绝大多数有尾，而少部分是多面体、丝状或多形性的。它们可以按照它们的形态、遗传内含物(DNA还是RNA)、特异性宿主、生活地点(海洋病毒还是其他栖息地)和生命周期进行分类。作为细菌细胞的细胞内寄生物，噬菌体在细菌宿主内表现出不同的生命周期：裂解性、溶原性、假溶原性和慢性感染(Weinbauer，2004；Drulis-Kawa，2012)。作为其生命周期的正常部分，裂解性噬菌体引起宿主细菌细胞的裂解。溶原性噬菌体(也被称为温和噬菌体)可以利用裂解性生命周期进行复制并引起宿主细菌裂解，或者它们可以将其DNA并入到宿主细菌DNA中并变成非感染性前噬菌体。不论噬菌体的生命周期是何种类型，第一步是附着于细菌细胞壁的受体，然后噬菌体的材料才可能进入细菌。这个特异性过程影响可能的噬菌体-细菌相互作用的范围。
噬菌体通常作为研究工具用于在实验室实验中改造细菌。
由于它们的靶宿主细胞特异性，已考虑将噬菌体用作疗法以治疗急性和慢性感染，特别是在皮肤病学、眼科学、泌尿科学、口腔病学、儿科学、耳鼻喉科学或外科学中。然而，这种噬菌体治疗细菌感染的治疗性用途的概念，从一开始就极富争议，并且未被公众或医学界广泛接受。早期研究由于缺少适合的对照并且结果不一致而广受批评。缺乏可重复性和在各种发表的研究中获得的许多冲突的结果，使美国医学联合会药学与化学理事会(Council on Pharmacy and Chemistry of the American Medical Association)得出关于裂解滤液的治疗价值的证据在极大程度上是矛盾的、不足以令人信服的结论，并推荐进行进一步研究以确认它声称的益处。
自从在1940年代引入抗生素以来，很少有人注意治疗学的这个领域，特别是在西方世界。但是抗生素的广泛使用已在全世界引起抗生素抗性细菌的广泛出现和传播，造成越来越严重的问题。因此，克服有限的剩余治疗选项以治疗主要的多药物抗性微生物，已变成主要的治疗挑战。
此外，许多致病性微生物驻留在生物膜内，所述生物膜在设计新的抗微生物剂时引起额外问题。就此而言，作为生物膜而不是以单细胞(“浮游”)形式生长的细菌倾向于对抗微生物剂特别有抗性，并且宿主免疫系统特别难以提供适合的应答。
自从在19世纪后期首次发现(Fordos 1859)以来，革兰氏阴性细菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)在恶名昭彰的人类病原体名单中就已获得声名狼藉的地位(Williams等，1894，Freeman等，1916)。抗生素时代的来临在健康患者中极大减轻了急性感染的以前致命的结果。在慢性感染的根治中仅取得相对进展，所述慢性感染主要发生在患有囊性纤维化或严重烧伤或免疫受损的个体中(Gang等，1999，Jones等，2010)。在这些患者中，感染的致命结果中的两个内在相关的因素是不适当的抗生素治疗的快速处方以及多药物抗性菌株的发生或获得。尽管已报道使用适合的抗生素在铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)感染的根治中是必不可少的因素(Kang等，2005，Micek等，2005)，但相反，抗生素滥用通过为获得逐渐增加的抗性施加连续的选择压力而显著地促成了抗性逐渐增加这种能力。单单抗生素不能解释多药物抗性变体的高度流行：铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)具有染色体编码的多种固有抗性机制，包括细胞被膜的低通透性和大量多药物外排泵。对这种细菌的成功的侵入行为和持久性负有责任的另一个主要因素是它的高适应性，允许在不同环境快速定殖。
此外，病原性细菌例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)能够形成生物膜，这促成了它们对抗生素的抗性增加。这种生物膜可能包含被分泌的细胞外基质支持并包围的超过一种类型的细菌，并帮助细菌定殖于各种不同表面。生物膜允许细菌附着于表面并达到原本不可承受的群体密度，不仅对抗生素而且对许多环境胁迫(包括毒素如重金属、漂白剂和其他清洁剂)提供增加的抗性。已知生物膜中的细菌对抗生素的抗性可以比以浮游形式生长的同一细菌菌株的抗性高100到1000倍。这种增加的抗性意味着在实验室试验中明显对抗生素敏感的细菌在临床背景中可能对疗法有抗性。即使一些细菌被清除，但生物膜可以提供抗性储库，允许在一旦抗生素不再存在后快速定殖。因此，显然生物膜在许多人类疾病中是重要因素。化学治疗不适合用于对抗生物膜，因为这恰恰是它们进化以对抗的情况。物理磨蚀确实提供了破坏生物膜的一种手段。不幸的是，生物膜支持细菌性发病所在的许多表面，即骨骼、关节、植入的医疗装置等，不太适合严酷磨蚀。例如，伤口或烧伤的表面极为敏感和柔弱。即使在磨蚀既适合也被常规使用之处，生物膜的清除也是有限的。牙齿表面上的口腔菌斑是生物膜并通过日常刷牙被部分清除。然而，细菌维持在未刷洗表面上(例如牙齿之间的缝隙中)，并且可以快速且有效地重新定殖在被清除的表面上。由此可以清楚看出，现有的清除生物膜的方法的功效有限。
快速适应能力和形成生物膜的能力是将铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)鉴定为机会致病菌的主要原因。它们已获得医院致病菌的地位，并且可以从获取自伤口、痰液、膀胱、尿道、阴道、耳、眼和呼吸道的临床样品分离。在这些临床铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株中出现对最强有力的新抗生素的抗性，甚至在治疗期间出现，使得与铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)医院致病菌的战斗成为极大难题。
此外，已报道对象的病理或生理状况受到对象菌群中微生物平衡的影响。因此，通过消灭铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)群体来改良微生物菌群或改良所述平衡或恢复所述平衡，也是改善对象状况的有价值的方法。
因此，对于可用于消灭即使组织在细菌生物膜中的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株，适合于在人类或动物疗法中使用以及适合于对材料消毒的新的抗细菌剂或组合物，存在着极大需求。
发明内容
本发明人已分离并表征了对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(P.aeruginosa)表现出特异性裂解活性的新噬菌体，其可作为活性剂用于药物制剂或兽医制剂，特别是用于治疗铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)细菌感染或用于改良对象中的微生物平衡。本发明的新噬菌体表现出强裂解活性、高选择性，并且可以组合以诱导非常大范围的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)细胞的受控破坏。
本发明的一个目的是提供抗细菌组合物，其包含至少一种、优选地至少两种对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(P.aeruginosa)菌株具有裂解活性的噬菌体，所述噬菌体选自基因组包含SEQ ID NO：1至13任一者的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的噬菌体。
本发明的另一个目的涉及一种噬菌体，其对铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(P.aeruginosa)菌株具有裂解活性，并且所述噬菌体的基因组包含选自SEQID NO：1至13任一者的核苷酸序列或与其具有至少97％同一性的序列。
本发明的噬菌体对铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的多药物抗性菌株、特别是对抗生素抗性致病菌株例如头孢菌素酶、羧苄青霉素酶和广谱β-内酰胺酶表现出裂解活性(Strateva T.和Yordanov D.，2009)。
另一方面，本发明涉及一种对致病性铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株具有裂解活性的噬菌体，其中所述噬菌体特异性针对铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，对抗生素抗性铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株有活性，并具有低于20的生产性裂解效应(productivelytic effect)。
本发明还涉及一种分离的被包含在本发明的噬菌体中的核酸，优选为包含选自SEQ ID NO：1至13任一者的核苷酸序列或与其具有至少97％同一性的序列的分离的核酸分子；以及一种分离的由所述核酸编码的多肽。
本发明的另一个目的是包含如上所定义的核酸或多肽的组合物。
本发明的组合物通常还包含可药用或可兽医用赋形剂或载体。它们可能是液体、半液体、固体或冷冻干燥的。
本发明的另一个目的涉及如上所定义的噬菌体、核酸、多肽或组合物，其用于治疗哺乳动物中的感染，改良哺乳动物中的微生物菌群，对材料消毒，和/或杀死铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)细菌或损害细菌生物膜的完整性。
本发明还涉及一种或几种裂解性噬菌体用于通过改良对象中的微生物菌群来改善所述对象的状况的用途。所述微生物菌群可以通过校正、改变或恢复所述菌群中微生物的适当平衡来改良。
