CN113046258A - 一株能够预防和/或治疗牙周炎的鼠李糖乳杆菌及其应用 - Google Patents

一株能够预防和/或治疗牙周炎的鼠李糖乳杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株能够预防和/或治疗牙周炎的鼠李糖乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明筛选得到了一株鼠李糖乳杆菌CCFM1138，此鼠李糖乳杆菌具有缓解牙周炎的作用，具体体现在：在体外可以抑制牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的双菌生物膜的形成，使双菌生物膜减少36.60％，并减少生物膜上牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌生物量1～2个数量级；在大鼠体内可显著降低牙周炎造模引起的体重下降和牙槽骨吸收、减少牙周炎造模引起的口腔内牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌数量的上升以及改善造模引起的牙龈指数和探诊深度的增加，因此，此鼠李糖乳杆菌在制备预防和/或治疗牙周炎的产品中，具有巨大的应用前景。

Description

一株能够预防和/或治疗牙周炎的鼠李糖乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株能够预防和/或治疗牙周炎的鼠李糖乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
牙周炎是一种以口腔致病微生物为起始因素的炎性疾病，通常导致口臭、牙龈肿痛出血、牙齿松动、咀嚼功能紊乱，同时也是成人牙齿缺失的首要原因。此外，牙周炎与多种全身疾病密切相关，并增加某些恶性肿瘤的患病机率。
宿主与牙菌斑微生物之间的相互作用很大程度上决定了牙周炎发展与严重程度。一旦宿主的饮食等因素发生变化而导致该牙菌斑生物膜的生态失衡时，牙菌斑生物膜中的致病菌微生物会成为优势菌群，造成牙周炎。
牙龈卟啉单胞菌是公认的牙周炎主要致病菌。牙龈卟啉单胞菌可以迅速黏附和侵入多种宿主细胞，侵入的细菌不仅能在宿主细胞内繁殖和存活，躲避宿主免疫防御系统的攻击，还可以通过调节细胞自吞噬循环通路来逃离原驻细胞，侵入临近未感染细胞，造成感染的扩散。
具核梭杆菌可以通过产生脂肪酸、硫化物、内毒素等物质，抑制成纤维细胞增殖、刺激巨噬细胞产生IL-1，加速牙周炎的病变速度。此外，牙龈卟啉单胞菌可以和具核梭杆菌发生强烈的特异性共聚作用。具核梭杆菌拥有多种凝集素，能与多种细菌和宿主细胞发生黏附作用，主导菌属内和菌属间的黏附共聚，破坏组织加大致病性。
目前，治疗牙周炎的方法主要为机械疗法和药物疗法，但在治疗过程中存在明显不足。例如，以牙周洁治术为主的机械疗法对牙周炎无法起到预防作用，并且容易产生牙齿酸痛，张口疲劳等情况。而药物疗法治疗时间长，效果不明显，长期使用还容易破坏口腔微生态平衡。因此，仍需找到一种副作用小且能够从根本上预防和/或治疗牙周炎的药物或治疗方式。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一株能够预防和/或治疗牙周炎的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)。
[技术方案]
为解决上述问题，本发明提供了一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1138，所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1138的分类学命名为Lactobacillus rhamnosus，已于2020年08月01日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.61115，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1138来源于山东泰安的粪便样本，该菌株经测序分析，其16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将测序得到的序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示菌株为鼠李糖乳杆菌，命名为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)CCFM1138。
所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1138在MRS培养基上的菌落呈小的半透明白色圆形。
本发明还提供了一种用于预防和/或治疗牙周炎的产品，所述产品含有上述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1138。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，上述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)CCFM1138的活菌数为不低于1×109CFU/mL或1×1012CFU/g。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为药品、食品或日化产品。
