BR112017009545B1 - Composição antibacteriana farmacêutica ou veterinária e método in vitro para a preparação de uma composição farmacêutica ou veterinária - Google Patents
Composição antibacteriana farmacêutica ou veterinária e método in vitro para a preparação de uma composição farmacêutica ou veterinária Download PDFInfo
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Abstract
composição antibacteriana, método para a preparação de uma composição, bacteriófago, ácido nucleico isolado, polipeptídeo isolado, e uso de um bacteriófago, ácido nucleico ou polipeptídeo. a presente invenção se refere à terapia com bacteriófagos. mais particularmente, a presente invenção se refere a novos bacteriófagos que têm uma especificidade elevada contra cepas de pseudomonas aeruginosa, sua produção, componentes dos mesmos, composições que compreendem os mesmos e usos dos mesmos em terapia com fagos.
Description
[001] A presente invenção se refere a novas composições de bacteriófagos, sua produção e os usos das mesmas. A invenção é particularmente adequada para o tratamento de uma infecção em um mamífero, particularmente no sistema respiratório.
[002] Os bacteriófagos (ou fagos) são pequenos vírus que exibem a capacidade de infectar e matar bactérias, ao mesmo tempo em que não afetam as células de outros organismos. Inicialmente descritos há quase um século por William Twort, e descobertos independentemente pouco depois por Félix d'Herelle, mais de 6000 diferentes bacteriófagos foram descobertos até agora e descritos morfologicamente, incluindo vírus bacterianos e arqueais. A grande maioria destes vírus possuem caudas, enquanto uma pequena proporção é poliédrica, filamentosa ou pleomórfica. Eles podem ser classificados de acordo com sua morfologia, seu conteúdo genético (DNA vs. RNA), seu hospedeiro específico, o local onde vivem (vírus marinhos versus outros habitats) e seu ciclo de vida. Como parasitas intracelulares de células bacterianas, os fagos exibem ciclos de vida diferentes dentro do hospedeiro bacteriano: infecção lítica, lisogênica, pseudolisogênica e crônica (Weinbauer, 2004; Drulis-Kawa, 2012). Os fagos líticos provocam a lise da célula bacteriana hospedeira como uma parte normal de seus ciclos de vida. Os fagos lisogênicos (também denominados fagos temperados) podem se replicar através do ciclo de vida lítico e provocar a lise da bactéria hospedeira ou podem incorporar seu DNA no DNA bacteriano hospedeiro e se tornar profagos não infecciosos. Qualquer que seja o tipo de ciclo de um fago, a primeira etapa é a ligação a receptores da parede celular bacteriana antes que o material fágico possa entrar na bactéria. Este processo específico influencia o espectro das possíveis interações fago-bactérias.
[003] Os bacteriófagos são comumente usados como ferramentas de pesquisa para modificar bactérias em experimentos laboratoriais.
[004] Em virtude de sua especificidade por células hospedeiras alvo, o uso de fagos como terapia para tratar infecções agudas e crônicas tem sido considerado, particularmente em dermatologia, oftalmologia, urologia, gastrologia, pediatria, otorrinolaringologia ou cirurgia. Este conceito de uso terapêutico de fagos para tratar infecção bacteriana, no entanto, era altamente controverso desde o início e não amplamente aceito pela comunidade pública ou médica. Os primeiros estudos foram amplamente criticados por falta de controles adequados e resultados inconsistentes. A falta de reprodutibilidade e muitos resultados conflitantes obtidos nos vários estudos publicados levaram o Council on Pharmacy and Chemistry of the American Medical Association a concluir que a evidência do valor terapêutico de filtrados líticos era, em sua maioria, contraditória, pouco convincente e pesquisa adicional recomendada para confirmar seus supostos benefícios.
[005] Desde a introdução dos antibióticos nos anos 40, pouca atenção foi dada a este campo da terapêutica, especialmente no mundo ocidental. Mas o uso extensivo de antibióticos levou ao aparecimento e disseminação generalizados de bactérias resistentes aos antibióticos em todo o mundo, causando problemas cada vez mais graves. Tornou-se, portanto, um importante desafio terapêutico superar as opções terapêuticas limitadas que restavam para tratar micróbios resistentes a múltiplos fármacos.
[006] Desde sua descoberta inicial no final do século 19 (Fordos 1859), a bactéria Gram-negativa Pseudomonas aeruginosa ganhou um lugar notório na lista dos patógenos humanos infames (Williams et al., 1894, Freeman et al., 1916). A chegada da era dos antibióticos aliviou em grande parte o resultado anteriormente fatal de infecções agudas em pacientes saudáveis. Apenas uma melhora relativa foi alcançada na erradicação de infecções crônicas, as quais se desenvolvem principalmente em indivíduos que sofrem de fibrose cística ou lesões graves ou que estão imunocomprometidos (Gang et al., 1999, Jones et al., 2010). Dois fatores intrinsecamente relacionados no desfecho fatal da infecção nestes pacientes são a prescrição rápida de tratamentos com antibióticos inapropriados e o desenvolvimento ou aquisição de cepas multirresistentes. Embora o uso de (um) antibiótico(s) apropriado(s) tenha sido reportado como um fator essencial para a erradicação de infecções por P. aeruginosa (Kang et al., 2005, Micek et al., 2005), por outro lado, o abuso de antibióticos contribui significativamente para aumentar a resistência, exercendo uma pressão seletiva contínua para a aquisição de tais capacidades. Antibióticos em separado não levam em conta a alta prevalência de variantes resistentes a múltiplos fármacos: a P. aeruginosa tem múltiplos mecanismos intrínsecos de resistência cromossomicamente codificados, incluindo baixa permeabilidade do envelope celular e numerosas bombas de efluxo de múltiplos fármacos. Outro fator importante que explica o sucesso do comportamento invasivo e persistência desta bactéria é sua elevada adaptabilidade, permitindo a rápida colonização de diferentes ambientes.
[007] Além disso, bactérias patogénicas, tal como P. aeruginosa, são capazes de formar biofilmes, os quais contribuem para sua maior resistência a antibióticos. Tais biofilmes podem compreender mais de um tipo de bactéria suportado e envolvido por uma matriz extracelular excretada, e ajudar as bactérias a colonizar várias superfícies. Os biofilmes permitem que as bactérias se prendam às superfícies e alcancem densidades populacionais as quais, de outra forma, seriam insuportáveis, conferindo maior resistência não apenas aos antibióticos, mas também a muitos estresses ambientais, incluindo toxinas, tais como metais pesados, alvejantes e outros agentes de limpeza. Sabe-se que as bactérias dentro dos biofilmes podem ser 100 a 1000 vezes mais resistentes a antibióticos do que a mesma cepa de bactérias que cresce em formas planctônicas. Tal aumento da resistência significa que bactérias que são aparentemente sensíveis a antibióticos em um teste laboratorial podem ser resistentes à terapia em um ambiente clínico. Mesmo se uma parte é eliminada, os biofilmes podem constituir reservatórios resistentes que permitem a colonização rápida, uma vez que os antibióticos não estão mais presentes. Portanto, é óbvio que os biofilmes são fatores importantes em muitas doenças humanas. Tratamentos químicos são inadequados para uso contra biofilmes, uma vez que isto é precisamente o que eles evoluíram para combater. A abrasão física constitui um meio para romper os biofilmes. Infelizmente, muitas superfícies onde os biofilmes sustentam a patogênese bacteriana são inadequadas para abrasão rigorosa, isto é, ossos, articulações, dispositivos médicos implantados, etc. Por exemplo, as superfícies das feridas ou queimaduras são extremamente sensíveis e delicadas. Mesmo onde a abrasão é adequada e em uso rotineiro, a remoção de biofilmes é limitada. A placa oral sobre a superfície dos dentes é um biofilme e é parcialmente eliminada pela escovação regular. No entanto, as bactérias são mantidas sobre superfícies não escovadas (por exemplo, nas aberturas entre os dentes) e podem recolonizar as superfícies limpas de forma tanto rápida como eficaz. A partir disso, é evidente que as abordagens existentes para eliminar biofilmes são de eficácia limitada.
