CN111518713B - 一株能够预防和/或治疗龋齿的鼠李糖乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株能够预防和/或治疗龋齿的鼠李糖乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明筛选得到了一株鼠李糖乳杆菌CCFM1070，此鼠李糖乳杆菌CCFM1070在体外能够抑制变异链球菌和白色念珠菌的双菌生物膜，使得变异链球菌和白色念珠菌的双菌生物膜量减少72.56％，并且，此鼠李糖乳杆菌CCFM1070在大鼠体内可显著降低龋齿造模引起的血糖指标的上升、减少龋齿造模引起的口腔内变异链球菌和白色念珠菌数量的上升、改善龋齿造模引起的牙齿脱矿的情况以及提高龋齿造模引起的龋齿评分的降低，因此，此鼠李糖乳杆菌CCFM1070在制备预防和/或治疗龋齿的产品中，具有巨大的应用前景。

Description

一株能够预防和/或治疗龋齿的鼠李糖乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株能够预防和/或治疗龋齿的鼠李糖乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
龋齿是一种儿童口腔常见病，主要表现为牙齿组织的破坏，它会引起牙齿缺损、疼痛，使咀嚼功能受到影响，严重者甚至造成继发性牙髓炎、颌骨骨髓炎，对儿童的健康产生严重的影响。因此，龋齿的预防以及治疗对儿童的健康至关重要。
龋病是发生于牙釉质及牙本质上的细菌感染性疾病，而牙菌斑生物膜的形成是龋病发生的先决条件。牙菌斑生物膜是由细菌在牙齿表面黏附并不断生长繁殖而形成的具有代谢活性的膜状微生态系统，生物膜中的细菌被包埋在由细菌本身产生的细胞外聚合物基质中。牙菌斑生物膜作用一种典型的生物膜结构，其形成包括浮游阶段、附着阶段、初始微菌落阶段和生物膜成熟以及散播阶段等四个过程。一旦由于宿主的饮食等因素发生变化而导致该牙菌斑生物膜的生态失衡时，牙菌斑生物膜中的致龋微生物会成为优势菌群，它们快速代谢分解碳水化合物，尤其是蔗糖，产生乳酸、甲酸、乙酸和丙酸，使牙菌斑生物膜的pH降低到5.5以下，导致牙釉质羟基磷灰石的脱矿化和牙齿硬组织结构损坏，如果这种脱矿化未加以干预，就会导致脱矿-再矿化的过程失衡，从而形成龋洞。
变异链球菌是公认的主要致龋菌。虽然变异链球菌不是口腔中最丰富的细菌，但它能快速协调致龋性生物膜的形成，并能结合其他致龋菌形成毒力更强的致龋生物膜。与口腔中浮游细菌不同的是，生物膜中的细菌通常由于营养受限，处于近似休眠状态，这种近似休眠状态下的细菌比浮游的代谢活性细菌更耐抗生素和抑菌剂，这无疑大大增加了龋齿的预防以及治疗难度。
临床调查发现，龋病患者的口腔中通常可同时检出白色念珠菌和变异链球菌，提示二者之间可能存在某种互动关系并介导龋病的发展。白色念珠菌与变异链球菌的关联能够增强变异链球菌的致病性并强化致龋生物膜的形成。白色念珠菌粘附牙面的能力较弱，但与变异链球菌结合后，口腔定植能力大大增强。变异链球菌产生的葡萄糖基转移酶(GTF)可与白色念珠菌细胞壁上的甘露聚糖粘附，将其募集到早期牙菌斑生物膜上(具体可见参考文献：Ellepola K,Liu Y,Cao T,et al.Bacterial GtfB augments Candida albicansaccumulation in cross-kingdom biofilms[J].Journal of dental research,2017,96(10):1129-1135.)。具有更大表面积的白色念珠菌可为更多的变异链球菌提供结合位点，增多的变异链球菌数量反过来又增加了白色念珠菌的数量。双种生物膜比单种生物膜具有更高的生物量和细胞数量，目前，已有研究证实白色念珠菌和口腔链球菌的双菌生物膜对抗生素的耐药性高于单一物种(具体可见参考文献：Shirtliff M E,Peters B M,Jabra-Rizk M A.Cross-kingdom interactions:Candida albicans and bacteria[J].FEMSmicrobiology letters,2009,299(1):1-8.)，这无疑进一步增加了龋齿的预防以及治疗难度。
传统的对龋齿的处理方法主要是通过外科手术的方式机械性地挖除并填补龋损部位，但是，这种方法实际上仅能在龋齿发病后，被动地治疗龋齿，不能起到预防的作用，并且，这种方法在一次治疗后，还有极大的复发可能，并不能从根源上达到预防以及治疗龋齿的目的。除外科手术外，临床上也会使用杀菌剂去灭杀存在于口腔中的致龋微生物，但是，这些杀菌剂除了会杀死致龋微生物外，还会杀死口腔中大部份的其他微生物，使得残存的口腔微生物并不能维持口腔菌群的平衡，进而导致龋齿复发，并且，许多杀菌剂在它们作用于致龋微生物之前就先与致龋生物膜中的胞外多糖结合，从而失去了效用，这也是抗菌剂在临床上防治龋齿效果不佳的原因之一。
因此，仍需找到一种能够从根本上预防和/或治疗龋齿的药物或治疗方式。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一株能够预防和/或治疗龋齿的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)。
[技术方案]
为解决上述问题，本发明提供了一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070，所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070的分类学命名为Lactobacillus rhamnosus，已于2019年08月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60744，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070来源于江苏无锡地区的23周岁健康成年人的口腔拭子，该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将测序得到的序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示菌株为鼠李糖乳杆菌，命名为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070。