本发明还涉及一种用于治疗哺乳动物中的感染的方法，所述方法包括向所述哺乳动物给药至少一种如上所定义的噬菌体、核酸、多肽或组合物。
本发明还涉及一种用于对怀疑被铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)细菌污染的表面或材料进行处理的方法，所述方法包括向所述表面或材料施加至少一种如上所定义的噬菌体、核酸、多肽或组合物。所述表面或材料可以是任何装置、容器的表面或实验室材料、衣物等。
本发明的另一个目的涉及一种试剂盒，其包含如上所定义的组合物和用于将所述组合物施用到对象或表面的机构。
本发明的另一个目的涉及一种用于预测或确定噬菌体疗法在对象中的功效的方法，其中所述方法包括在体外确定一种或多种本发明的噬菌体对来自于所述对象的样品的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株的裂解活性，一种或多种本发明的噬菌体对来自于所述样品的至少一株铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株的裂解活性指示有效的治疗。所述方法还任选地包括用至少一种对来自于所述对象的样品的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株具有裂解活性的噬菌体治疗所述对象的步骤。
另一方面，本发明提供了一种选择对象或确定对象是否易于从噬菌体疗法获益的方法，其中所述方法包括在体外确定一种或多种本发明的噬菌体对来自于所述对象的样品的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株的裂解活性的步骤，一种或多种所述噬菌体对至少一种铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株的裂解活性指示响应者对象。
本发明可用于任何哺乳动物中，优选用于人类中，或用于处理任何材料，包括实验室材料或医疗装置。
附图说明
图1：本发明的噬菌体对铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株的各种不同组合的体外功效。
图2：本发明的噬菌体对铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株的各种不同组合的体内功效。
图3：本发明的噬菌体对Is580铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株介导的感染的体内功效。
发明详述
本发明涉及新的噬菌体、其组分、包含所述噬菌体的组合物、它们的制造及其作为抗细菌剂的用途，特别是用于治疗哺乳动物中的感染和通过改良对象中的微生物菌群来改善所述对象的状况。
定义
为了便于理解本发明，下面对许多术语进行定义。
当在本文中使用时，术语“噬菌体”是指有功能的噬菌体粒子，其包含被包装在蛋白质包膜或衣壳中的核酸基因组。该术语也指称噬菌体的部分，包括例如头部；或提供基本上相同的功能活性的噬菌体组分的组装体。
术语“表型特征”更优选地是指噬菌体的形态和/或宿主范围。用于确定噬菌体表型的方法本身在本领域中是公知的，并且包括例如确定细菌宿主范围和/或针对由某些细菌菌株产生的生物膜的活性。
当在本发明中使用时，术语“裂解活性”是指噬菌体引起细菌细胞裂解的性能。可以按照本身在本领域中已知的技术在铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株上测试噬菌体的裂解活性(也参见实验部分)。
术语参比噬菌体的“变体”是指与所述参比噬菌体相比在基因组序列和/或由其编码的多肽中具有变异，同时保留与参比噬菌体相同的表型特征的噬菌体。变体通常包含例如遗传物质的沉默突变、保守突变、少量缺失和/或少量复制，并保留参比噬菌体的表型特征。在优选实施方式中，本发明的变体保留取决于本发明的噬菌体的基因组的任何可观察的特征或特性，即所述噬菌体的表型特征，和/或针对铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株的裂解活性。与参比噬菌体的基因组相比，优选的变体具有少于5％的核酸变异，甚至更优选地少于4％，更优选地少于2％。可替选地或组合地，与参比噬菌体的多肽相比，变体在编码的多肽序列中优选地具有少于5％的氨基酸变异。
对于核酸或氨基酸序列来说，术语“％同一性”是指所述序列之间的同一性或同源性水平，并且可以通过本身在本领域中已知的技术来确定。通常，两个核酸或氨基酸序列之间的％同一性利用计算机程序来确定，例如在GCG程序包中提供的GAP(用于威斯康星软件包的程序手册(Program Manual for the Wisconsin Package),版本8,1996年8月,遗传学计算机集团(Genetics Computer Group),575Science Drive,Madison,Wisconsin,USA53711)(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.,(1970),Journal of Molecular Biology,48,443-453)。使用被调整到例如DNA序列的设置(具体来说：GAP生成罚分为5.0，GAP扩展罚分为0.3)，可以使用可作为GCG程序包的一部分获得的Pileup比对软件将核酸分子彼此对齐。两个序列之间的％同一性是指在所述序列的整个长度内的同一性。
术语核酸的“片段”通常是指具有所述核酸的至少10个连续核苷酸，更优选地具有所述核酸的至少15、20、25、30、35、40、50或更多个连续核苷酸的片段。
术语多肽的“片段”通常是指具有所述多肽的至少5个连续氨基酸，更优选地具有所述多肽的至少10、15、20、30、40、50或更多个连续氨基酸的片段。
术语“ESBL铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株”是指产生头孢菌素酶和/或广谱β-内酰胺酶的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株，包括各种不同形式的抗生素抗性例如AmpCβ-内酰胺酶或A类羧苄青霉素水解性β-内酰胺酶等。
对于噬菌体来说，术语“特异的”或“特异性”是指所述噬菌体能够感染的宿主类型。特异性通常由噬菌体的尾部纤维介导，所述尾部纤维参与与细胞上表达的受体的相互作用。“特异性”针对铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的噬菌体更优选地是指可以感染一种或几种铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株并且在生理条件下不能感染非铜绿假单胞菌细菌的噬菌体。
当在本文中使用时，术语“多肽”是指任何尺寸的多肽，包括例如5至20个氨基酸的小肽、更长的多肽、蛋白质或其片段。
术语“PLE”或“生产性裂解效应”是指给定噬菌体的释放量(burstsize)与生产性裂解时间之间的比率。释放量和生产性裂解时间是定义噬菌体-宿主相互作用的参数，并且分别对应于由一个细菌被一个噬菌体感染所产生的噬菌体粒子的平均得率和游离噬菌体裂解细菌细胞所花费的时间。
在本说明书的情形中，术语“分离的噬菌体”应该被认为意指从它天然存在的原始环境中取出的材料。对于噬菌体来说，该术语具体是指例如被培养、纯化和/或与它天然所在的环境分开地培养的噬菌体。对于核酸或多肽来说，术语“分离的”是指例如与其天然环境的至少一些组分例如蛋白质、脂类和/或核酸分离开的核酸分子或多肽。
当在本文中使用时，术语“可药用或可兽医用”是指与在哺乳动物对象中的使用相容的任何材料(例如载体、赋形剂或介质)。这些材料包括对生物体无害或不引起任何显著的特异性或非特异性免疫反应或不废止活性化合物的生物活性的生理上可接受的溶液或介质。为了将组合物配制成液体制剂，可以使用盐水、无菌水、林格氏溶液(Ringer'ssolution)、缓冲生理盐水、白蛋白输注溶液、右旋糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇及其混合物作为可药用或可兽医用赋形剂或载体。如有必要，可以添加其他常规添加剂例如增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂、抗氧化剂和抑菌剂。此外，可以另外向组合物添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂，以制备可注射制剂例如水性溶液、悬液和乳液，口服制剂例如丸剂、胶囊、颗粒剂或片剂，或粉末制剂。
当在本文中使用时，“PFU”是指噬斑形成单位，正如在本领域中明确定义的。裂解性噬菌体裂解宿主细胞，在培养板上产生清空区(或噬斑)。理论上，每个噬斑由一个噬菌体形成，并且噬斑数目乘以稀释倍数等于试验制备物中噬菌体的总数。
术语“治疗”或“疗法”是指疾病的治愈性或预防性治疗。治愈性治疗被定义为引起疾病痊愈的治疗，或直接或间接地缓和、减轻、稳定或消除疾病的症状或它所引起的痛苦的治疗，或改善对象状况或减缓疾病发展的治疗。预防性治疗包含引起疾病预防的治疗以及减小和/或延迟疾病的发生率或它出现的风险的治疗两者。
术语“哺乳动物”包括人类对象以及非人类哺乳动物例如宠物(例如狗、猫)、马、反刍动物、绵羊、山羊、猪等。
当在本文中使用时，术语“生物膜”是指在各种不同表面上生长的非均相细菌形成物；优选为包埋在附着于固体生物或非生物表面上的胞外多糖基质中生长的细菌群落。