[008] A capacidade de adaptação rápida e sua capacidade de formar biofilmes são as principais razões que identificam a P. aeruginosa como um patógeno oportunista. Ela adquiriu o estado de patógeno hospitalar e pode ser isolada a partir de amostras clínicas retiradas de feridas, escarro, bexiga, uretra, vagina, orelhas, olhos e trato respiratório. O aparecimento de resistência aos antibióticos mais novos e potentes em tais cepas clínicas de P. aeruginosa, que ocorrem mesmo durante tratamento, torna a luta contra patógenos hospitalares P. aeruginosa um grande problema.
[009] Portanto, há uma grande necessidade de novos agentes ou composições antibacterianas que possam ser usadas para destruir cepas de P. aeruginosa, mesmo quando organizadas em biofilmes bacterianos, adequadas para uso em terapia humana ou animal, bem como para descontaminação de materiais.
[0010] Os inventores isolaram e caracterizaram novos bacteriófagos que exibem atividade lítica forte e específica para cepas de Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Estes bacteriófagos, especialmente suas combinações, conferem um efeito antibacteriano muito potente e podem ser usados como agentes ativos em preparados farmacêuticos ou veterinários, particularmente para o tratamento de infecções bacterianas por P. aeruginosa.
[0011] Um objetivo da invenção é fornecer composições antibacterianas que compreendem pelo menos dois bacteriófagos que têm atividade lítica contra uma cepa de Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), os ditos pelo menos dois bacteriófagos sendo selecionados a partir dos bacteriófagos que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1 a 7 ou uma sequência que têm pelo menos 90 % de identidade com as mesmas.
[0012] Um outro objetivo da invenção se refere a um bacteriófago que têm atividade lítica de uma cepa de Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) e que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir de qualquer uma de SEQ ID NOs: 2 a 7 ou uma sequência que tem pelo menos 95 % de identidade com as mesmas.
[0013] Os bacteriófagos da presente invenção exibem forte atividade lítica de cepas de P. aeruginosa resistentes a múltiplos fármacos, em particular cepas patogênicas resistentes a antibióticos, tais como cepas resistentes à cefalosporinase, carbenicilinases, carbapenemase e/ou β-lactamases de largo espectro e são, portanto, particularmente adequados e vantajosos para tratar infecções bacterianas.
[0014] A invenção se refere ainda a uma molécula de ácido nucleico isolada contida em um bacteriófago da invenção, de preferência, uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir de qualquer uma de SEQ ID NO: 2 a 7 ou uma sequência que têm pelo menos 95 % de identidade com as mesmas, bem como um polipeptídeo isolado codificado pelo dito ácido nucleico.
[0015] Outro objetivo da invenção é uma composição que compreende um ácido nucleico ou polipeptídeo conforme definido acima.
[0016] As composições da invenção ainda compreendem, tipicamente, um excipiente ou veículo veterinária ou farmaceuticamente aceitável. Eles podem ser líquidos, semilíquidos, sólidos ou liofilizados.
[0017] Outro objetivo da invenção se refere a um bacteriófago, ácido nucleico, polipeptídeo ou composição conforme definido acima para uso no tratamento de uma infecção em um mamífero, para modificar a flora microbiana em um mamífero, para descontaminar um material e/ou para matar uma bactéria P. aeruginosa ou comprometer a integridade de um biofilme bacteriano.
[0018] A invenção também se refere a um bacteriófago, ácido nucleico, polipeptídeo ou composição conforme definido acima para uso para melhorar uma condição em um indivíduo ao modificar a flora microbiana no dito indivíduo. A flora microbiana pode ser modificada ao corrigir, adaptar ou restaurar um equilíbrio adequado de micro-organismos na dita flora.
[0019] A invenção também se refere a um método para tratar uma infecção em um mamífero que compreende a administração, ao dito mamífero, de pelo menos um bacteriófago, ácido nucleico, polipeptídeo ou composição conforme definido acima.
[0020] A invenção também se refere a um método para o tratamento de uma superfície ou material suspeito de estar contaminado com uma bactéria Pseudomonas aeruginosa que compreende aplicação, ao dito material ou superfície, de pelo menos um bacteriófago, ácido nucleico, polipeptídeo ou composição conforme definido acima. A superfície ou material pode ser uma superfície de qualquer dispositivo, recipiente ou material de laboratório, tecido, etc.
[0021] Um outro objetivo da invenção se refere a um kit que compreende uma composição conforme definido acima e um meio para aplicar a mesma a um indivíduo ou superfície.
[0022] A invenção pode ser usada em qualquer mamífero, de preferência, em seres humanos, ou para tratar qualquer material, incluindo materiais laboratoriais ou dispositivos médicos.
[0023] Figura 1: Eficácia do bacteriófago 1384 sobre a cepa PAO1.
[0024] Figura 2: Eficácia do bacteriófago 1777 sobre a cepa PAO1.
[0025] Figura 3: Eficácia do bacteriófago 1792 sobre a cepa PAO1.
[0026] Figura 4: Eficácia do bacteriófago 1797 sobre a cepa PAO1.
[0027] Figura 4: Eficácia do bacteriófago 1800 sobre a cepa PAO1.
[0028] Figura 6: Eficácia do bacteriófago 1902 sobre a cepa PAO1.
[0029] Figura 7: Eficácia do coquetel de bacteriófago sobre a cepa PAO1.
[0030] Figura 8: Eficácia do coquetel de bacteriófago sobre a cepa CF1.
[0031] Figura 9: Eficácia do coquetel de bacteriófago sobre a cepa CF2.
[0032] Figura 10: Eficácia do coquetel de bacteriófago sobre a cepa CF3.
[0033] A presente invenção se refere a novos bacteriófagos, componentes dos mesmos, composições que compreendem os mesmos, sua produção e os usos dos mesmos como agentes antibacterianos, particularmente para o tratamento de uma infecção em um mamífero ou para melhorar uma condição em um indivíduo ao modificar a flora microbiana no dito indivíduo.
[0034] Para facilitar a compreensão da invenção, uma série de termos são definidos a seguir.
[0035] Conforme usado no presente documento, o termo "bacteriófago" ou "fago" se refere a uma partícula de fago funcional que compreende um genoma de ácido nucleico embalado em um envelope proteico ou cápside. O termo se refere também a porções do bacteriófago incluindo, por exemplo, uma porção de cabeça, ou um conjunto de componentes fágicos, os quais conferem substancialmente a mesma atividade funcional.