所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070在MRS培养基上的菌落呈小的半透明白色圆形。
本发明还提供了一种用于预防和/或治疗龋齿的产品，所述产品含有上述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，上述鼠李糖乳杆菌(Lactobacilluscasei)CCFM1070的活菌数为不低于1×109CFU/mL或1×1012CFU/g。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为药品、食品或日化产品。
在本发明的一种实施方式中，所述药品的成分包含上述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070以及载体。
在本发明的一种实施方式中，所述载体为药学上可接受的载体。
在本发明的一种实施方式中，所述载体为药学上可接受的填充剂、润湿剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂或矫味剂中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述食品为上述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)CCFM1070的酸奶或口香糖。
在本发明的一种实施方式中，所述牙膏中还含有蔓越莓提取物。
在本发明的一种实施方式中，所述日化产品为含有上述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070的牙膏。
本发明还提供了一种制备用于预防和/或治疗龋齿的产品的方法，所述方法为使用上述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，上述鼠李糖乳杆菌(Lactobacilluscasei)CCFM1070的活菌数为不低于1×109CFU/mL或1×1012CFU/g。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为药品、食品或日化产品。
在本发明的一种实施方式中，所述药品的成分包含上述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070以及载体；所述食品为含有上述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070的酸奶或口香糖；所述日化产品为含有上述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070的牙膏。
在本发明的一种实施方式中，所述牙膏中还含有蔓越莓提取物。
在本发明的一种实施方式中，所述载体为药学上可接受的载体。
在本发明的一种实施方式中，所述载体为药学上可接受的填充剂、润湿剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂或矫味剂中的一种或多种。
[有益效果]
1、本发明筛选得到了一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070，此鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070在体外能够抑制变异链球菌和白色念珠菌的双菌生物膜，使得变异链球菌和白色念珠菌的双菌生物膜量减少72.56％，并且，此鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070在大鼠体内可显著降低龋齿造模引起的血糖指标的上升、减少龋齿造模引起的口腔内变异链球菌和白色念珠菌数量的上升、改善龋齿造模引起的牙齿脱矿的情况以及提高龋齿造模引起的龋齿评分的降低，因此，此鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070在制备预防和/或治疗龋齿的产品(如药品、食品或日化产品等)中，具有巨大的应用前景。
2、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)是益生菌的一种，目前已被纳入卫生部下发的《可用于食品的菌种名单》，因此，本发明筛选得到的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070不会给人体带来任何潜在的安全隐患，用于预防和/或治疗龋齿的产品(如药品、食品或日化产品等)中时，安全性较高。
生物材料保藏
一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070，分类学命名为Lactobacillus rhamnosus，已于2019年08月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60744，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
图1：鼠李糖乳杆菌CCFM1070对溶菌酶的耐受性。
图2：实施例1中的实验流程图。
图3：各组大鼠牙釉质的三维重建视图、剖面图以及釉质分离图。
图4：各组大鼠牙釉质的体积变化情况。
图5：大鼠下颌磨牙颊舌面计分单位的划分示意图.