在本发明的一种实施方式中，所述药品的成分包含上述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1138以及载体。
在本发明的一种实施方式中，所述载体为药学上可接受的载体。
在本发明的一种实施方式中，所述载体为药学上可接受的填充剂、润湿剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂或矫味剂中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述食品为上述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)CCFM1138的酸奶或口香糖。
在本发明的一种实施方式中，所述日化产品为含有上述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1138的漱口水或牙膏。
本发明还提供了一种制备用于预防和/或治疗牙周炎的产品的方法，所述方法为使用上述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1138。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，上述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)CCFM1138的活菌数为不低于1×109CFU/mL或1×1012CFU/g。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为药品、食品或日化产品。
在本发明的一种实施方式中，所述药品的成分包含上述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1138以及载体。
在本发明的一种实施方式中，所述载体为药学上可接受的载体。
在本发明的一种实施方式中，所述载体为药学上可接受的填充剂、润湿剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂或矫味剂中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述食品为含有上述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)CCFM1138的酸奶或口香糖。
在本发明的一种实施方式中，所述日化产品为含有上述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1138的漱口水或牙膏。
[有益效果]
1、本发明筛选得到了一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1138，此鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1138具有缓解牙周炎的作用，具体体现在：
(1)在体外可以抑制牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的双菌生物膜的形成，使双菌生物膜量减少36.60％，并减少生物膜上牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌生物量1～2个数量级；
(2)在大鼠体内可显著降低牙周炎造模引起的体重下降和牙槽骨吸收、减少牙周炎造模引起的口腔内牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌数量的上升以及改善造模引起的牙龈指数和探诊深度的增加，
因此，此鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1138在制备预防和/或治疗牙周炎的产品(如药品、食品或日化产品等)中，具有巨大的应用前景。
2、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)是益生菌的一种，目前已被纳入卫生部下发的《可用于食品的菌种名单》，因此，本发明筛选得到的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1138不会给人体带来任何副作用，用于预防和/或治疗牙周炎的产品(如药品、食品或日化产品等)中时，安全性较高。
生物材料保藏
一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1138，分类学命名为Lactobacillus rhamnosus，已于2020年08月01日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.61115，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
图1：大鼠牙周炎结扎效果图。
图2：鼠李糖乳杆菌CCFM1138对溶菌酶的耐受性。