当在本文中使用时，术语“损害”是指完整性的任何改变。损害细菌生物膜被理解为生物膜被噬菌体的侵入，生物膜相关细菌的感染或其裂解，和/或生物膜的部分或全部清除(即通过停止定殖和/或破坏生物膜)。
当在本文中使用时，术语“样品”是指任何含有细胞的样品。这些样品的实例包括流体例如血液、血浆、唾液或尿液，以及活组织检查、器官、组织或细胞样品。样品可以在使用前进行处理。
当在本文中使用时，术语“对象”或“患者”是指动物，优选为哺乳动物，甚至更优选为人类，包括成年人和儿童。然而，术语“对象”也涵盖非人类动物，尤其是哺乳动物例如狗、猫、马、奶牛、猪、绵羊和非人类灵长动物等。
当在本文中使用时，术语治疗的“功效”或对噬菌体疗法的“响应”是指与治疗前铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株的数目相比在噬菌体治疗后引起对象中铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株的数目减少的治疗。“良好响应者”对象是指当用噬菌体疗法治疗时显示出或将会显示出临床上显著的恢复的对象。
术语噬菌体的“混合物”或组合物是指不同类型的噬菌体的组合。混合物/组合物中的噬菌体优选被配制在一起，即在同一容器或包装中，尽管它们也可以作为部件的试剂盒使用，其中将噬菌体(或一些噬菌体)分开地配制或包装并在使用或给药时组合。
实施方式描述
本发明涉及新的噬菌体疗法。更具体来说，本发明涉及对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株具有高特异性的新噬菌体、它们的制造、其组分、包含它们的组合物及其在噬菌体疗法中的用途。
噬菌体：
第一方面，本发明公开了特异性针对铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株并且单独或组合地表现出裂解活性的引人注目的宿主范围的新噬菌体的分离和表征。这些噬菌体从环境样品选择、分离、测序并表征。正如指明的，所述噬菌体单个地和组合地具有对抗铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株的活性。它们明显有效地对抗致病性铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株例如抗生素抗性铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株，例如ESBL铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株。此外，本发明的噬菌体具有低于20、更优选地低于15、还更优选地在0.3至15之间的显著的生产性裂解效应(“PLE”)。此外，本发明的噬菌体特异性针对铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株，即它们不引起非铜绿假单胞菌细菌的裂解。正如将会进一步说明的，本发明显示，这些噬菌体可以组合且配制成适合用作制药或兽医药剂的状态，以表现出针对受控范围的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株的靶向且非常强的抗细菌效应。
更具体来说，已选择并表征了下列噬菌体。它们相应的核酸序列也被注明。
表1
SEQ ID号 噬菌体
SEQ ID NO:1 BP1384
SEQ ID NO:2 BP1429
SEQ ID NO:3 BP1430
SEQ ID NO:4 BP1433
SEQ ID NO:5 BP1450
SEQ ID NO:6 BP1644
SEQ ID NO:7 BP1647
SEQ ID NO:8 BP1648
SEQ ID NO:9 BP1649
SEQ ID NO:10 BP1650
SEQ ID NO:11 BP1658
SEQ ID NO:12 BP1661
SEQ ID NO:13 BP1662
已在广泛的大量铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株上确定了这些噬菌体的裂解情况。正如在下面的表中所公开的，这些噬菌体因它们的效力和组合潜力而被选择。在该表中，展现了噬菌体对参比和病原体抗性菌株的裂解效果，以证实高裂解潜力。
表2
细菌/噬菌体 1384 1429 1430 1433 1450 1644 1647 1648 1649 1650 1658 1661 1662
LMG 24882 + + + + + + + + + + + +
LMG 24883 + +/- + + + + + + + + +
LMG 24886 + + + + +/- + +/- +
LMG 24887 +/- +/- +/- + + +/- + + +/- +/-
LMG 24891 + + + + + + + + + + + +
LMG 24892 + + + + + + + + +/- + +
LMG 24893 + + + + + + + + + + + + +
LMG 24896 + + + + + + + + + + + + +
LMG 24898 + + + + + + + + + + + + +
LMG 24901 +/- + +/-
LMG 24903 +/- +/- + + +/-
LMG 24904 +/- +/- +/- + +/-
LMG 24905 +/- + + + + +
LMG 24909 + +/- + + + + + + +/- +
LMG 24913 +/- + + +/- +/-
LMG 24916 + + + + +
下面展示了在来自于伤口或烧伤的高抗性菌株上的进一步结果，进一步证实了本发明的噬菌体的引人注目的活性情况以及它们的互补性。
表3
1384 1429 1430 1433 1450 1644 1647 1648 1649 1650 1658 1661 1662 CAR*
LMG 25000 + + + - + + + - + - + + - 1
LMG 25122 - - - - + + - - + - + + - 5
LMG 25140 - + - - + + - - + - + + + 5
LMG 25133 - - - + + - + - - - + + - 2
LMG 25165 - - + - - - + - - - - + - 5
LMG 25146 - - - - + + - - + - + + - 4
*CAR：ATB抗性类型
正如可以从表2和3看到的，所述噬菌体单独地具有非常强的裂解能力，并且可以产生能够杀死所有被测试的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株的这些噬菌体的组合(或混合物)，由此产生广谱抗细菌组合物。
作为示例，本发明的所有13种噬菌体的混合物能够有效地杀死表2和表3中列出的所有细菌。
此外，已在许多非铜绿假单胞菌菌株上测试了所述噬菌体的特异性。更具体来说，实验部分证实了本发明的噬菌体对选自大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、鲍曼不动杆菌(Acinebacter baumanii)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)、奇异变形杆菌(Porteus mirabilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococus aureus)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophila)和/或粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的任何细菌都没有裂解效应。
因此，本发明的特定目的在于一种对铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株具有裂解活性的噬菌体，所述噬菌体的基因组包含选自SEQ ID NO：1至13任一者的核苷酸序列或与其具有至少97％同一性、优选地至少98％或99％同一性的序列。
正如将在下文中更详细公开的，本发明的噬菌体可以被培养、扩增、分离、纯化并用于例如铜绿假单胞菌介导的障碍的噬菌体疗法中。此外，可以通过本身在本领域中已知的技术来生产和/或分离这些噬菌体的保留了所述噬菌体的表型(例如特异性和裂解活性)的变体。
本发明的噬菌体可以通过标准的培养、分离和纯化方法来制备。例如，对铜绿假单胞菌生产细菌进行培养，用噬菌体样品感染，然后进行处理以除去细菌细胞和碎片。可以将富集的噬菌体溶液在带有包埋的铜绿假单胞菌易感宿主菌株的培养基例如琼脂培养基中铺板，以获得噬斑。然后，可以挑取出单个噬斑用于随后的噬菌体纯化和扩增。本发明的噬菌体的一个或多个选择性扩增循环例如可以如下进行：将噬菌体与感受态铜绿假单胞菌混合，然后添加生长培养基并在所选的试验生长条件下温育。在离心后，将澄清的扩增上清液通过滤器过滤，并进行另一个选择性扩增循环或测试裂解活性的存在。
然后可以通过已知方法，例如通过噬斑计数来评估悬液中噬菌体的滴度和本发明的噬菌体的噬斑形态的可视化。此外，正如在本领域中公知的，可以通过任何适合的方法将本发明的噬菌体加工成各种不同形式(液体、冷冻干燥等)，以备短期、长期、冷冻或任何其他类型的储存(参见例如Clark，1962)。