[0036] O termo "característica fenotípica" designa, mais preferivelmente, a morfologia e/ou a faixa de hospedeiros de um bacteriófago. Métodos para a fenotipagem de bacteriófagos são bem conhecidos per se na técnica e incluem, por exemplo, determinação da faixa de hospedeiros bacterianos e/ou atividade contra o biofilme produzido por determinadas cepas bacterianas.
[0037] O termo "atividade lítica", conforme usado na invenção, designa a propriedade de um bacteriófago de causar a lise de uma célula bacteriana. A atividade lítica de um bacteriófago pode ser testada em cepas de P. aeruginosa de acordo com métodos conhecidos per se na técnica (vide também a seção experimental).
[0038] O termo "variante" de um bacteriófago de referência designa um bacteriófago que tem (uma) variação(ões) na sequência genômica e/ou polipeptídeo(s) codificado(s) pela mesma quando comparado com o dito bacteriófago de referência, ao mesmo tempo em que retém a mesma característica fenotípica que o bacteriófago de referência. As variantes compreendem, tipicamente, por exemplo, mutações silenciosas, mutações conservativas, eliminações menores e/ou pequenas replicações de material genético e retêm características fenotípicas do bacteriófago de referência. Em uma modalidade preferida, as variantes de acordo com a invenção retêm qualquer característica ou propriedade observável que é dependente do genoma do bacteriófago da invenção, isto é, características fenotípicas do dito bacteriófago e/ou atividade lítica contra as cepas de P. aeruginosa. As variantes preferidas têm menos de 5 % de variação de ácido nucleico quando comparado com o genoma do bacteriófago de referência, mais preferivelmente menos de 4 %, ainda mais preferivelmente menos de 2 %. Alternativamente, ou em combinação, as variantes têm, de preferência, menos de 5 % de variação de aminoácidos em uma sequência polipeptídica codificada quando comparado com um polipeptídeo do bacteriófago de referência.
[0039] O termo "cepa ESBL de P. aeruginosa" se refere a cepas de P. aeruginosa produtoras de cefalosporinase e/ou β-lactamase de amplo espectro, incluindo várias formas de resistência a antibióticos, tais como AmpC β-lactamase ou β-lactamases que hidrolizam carbenicilina de Classe A, etc.
[0040] O termo "específico" ou "especificidade", em relação a um bacteriófago, se refere ao tipo de hospedeiro o qual o dito bacteriófago é capaz de infectar. Um bacteriófago "específico" para P. aeruginosa designa, mais preferivelmente, um bacteriófago que pode infectar uma ou várias cepas de P. aeruginosa e que não pode infectar bactérias que não P. aeruginosa sob condições fisiológicas.
[0041] Conforme usado no presente documento, o termo "polipeptídeo" se refere a polipeptídeos de qualquer tamanho, incluindo pequenos peptídeos, por exemplo, a partir de 5 a 20 aminoácidos, polipeptídeos mais longos, proteínas ou fragmentos dos mesmos.
[0042] O termo "PLE" ou "Efeito Lítico Produtivo" designa a proporção entre o tamanho de explosão e o tempo lítico produtivo de um dado bacteriófago. O tamanho da explosão e o tempo lítico produtivo são parâmetros que definem a interação fago-hospedeiro e correspondem, respectivamente, ao rendimento médio de partículas de bacteriófago produzidas pela infecção de uma bactéria por um fago e ao tempo levado para que um bacteriófago livre submeta uma célula bacteriana à lise.
[0043] No contexto do presente relatório descritivo, o termo "bacteriófago isolado" deve ser considerado como significando um bacteriófago removido de seu ambiente natural e/ou separado de um componente de seu ambiente natural. O termo designa, em particular, um fago que é, por exemplo, cultivado in vitro, purificado e/ou formulado com qualquer diluente ou excipiente adequado. Em relação a um ácido nucleico ou polipeptídeo, o termo "isolado" designa, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico ou um polipeptídeo que é separado de pelo menos um componente de seu ambiente natural tal como, por exemplo, uma proteína, um lipídio e/ou um ácido nucleico.
[0044] Os termos "veterinário ou farmaceuticamente aceitável", conforme usado no presente documento, se refere a qualquer material (por exemplo, veículo, excipiente ou diluente) que é compatível para ser usado em um indivíduo mamífero. Este inclui soluções ou veículos fisiologicamente aceitáveis que são inofensivos ou não causam qualquer reação imune específica ou não específica significativa em um organismo ou não anulam a atividade biológica do composto ativo. Para formulação da composição em um preparado líquido, solução salina, água estéril, solução de Ringer, solução salina fisiológica tamponada, solução de infusão de albumina, solução de dextrose, solução de maltodextrina, glicerol, etanol e misturas dos mesmos podem ser usados como um excipiente ou veículo veterinária ou farmaceuticamente aceitável. Se necessário, podem ser adicionados outros aditivos convencionais, tais como espessantes, diluentes, tampões, conservantes, tensoativos, antioxidantes e agentes bacteriostáticos. Ainda, diluentes, dispersantes, tensoativos, aglutinantes e lubrificantes podem ser adicionalmente acrescentados à composição para preparar formulações injetáveis, tais como soluções, suspensões e emulsões aquosas, formulações orais, tais como pílulas, cápsulas, grânulos ou comprimidos, ou formulações em pó.
[0045] Conforme usado no presente documento, "PFU" significa unidade formadora de placas, conforme é bem definido na técnica. Os bacteriófagos líticos submetem a célula hospedeira à lise, provocando uma zona de eliminação (ou placa) sobre uma placa de cultura. Teoricamente, cada placa é formada por um fago e o número de placas multiplicado pelo fator de diluição é igual ao número total de fagos em um preparado de teste.
[0046] O termo "tratamento" ou "terapia" designa um tratamento curativo ou profilático de uma doença. Um tratamento curativo é definido como um tratamento que resulta na cura de uma doença ou um tratamento que alivia, reduz, estabiliza ou elimina os sintomas de uma doença ou o sofrimento que ela causa, direta ou indiretamente, ou que melhora a condição de um indivíduo ou reduz a progressão de uma doença. Um tratamento profilático compreende um tratamento que resulta na prevenção de uma doença e/ou um tratamento que reduz e/ou retarda a incidência de uma doença ou o risco de sua ocorrência.
[0047] O termo "biofilme", conforme usado no presente documento, designa a formação bacteriana heterogênea que cresce sobre várias superfícies; de preferência, uma comunidade bacteriana em crescimento incorporada em uma matriz de exopolissacarídeo aderida sobre superfícies sólidas biológicas ou não biológicas.
[0048] O termo "comprometer", conforme usado no presente documento, se refere a qualquer alteração da integridade. Por comprometer um biofilme bacteriano entende- se uma penetração do biofilme pelo bacteriófago, uma infecção de bactérias associadas a biofilme e/ou lise das mesmas e/ou uma eliminação parcial ou total do biofilme (isto é, interrupção da colonização e/ou ruptura de biofilmes).
[0049] O termo "amostra", conforme usado no presente documento, significa quaisquer amostras que contêm células. Exemplos de tais amostras incluem fluidos corporais, tais como sangue, plasma, saliva ou urina, bem como biopsias, órgãos, tecidos ou amostras de células. A amostra pode ser tratada antes de seu uso.