图3：实施例5中的实验流程图。
图4：各组大鼠的体重变化。
图5：各组大鼠的牙槽骨吸收情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的SPF级Wistar大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司(生产许可证号SCXK(京)2012-0001)；下述实施例中涉及的牙龈卟啉单胞菌购自广东省微生物菌种保藏中心，产品编号为：GDMCC 1.851；下述实施例中涉及的具核梭杆菌购自广东省微生物菌种保藏中心，产品编号为：GDMCC 1.1290；下述实施例中涉及的副干酪乳杆菌ADP-1灭活菌粉购自景岳生物科技股份有限公司；下述实施例中涉及的洗必泰购自阿里健康大药房；下述实施例中涉及的致龋饲料Keyes 2000购自南通特洛菲饲料科技有限公司；下述实施例中涉及的溶菌酶购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS培养基：酵母粉5.0g/L、牛肉膏10.0g/L、蛋白胨10.0g/L、葡萄糖20.0g/L、无水乙酸钠2.0g/L、柠檬酸氢二铵2.0g/L、三水合磷酸氢二钾2.6g/L、一水合硫酸锰0.25g/L、七水合硫酸镁0.5g/L和吐温-80 1mL/L，pH 6.2～6.4。
BHI培养基：胰蛋白胨10.0g/L、牛心浸粉17.5g/L、氯化钠5.0g/L、酵母提取物5.0g/L、葡萄糖2.0g/L、十二水合磷酸氢二钠2.5g/L、一水合L-半胱氨酸盐酸盐0.4g/L、0.5％维生素K1-氯化血红素1mL/L，pH 7.2～7.4。
下述实施例中涉及的菌悬液的制备方法如下：
具核梭杆菌菌悬液：将具核梭杆菌菌体以占BHI培养基总体积2％的接种量接种至BHI培养基中，于37℃厌氧培养48h后用BHI培养基调节菌液浓度为1×109CFU/mL。
牙龈卟啉单胞菌菌悬液：将牙龈卟啉单胞菌菌体以占BHI培养基总体积2％的接种量接种至BHI培养基中，于37℃厌氧培养48h后用BHI培养基调节菌液浓度为1×109CFU/mL。
下述实施例中涉及的灭活菌悬液的制备方法如下：
鼠李糖乳杆菌CCFM1138灭活菌悬液：将鼠李糖乳杆菌CCFM1138以占MRS培养基总体积2％的接种量接种至MRS培养基中，于37℃培养24h，获得培养液；将培养液6000r/min、4℃下离心5min，收集菌泥；将菌泥用无菌生理盐水清洗后，重悬于无菌PBS缓冲溶液中至菌液浓度为1×109CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液68℃灭活30min，得到鼠李糖乳杆菌CCFM1138灭活菌悬液。
副干酪乳杆菌ADP-1灭活菌悬液：将副干酪乳杆菌ADP-1灭活菌粉重悬于无菌PBS缓冲溶液中至菌液浓度为1×109CFU/mL，得到副干酪乳杆菌ADP-1活菌悬液。
下述实施例中涉及的PBS缓冲液的配备方法如下：
PBS缓冲液：氯化钠8g/L，十二水合磷酸氢二钠3.63g/L，磷酸二氢钾0.24g/L，氯化钾0.2g/L，pH 7.4。
下述实施例中涉及的牙周炎建模方法如下：
选择雄性、5周龄、体重150～170g的SPF级Wistar大鼠，肌肉注射200mg/kg的盐酸氯胺酮对大鼠进行麻醉，用0.22mm的正畸钢丝对大鼠左上颌第二磨牙进行丝线结扎，结扎效果见图1。经3天恢复期后，用牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌菌悬液进行侵染，每2天一次，持续3次。6天后，用棉签从大鼠牙齿擦拭取样，将棉签置于1mL的生理盐水中，使得棉签上的菌转移到生理盐水中，将转移后的1mL生理盐水进行稀释涂布并对具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌的数量进行计数，计数结果>102CFU/mL即为建模成功，期间，若不成功，需继续建模；其中，侵染的具体操作手法为：用无菌针管吸取牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌菌悬液各1mL，进行管饲并禁食禁水半小时。
下述实施例中涉及的防治方法如下：
用无菌针管分别吸取鼠李糖乳杆菌CCFM1138灭活菌悬液1mL、副干酪乳杆菌ADP-1灭活菌悬液1mL或0.02％(v/v)的洗必泰(CHX)1mL，进行管饲并禁食禁水半小时。
下述实施例中涉及的饲料配方如下：
Keyes2000饲料(m/m)：奶粉28％，蔗糖56％，小麦粉6％，酵母4％，苜蓿粉3％，肝粉1％，盐2％。
实施例1：鼠李糖乳杆菌的筛选及菌种鉴定
1、筛选
以来源于山东泰安的粪便为样本，将样本经预处理后，在20％甘油中保存于-80℃冰箱，取出解冻后，混匀样本吸取0.5mL样本加到4.5mL的9g/L生理盐水进行梯度稀释，选择合适的梯度稀释液涂布在含有20g/L琼脂的MRS培养基上，于37℃培养48h，挑取鼠李糖乳杆菌的典型菌落至含有20g/L琼脂的MRS培养基上划线纯化，挑取单菌落转接至MRS培养基增菌，30％甘油保藏，得到菌株CCFM1138；其中，鼠李糖乳杆菌的典型菌落呈小的白色半透明圆形。
2、鉴定