本发明的噬菌体的活性可以通过本领域中公知的方法例如噬斑测定法(也称为双琼脂法)，在下述基础上进行评估：使用潜在的宿主细胞生长所述噬菌体，然后评估它们杀死所述宿主细菌细胞的能力。在噬斑测定法中，在软琼脂培养基中温育一段时间后，噬菌体引起靶铜绿假单胞菌菌株的裂解，在平板上产生被称为噬斑的清空区。
在特定实施方式中，本发明涉及BP1384噬菌体或其任何变体。BP1384噬菌体或其任何变体可以在例如铜绿假单胞菌菌株PAO1中生产或扩增。BP1384或其任何变体对LMG24882、LMG24883、LMG24886、LMG24891、LMG24892、LMG24893、LMG24896、LMG24898和/或LMG24909菌株是特异的并针对所述菌株具有裂解活性。BP1384的基因组包含如SEQ ID NO：1中所示的序列或与SEQ IDNO：1具有至少80％同一性、更优选地至少85％同一性、还更优选地90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。还提供了来自于BP1384噬菌体或其变体的分离的核酸序列。本发明还涵盖了由BP1384噬菌体或其变体编码或由来自于本发明的BP1384噬菌体的分离的核酸序列编码的分离的多肽。本发明的BP1384噬菌体的另一个特征在于PLE低于20，更优选地低于15，还更优选地为6.2左右。
在另一个特定实施方式中，本发明涉及BP1429噬菌体或其任何变体。BP1429噬菌体或其任何变体可以在例如铜绿假单胞菌菌株PAO1中生产或扩增。BP1429或其任何变体对LMG24882、LMG24891、LMG24892、LMG24893、LMG24896、LMG24898和/或LMG24916菌株是特异的并针对所述菌株具有裂解活性。BP1429的基因组包含如SEQ ID NO：2中所示的序列或与SEQ ID NO：2具有至少80％同一性、更优选地至少85％同一性、还更优选地90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。还提供了来自于BP1429噬菌体或其变体的分离的核酸序列。本发明还涵盖了由BP1429噬菌体或其变体编码或由来自于本发明的BP1429噬菌体的分离的核酸序列编码的分离的多肽。本发明的BP1429噬菌体的另一个特征在于PLE低于20，更优选地低于15，还更优选地为0.70左右。
另一方面，本发明涉及BP1430噬菌体或其任何变体。BP1430噬菌体或其任何变体可以在例如铜绿假单胞菌菌株PAO1中生产或扩增。BP1430或其任何变体对LMG24882、LMG24883、LMG24891、LMG24892、LMG24893、LMG24896、LMG24898、LMG24901和/或LMG24918菌株是特异的并针对所述菌株具有裂解活性。BP1430的基因组包含如SEQ ID NO：3中所示的序列或与SEQ ID NO：3具有至少80％同一性、更优选地至少85％同一性、还更优选地90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。还提供了来自于BP1430噬菌体或其变体的分离的核酸序列。本发明还涵盖了由BP1430噬菌体或其变体编码或由来自于本发明的BP1430噬菌体的分离的核酸序列编码的分离的多肽。本发明的BP1430噬菌体的另一个特征在于PLE低于20，更优选地低于15，还更优选地为3左右。
另一方面，本发明涉及BP1433噬菌体或其任何变体。BP1433噬菌体或其任何变体可以在例如铜绿假单胞菌菌株PAO1中生产或扩增。BP1433或其任何变体对LMG24882、LMG24883、LMG24886、LMG24887、LMG24891、LMG24892、LMG24893、LMG24896、LMG24896、LMG24905、LMG24909和/或LMG24916菌株是特异的并针对所述菌株具有裂解活性。BP1433的基因组包含如SEQ ID NO：4中所示的序列或与SEQ ID NO：4具有至少80％同一性、更优选地至少85％同一性、还更优选地90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。还提供了来自于BP1433噬菌体或其变体的分离的核酸序列。本发明还涵盖了由BP1433噬菌体或其变体编码或由来自于本发明的BP1433噬菌体的分离的核酸序列编码的分离的多肽。本发明的BP1433噬菌体的另一个特征在于PLE低于20，更优选地低于15，还更优选地为4左右。
在另一个特定实施方式中，本发明涉及BP1450噬菌体或其任何变体。BP1450噬菌体或其任何变体可以在例如铜绿假单胞菌菌株PAO1中生产或扩增。BP1450或其任何变体对LMG24882、LMG24883、LMG24886、LMG24887、LMG24891、LMG24892、LMG24893、LMG24896、LMG24898、LMG24903、LMG24904、LMG24905、LMG24909和/或LMG24913菌株是特异的并针对所述菌株具有裂解活性。BP1450的基因组包含如SEQ ID NO：5中所示的序列或与SEQ IDNO：5具有至少80％同一性、更优选地至少85％同一性、还更优选地90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。还提供了来自于BP1450噬菌体或其变体的分离的核酸序列。本发明还涵盖了由BP1450噬菌体或其变体编码或由来自于本发明的BP1450噬菌体的分离的核酸序列编码的分离的多肽。本发明的BP1450噬菌体的另一个特征在于PLE低于20，更优选地低于15，还更优选地为2左右。
另一方面，本发明涉及BP1644噬菌体或其任何变体。BP1644噬菌体或其任何变体可以在例如铜绿假单胞菌菌株PAO1中生产或扩增。BP1644或其任何变体对LMG24882、LMG24883、LMG24886、LMG24891、LMG24892、LMG24893、LMG24896、LMG24898、LMG24905和/或LMG24909菌株是特异的并针对所述菌株具有裂解活性。BP1644的基因组包含如SEQ ID NO：6中所示的序列或与SEQ IDNO：6具有至少80％同一性、更优选地至少85％同一性、还更优选地90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。还提供了来自于BP1644噬菌体或其变体的分离的核酸序列。本发明还涵盖了由BP1644噬菌体或其变体编码或由来自于本发明的BP1644噬菌体的分离的核酸序列编码的分离的多肽。本发明的BP1644噬菌体的另一个特征在于PLE低于20，更优选地低于15，还更优选地为1.5左右。
在另一个特定实施方式中，本发明涉及BP1647噬菌体或其任何变体。BP1647噬菌体或其任何变体可以在例如铜绿假单胞菌菌株PAO1中生产或扩增。BP1647或其任何变体对LMG24882、LMG24883、LMG24891、LMG24892、LMG24893、LMG24896、LMG24898、LMG24903和/或LMG24916菌株是特异的并针对所述菌株具有裂解活性。BP1647的基因组包含如SEQ ID NO：7中所示的序列或与SEQ IDNO：7具有至少80％同一性、更优选地至少85％同一性、还更优选地90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。还提供了来自于BP1647噬菌体或其变体的分离的核酸序列。本发明还涵盖了由BP1647噬菌体或其变体编码或由来自于本发明的BP1647噬菌体的分离的核酸序列编码的分离的多肽。本发明的BP1647噬菌体的另一个特征在于PLE低于20，更优选地低于15，还更优选地为0.4左右。
在另一个特定实施方式中，本发明涉及BP1648噬菌体或其任何变体。BP1648噬菌体或其任何变体可以在例如铜绿假单胞菌菌株PAO1中生产或扩增。BP1648或其任何变体对LMG24882、LMG24883、LMG24891、LMG24893、LMG24896、LMG24898和/或LMG24909菌株是特异的并针对所述菌株具有裂解活性。BP1648的基因组包含如SEQ ID NO：8中所示的序列或与SEQ ID NO：8具有至少80％同一性、更优选地至少85％同一性、还更优选地90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。还提供了来自于BP1648噬菌体或其变体的分离的核酸序列。本发明还涵盖了由BP1648噬菌体或其变体编码或由来自于本发明的BP1648噬菌体的分离的核酸序列编码的分离的多肽。本发明的BP1648噬菌体的另一个特征在于PLE低于20，更优选地低于15，还更优选地为2左右。
另一方面，本发明涉及BP1649噬菌体或其任何变体。BP1649噬菌体或其任何变体可以在例如铜绿假单胞菌菌株PAO1中生产或扩增。BP1649或其任何变体对LMG24882、LMG24883、LMG24886、LMG24887、LMG24891、LMG24892、LMG24893、LMG24896、LMG24898、LMG24905、LMG24909和/或LMG24913菌株是特异的并针对所述菌株具有裂解活性。BP1649的基因组包含如SEQ ID NO：9中所示的序列或与SEQ ID NO：9具有至少80％同一性、更优选地至少85％同一性、还更优选地90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。还提供了来自于BP1649噬菌体或其变体的分离的核酸序列。本发明还涵盖了由BP1649噬菌体或其变体编码或由来自于本发明的BP1649噬菌体的分离的核酸序列编码的分离的多肽。本发明的BP1155噬菌体的另一个特征在于PLE低于20，更优选地低于15，还更优选地为3.5左右。