[0050] Conforme usado no presente documento, o termo "indivíduo" ou "paciente" se refere a um animal, de preferência, um mamífero, mais preferivelmente um ser humano, incluindo adultos e crianças. O termo "indivíduo" também abrange animais não humanos, em particular mamíferos não humanos, tais como animais de estimação (por exemplo, cães, gatos), cavalos, vacas, cabras, porcos, ovelhas e primatas não humanos, dentre outros.
[0051] O termo "eficácia" de tratamento ou "resposta" a uma terapia com bacteriófagos, conforme usado no presente documento, se refere a um tratamento que resulta em uma diminuição no número de cepas de P. aeruginosa em um paciente após tratamento com bacteriófagos quando comparado com o número de P. aeruginosa antes de tratamento. Um indivíduo "bom respondedor" se refere a um indivíduo que mostra ou mostrará uma recuperação clinicamente significativa quando tratado com uma terapia com bacteriófagos.
[0052] O termo "coquetel" de bacteriófagos designa uma combinação de diferentes tipos de bacteriófagos. Os bacteriófagos em um coquetel são, de preferência, formulados juntos em um mesmo recipiente ou embalagem, embora possam ser usados como kits de partes em que alguns dos bacteriófagos são formulados ou embalados separadamente e combinados quando usados ou administrados.
[0053] A presente invenção está relacionada a novas terapias com bacteriófagos. Mais particularmente, a presente invenção se refere a novos bacteriófagos que têm uma elevada especificidade contra cepas de Pseudomonas aeruginosa, sua produção, componentes dos mesmos, composições que compreendem os mesmos e os usos dos mesmos em terapia com fagos.
[0054] Em um primeiro aspecto, a invenção descreve o isolamento e caracterização de novos bacteriófagos que são específicos para cepas de P. aeruginosa e apresentam, quer isoladamente ou em combinação, um notável espectro por uma faixa de hospedeiros de atividade lítica. Estes bacteriófagos foram selecionados a partir de amostras ambientais, isolados, sequenciados e caracterizados. Eles são, individualmente e em combinação, ativos contra cepas de P. aeruginosa. Eles são extraordinariamente eficazes contra cepas de P. aeruginosa patogênicas, incluindo cepas de P. aeruginosa resistentes a antibióticos, tal como uma cepa ESBL de P. aeruginosa. Além disso, os bacteriófagos da invenção têm um notável efeito lítico produtivo ("PLE") compreendido entre 1 e 7. Além disso, os bacteriófagos da invenção são específicos para cepas de P. aeruginosa, isto é, eles não causam lise de bactérias que não P. aeruginosa. Conforme será ilustrado mais adiante, a invenção mostra que estes bacteriófagos podem ser combinados e formulados em condições adequadas para uso como agentes farmacêuticos ou veterinários para exibir em efeito antibacteriano alvo e muito potente contra um espectro controlado de cepas de P. aeruginosa.
[0055] Mais especificamente, os bacteriófagos a seguir foram isolados. Sua sequência de ácido nucleico correspondente também é indicada. Tabela 1
[0056] O perfil lítico destes bacteriófagos foi determinado sobre um amplo número de cepas de P. aeruginosa. Estes bacteriófagos foram selecionados por sua potência e potencial de combinação, conforme descrito na tabela a seguir. Nesta tabela, o efeito lítico dos bacteriófagos sobre linhagens de referência e resistentes a patógenos é apresentado, confirmando seu elevado potencial lítico. Tabela 2pm: lise parcial
[0057] Conforme pode ser visto a partir da Tabela 2, podem ser produzidas combinações (ou coquetéis) destes bacteriófagos que são capazes de matar todas as cepas de P. aeruginosa testadas, deste modo, produzindo composições antibacterianas de largo espectro. Como um exemplo ilustrativo, um coquetel de todos os 7 bacteriófagos pode matar todas as bactérias testadas.
[0058] Além disso, a especificidade dos bacteriófagos foi testada em muitas cepas que não P. aeruginosa. Mais particularmente, a seção experimental demonstra que os bacteriófagos da invenção não têm nenhum efeito lítico sobre quaisquer bactérias selecionadas a partir de Escherichia coli, Acinetobacter baumanii, Enterobacter aerogenes, Enterobacter asburiae, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Staphylococcus aureus, Stenotrophomonas maltophila e Serratia marcescens. Estes bacteriófagos, individualmente ou em combinação(ões) representam, assim, agentes potentes para o tratamento de infecções por P. aeruginosa.
[0059] Um objetivo particular da invenção reside, assim, em um bacteriófago que têm atividade lítica para uma cepa de P. aeruginosa e que tem um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir de qualquer uma de SEQ ID NOs: 2 a 7 ou uma sequência que tem pelo menos 95 % de identidade com as mesmas, de preferência, pelo menos 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com as mesmas.
[0060] Os bacteriófagos da invenção podem ser cultivados, expandidos, isolados, purificados e usados, por exemplo, em terapia com fagos de transtornos mediados por P. aeruginosa, conforme será descrito em maiores detalhes abaixo. Além disso, variantes destes bacteriófagos que retêm um fenótipo (por exemplo, especificidade e atividade lítica) dos bacteriófagos podem ser produzidas e/ou isoladas por meio de métodos conhecidos per se na técnica.
[0061] Os bacteriófagos da invenção podem ser preparados por meio de métodos convencionais de cultura, isolamento e purificação. Por exemplo, bactéria produtoras P. aeruginosa são cultivadas, infectadas por uma amostra de um bacteriófago e depois tratadas para remover as células bacterianas e detritos. A solução de bacteriófago enriquecida pode ser banhada em um meio, por exemplo, meio de agar, com cepas hospedeiras de P. aeruginosa suscetíveis incorporadas para obter placas. Então, uma única placa pode ser escolhida para posterior purificação e amplificação de bacteriófagos. Um ou mais ciclos de amplificação seletiva dos bacteriófagos da invenção podem ser realizados, por exemplo, por meio de mistura de bacteriófagos com a P. aeruginosa competente, seguido pela adição de um meio de crescimento e incubação sob condições de crescimento de teste selecionadas. Após centrifugação, o sobrenadante amplificado clarificado é filtrado através de um filtro e submetido a outro ciclo de amplificação seletiva ou testado quanto à presença de atividade lítica.
[0062] A titulação de fagos em uma suspensão e a visualização da morfologia da placa dos bacteriófagos da invenção podem, então, ser avaliadas por meio de métodos conhecidos, por exemplo, através de contagem de placas. Adicionalmente, o processamento de bacteriófagos da invenção em várias formas (líquida, liofilizada, etc.) para armazenamento a curto prazo, longo prazo, congelamento ou qualquer outro tipo de armazenamento pode ser realizado por meio de qualquer método adequado, conforme é bem conhecido na técnica (vide, por exemplo, Clark, 1962).
[0063] A atividade dos bacteriófagos da invenção pode ser avaliada por meio de métodos bem conhecidos na técnica, tal como o ensaio em placa também conhecido como método de agar duplo, com base no crescimento de bacteriófagos com bactérias hospedeiras potenciais e seguido por avaliação de sua capacidade de matar a célula bacteriana hospedeira. No método de ensaio em placa, o bacteriófago induz à lise de cepas de P. aeruginosa alvo após um período de incubação em meio de agar macio, resultando em zonas de eliminação sobre a placa conhecidas como placas.