图6：大鼠下颌磨牙窝沟计分单位的划分示意图。
图7-10：体式显微镜下各组大鼠磨牙观察图；其中，A、B、C、D、E、F、G、H分别为空白对照组、龋齿模型组、洗必泰干预组、洗必泰预防组、CCFM1070干预组、CCFM1070预防组、CCFM634干预组、CCFM634预防组大鼠磨牙光滑面染色图；a、b、c、d、e、f、g、h分别为空白对照组、龋齿模型组、洗必泰干预组、洗必泰预防组、CCFM1070干预组、CCFM1070预防组、CCFM634干预组、CCFM634预防组大鼠磨牙窝沟面(纵切面)染色图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的SPF级Wistar大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司(生产许可证号SCXK(京)2012-0001)；下述实施例中涉及的变异链球菌购自中国普通微生物菌种保藏中心，产品编号为：ATCC 25175；下述实施例中涉及的白色念珠菌购自北纳生物，产品名称为：SC5314；下述实施例中涉及的植物乳杆菌CCFM634记载于公开号为CN105132308A的专利申请文本中，保藏编号为：CGMCC No.9740；下述实施例中涉及的洗必泰购自阿里健康大药房；下述实施例中涉及的致龋饲料Diet 2000购自南通特洛菲饲料科技有限公司；下述实施例中涉及的溶菌酶购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS培养基：酵母粉5.0g/L、牛肉膏10.0g/L、蛋白胨10.0g/L、葡萄糖20.0g/L、无水乙酸钠2.0g/L、柠檬酸氢二胺2.0g/L、磷酸氢二钾2.6g/L、一水合硫酸锰0.25g/L、七水合硫酸镁0.5g/L和吐温-801mL/L，pH 6.2～6.4。
TSBY培养基：酵母粉6.0g/L、大豆蛋白3.0g/L、胰蛋白胨17.0g/L、葡萄糖2.5g/L、氯化钠5g/L和磷酸氢二钾2.5g/L，pH 7.0～7.4。
YPD培养基：酵母粉1.0g/L、葡萄糖2.0g/L和蛋白胨2.0g/L。
BIGGY培养基：酵母提取物1.0g/L、甘氨酸10.0g/L、葡萄糖10.0g/L、柠檬酸铋铵5.0g/L、亚硫酸钠3.0g/L、琼脂16.0g/L，pH 6.6～7.0。
MS(mitis salivarius agar)培养基：酪蛋白胨15.0g/L、动物组织胃酶水解物5.0g/L、D-葡萄糖1.0g/L、蔗糖50.0g/L、磷酸氢二钾4.0g/L、锥虫蓝0.075g/L、结晶紫0.0008g/L和琼脂15.0g/L，pH 6.8～7.2。
下述实施例中涉及的菌悬液的制备方法如下：
鼠李糖乳杆菌菌悬液：将鼠李糖乳杆菌菌体以占MRS培养基总体积2％的的接种量接种至MRS培养基中，于37℃培养24h后调节菌液浓度为1×109CFU/mL。
植物乳杆菌菌悬液：将植物乳杆菌菌体以占MRS培养基总体积2％的的接种量接种至MRS培养基中，于37℃培养24h后调节菌液浓度为1×109CFU/mL。
变异链球菌菌悬液：将变异链球菌菌体以占TSBY培养基总体积2％的的接种量接种至TSBY培养基中，于37℃培养12h后调节菌液浓度为1×109CFU/mL。
白色念珠菌菌悬液：将白色念珠菌菌体以占YPD培养基总体积2％的的接种量接种至YPD培养基，于37℃培养12h后调节菌液浓度为1×106CFU/mL。
下述实施例中涉及的龋齿建模方法如下：
选择雄性、3周龄、体重40～50g的SPF级Wistar大鼠，对大鼠用变异链球菌和白色念珠菌进行侵染，每天一次，连续5天，5天后，每天从大鼠牙齿用棉签擦拭取样，将棉签置于1mL的生理盐水中，使得棉签上的菌转移到生理盐水中，将转移后的1mL生理盐水进行稀释涂布并对变异链球菌和白色念珠菌的数量进行计数，计数结果>102CFU/mL即为建模成功，期间，若不成功，需继续建模；其中，侵染的具体操作手法为：用无菌棉棒饱和吸收变异链球菌和白色念珠菌菌悬液各200μL，涂于大鼠上下颚臼齿咬合面并作用15s，在涂牙之后禁食禁水半小时。
下述实施例中涉及的介导方法如下：
用无菌棉棒饱和吸收鼠李糖乳杆菌菌悬液200μL、植物乳杆菌菌悬液200μL或0.02％的洗必泰(CHX)200μL，涂于大鼠上下颚臼齿咬合面并作用15s，在涂牙之后禁食禁水半小时。
下述实施例中涉及的预防方法如下：
选择雄性、3周龄、体重40～50g的SPF级Wistar大鼠，对大鼠用鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌进行预防，每天一次，连续5天，5天后，每天从大鼠牙齿用棉签擦拭取样，将棉签置于1mL的生理盐水中，使得棉签上的菌转移到生理盐水中，将转移后的1mL生理盐水进行稀释涂布并对鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌的数量进行计数，计数结果>102CFU/mL即为预防成功，期间，若不成功，需继续预防；其中，预防的具体操作手法为：用无菌棉棒饱和吸收鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌菌悬液各200μL，涂于大鼠上下颚臼齿咬合面并作用15s，在涂牙之后禁食禁水半小时。