在另一个特定实施方式中，本发明涉及BP1650噬菌体或其任何变体。BP1650噬菌体或其任何变体可以在例如铜绿假单胞菌菌株PAO1中生产或扩增。BP1650或其任何变体对LMG24882、LMG24893、LMG24896、LMG24898、LMG24905和/或LMG24909菌株是特异的并针对所述菌株具有裂解活性。BP1650的基因组包含如SEQ ID NO：10中所示的序列或与SEQ ID NO：10具有至少80％同一性、更优选地至少85％同一性、还更优选地90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。还提供了来自于BP1650噬菌体或其变体的分离的核酸序列。本发明还涵盖了由BP1650噬菌体或其变体编码或由来自于本发明的BP1650噬菌体的分离的核酸序列编码的分离的多肽。本发明的BP1650噬菌体的另一个特征在于PLE低于20，更优选地低于15，还更优选地为14左右。
另一方面，本发明涉及BP1658噬菌体或其任何变体。BP1658噬菌体或其任何变体可以在例如铜绿假单胞菌菌株PAO1中生产或扩增。BP1658或其任何变体对LMG24882、LMG24887、LMG24891、LMG24893、LMG24896和/或LMG24898菌株是特异的并针对所述菌株具有裂解活性。BP1658的基因组包含如SEQ ID NO：11中所示的序列或与SEQ ID NO：11具有至少80％同一性、更优选地至少85％同一性、还更优选地90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。还提供了来自于BP1658噬菌体或其变体的分离的核酸序列。本发明还涵盖了由BP1658噬菌体或其变体编码或由来自于本发明的BP1658噬菌体的分离的核酸序列编码的分离的多肽。本发明的BP1658噬菌体的另一个特征在于PLE低于20，更优选地低于15，还更优选地为3左右。
另一方面，本发明涉及BP1661噬菌体或其任何变体。BP1661噬菌体或其任何变体可以在例如铜绿假单胞菌菌株PAO1中生产或扩增。BP1661或其任何变体对LMG24882、LMG24883、LMG24886、LMG24891、LMG24892、LMG24893、LMG24896、LMG24898和/或LMG24909菌株是特异的并针对所述菌株具有裂解活性。BP1661的基因组包含如SEQ ID NO：12中所示的序列或与SEQ ID NO：12具有至少80％同一性、更优选地至少85％同一性、还更优选地90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。还提供了来自于BP1661噬菌体或其变体的分离的核酸序列。本发明还涵盖了由BP1661噬菌体或其变体编码或由来自于本发明的BP1661噬菌体的分离的核酸序列编码的分离的多肽。本发明的BP1661噬菌体的另一个特征在于PLE低于20，更优选地低于15，还更优选地为4左右。
另一方面，本发明涉及BP1662噬菌体或其任何变体。BP1662噬菌体或其任何变体可以在例如铜绿假单胞菌菌株PAO1中生产或扩增。BP1662或其任何变体对LMG24883、LMG24891、LMG24892、LMG24893、LMG24896、LMG24898和/或LMG24916菌株是特异的并针对所述菌株具有裂解活性。BP1662的基因组包含如SEQ ID NO：13中所示的序列或与SEQ ID NO：13具有至少80％同一性、更优选地至少85％同一性、还更优选地90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。还提供了来自于BP1662噬菌体或其变体的分离的核酸序列。本发明还涵盖了由BP1662噬菌体或其变体编码或由来自于本发明的BP1662噬菌体的分离的核酸序列编码的分离的多肽。本发明的BP1662噬菌体的另一个特征在于PLE低于20，更优选地低于15，还更优选地为1左右。
核酸和多肽
本发明涉及被包含在本发明的噬菌体中的核酸或这种核酸的任何片段。术语片段更优选地是指含有开放阅读框(或由其构成)的片段。所述核酸可以是DNA或RNA，是单链或双链的。
所述核酸可以从保藏的噬菌体分离，或者使用重组DNA技术(例如聚合酶链反应(PCR)扩增、克隆)、酶促合成或化学合成或其组合，按照本身在本领域中已知的通用技术来生产。还包括其同源序列和片段，包括但不限于天然等位基因变体和其中核苷酸已被插入、缺失、替换和/或颠倒的修饰的核酸序列。
在特定实施方式中，本发明涉及包含选自SEQ ID NO：1-13任一者的序列或与SEQID NO：1-13任一者具有至少95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的序列的核酸。
在另一个特定实施方式中，本发明涉及包含以下片段的序列的核酸：选自SEQ IDNO：1-13任一者的序列的片段或与SEQ ID NO：1-13任一者具有至少95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的序列的片段，所述片段包含开放阅读框或调控元件例如启动子。
本发明的核酸可以是游离形式或被克隆在载体中。
另一方面，本发明还涉及分离的多肽，其由选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的核酸序列编码。所述多肽可以通过本身在本领域中已知的技术例如合成、重组技术或其组合来生产。所述多肽可以被分离或纯化，作为抗细菌剂使用或作为试剂用于体外分析。
本发明的组合物
本发明的一个方面涉及组合物，其包含至少一种、更优选地至少两种或更多种如上所述的噬菌体，以及任选的可药用或可兽医用赋形剂。正如所述，本发明的噬菌体对铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株具有非常强的裂解活性。可以产生这些噬菌体的组合以扩展宿主范围并生产高度有效的抗细菌组合物。
更具体来说，本发明涉及一种抗细菌组合物，其包含对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(P.aeruginosa)菌株具有裂解活性的至少两种噬菌体，所述至少两种噬菌体选自基因组包含SEQ ID NO：1至13任一者的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性、优选地与其具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的噬菌体。
在优选实施方式中，本发明的组合物包含至少三种、甚至更优选地至少四种不同噬菌体，所述噬菌体选自基因组包含SEQ ID NO：1至13任一者的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性、优选地与其具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的噬菌体。本发明的组合物可以包含至少5、6、7、8、9、10、11、12种或所有13种如上所公开的不同类型的噬菌体。
本发明的一个方面涉及一种组合物，其包含选自BP1384、BP1429、BP1430、BP1433、BP1450、BP1644、BP1647、BP1648、BP1649、BP1650、BP1658、BP1661和/或BP1662或其变体的至少一种噬菌体。
本发明还涉及一种组合物，其包含选自BP1384、BP1429、BP1430、BP1433、BP1450、BP1644、BP1647、BP1648、BP1649、BP1650、BP1658、BP1661和/或BP1662或其变体的至少两种不同噬菌体。
在特定实施方式中，本发明的组合物包含BP1384与选自BP1429、BP1430、BP1433、BP1450或BP1644的至少一种其他噬菌体的组合。
在另一个特定实施方式中，本发明的组合物包含BP1384与选自BP1450和BP1647的至少一种其他噬菌体的组合。
在另一个特定实施方式中，本发明的组合物包含BP1430与选自BP1450、BP1644、BP1649和BP1661的至少一种其他噬菌体的组合。
在另一个特定实施方式中，所述组合物包含BP1433与选自BP1450、BP1647、BP1648、BP1650和BP1658的至少一种其他噬菌体的组合。
在另一个优选实施方式中，所述组合物包含BP1384与选自BP1429、BP1647、BP1649和BP1662的至少一种其他噬菌体的组合。
本发明还涉及一种组合物，其包含所有噬菌体BP1384、BP1429、BP1430、BP1433、BP1450、BP1644、BP1647、BP1648、BP1649、BP1650、BP1658、BP1661和/或BP1662或其变体的组合。
本发明的组合物的具体实例包括：
基因组包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的噬菌体，以及基因组包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的噬菌体；
基因组包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的噬菌体，以及基因组包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的噬菌体；