[0064] A invenção se refere a um ácido nucleico contido em um bacteriófago da invenção ou qualquer fragmento de tal ácido nucleico. O termo fragmento designa, mais preferivelmente, um fragmento que contém (ou que consiste em) um quadro de leitura aberto. O ácido nucleico pode ser DNA ou RNA fita simples ou dupla.
[0065] O ácido nucleico pode ser isolado a partir dos bacteriófagos depositados ou produzido usando a tecnologia de DNA recombinante (por exemplo, amplificação por meio de reação em cadeia de polimerase (PCR), clonagem), síntese enzimática ou química ou combinações dos mesmos, de acordo com métodos gerais conhecidos per se na técnica. Também estão incluídas sequências homólogas e fragmentos dos mesmos incluindo, porém sem limitações, variantes alélicas naturais e sequências de ácidos nucleicos modificadas nas quais nucleotídeos foram inseridos, eliminados, substituídos e/ou invertidos.
[0066] Em uma modalidade particular, a invenção se refere a um ácido nucleico que compreende uma sequência selecionada a partir de qualquer uma de SEQ ID NO: 2-7 ou uma sequência que têm pelo menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais de identidade de sequência com qualquer uma de SEQ ID NO: 2-7.
[0067] O ácido nucleico da invenção pode estar na forma livre, ou ser clonado em um vetor, tal como um plasmídeo, vetor viral, cassete de expressão, cosmídeo, etc.
[0068] Em um outro aspecto, a invenção também se refere a um polipeptídeo isolado codificado por uma sequência de ácido nucleico conforme definido acima, de preferência, uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7. O(s) polipeptídeo(s) pode(m) ser produzido(s) por meio de métodos conhecidos per se na técnica, tais como síntese, tecnologia de DNA recombinante ou combinações dos mesmos. Os polipeptídeos podem ser isolados ou purificados e usados como agentes antibacterianos ou como reagentes para análises in vitro.
[0069] Um aspecto da invenção se refere a composições que compreendem pelo menos um bacteriófago conforme descrito acima, mais preferivelmente pelo menos 2 ou mais e, opcionalmente, um excipiente veterinário ou farmaceuticamente aceitável. Conforme descrito, os bacteriófagos da invenção têm atividade lítica muito potente contra cepas de P. aeruginosa. Combinações destes bacteriófagos podem ser produzidas para expandir o espectro de hospedeiros e produzir composições antibacterianas altamente eficazes.
[0070] Mais particularmente, a invenção se refere a uma composição antibacteriana que compreende pelo menos dois bacteriófagos com atividade lítica contra uma cepa de Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), os ditos pelo menos dois bacteriófagos sendo selecionados a partir de bacteriófagos que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1 a 7 ou uma sequência que têm pelo menos 90 % de identidade com as mesmas.
[0071] Em uma modalidade preferida, as composições da invenção compreendem pelo menos três, mais preferivelmente pelo menos quatro bacteriófagos distintos selecionados a partir de bacteriófagos que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma de SEQ ID NO: 1 a 7 ou uma sequência que têm pelo menos 90 % de identidade com as mesmas.
[0072] Composições particulares da invenção compreendem pelo menos um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 ou 4 ou uma sequência que têm pelo menos 90 % de identidade com as mesmas.
[0073] Exemplos específicos de composições da invenção compreendem: . um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência que têm pelo menos 90 % de identidade com a mesma e um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência que têm pelo menos 90 % de identidade com a mesma; . um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência que têm pelo menos 90 % de identidade com a mesma e um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 ou uma sequência que têm pelo menos 90 % de identidade com a mesma; . um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência que têm pelo menos 90 % de identidade com a mesma e um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5 ou uma sequência que têm pelo menos 90 % de identidade com a mesma; . um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência que têm pelo menos 90 % de identidade com a mesma e um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 ou uma sequência que têm pelo menos 90 % de identidade com a mesma; . um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência que têm pelo menos 90 % de identidade com a mesma e um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5 ou uma sequência que têm pelo menos 90 % identidade com a mesma; . um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma e um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência que têm pelo menos 90 % de identidade com a mesma e um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 ou uma sequência que têm pelo menos 90 % de identidade com a mesma; . um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma e um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência que têm pelo menos 90 % identidade com a mesma e um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 ou uma sequência que têm pelo menos 90 % de identidade com a mesma e um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ 10 ID NO: 5 ou um sequência que têm pelo menos 90 % de identidade com a mesma.
[0074] Em uma modalidade preferida, as composições da invenção compreendem pelo menos: . um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma; . um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma; . um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência que têm pelo menos 90 % de identidade com a mesma; . um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 ou uma sequência que têm pelo menos 90 % de identidade com a mesma; . um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5 ou uma sequência que têm pelo menos 90 % de identidade com a mesma; . um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 6 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma; e . um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7 ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade com a mesma.
[0075] As composições da invenção podem compreender ainda agentes antibacterianos adicionais, particularmente outros bacteriófagos que têm especificidade de hospedeiro distinta.
[0076] A maioria das composições preferidas da invenção são líticas contra mais do que 85 % de todas as cepas bacterianas da coleção LMG obtida a partir da BCCM/LMG Bacteria Collection. Esta coleção contém um grande número de cepas com uma grande diversidade genética entre as espécies bacterianas.
[0077] As composições da invenção podem compreender qualquer quantidade eficaz do(s) bacteriófago(s) selecionado(s). De preferência, elas compreendem entre 10e4 e 10e12 PFU de cada um dos ditos bacteriófagos, de preferência, entre 10e5 e 10e10 PFU. As quantidades relativas de cada tipo de bacteriófago em uma composição da invenção podem ser ajustadas por aqueles versados na técnica. Tipicamente, quando a composição antibacteriana compreende diversos (n) bacteriófagos distintos, conforme definido acima, a quantidade % total relativa de cada um bacteriófago na composição é, mais preferivelmente, % A = (100ni)xV, em que ni representa o número de tipos distintos de bacteriófagos e V é um fator de variabilidade compreendido entre 0,2 e 5. Mais preferivelmente, V está compreendido entre 0,3 e 3, ainda mais preferivelmente entre 0,5 e 2, em geral entre 0,8 e 1,5. Em uma modalidade típica preferida, cada tipo de bacteriófago está presente em uma composição da invenção em quantidades relativas aproximadamente iguais.
[0078] As composições antibacterianas da presente invenção podem estar em várias formas, tais como formulações líquidas, semilíquidas, sólidas ou liofilizadas. As composições da invenção compreendem, de preferência, um diluente ou veículo adequado, tal como um excipiente ou veículo veterinária ou farmaceuticamente aceitável. As composições de acordo com a presente invenção pode incluir qualquer excipiente ou veículo, tais como espessantes, diluentes, tampões, conservantes, tensoativos e assim por diante, além do(s) bacteriófago(s) de escolha. Estas incluem soluções fisiologicamente aceitáveis ou veículos que são inofensivos ou não causam qualquer reação imune específica ou não específica significativa para um organismo ou não anulam a atividade biológica do bacteriófago. Para uma formulação líquida, solução salina, água estéril, solução de Ringer, solução salina tamponada fisiológica, solução de infusão de albumina, solução de dextrose, solução de maltodextrina, glicerol, etanol e misturas dos mesmos podem ser usados como um excipiente ou veículo veterinária ou farmaceuticamente aceitável. Se for necessário, outros aditivos convencionais, tais como espessantes, diluentes, tampões, conservantes, tensoativos, antioxidantes e agentes bacteriostáticos podem ser adicionados. Além disso, diluentes, dispersantes, tensoativos, aglutinantes e lubrificantes podem ser adicionalmente acrescentados à composição para preparar formulações injetáveis, tais como soluções, suspensões e emulsões aquosas, formulações orais, tais como comprimidos, cápsulas, grânulos ou pílulas, ou formulações em pó. As formulações para administração tópica podem incluir curativos, emplastros, adesivos, filmes, pomadas, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, sprays, tampões, lenços higiênicos, líquidos e pós. As formulações para descontaminação ou para uso médico também podem incluir aerossóis ou sprays.