实施例1：鼠李糖乳杆菌的筛选及菌种鉴定
1、筛选
以来源于江苏无锡地区的23周岁健康成年人的口腔拭子为样本，将样本经预处理后，在20％甘油中保存于-80℃冰箱，取出解冻后，混匀样本吸取0.5mL样本加到4.5mL，以含有0.05g/L半胱氨酸的0.9％生理盐水进行梯度稀释，选择合适的梯度稀释液涂布在含有0.05g/L半胱氨酸以及20g/L琼脂的MRS培养基上，于37℃培养48h，挑取鼠李糖乳杆菌的典型菌落至含有20g/L琼脂的MRS培养基上划线纯化，挑取单菌落转接至含有0.05g/L半胱氨酸的MRS培养基增菌，30％甘油保藏，得到菌株CCFM1070；其中，鼠李糖乳杆菌的典型菌落呈小的白色半透明圆形。
2、鉴定
提取CCFM1070的基因组，将CCFM1070的16S rDNA进行扩增和测序(由英维捷基公司进行，CCFM1070扩增得到的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，将该序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示菌株为鼠李糖乳杆菌，命名为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070。
实施例2：鼠李糖乳杆菌的培养
将鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070接入含有0.05g/L半胱氨酸以及20g/L琼脂的MRS培养基上，于37℃培养48h后，观察其菌落，发现其菌落呈小的白色半透明圆形。
将鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070接入含有0.05g/L半胱氨酸的MRS培养基中，于37℃厌氧培养24h后，转入新鲜的含有0.05g/L半胱氨酸的MRS培养基中中，同样条件培养24h，6000g离心菌体15min，0.9％生理盐水洗涤菌体后6000g再次离心10min，得到菌体，用30％蔗糖溶液重悬，冻存在-80℃待用。
实施例3：鼠李糖乳杆菌对溶菌酶的耐受性
在96孔培养板中加入200μL MRS培养基；实验组继续于96孔培养板中分别添加不同浓度的溶菌酶溶液使得MRS培养基中溶菌酶的终浓度分别为0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、3.0mg/mL，对照组继续于96孔培养板中添加与溶菌酶溶液等体积的无菌水；将实施例2获得的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070以5％(v/v)的接种量接种到96孔培养板中，37℃培养24h；24h后，测定96孔培养板中培养液在OD600下的吸光度，根据吸光度值判断鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070对溶菌酶的耐受性，检测结果见图1。
如图1所示，以实验组OD值/对照组OD值×100％>60％为依据作为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070对溶菌酶具有高耐受性的标准，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070对溶菌酶的最高耐受浓度为1.6mg/mL，远高于人口腔唾液中溶菌酶的浓度(0～57μg/mL)，说明，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070具备在口腔环境中存活的能力。
实施例4：鼠李糖乳杆菌对双菌生物膜的影响
实验分为三组，分别为鼠李糖乳杆菌介导组、植物乳杆菌介导组以及空白对照组；
其中，鼠李糖乳杆菌介导组为：将鼠李糖乳杆菌CCFM1070菌体以占MRS培养基总体积2％的的接种量接种至MRS培养基中，于37℃培养24h，获得培养液，将培养液于8000r/min、4℃下离心5min，获得上清液，将上清液以0.22μm无菌滤膜过滤，获得鼠李糖乳杆菌CCFM1070上清；在96孔板中加入变异链球菌和白色念珠菌菌悬液各50μL，于37℃培养24h，得到双菌生物膜，将双菌生物膜用PBS缓冲液清洗2遍后，在96孔板中加入鼠李糖乳杆菌CCFM1070上清100μL，于37℃继续培养24h，得到共培养后的双菌生物膜，将共培养后的双菌生物膜用PBS缓冲液清洗2遍并在25℃下静置晾干后，在96孔板中加入100μL的浓度为0.1％的结晶紫溶液，对共培养后的双菌生物膜染色30min，得到染色后的双菌生物膜，将染色后的双菌生物膜用PBS缓冲液清洗2遍后，在96孔板中加入浓度为95％的乙醇溶解染色后的双菌生物膜，于酶标仪中读取OD600下的吸光度值，得到介导后的双菌生物膜量，通过介导后的双菌生物膜量计算鼠李糖乳杆菌CCFM1070介导后双菌生物膜的减少量；