基因组包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的噬菌体，以及基因组包含SEQ ID NO：9的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的噬菌体；
基因组包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的噬菌体，以及基因组包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的噬菌体；
基因组包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的噬菌体，以及基因组包含SEQ ID NO：10的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的噬菌体；
基因组包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的噬菌体，基因组包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的噬菌体，以及基因组包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的噬菌体；
基因组包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的噬菌体，基因组包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的噬菌体，以及基因组包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的噬菌体；或者
基因组包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的噬菌体，基因组包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的噬菌体，以及基因组包含SEQ ID NO：9的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的噬菌体。
本发明的具体实施方式涉及一种组合物，其包含：
基因组包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的噬菌体；
基因组包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的噬菌体；
基因组包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的噬菌体；
基因组包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的噬菌体；
基因组包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的噬菌体；
基因组包含SEQ ID NO：6的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的噬菌体；
基因组包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的噬菌体；
基因组包含SEQ ID NO：8的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的噬菌体；
基因组包含SEQ ID NO：9的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的噬菌体；
基因组包含SEQ ID NO：10的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的噬菌体；
基因组包含SEQ ID NO：11的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的噬菌体；
基因组包含SEQ ID NO：12的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的噬菌体；以及
基因组包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的噬菌体。
本发明的组合物还可以包含其他抗细菌剂，特别是具有不同宿主特异性的其他噬菌体。
本发明的优选组合物对抗生素抗性铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株具有裂解活性。
本发明的其他优选组合物对从公知的BCCM/LMG细菌保藏中心(BCCM/LMGBacteria Collection)获得的LMG保藏库的所有细菌菌株中超过90％的菌株具有裂解活性。该保藏库可以通过http://www.cabri.org/CABRI/srs-doc/bccm_lmg.info.html网址进入。
本发明的抗细菌组合物可以是各种不同形式，例如液体、半液体、固体或冷冻干燥制剂。
本发明的组合物可以包含任何有效量的所选噬菌体。优选地，它们包含10e4至10e12PFU之间、优选地10e5至10e10PFU之间的每种所述噬菌体。本发明的组合物中每种类型噬菌体的相对量可以由专业技术人员调整。通常，当抗细菌组合物包含几种(n种)不同的如上所定义的噬菌体时，组合物中每种噬菌体的总相对量％A更优选为％A＝(100/ni)xV，其中ni表示不同类型的噬菌体的数目，V是0.2至5之间的变异系数。最优选地，V在0.3至3之间，甚至更优选地在0.5至2之间，一般在0.8至1.5之间。在优选的典型实施方式中，每种类型的噬菌体以近似相等的相对量存在于本发明的组合物中。
本发明的组合物优选地包含适合的稀释剂或载体，例如可药用或可兽医用赋形剂或载体。除了所选的噬菌体之外，本发明的组合物还可以包括任何赋形剂或载体，例如增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂等。它们包括对生物体无害或不引起任何显著的特异性或非特异性免疫反应或不废止噬菌体的生物活性的生理上可接受的溶液或介质。对于液体制剂来说，可以使用盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲生理盐水、白蛋白输注液、右旋糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇及其混合物作为可药用或可兽医用赋形剂或载体。如有必要，可以添加其他常规添加剂例如增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂、抗氧化剂和抑菌剂。此外，可以另外向组合物添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂，以制备可注射制剂例如水性溶液、悬液和乳液，口服制剂例如丸剂、胶囊、颗粒剂或片剂，或粉末制剂。用于表面给药的制剂可以包括创可贴、敷料、贴片、薄膜、软膏、洗剂、霜剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、卫生棉条、卫生巾、液体和粉剂。用于消毒或用于医学用途的制剂也可以包括气溶胶或喷雾剂。
本发明的组合物可用于医学领域，包括人类或兽医医学领域，用于例如治疗哺乳动物中的感染或用于改善对象状况。所述组合物可用于杀死生物体中的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)细菌，用于治疗感染。所述组合物也可用于通过改良哺乳动物中的微生物菌群来改善所述哺乳动物的状况。具体来说，本发明的组合物可以特异性去除哺乳动物皮肤或粘膜上的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株，由此改良其微生物菌群并恢复适合的平衡。
在特定实施方式中，本发明还涉及用于治疗哺乳动物中的感染的方法，所述方法包括向所述哺乳动物给药如上所定义的组合物或噬菌体或核酸或多肽。在特定实施方式中，所述方法包括给药选自BP1384、BP1429、BP1430、BP1433、BP1450、BP1644、BP1647、BP1648、BP1649、BP1650、BP1658、BP1661和/或BP1662或其变体的至少一种、优选地至少两种、甚至更优选地至少三种噬菌体。
本发明还涉及所描述的组合物、噬菌体、核酸或多肽在制造用于治疗哺乳动物中的感染或在所述哺乳动物中恢复微生物菌群的药物中的用途。
本发明的组合物或药剂可以通过任何方便的途径给药，包括静脉内、口服、透皮、皮下、粘膜、肌内、肺内、鼻内、肠胃外、直肠、阴道和表面。在优选实施方式中，所述噬菌体或组合物通过表面途径给药，例如通过施用在对象的皮肤上。所述组合物可以直接或间接给药，例如经由支撑物给药。就此而言，所述组合物可以例如被施用或喷洒到患病区域。本发明的组合物还可以通过口服或肠胃外途径给药。适合于施用、喷洒或给药本发明的组合物的剂量，可以由本领域技术人员根据各种不同因素(包括制剂，给药方式，待治疗的哺乳动物在给药时的年龄、体重、性别、状况、饮食，给药途径和反应敏感性)来调整。具有本领域普通技术的医生可以容易地确定并开出所需的组合物的有效量。
剂量也可以由专业技术人员调整，以便获得针对抗生素抗性铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株的裂解活性。取决于给药途径，在体内获得裂解活性的有效剂量通常包括至少10e2PFU/ml、优选地约10e2至10e12PFU/ml的浓度。给药可以只进行一次，或者如有必要可以重复进行。