[0079] As composições da invenção podem ser usadas no campo médico, incluindo as áreas médicas humana ou veterinária, por exemplo, para o tratamento de uma infecção em um mamífero ou para melhorar uma condição em um indivíduo. As composições podem ser usadas para matar bactérias P. aeruginosa em um organismo para o tratamento de uma infecção. A composição também pode ser usada para melhorar a condição de um mamífero ao modificar a flora microbiana no dito mamífero. Em particular, as composições da invenção podem remover especificamente cepas de P. aeruginosa na pele ou membranas mucosas de um mamífero, assim, modificando sua flora microbiana e restaurando um equilíbrio adequado.
[0080] Em uma modalidade particular, a invenção se refere também a um método para o tratamento de uma infecção em um mamífero que compreende a administração, ao dito mamífero, de uma composição ou bacteriófago ou ácido nucleico ou polipeptídeo conforme definido acima.
[0081] A invenção se refere também ao uso de uma composição, bacteriófago, ácido nucleico ou polipeptídeo conforme descrito para a produção de um medicamento para o tratamento de uma infecção em um mamífero ou para restaurar a flora microbiana no dito mamífero.
[0082] As composições da invenção podem ser usadas para tratar várias infecções mediadas por P. aeruginosa, particularmente do sistema respiratório. O número de pacientes com pneumonia alcançou 2 a 3 milhões nos EUA e 3 a 4 milhões na Europa em 2013. A Pseudomonas aeruginosa é um dos principais agentes microbiológicos responsáveis pela patologia, especialmente em populações de crianças e idosos, bem como em pacientes imunocomprometidos, com fibrose cística, queimaduras e politraumatizados. Embora as fontes epidemiológicas flutuem e a despeito de um recente aumento de infecções Gram-negativas (incluindo P. aeruginosa), as estimativas para 2014 indicam que pelo menos 15 % das pneumonias são causadas por P. aeruginosa (por exemplo, 15,9 % de acordo com o ECDC Annual Surveillance Report - 2013) . De um ponto de vista conservador, cerca de 20 % destes germes são resistentes a vários ou todos os antibióticos do nosso arsenal terapêutico (notavelmente, o número mais elevado de casos resistentes está sendo observado na unidade de cuidados intensivos: http://www.infectio- lille.com/diaporamas/DUAC/pyo-DUAC09-Cattoen.pdf). Como uma consequência, os valores estimados indicam que pelo menos 90 000 casos de pneumonia nos EUA e 120 000 na Europa são induzidos por cepas bacterianas de P. aeruginosa resistentes a múltiplos antibióticos. A invenção é, portanto, particularmente adequada para o tratamento de pneumonia associada com, ou causada por, infecção por P. aeruginosa. Um objetivo da invenção reside, assim, em um método para o tratamento de pneumonia em um indivíduo que precisa do mesmo que compreende administração de uma composição da invenção ao dito indivíduo. O método é particularmente adequado para o tratamento de pneumonia induzida por bactérias de P. aeruginosa resistentes a antibióticos. O indivíduo pode ser qualquer ser humano, tais como crianças, adultos ou idosos.
[0083] As composições da invenção podem ser administradas por meio de qualquer via conveniente, incluindo intravenosa, oral, transdérmica, subcutânea, mucosal, intramuscular, intrapulmonar, intranasal, parentérica, retal, vaginal e tópica. Em uma modalidade preferida, os bacteriófagos ou composições são administrados por meio de instilação intranasal ou intrapulmonar. As composições podem ser administradas direta ou indiretamente, por exemplo, por intermédio de um suporte. A este respeito, as composições podem, por exemplo, ser aplicadas ou pulverizadas na área afetada. As composições da invenção também podem ser administradas por vias orais ou parentéricas. A dosagem apropriada para aplicação, pulverização ou administração das composições da presente invenção podem ser ajustadas por aqueles versados na técnica dependendo de uma variedade de fatores, incluindo a formulação, o modo de administração, idade, peso, sexo, condição, dieta do mamífero a ser tratado, momento da administração, via de administração e sensibilidade de reação. Um médico com capacidades comuns na técnica pode determinar e prescrever facilmente a quantidade eficaz da composição requerida.
[0084] A dosagem também pode ser ajustada por aqueles versados na técnica de modo que uma atividade lítica contra cepas de P. aeruginosa resistentes a antibiótico seja obtida. Uma dose eficaz para obter uma atividade lítica in vivo inclui, tipicamente, uma concentração de pelo menos 10e4 PFU/ml, de preferência, a partir de cerca de 10e2 a 10e12 PFU/ml, dependendo da via de administração.
[0085] Conforme mostrado na seção experimental, os bacteriófagos e composições da invenção são capazes de matar seletivamente bactérias P. aeruginosa in vitro ou in vivo. As composições podem destruir misturas de diferentes bactérias P. aeruginosa, mesmo in vivo, mesmo em baixa dosagem. Além disso, as composições da invenção são eficazes para matar bactérias incorporadas em biofilmes, o que é particularmente importante para bactérias patogênicas. Além disso, as composições e os bacteriófagos da invenção são estritamente incapazes de afetar células de mamíferos e, são, portanto, específicos e desprovidos de efeitos secundários in vivo.
[0086] A invenção se refere também ao uso de uma composição, bacteriófago, ácido nucleico ou polipeptídeo da invenção para descontaminação de um material. Em virtude de seu efeito antibacteriano potente e sua capacidade mesmo de comprometer a integridade de um biofilme bacteriano, as composições da invenção podem ser usadas como agente de descontaminação para eliminar ou pelo menos causar uma redução no número de bactérias sobre um material. Tais métodos podem ser aplicados para o tratamento de uma variedade de superfícies biológicas ou não biológicas tanto em contextos médicos quanto não médicos, incluindo materiais ou dispositivos sólidos tais como, por exemplo, lentes de contato, superfícies de dispositivos a serem implantados no corpo, tubos, tubagens, recipientes de laboratório, têxteis, etc.
[0087] A invenção se refere também a um método para prever ou determinar a eficácia de uma terapia com bacteriófagos em um indivíduo, em que o método compreende uma etapa de determinação de uma atividade lítica de um ou mais bacteriófagos da invenção para uma cepa de P. aeruginosa a partir de uma amostra do dito indivíduo, tal atividade lítica sendo indicativa de um tratamento eficaz. Em um aspecto preferido, o método compreende ainda, opcionalmente, uma etapa de tratamento do dito indivíduo por um ou mais bacteriófagos que têm uma atividade lítica para uma cepa de P. aeruginosa a partir de uma amostra do dito indivíduo.