植物乳杆菌介导组为：将植物乳杆菌CCFM634菌体以占MRS培养基总体积2％的的接种量接种至MRS培养基中，于37℃培养24h，获得培养液，将培养液于8000r/min、4℃下离心5min，获得上清液，将上清液以0.22μm无菌滤膜过滤，获得植物乳杆菌CCFM634上清；在鼠李糖乳杆菌介导组的基础上，将鼠李糖乳杆菌CCFM1070上清替换为植物乳杆菌CCFM634上清，得到介导后的双菌生物膜量，通过介导后的双菌生物膜量计算植物乳杆菌CCFM634介导后双菌生物膜的减少量；
空白对照组为：在鼠李糖乳杆菌介导组的基础上，将鼠李糖乳杆菌CCFM1070上清替换为MRS培养基，得到双菌生物膜量；
介导后双菌生物膜的减少量(％)＝(空白对照组的双菌生物膜量-介导后的双菌生物膜量)/空白对照组的双菌生物膜量。
计算结果如下：鼠李糖乳杆菌CCFM1070介导后，双菌生物膜减少72.56％，植物乳杆菌CCFM634介导后，双菌生物膜减少65.57％。可见，鼠李糖乳杆菌CCFM1070和植物乳杆菌CCFM634均能抑制变异链球菌和白色念珠菌的双菌生物膜，但鼠李糖乳杆菌CCFM1070对变异链球菌和白色念珠菌的双菌生物膜的抑制能力强于植物乳杆菌CCFM634。
实施例5：鼠李糖乳杆菌对龋齿大鼠血清生化、口腔菌群计数、牙齿脱矿情况以及龋齿评分的影响
实验流程如图2所示，实验方案和分组如表1所示。
取64只雄性、3周龄、体重40～50g的SPF级Wistar大鼠，随机分成8组，每组8只，8组分别为空白对照组、模型组、洗必泰干预组、洗必泰预防组、CCFM1070干预组、CCFM1070预防组、CCFM634干预组、CCFM634预防组；其中，空白对照大鼠整个实验过程中正常饮食，其他组大鼠均喂以致龋饲料Diet 2000并在饮食中辅以添加有5％(v/v)蔗糖的蒸馏水，模型组和干预组都需经历连续5天(第1～5天)的龋齿建模，所有小鼠均在第6～7天建模成功，建模成功后，干预组再分别用鼠李糖乳杆菌CCFM1070、植物乳杆菌CCFM634或0.02％的洗必泰(CHX)分别连续介导5天(第8～12天)，之后每周进行三次介导、介导6周，预防组都需经历连续5天(第1～5天)的预防，所有小鼠均在第6～7天预防成功，预防成功后，在第8～12天连续5天对小鼠进行建模，第13～14天从大鼠牙齿用棉签擦拭取样，将棉签置于1mL的生理盐水中，使得棉签上的菌转移到生理盐水中，将转移后的1mL生理盐水进行稀释涂布并对变异链球菌和白色念珠菌的数量进行计数，计数后继续饲养6周。
1、鼠李糖乳杆菌对龋齿大鼠血清生化的影响
实验结束后，对各组大鼠禁食14h，14h后，对大鼠进行麻醉，麻醉后，将大鼠断颈处死并进行心脏取血，采血管静置半小时，在4℃下3000xg离心15min取得血清，-20℃保存，通过全自动生化分析仪测定血清指标，检测项目包括血糖Glu(血液中葡萄糖含量)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)指标，检测结果见表2。
由表2可知，模型组大鼠的各项指标均较空白组大鼠有了明显的提高，CCFM1070预防组大鼠的各项指标均较模型组大鼠有了明显的下降，且下降效果比洗必泰干预组和CCFM1070预防组更好。可见，鼠李糖乳杆菌CCFM1070的率先定植口腔可以减轻蔗糖饮食带来的影响，可能是其发挥龋齿防治的途径之一。
2、鼠李糖乳杆菌对龋齿大鼠口腔菌群计数的影响
实验期间，用无菌棉棒来回旋转刮取各组大鼠口腔牙面样本，进行稀释涂布计数，整个实验为期8周，期间进行四次采样，第一次取样在第6天作为致龋菌或鼠李糖乳杆菌CCFM1070的定植检验，第二次取样定植检验是在另外连续5天的菌悬液处理过后，即实验第13天，第三次取样为实验第28天，第四次取样为实验第56天即大鼠处死前做最后一次取样；其中，菌落计数共用到3种固体平板，分别为MS(mitis salivarius agar)加200U/L的杆菌肽对变异链球菌进行计数；添加20μg/ml万古霉素的MRS固体培养基对大鼠口腔中的乳杆菌进行计数；BIGGY固体培养基(BBL,No.211027,BD Diagnostic Systems)对白色念珠菌计数，计数结果见表3-5。
由表3-4可知，四次采样中，模型组的变异链球菌计数结果都没有显著性差异，而白色念珠菌计数结果在第三次和第四次采样中均有上升趋势；从干预组来看，变异链球菌和白色念珠菌的计数结果第一次采样中没有显著性差别，但在第二、三、四次采样中，洗必泰和鼠李糖乳杆菌CCFM1070的干预使得变异链球菌的数量从4×105CFU/mL降到了1～2×104CFU/mL(P<0.05)，使得白色念珠菌的数量同样降了一个数量级(P<0.05)，并且，第四次采样结果显示，鼠李糖乳杆菌CCFM1070抑制白色念珠菌的效果强于洗必泰，可能是因为定期的干预更有利于乳杆菌定植并且能够长久发挥作用；从预防组效果来看，变异链球菌的数量水平在率先定植鼠李糖乳杆菌CCFM1070后保持在4～6×104CFU/mL，显著小于模型组(P<0.05)，而洗必泰在预防后的两周天内有效果，实验结束时基本没有抑制变异链球菌的作用了，白色念珠菌的定植在第一次采样和第二次采样期间均没有因为鼠李糖乳杆菌CCFM1070的定植受到影响，但在第三次和第四次采样中都显著降低(P<0.05)，而洗必泰在整个过程中对白色念珠菌的定植没有任何抑制作用。