本发明的组合物可以被给药以治疗铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)感染，通常为呼吸道、尿道、烧伤、伤口、耳、皮肤或软组织的感染或胃肠道或手术后感染。
正如在实验部分中所示，本发明的噬菌体和组合物能够在体外或体内选择性杀死铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)细菌。所述组合物甚至在体内、甚至在低剂量下也可以破坏不同铜绿假单胞菌细菌的混合物。此外，本发明的组合物可以有效杀死包埋在生物膜中的细菌，这对于致病性细菌来说尤为重要。另外，本发明的组合物和噬菌体严格地不能影响哺乳动物细胞，因此在体内是特异的并且没有副作用。
本发明还涉及本发明的组合物、噬菌体、核酸或多肽在对材料进行消毒中的用途。由于它们的强力抗细菌效果和它们甚至损害细菌生物膜的完整性的能力，本发明的组合物可用作消毒剂，以消除材料上的细菌或至少引起细菌数量减少。这样的方法可用于在医学和非医学两种背景中处理各种不同的生物或非生物表面，包括固体材料或装置例如隐形眼镜、待植入到身体内的装置的表面、管道、导管、实验室容器、织物等。
本发明的诊断/预测试验：
本发明还涉及一种用于预测或确定噬菌体疗法在对象中的功效的方法，其中所述方法包括确定选自BP1384、BP1429、BP1430、BP1433、BP1450、BP1644、BP1647、BP1648、BP1649、BP1650、BP1658、BP1661和/或BP1662的一种或多种噬菌体对来自于所述对象的样品的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株的裂解活性的步骤，这种裂解活性指示有效的治疗。在优选情况下，所述方法还任选地包括用对来自于所述对象的样品的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株具有裂解活性的一种或多种噬菌体治疗所述对象的步骤。
另一方面，本发明提供了一种用于选择对象或确定对象是否易于从噬菌体疗法获益的方法，其中所述方法包括确定选自BP1384、BP1429、BP1430、BP1433、BP1450、BP1644、BP1647、BP1648、BP1649、BP1650、BP1658、BP1661和/或BP1662的一种或多种噬菌体对来自于所述对象的样品的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株的裂解活性的步骤，一种或多种本发明的噬菌体对至少一种铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株的裂解活性指示响应者对象。
本发明的另一个目的涉及一种用于预测对象对噬菌体疗法的响应的方法，其中所述方法包括确定选自BP1384、BP1429、BP1430、BP1433、BP1450、BP1644、BP1647、BP1648、BP1649、BP1650、BP1658、BP1661和/或BP1662的一种或多种噬菌体对来自于所述对象的样品的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株的裂解活性的步骤，一种或多种本发明的噬菌体对至少一种铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株的裂解活性指示对所述疗法的良好响应。
本发明的其他方面和优点将在下面的实验部分中公开，所述实验部分仅仅是说明性的。
实施例
材料和方法
噬菌体分离和制备
MDR铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)细菌被用于从环境水分离和富集每种烈性噬菌体。将环境样品与Luria Bertani(LB)中的细菌过夜培养物混合并在37℃下振摇温育24h，以富集特定噬菌体。在温育结束时，向培养物加入数滴氯仿。将所述培养物以11,000g离心5分钟以除去细菌细胞和碎片。将上清液通过0.2μm滤器以除去残余的细菌细胞。将富集的噬菌体溶液在包埋有铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的LB琼脂培养基上铺板。在37℃温育24h后在板上形成噬斑。挑取单个噬斑用于随后的噬菌体纯化和扩增。然后将噬菌体以LB肉汤或生理盐水中的悬液的形式储存在4℃下。
通过噬斑计数估算悬液中噬菌体的滴度(Postic，1961)。将悬液的10倍稀释液投送到繁殖的菌株的干燥菌苔上。在过夜温育后读板。噬斑计数法也允许噬斑形态的可视化。
宿主范围确定
在来自于LMG保藏库的一组20株铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)中确定噬菌体的宿主范围。将109个细菌细胞与融化的琼脂混合，并将该混合物倾倒在固体琼脂上以制造双层琼脂板。在固化后，将分离的噬菌体储用溶液点在具有不同细菌菌株的每块板上。在允许点样被吸收20min后，将板倒置并在27℃温育24h，然后记录裂解程度(Postic，1961；Yang，2010)。
电子显微术
使用透射电子显微镜获取每个噬菌体的电子显微照片。
噬菌体基因组的测序、分析和注释
为了分离噬菌体DNA，如上所述将噬菌体进行繁殖。噬菌体DNA通过用苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1，V/V)提取、乙醇沉淀和重新溶解在水中来分离。进行全基因组测序，并使用BLAST算法来确定与国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)[NCBI]数据库中所描述的基因的相似性。扫描基因组以获得潜在的开放阅读框(ORF)。
实施例1：噬菌体-宿主特征和动力学
按照以前的描述进行一步生长实验，以首先确定生产性裂解时间、吸附速率，然后确定噬菌体释放量。为了确定吸附速率，以不同时间间隔取样以分析溶液中的游离噬菌体粒子。对于生产性时间和噬菌体释放量的确定来说，将铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)细菌与噬菌体溶液混合，并允许噬菌体吸附15min。将该混合物立即以5000rpm离心10min以除去游离噬菌体粒子。将沉淀物重悬浮在5份新鲜的LB培养基中，并将培养物在37℃继续温育。以3min的时间间隔取样并确定噬菌体滴度。这些结果允许计算每个细菌产生的噬菌体数目(释放量)、生产性时间和生产性裂解效应(PLE)，正如下面表5中所示。
表4
Figure GDA0001063029480000321
这些结果显示，所有噬菌体都具有强的病毒生产能力和吸附速率。大多数噬菌体具有低于7的PLE，这证实了杰出的特性。就此而言，噬菌体1429和1647是特别有效的。此外，不同的PLE和吸附时间允许产生具有所选变化性的混合物。
实施例2：混合组合物的制备
构建了下列混合组合物，其各自包含10-9至10-11pfu之间的每种噬菌体：
表5
混合物 噬菌体
I P1384+P1433
II P1384+P1450
III P1430+P1649
IV P1430+P1433
V P1430+P1650
VI P1384+P1430+P1433
VII P1384+P1430+P1450
VIII P1384+P1430+P1649
构建了下面另外两种包含所有各种不同噬菌体的混合组合物，其覆盖了铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)物种的最重要的多样性：
混合组合物A：
Figure GDA0001063029480000331
混合组合物B：
Figure GDA0001063029480000332
实施例3：细菌对本发明的噬菌体混合物的敏感性
使用本发明的噬菌体混合物，以2.109个噬菌体/ml的浓度对各种不同细菌菌株进行测试。将不同的细菌浓度铺于浓度为2.109个噬菌体/ml的噬菌体混合物上，并在37℃温育24h。
在表2和3中列出的22种不同的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)细菌上测试了混合物。对所述混合物敏感的细菌物种的％列于下面的表6中：
表6
混合物 被杀死的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)物种的％
I 73％
II 82％
III 91％
IV 86％
V 77％
VI 86％
VII 95％
VIII 95％
A 100％
B 100％
计算细菌的数量并将其用于抗性率(温育后的细菌数目/铺板的细菌数目)的计算。使用包含13种不同类型噬菌体的混合物的抗性率示出在下面的表7中：
表7
细菌 抗性率(细菌/ml)
LMG 24891 1,00E-05
LMG 24945 5,80E-06
LMG 24970 1,00E-05
LMG 25082 4,60E-06
LMG 25131 9,00E-06
LMG 25194 9,00E-06
所有被测试的细菌都对本发明的组合物敏感。
实施例4：混合物的特异性