提取菌株CCFM1138的基因组，将菌株CCFM1138的16S rDNA进行扩增和测序(由英维捷基公司进行，CCFM1138扩增得到的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，将该序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示菌株CCFM1138为鼠李糖乳杆菌，命名为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1138(原始菌株编号为FSXDTPAL5)。
实施例2：鼠李糖乳杆菌对溶菌酶的耐受性
在96孔培养板中加入200μL MRS培养基；实验组继续于96孔培养板中分别添加不同浓度的溶菌酶溶液使得MRS培养基中溶菌酶的终浓度分别为0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、3.0mg/mL，空白对照组继续于96孔培养板中添加与溶菌酶溶液等体积的无菌水；将鼠李糖乳杆菌CCFM1138菌体以占MRS培养基总体积2％的接种量接种至MRS培养基中，于37℃培养24h，获得菌液；将菌液以5％(v/v)的接种量接种到96孔培养板中，37℃培养24h；24h后，测定96孔培养板中培养液在OD600下的吸光度，根据吸光度值判断鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1138对溶菌酶的耐受性，检测结果见图2。
如图2所示，以实验组OD值/对照组OD值×100％>60％为依据作为鼠李糖乳杆菌CCFM1138对溶菌酶具有高耐受性的标准，鼠李糖乳杆菌CCFM1138对溶菌酶的最高耐受浓度为1.2mg/mL，远高于人口腔唾液中溶菌酶的浓度(0～57μg/mL)，说明，鼠李糖乳杆菌CCFM1138具备在口腔环境中存活的能力。
实施例3：鼠李糖乳杆菌对双菌生物膜量的影响
实验分为三组，分别为鼠李糖乳杆菌介导组、副干酪乳杆菌介导组和空白对照组；
其中，鼠李糖乳杆菌介导组为：在96孔板中加入牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌菌悬液各70μL，再加入鼠李糖乳杆菌CCFM1138灭活菌悬液60μL，于37℃厌氧培养48h，得到双菌生物膜，将生物膜分别用PBS缓冲液清洗2遍并在25℃下静置晾干后，在96孔板中加入100μL的浓度为0.1％(v/v)的结晶紫溶液，对生物膜染色30min，将染色后的生物膜分别用PBS缓冲液清洗2遍，在96孔板中加入100μL浓度为95％(v/v)的乙醇溶解染色后的生物膜，于酶标仪中读取OD600下的吸光度值，得到介导后的生物膜量，计算鼠李糖乳杆菌CCFM1138介导后双菌生物膜的减少量；
副干酪乳杆菌介导组：在鼠李糖乳杆菌介导组的基础上，将鼠李糖乳杆菌CCFM1138灭活菌悬液替换为副干酪乳杆菌ADP-1灭活菌悬液；
空白对照组为：在鼠李糖乳杆菌介导组的基础上，将鼠李糖乳杆菌CCFM1138灭活菌悬液替换为PBS缓冲液；
介导后双菌生物膜的减少量(％)＝(空白对照组的双菌生物膜量-介导后的双菌生物膜量)/空白对照组的双菌生物膜量。
计算结果见表1：鼠李糖乳杆菌CCFM1138介导后，双菌生物膜量减少36.60％，副干酪乳杆菌ADP-1介导后，双菌生物膜量减少29.91％。可见，鼠李糖乳杆菌CCFM1138和副干酪乳杆菌ADP-1均能抑制牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的双菌生物膜，但鼠李糖乳杆菌CCFM1138对牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的双菌生物膜的抑制能力强于副干酪乳杆菌ADP-1。
表1不同菌株介导后双菌生物膜的减少量
组别 吸光度 减少量
空白对照组 3.639±0.058 0％
鼠李糖乳杆菌介导组 2.307±0.027 36.60％
副干酪乳杆菌介导组 2.551±0.042 29.91％
实施例4：鼠李糖乳杆菌对双菌生物膜中致病菌数的影响
实验分为两组，分别为鼠李糖乳杆菌介导组和空白对照组；
其中，鼠李糖乳杆菌介导组为：在6孔板中先放入18mm×18mm的无菌盖玻片，然后加入牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌菌悬液各2mL，再在0h时加入鼠李糖乳杆菌CCFM1138灭活菌悬液250μL，37℃培养24h；24h后，先用无菌镊子取出6孔板中的盖玻片放入50mL离心管中，然后用10mL的0.89％(v/v)无菌生理盐水将其浸没，再将离心管放置于超声清洗装置中清洗2h保证生物膜从盖玻片上洗脱下来，混悬于生理盐水中，得到生物膜悬液；梯度稀释生物膜悬液，每个梯度取100μL稀释悬液，用含有5％(v/v)羊血的BHI培养基浇注平板，37℃厌氧培养48h后计数，一式三个平行，重复三次实验，得到鼠李糖乳杆菌CCFM1138介导后的双菌生物膜中的致病菌数；
空白对照组为：在鼠李糖乳杆菌介导组的基础上，将鼠李糖乳杆菌CCFM1138灭活菌悬液替换为PBS缓冲液，得到鼠李糖乳杆菌CCFM1138介导前的双菌生物膜中的致病菌数。