由表5可知，各组中鼠李糖乳杆菌CCFM1070的数量在经历了连续五天的定植之后，达到了4×105CFU/mL，但是随着变异链球菌和白色念珠菌的加入，预防组鼠李糖乳杆菌CCFM1070的数量就降为2×104CFU/mL(P<0.05)，这可能是变异链球菌和白色念珠菌与鼠李糖乳杆菌在口腔中竞争的结果，后期，预防组鼠李糖乳杆菌CCFM1070的数量稳定在了2×104CFU/mL左右；干预组鼠李糖乳杆菌CCFM1070的数量也经历了一个波动，但间断性的干预一直保持在4×104CFU/mL。
综上，鼠李糖乳杆菌CCFM1070可以在口腔中定植较好，保持定期摄入可以更好的维持鼠李糖乳杆菌CCFM1070在口腔中的水平，并且，鼠李糖乳杆菌CCFM1070对变异链球菌和白色念珠菌的预防和干预效果都强于洗必泰。
3、鼠李糖乳杆菌对龋齿大鼠牙齿脱矿情况的影响
实验结束后，所有大鼠的下颌骨均用微计算机断层扫描(Micro CT)系统(QuantumGx2；Perkinelmer，Hopkinton，MA，USA)成像；参数：90kv，88μA；视野范围：18μm；采集时间：4min；相机模式：高分辨率。将每个样本旋转360°并将所有图像导入Analyze 12.0软件(AnalyzeDirect，Overland Park，KS，USA)，分别重建下颌骨的三维图像进行分析。以固定阈值将牙釉质与整个下颌骨分离并计算牙釉质的体积。各组三维重建视图和剖面图以及釉质分离图见图3，各组釉质体积变化见图4。
如图3，从完整的3D重建的牙体硬组织中可以明显看到模型组的龋损部位以及剥离的釉质的缺失情况，相比之下，空白对照组无龋损，且釉质完整，两组对照符合预期；比较干预组和预防组，发现洗必泰预防组能从图上看到明显的龋损部位，而洗必泰干预组、CCFM1070干预和CCFM1070预防组则相对看不出特别明显的龋损部位，从剖面图看龋损深度也较浅。
如图4，根据剥离的釉质计算釉质体积来直观呈现釉质的龋损情况，模型组的釉质体积显著小于空白组体积(P<0.05)，但是洗必泰和乳杆菌干预、预防组的釉质体积没有显著差别(P>0.05)，但都显著大于模型组(P<0.05)。
综上，鼠李糖乳杆菌CCFM1070和洗必泰都有减少牙体硬组织龋损深度的效果。
4、鼠李糖乳杆菌对龋齿大鼠龋齿评分的影响
实验结束后，对大鼠牙齿处理操作如下：麻醉后断颈处死大鼠，取出大鼠头骨，用手术刀剥离牙齿颌骨上的软组织，超声清洗颌骨20min，洗掉其牙缝里的残留渣滓，将上下颌骨泡于10％多聚甲醛中24h，结束后洗净晾干；配制0.4％紫脲酸铵染液，将上下颌骨泡于染液中12h，取出后清水漂洗干净，晾干后用金刚砂片沿大鼠的上下和磨牙牙面近远中向矢状半切，在体式显微镜下观察、评估大鼠磨牙龋损情况，并根据Keyes(keyes，Journal ofDental Research，1958)评分标准进行打分。
评分标准如下：染色后的大鼠磨牙的龋损部位呈现出红色，而正常的未龋损部位几乎没有染色或者颜色很浅。将牙齿的龋坏程度分为四个等级：E级龋，龋坏仅在牙釉质；Ds级龋，牙釉质损坏及龋坏范围不超过1/4的牙本质外层；Dm级龋，龋坏范围处于1/4～3/4牙本质；Dx级龋，龋坏范围超过3/4的牙本质。根据大鼠磨牙的颊面、舌面、邻面及窝沟情况将其分成若干个牙面单位，如表6所示。大鼠下磨牙颊舌面和窝沟计分单位划分示意图见图5-6。累及牙本质的龋损计分，仍是在E级龋计分的基础上加上龋损深入发展到各级牙本质龋的得分，即龋损较深的牙齿的总得分是各级的叠加，E级龋得分不受影响，且D级龋损的分值永远不可能超过E级龋。
具体评分方法简述如下：光滑面龋包括颊面龋、舌面龋、邻面龋。其中，颊、舌面的评分是对龋损波及的釉质面的比例进行大体估算(必要时探测龋损深度，而本实验主要研究釉质龋，故未做深度探测)，即将牙面平均分为若干等份(如图5所示)，龋损波及一份范围就计1分，小范围的位置分散的龋损可以用叠加法大致估算其波及的总范围；每个邻面按一个单位计1分，但是由于第一磨牙近中面几乎很少发生龋坏故一般不算入总分(但若真的发现龋损，也可视为一个单位计为1分)，第三磨牙远中面视为颊面的延续，被包含于所划分的四个单位之一中。窝沟龋是在纵切面上，将磨牙各窝沟壁曲线虚拟平铺后，平分成若干个线性单位(如图6所示)，每个单位计1分，下颌第一、二、三磨牙窝沟数目依次为3、2、1，上颌依次为2、2、1。同一颌骨标本被半切后得到颊舌两侧，将其切面窝沟分别计分，最终选取分值较大者作为该标本的得分。大鼠磨牙各类龋损划分的总单位数目(即总分)如表3所示。注：各项评分结果均取正整数，没有小数。
体式显微镜下大鼠下颌磨牙龋损情况见图7-10，体式显微镜下对各组大鼠牙齿进行观察拍照，根据龋损破坏范围进行相应的龋齿打分，得分结果如表7所示。
从图7-10可以看到每组大鼠下颌磨牙的光滑面图和窝沟图，染上红色的部位为龋损部位，根据红色部位的单位计分来评判龋齿的严重程度，而空白对照没有被染上颜色则说明没有龋损；单从体式显微镜结果来看，相比模型组的严重程度，鼠李糖乳杆菌CCFM1070无论是从预防还是干预的角度都展现出显著效果，而植物乳杆菌CCFM634却在体内没有显著的效果甚至和模型组差不多。