通过在包括大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、鲍曼不动杆菌(Acinebacterbaumanii)、产气肠杆菌C(Enterobacter aerogenes)、阿氏肠杆菌(Enterobacterasburiae)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumonia)、奇异变形杆菌(Porteus mirabilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococusaureus)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophila)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)的10个细菌物种上测试，验证了混合物的特异性。
表8概述了对单独使用或作为13种噬菌体的混合物组合使用的每种噬菌体观察到的裂解活性。
Figure GDA0001063029480000351
上表清楚地显示不存在对铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株之外的细菌的裂解活性。因此，本发明的噬菌体和混合物对铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株是高度特异的。
实施例5：在体外噬菌体对铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株的效能
选择几株LMG保藏库的菌株以代表铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的遗传多样性和各种不同形式的抗生素抗性。如表9中所述，菌株对一种或几种抗生素敏感或有抗性。它们被单独地生长或2至8株菌株组合生长。噬菌体混合物以1至10e-6的MOI，即以1比1百万(细菌/噬菌体)的稀释率添加。
表9：关于细菌菌株的信息
LMG n° 国家 年份 来源 血清型 ATB抗性类型
LMG 24891 法国 1882-1918 外科绷带 11 1
LMG 24893 希腊 1994 痰液 11 2
LMG 24909 哥伦比亚 2003 腹膜液 12 0
LMG 24988 土耳其 1997 烧伤 8 3
LMG 24992 英国 2003 CF患者 NT 4
LMG 25041 菲律宾 1993 伤口 NT 2
LMG 25049 法国 1882-1918 伤口 6 1
LMG 25140 巴拿马 2006 伤口 11 5
结果显示在图1和下面的表10中。
表10：获得的噬菌体混合物在体外对铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)混合物的效能：在2.10e7cfu/ml的密度和各种不同稀释度下：
Figure GDA0001063029480000361
本发明的组合物能够杀死8种不同的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)细菌菌株在一起的混合物。在1/1000的稀释度下，该混合物仍对8种菌株有效。
实施例6：在体内噬菌体对铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株的效能
将1997年在烧伤患者上收集的分离的Is580菌株用于下面的实验。
Is580菌株对氨苄青霉素、AMC、PIP、CEF、CXM、CXM乙酰氧乙酯、FOX、CPD、CTX、CAZ、GEN、TOB、OFX、NIT、SXT有抗性。
使用SKH1小鼠(或无毛小鼠)作为铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)感染的小鼠模型。
做法：(参见下面的表11)
-通过从感染前第-3天起每2天进行1.5mg环磷酰胺(Cy)IP注射共3次，对小鼠进行免疫抑制。
-使用30mg/kg的2μl液体芥子气在小鼠皮肤上进行烧伤。
-在烧伤后两天，通过在烧伤位点皮下注射细菌悬液进行感染。
表11：
Figure GDA0001063029480000371
混合组合物按照实施例1制备，并在第0天施加用10e7个噬菌体/ml的噬菌体混合物浸湿的压布。
使用100μl噬菌体混合物测试了各种不同浓度的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株。如图2上所示，在处理后6h，所有铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株被杀死。
在通过皮下注射将Is580铜绿假单胞菌菌株给药到SKH1小鼠后，在不存在进一步处理的情况下只有35％的小鼠存活。在如上面表10中所示通过注射噬菌体混合物进行处理的小鼠中，观察到引人注目的存活率(参见图3)：对于皮下处理的SKH1小鼠来说，在感染后16天100％存活。作为比较，对于用抗生素处理的SKH1小鼠来说，在感染后2天观察到50％的存活率。
因此，本发明的组合物可以在体内治疗感染，并且可以在被感染的小鼠中引起100％的存活率。
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Claims (21)

1.一种抗细菌组合物，其包含对铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株具有裂解活性的至少两种不同的噬菌体，所述至少两种不同的噬菌体选自基因组由SEQ ID NO：1至13任一者的核苷酸序列构成的噬菌体。
2.权利要求1的组合物，其包含至少三种不同的噬菌体，所述噬菌体选自基因组由SEQID NO：1至13任一者的核苷酸序列构成的噬菌体。
3.权利要求1的组合物，其包含至少四种不同的噬菌体，所述噬菌体选自基因组由SEQID NO：1至13任一者的核苷酸序列构成的噬菌体。
4.权利要求1的组合物，其包含以下噬菌体组合中的任一者：
·基因组由SEQ ID NO：1的核苷酸序列构成的噬菌体，和基因组由SEQ ID NO：4的核苷酸序列构成的噬菌体；或者
·基因组由SEQ ID NO：1的核苷酸序列构成的噬菌体，和基因组由SEQ ID NO：5的核苷酸序列构成的噬菌体；或者
·基因组由SEQ ID NO：3的核苷酸序列构成的噬菌体，和基因组由SEQ ID NO：9的核苷酸序列构成的噬菌体；或者
·基因组由SEQ ID NO：3的核苷酸序列构成的噬菌体，和基因组由SEQ ID NO：4的核苷酸序列构成的噬菌体；或者
·基因组由SEQ ID NO：3的核苷酸序列构成的噬菌体，和基因组由SEQ ID NO：10的核苷酸序列构成的噬菌体；或者
·基因组由SEQ ID NO：1的核苷酸序列构成的噬菌体，和基因组由SEQ ID NO：3的核苷酸序列构成的噬菌体，和基因组由SEQ ID NO：4的核苷酸序列构成的噬菌体；或者
·基因组由SEQ ID NO：1的核苷酸序列构成的噬菌体，和基因组由SEQ ID NO：3的核苷酸序列构成的噬菌体，和基因组由SEQ ID NO：5的核苷酸序列构成的噬菌体；或者
·基因组由SEQ ID NO：1的核苷酸序列构成的噬菌体，和基因组由SEQ ID NO：3的核苷酸序列构成的噬菌体，和基因组由SEQ ID NO：9的核苷酸序列构成的噬菌体。
5.权利要求1的组合物，其包含所有噬菌体BP1384、BP1429、BP1430、BP1433、BP1450、BP1644、BP1647、BP1648、BP1649、BP1650、BP1658、BP1661和BP1662的组合，这些噬菌体分别由SEQ ID NO：1至13的核苷酸序列构成。
6.权利要求1至5任一项的组合物，其对抗生素抗性铜绿假单胞菌菌株具有裂解活性。
7.权利要求1至5任一项的组合物，其对LMG保藏库的所有细菌菌株中超过90％的细菌菌株具有裂解活性。
8.权利要求1至5任一项的组合物，其还包含可药用赋形剂或载体。
9.权利要求1至5任一项的组合物，其是液体、半液体、固体或冻干制剂。
10.权利要求1至5任一项的组合物，其包含10e4至10e12 PFU之间的每种噬菌体。
11.权利要求1至10任一项的组合物在制备用于治疗哺乳动物中的感染的药物中的用途。
12.权利要求1至10任一项的组合物在制备用于通过改良哺乳动物中的微生物菌群来改善所述哺乳动物的状况的药物中的用途。
13.权利要求1至10任一项的组合物用于对材料消毒的体外用途。
14.一种用于制备权利要求1至10任一项的组合物的方法，所述方法包括分开地生产所述一种或多种噬菌体，以及将所述噬菌体与适合的载体或赋形剂组合。
15.权利要求1至10任一项中定义的任意一种或多种噬菌体在制备用于预测或确定对抗铜绿假单胞菌感染的噬菌体疗法的功效的药剂或试剂盒中的用途，所述疗法包含所述一种或多种噬菌体。
16.一种噬菌体，其对铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株具有裂解活性，并且所述噬菌体的基因组由选自SEQ ID NO：1至13任一者的核苷酸序列构成。
17.一种分离的核酸，其由选自SEQ ID NO：1至13任一者的核苷酸序列构成。
18.一种包含权利要求16的噬菌体或权利要求17的核酸的组合物。
19.权利要求16的噬菌体或权利要求17的核酸或权利要求18的组合物在制备用于治疗哺乳动物中的感染的药物中的用途。
20.权利要求16的噬菌体或权利要求17的核酸或权利要求18的组合物在制备用于通过改良哺乳动物中的微生物菌群来改善所述哺乳动物的状况的药物中的用途。
21.权利要求16的噬菌体或权利要求17的核酸或权利要求18的组合物用于对材料消毒的体外用途。
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