[0088] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para selecionar um indivíduo ou determinar se for provável que um indivíduo se beneficie de uma terapia com bacteriófagos, em que o método compreende a etapa de determinar uma atividade lítica de um ou mais bacteriófagos da invenção para uma cepa de P. aeruginosa a partir de uma amostra do dito indivíduo, uma atividade lítica de um ou mais bacteriófagos da presente invenção para pelo menos uma cepa de P. aeruginosa indicando um indivíduo respondedor.
[0089] Um outro objetivo da invenção se refere a um método para prever a resposta de um indivíduo a uma terapia com bacteriófagos, em que o método compreende a etapa de determinar uma atividade lítica de um ou mais bacteriófagos da invenção para uma cepa de P. aeruginosa a partir de uma amostra do dito indivíduo, uma atividade lítica de um ou mais bacteriófagos da invenção para pelo menos uma cepa de P. aeruginosa sendo indicativa de uma boa resposta à dita terapia.
[0090] Outros aspectos e vantagens da presente invenção serão descritos na seção experimental a seguir, a qual é apenas ilustrativa.
[0091] As faixas de hospedeiros de bacteriófagos foram determinadas entre uma coleção de P. aeruginosa a partir da coleção LMG. 109 células bacterianas foram misturadas com agar derretido e esta mistura foi vertida em agar sólido para fazer placas de agar de camada dupla. Após solidificação, soluções de estoque de bacteriófagos isolados foram colocadas em cada placa com diferentes cepas da bactéria. Após permitir 20 min durante a colocação para absorção, as placas foram invertidas e incubadas durante 24 h a 37 °C antes que o grau de lise fosse registrado (Postic, 1961; Yang, 2010).
[0092] Para isolar o DNA de fagos, os fagos foram propagados conforme descrito acima. O DNA do fago foi isolado por meio de extração com fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1, V/V), precipitação com etanol e decomposição em água. Sequenciamento do genoma inteiro foi feito e o algoritmo BLAST foi usado para determinar a similaridade com os genes descritos no banco de dados National Center for Biotechnology Information [NCBI]. Os genomas foram verificados quanto a potenciais quadros de leitura aberta (ORF).
[0093] Os bacteriófagos foram isolados a partir de amostras ambientais. Bactérias P. aeruginosa resistentes a múltiplos fármacos (MDR) foram usadas para isolar e enriquecer cada bacteriófago virulento a partir de água ambiental. Mais particularmente, amostras ambientais e cultura noturna de bactérias em caldo de Luria Bertani (LB) foram misturadas e incubadas a 37 °C durante 24h com agitação para enriquecer bacteriófagos específicos. Ao final da incubação, gotas de clorofórmio foram adicionadas à cultura. A cultura foi centrifugada a 11.000 g durante 5 minutos para remover as células bacterianas e detritos. O sobrenadante foi submetido a um filtro de 0,2 μm para remover as células bacterianas residuais. A solução de fagos enriquecida foi colocada em meio de agar LB com P. aeruginosa incorporada. As placas se formaram sobre as placas após incubação de 24 horas a 37 °C. Uma única placa foi escolhida para subsequente purificação e amplificação de fago. O fago foi, então, armazenado a 4 °C em uma suspensão em caldo LB ou solução salina fisiológica.
[0094] A titulação de fagos em uma suspensão foi calculada contando-se as placas (Postic, 1961). Diluições de dez vezes de uma suspensão foram distribuídas sobre um gramado seco da cepa em propagação. As placas foram lidas após incubação durante a noite. O método de contagem de placas também permitiu a visualização da morfologia das placas.
[0095] Foram selecionados
[0096] 7 bacteriófagos altamente ativos. Sua sequência foi determinada e é fornecida no presente pedido, de acordo com a tabela a seguir: Tabela 1
[0097] A atividade dos bacteriófagos, individualmente ou em combinação, foi ainda testada em diferentes modelos e condições, conforme descrito nos exemplos a seguir.
[0098] Os experimentos de crescimento em uma etapa foram realizados de acordo com as descrições anteriores para determinar primeiro o tempo produtivo lítico, taxa de adsorção e, então, o tamanho da explosão de fagos. Para determinar as taxas de adsorção, amostras foram tomadas em diferentes intervalos de tempo para analisar as partículas de fago livres nas soluções. Para determinação do tempo produtivo e tamanho de explosão de fago, bactérias P. aeruginosa foram misturadas com soluções de fagos e os fagos foram deixados adsorver durante 15 min. A mistura foi submetida à centrifugação imediatamente a 5000 rpm durante 10 min para remover as partículas de fago livres. O pélete foi ressuspenso em meio LB fresco e a cultura foi incubada continuamente a 37 °C. Amostras foram tomadas em intervalos de 5 min e a titulação de fagos foi determinada. Estes resultados permitiram calcular o número de fagos produzidos por bactérias (tamanho de explosão), o tempo de produção e o efeito lítico produtivo (PLE), conforme mostrado na Tabela 3 abaixo. Tabela 3
[0099] Estes resultados mostram que todos os fagos têm taxas de absorção e capacidade de produção viral potentes. A maioria dos fagos têm um PLE abaixo de 7, o que demonstra um perfil notável. O Fago 1777 é particularmente eficaz a este respeito. Além disso, os diferentes PLE e vezes de adsorção permitem criar coquetéis com variabilidade selecionada.
[00100] As composições de coquetel a seguir são constituídas, cada uma compreendendo entre 109 e 1011 pfu de cada bacteriófago: Tabela 4
[00101] Várias cepas de bactérias são incubadas com um coquetel de bacteriófagos da invenção a 2,109 bacteriófagos/ml durante 24 h a 37 °C. Os coquetéis são testados em 16 bactérias P. aeruginosa distintas listadas na Tabela 2. O % de espécies de bactérias sensíveis aos coquetéis é listado na Tabela 5 abaixo: Tabela 5
[00102] As bactérias foram enumeradas e usadas para o cálculo do índice de resistência (número de espécies de bactérias após incubação/número de bactérias na placa) com coquetel VI. As taxas de resistência foram obtidas, conforme mostrado na Tabela 6 a seguir: Tabela 6
[00103] Todas as bactérias testadas são sensíveis às composições da invenção.
[00104] A especificidade de coquetel foi confirmada por meio de testes em dez diferentes espécies de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas, incluindo Escherichia coli (várias cepas), Acinetobacter baumanii, Enterobacter aerogenes C, Enterobacter asburiae, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Staphylococcus aureus, Stenotrophomonas maltophila, Serratia marcescens.
[00105] A Tabela 7 mostra a ausência de atividade lítica do coquetel que contém os 7 bacteriófagos. Tabela 7
[00106] As tabelas acima mostram claramente que nenhuma atividade lítica sobre bactérias que não cepas de P. aeruginosa ocorreu. Os bacteriófagos e coquetel da invenção são, portanto, altamente específicos para cepas de P. aeruginosa.
[00107] A cepa PAO1 foi selecionada porque ela é uma cepa de laboratório comumente usada. As bactérias foram cultivadas individualmente e cada bacteriófago foi adicionado individualmente (Figuras 1-6) ou em um coquetel (Figura 7) em uma MOI de 1 a 10e-4, isto é, em uma proporção de diluição (bactérias/fago) de 1 para 10 000.