从表7可以看到每组大鼠的龋齿计分结果，相比较龋齿模型，植物乳杆菌CCFM634意外地在动物实验中没有预防或者干预龋齿地效果，甚至有加重窝沟龋齿地趋势，尽管其在体外抑制致病菌生物膜时效果较好；其他四组处理组除洗必泰预防组之外都显著减轻光滑面以及窝沟釉质龋(E)、牙本质浅龋(Ds)的发生，而洗必泰预防组只减轻了光滑面釉质龋(E)，说明药物预防基本没有鲜果，即使有效果也仅仅停留在牙齿表面。植物乳杆菌CCFM1070在干预和预防组中都显著降低了光滑面和窝沟龋齿评分，而且从总分上看是乳杆菌干预组效果大于预防组，但是从龋损深度计分来看，乳杆菌预防组又比干预组缓解效果更好，说明早期的定植乳杆菌是很有利于其在口腔发挥缓解龋齿作用的，不仅从龋损单位而言，更是从龋损深度而言。而洗必泰干预组并未能显著减轻窝沟Dm，治疗效果比较表面，预防组更是没有发挥效果。总体而言，按防治龋齿效果(E级评分)排序为：鼠李糖乳杆菌CCMFM1070干预>鼠李糖乳杆菌CCMFM1070预防>洗必泰干预>洗必泰预防。
综上，植物乳杆菌CCFM634在体内没有发挥出预防以及治疗龋齿的效果，而鼠李糖乳杆菌CCMFM1070在体内预防以及治疗龋齿的效果极佳。
表1大鼠实验分组情况
Figure BDA0002218600380000121
注：致龋饲料Diet2000的主要成分如下：全麦粉6％，蔗糖56％，精炼奶粉28％，苜蓿叶粉3％，脱水全干粉1％，酵母4％，盐2％。
表2各组大鼠血清生化指标(±s)
Figure BDA0002218600380000122
Figure BDA0002218600380000131
注：a,b,c,d表示每个指标各组之间的显著性差异P<0.05)。
表3各组大鼠口腔变异链球菌的计数结果
Figure BDA0002218600380000132
注：*表示实验组与对照组差异显著(P<0.05)
表4各组大鼠口腔白色念珠菌的计数结果
Figure BDA0002218600380000133
注：*表示实验组与对照组差异显著(P<0.05)
表5各组大鼠口腔乳杆菌(鼠李糖乳杆菌或植物乳杆菌)的计数结果
Figure BDA0002218600380000134
注：a,b,c表示各组之间显著性(P<0.05)
表6大鼠磨牙牙面单位总数分布
Figure BDA0002218600380000141
注：1st 2nd 3rd分别表示大鼠第一、二、三磨牙；大鼠第二磨牙包含一个近中邻面和一个远中邻面。
表7各组大鼠龋齿得分情况
Figure BDA0002218600380000142
注：*表示与模型组差异显著(P<0.05)
实施例6：鼠李糖乳杆菌的应用
将实施例2获得的鼠李糖乳杆菌CCFM1070以占MRS培养基总质量10％的接种量添加至MRS培养基中，于37℃培养12h，控制发酵过程的pH为5.4～5.8，获得发酵液；终止发酵后，使得发酵液降温至20℃以下，采用离心设备收集菌体，获得菌泥；将菌泥与冻干保护剂(甘油4％、脱脂乳粉25％、抗坏血酸4％、碳酸钠1.5％)按照质量比1:1的比例进行混合，混合后，平衡乳化30min，获得乳化液；将乳化液置于冻干机中，-40℃、4Pa冷冻干燥48h，获得冻干产物；将冻干产物进行低强度粉碎过筛，得到鼠李糖乳杆菌CCFM1070冻干粉。
将奶粉、菊粉、甜菊糖、水按质量比20：5：5：75的比例进行混料，均质，制成发酵原材料；将发酵原材料以121℃超高温灭菌300s杀菌，然后冷却到42℃，接种发酵菌保加利亚乳杆菌(购自北纳生物)和嗜热链球菌(购自北纳生物)的混合菌粉(活菌比2:1)，将混合菌粉按照占发酵原材料总质量0.3％的接种量添加至发酵原材料中，于42℃发酵12h，获得发酵产物；将发酵产物冷却至37℃，加入鼠李糖乳杆菌CCFM1070冻干粉，投料量为109CFU/mL发酵产物，搅拌，罐装，在4℃下保存2天自然完成后熟，获得含有鼠李糖乳杆菌CCFM1070的酸奶。
实施例7：实施例6所得酸奶的效果验证
将实施例6获得的酸奶应用于患龋儿童，实验方法为：选取30名确诊为龋齿的8～12岁儿童，随机分为2组，每组15人，两组分别为对照组以及实验组；其中，对照组给予市售普通酸奶(购自伊利乳业)，实验组给予实施例6获得的酸奶。所有儿童在实验前，在舌头背部一侧收集唾液样品，梯度稀释后用MS(mitis salivarius agar)平板对变异链球菌进行计数；实验组和对照组每日食用100g酸奶。两组儿童每日早晚刷牙一次，所用牙膏无任何抗菌成分。2个月后，在所有儿童舌头背部吸取唾液样本，将唾液样本梯度稀释后用MS(mitissalivarius agar)平板对变异链球菌进行计数，实验结果如表8所示。
从表8可以看出，食用实施例6获得的酸奶后，患龋儿童口腔内变异链球菌数量显著减少，说明该菌的应用产品能够有效对抗口腔中变链的生长情况，缓解儿童龋齿情况。
表8儿童口腔变异链球菌水平变化情况
组别 实验前(10<sup>5</sup>CFU) 实验第60天(10<sup>5</sup>CFU)
对照组 5.5±2.1 5.2±2.5
实验组 5.6±1.9 0.4±2.1*
注：*表示实验组与对照组差异显著(P<0.05)
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一株能够预防和/或治疗龋齿的鼠李糖乳杆菌及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 800
<212> DNA
<213> 鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus casei）
<400> 1
agctataatg cagtcgacga gttctgatta ttgaaaggtg cttgcatctt gatttaattt 60
tgaacgagtg gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcccttaagt gggggataac 120
atttggaaac agatgctaat accgcataaa tccaagaacc gcatggttct tggctgaaag 180
atggcgtaag ctatcgcttt tggatggacc cgcggcgtat tagctagttg gtgaggtaac 240
ggctcaccaa ggcaatgata cgtagccgaa ctgagaggtt gatcggccac attgggactg 300
agacacggcc caaactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccacaa tggacgcaag 360
tctgatggag caacgccgcg tgagtgaaga aggctttcgg gtcgtaaaac tctgttgttg 420
gagaagaatg gtcggcagag taactgttgt cggcgtgacg gtatccaacc agaaagccac 480
ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttat ccggatttat 540
tgggcgtaaa gcgagcgcag gcggtttttt aagtctgatg tgaaagccct cggcttaacc 600
gaggaagtgc atcggaaact ggaaaacttg agtgcagaag aggacagtgg aactccatgt 660
gtagcggtga aatgcgtaga tatatggaag aacaccagtg gcgaaaggcg gctgtctggt 720
ctgtaactga cgctgaggct cgaaagcatg ggttagcgaa caggatttat attcccttgg 780
tagtccacgc cctaaacgat 800

Claims (10)

1.一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的分类学命名为Lactobacillus rhamnosus，已于2019年08月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60744，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
2.一种用于预防和/或治疗龋齿的产品，其特征在于，所述产品含有权利要求1所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)。
3.如权利要求2所述的产品，其特征在于，所述产品为药品、食品或日化产品。
4.如权利要求3所述的产品，其特征在于，所述药品的成分包含权利要求1所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)以及载体。
5.如权利要求4所述的产品，其特征在于，所述食品为含有权利要求1所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的酸奶或口香糖。
6.如权利要求5所述的产品，其特征在于，所述日化产品为含有权利要求1所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的牙膏。
7.一种制备用于预防和/或治疗龋齿的产品的方法，其特征在于，所述方法为使用权利要求1所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述产品为药品、食品或日化产品。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述药品的成分包含权利要求1所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)以及载体；所述食品为含有权利要求1所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的酸奶或口香糖；所述日化产品为含有权利要求1所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的牙膏。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述载体为药学上可接受的载体。
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