[00108] A Figura 1 mostra que o bacteriófago 1384 é eficiente em uma MOI de 1, 0,1 ou 0,01.
[00109] A Figura 2 mostra que o bacteriófago 1777 é eficiente em uma MOI de 1.
[00110] A Figura3 mostra que o bacteriófago 1792 é ativo contra a cepa PAO1 durante pelo menos 6 horas mesmo em uma MOI de 10e-4.
[00111] A Figura 4 mostra que o bacteriófago 1797 é ativo contra a cepa PAO1 durante pelo menos 6 horas mesmo em uma MOI de 10e-4.
[00112] A Figura 5 mostra que o bacteriófago 1800 é ativo contra a cepa PAO1 durante pelo menos 6 horas mesmo em uma MOI de 10e-4.
[00113] A Figura 6 mostra que, dependendo da MOI, o bacteriófago 1800 é ativo contra a cepa PAO1 durante pelo menos 6 horas.
[00114] A Figura 7 mostra a eficácia do coquetel de bacteriófagos VI sobre a cepa PAO1. O coquetel é altamente ativo contra a cepa PAO1 durante pelo menos 6 horas até a uma MOI de 10e-4 e é mais eficiente do que os fagos individualmente.
[00115] Várias cepas foram escolhidas para representar P. aeruginosa que causa problemas respiratórios. Elas foram cultivadas individualmente e o coquetel de bacteriófagos VI foi adicionado em uma MOI de 1 a 10e-4, isto é, uma proporção de diluição (bactérias/fago) de 1 para 10 000. Tabela 8: Informações Sobre as Cepas Bacterianas
[00116] Os resultados são apresentados nas Figuras 8, 9 e 10.
[00117] A Figura 8 mostra que o coquetel é totalmente eficiente sobre a cepa CF1, mesmo após 6 horas e com uma MOI muito baixa.
[00118] A Figura 9 mostra que o coquetel é altamente eficiente sobre a cepa CF2 mesmo após 6 h.
[00119] A Figura 10 mostra que o coquetel é eficiente sobre a cepa CF3.
[00120] Os resultados mostram que o coquetel de bacteriófagos VI foi muito eficiente em três cepas bacterianas nosocomiais de P. aeruginosa isoladas a partir de pacientes hospitalizados, mesmo após ser diluído até dez mil vezes. Estes resultados demonstram, assim, que as composições da invenção podem ser usadas para tratar infecção por P. aeruginosa in vivo e são ativas contra cepas bacterianas multirresistentes.
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Claims (15)
1. COMPOSIÇÃO ANTIBACTERIANA FARMACÊUTICA OU VETERINÁRIA, caracterizada por compreender pelo menos dois bacteriófagos com atividade lítica contra uma cepa de Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), os ditos pelo menos dois bacteriófagos sendo selecionados a partir de bacteriófagos que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1 a 7, e um excipiente ou veículo veterinária ou farmaceuticamente aceitável.
2. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender pelo menos três bacteriófagos diferentes selecionados a partir de bacteriófagos que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1 a 7, e um excipiente ou veículo veterinária ou farmaceuticamente aceitável.
3. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada por compreender pelo menos quatro bacteriófagos diferentes selecionados a partir de bacteriófagos que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1 a 7, e um excipiente ou veículo veterinária ou farmaceuticamente aceitável.
4. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender pelo menos um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 ou 4, e um excipiente ou veículo veterinária ou farmaceuticamente aceitável.
5. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 4, caracterizada por compreender: - um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4; - um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 6; e um excipiente ou veículo veterinária ou farmaceuticamente aceitável.
6. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada por compreender qualquer uma das seguintes combinações de bacteriófagos com um excipiente ou veículo veterinária ou farmaceuticamente aceitável: - um bacteriófago tendo um genoma compreendendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 e um bacteriófago tendo um genoma compreendendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 6; ou - um bacteriófago tendo um genoma compreendendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4, um bacteriófago tendo um genoma compreendendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5, e um bacteriófago tendo um genoma compreendendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1; ou - um bacteriófago tendo um genoma compreendendo uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2, um bacteriófago tendo um genoma compreendendo uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 4, um bacteriófago tendo um genoma compreendendo uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 7, e um bacteriófago tendo um genoma compreendendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1; ou - um bacteriófago tendo um genoma compreendendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2, um bacteriófago tendo um genoma compreendendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3, um bacteriófago tendo um genoma compreendendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4, um bacteriófago tendo um genoma compreendendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5, e um bacteriófago tendo um genoma compreendendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1; ou - um bacteriófago tendo um genoma compreendendo uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2, um bacteriófago tendo um genoma compreendendo uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 3, um bacteriófago tendo um genoma compreendendo uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 4, um bacteriófago tendo um genoma compreendendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5, um bacteriófago tendo um genoma compreendendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 6, e um bacteriófago tendo um genoma compreendendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1; ou - um bacteriófago tendo um genoma compreendendo uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2, um bacteriófago tendo um genoma compreendendo uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 3, um bacteriófago tendo um genoma compreendendo uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 4, um bacteriófago tendo um genoma compreendendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5, um bacteriófago tendo um genoma compreendendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 6, um bacteriófago tendo um genoma compreendendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7, e um bacteriófago tendo um genoma compreendendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1; ou - um bacteriófago tendo um genoma compreendendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 e um bacteriófago tendo um genoma compreendendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1; ou - um bacteriófago tendo um genoma compreendendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 e um bacteriófago tendo um genoma compreendendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1.
7. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada por compreender: - um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1; - um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2; - um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3; - um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4; - um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5; - um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 6; e - um bacteriófago que têm um genoma que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID 10 NO: 7; e - um excipiente ou veículo veterinária ou farmaceuticamente aceitável.
8. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada por ser lítica contra cepas de P. aeruginosa resistentes a antibióticos.
9. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada por ser uma formulação líquida, semilíquida, sólida ou liofilizada.
10. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada por compreender entre 10e4 e 10e12 PFU de cada bacteriófago.
11. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada por ser para o tratamento de uma infecção em um mamífero.
12. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pela infecção ser uma infecção do trato respiratório.
13. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada por ser para melhorar a condição de um mamífero através de modificação da flora microbiana no dito mamífero.
14. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada por ser para a descontaminação de um material.
15. MÉTODO IN VITRO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA OU VETERINÁRIA, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por compreender produzir separadamente os ditos pelo menos dois bacteriófagos selecionados a partir de bacteriófagos tendo um genoma compreendendo uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 7, e combinar os ditos bacteriófagos com um veículo ou excipiente veterinário ou farmacêutico adequado.
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| B07D | Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette] |
Free format text: DE ACORDO COM O ARTIGO 229-C DA LEI NO 10196/2001, QUE MODIFICOU A LEI NO 9279/96, A CONCESSAO DA PATENTE ESTA CONDICIONADA A ANUENCIA PREVIA DA ANVISA. CONSIDERANDO A APROVACAO DOS TERMOS DO PARECER NO 337/PGF/EA/2010, BEM COMO A PORTARIA INTERMINISTERIAL NO 1065 DE 24/05/2012, ENCAMINHA-SE O PRESENTE PEDIDO PARA AS PROVIDENCIAS CABIVEIS. |
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Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 06/11/2015, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS |
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