结果见表2：与空白对照组相比，在0h时加入鼠李糖乳杆菌CCFM1138灭活菌悬液介导后双菌生物膜中致病菌数量都下降了1～2个数量级，可见，鼠李糖乳杆菌CCFM1138不单可使牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的双菌生物膜生物膜量显著减少，也可使生物膜上的致病菌牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的数量相应减少。
表2生物膜致病菌计数(lgCFU/mL)
菌株 介导前 介导后
牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis) 5.388±0.035 4.012±0.048
具核梭杆菌(F.nucleatum) 6.521±0.040 4.305±0.012
实施例5：鼠李糖乳杆菌对牙周炎大鼠体重、牙龈指数GI、探诊深度PD、口腔致病菌数和牙槽骨吸收量的影响
实验流程如图3所示，实验分组如表3所示。
选择雄性、5周龄、体重150～170g的SPF级Wistar大鼠30只，按每组平均体重一致的原则随机分成5组，每组6只。5组分别为空白组、模型组、洗必泰组、鼠李糖乳杆菌CCFM1138组、副干酪乳杆菌ADP-1组(除空白组外，其余组均为实验组)。除空白组外，其他组大鼠均进行牙周炎造模，持续一周。造模期间，同时对洗必泰组、鼠李糖乳杆菌CCFM1138组、副干酪乳杆菌ADP-1组进行介导，具体介导方式为：在管饲牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌菌悬液并禁水禁食半小时后，分别管饲0.02％(v/v)的洗必泰(CHX)、鼠李糖乳杆菌CCFM1138灭活菌悬液或副干酪乳杆菌ADP-1灭活菌悬液各1mL，并禁食禁水半小时。造模成功后，洗必泰组、鼠李糖乳杆菌CCFM1138组、副干酪乳杆菌ADP-1组再分别继续用0.02％(v/v)的洗必泰(CHX)、鼠李糖乳杆菌CCFM1138灭活菌悬液或副干酪乳杆菌ADP-1灭活菌悬液进行连续介导，持续21天。整个实验期间，模型组、洗必泰组、鼠李糖乳杆菌CCFM1138组、副干酪乳杆菌ADP-1组均喂以饲料Keyes2000并在饮食中辅以添加有10％(v/v)蔗糖的蒸馏水，空白组正常饮食。
1、鼠李糖乳杆菌对牙周炎大鼠体重的影响
整个实验持续4周，期间每隔一周对各组大鼠进行称重，比较各组大鼠生长情况，计算平均值，结果见图4。
由图4可知，模型组大鼠相较于空白组大鼠体重显著下降，牙周炎明显影响模型组大鼠进食，造成体重下降。洗必泰虽可以在一定程度上缓解牙周炎，但体重上升幅度较小，防治效果一般。鼠李糖乳杆菌CCFM1138组、副干酪乳杆菌ADP-1组较模型组大鼠体重有了明显的上升，且鼠李糖乳杆菌CCFM1138组的体重与空白组相当，优于副干酪乳杆菌ADP-1组。可见，鼠李糖乳杆菌CCFM1138可以缓解大鼠由于牙周炎引起的体重下降。
2、鼠李糖乳杆菌对牙周炎大鼠牙龈指数GI和探诊深度PD的影响
待实验结束后，对大鼠进行肌肉注射200mg/kg的盐酸氯胺酮麻醉，使用牙周袋探诊针对牙龈指数和探诊深度进行评价。
采用Loe与Silness在1967年修订的检查方法对大鼠牙龈进行评分。评分标准如下：0＝牙龈健康；1＝牙龈轻度炎症：牙龈的颜色有轻度改变并轻度水肿，探诊不出血；2＝牙龈中等炎症：牙龈色红，水肿光亮，探诊出血；3＝牙龈严重炎症：牙龈明显红肿或有溃疡，并有自动出血倾向。结果用平均值±标准差表示。
探诊深度测量方法如下：使用牙周袋探诊针测量牙龈缘至牙周袋底或龈沟底的深度。分别检查大鼠左上颌第二磨牙的腭侧近中，腭侧正中，腭侧远中三点。结果用平均值±标准差表示。
结果见表4：模型组的牙龈指数和探诊深度均显著高于空白组。洗必泰的防治效果并不理想，洗必泰虽可以在一定程度上抑制牙龈出血，但其探诊深度接近于模型组，显示其对牙周袋的形成无抑制作用。而鼠李糖乳杆菌CCFM1138和副干酪乳杆菌ADP-1均可以降低大鼠牙龈指数和探诊深度两个指标，表明鼠李糖乳杆菌CCFM1138和副干酪乳杆菌ADP-1可以缓解牙周炎大鼠牙龈红肿出血的症状，抑制牙周袋的形成。并且，鼠李糖乳杆菌CCFM1138对降低大鼠牙龈指数和探诊深度的效果要优于副干酪乳杆菌ADP-1。
3、鼠李糖乳杆菌对牙周炎大鼠口腔致病菌数的影响
实验期间，使用灭菌镊子将灭菌纸尖插入大鼠牙周袋，采集大鼠左上颌第二磨牙龈下菌斑，放置约20s后取出，将纸尖插入有1mL无菌PBS缓冲溶液的EP管中，稀释涂布于相应平板并计数，作为致病菌定植检验。本次实验共进行两次采样，第一次取样在第7天(第1周)作为牙周炎致病菌的定植检验，第二次取样定植检验为实验第28天(第4周)即大鼠处死前取样，检查不同介导方式对牙周炎致病菌定植的影响。其中，菌落计数用到的固体平板为：用添加12μg/mL氨苄青霉素和5％(v/v)羊血的BHI培养基并结合菌落形态特征对大鼠口腔中的具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌进行计数。
结果见表5：两次采样中，牙龈卟啉单胞菌与具核梭杆菌两种致病菌在空白组中均无定植。根据第一次采样可知，模型组中具核梭杆菌的计数结果可达到3.79lg CFU/mL，而鼠李糖乳杆菌CCFM1138组中具核梭杆菌的计数结果为2.46lg CFU/mL，具核梭杆菌的数量降了一个数量级(P<0.05)，说明CCFM1138可以减少具核梭杆菌在口腔中的定植。而洗必泰和副干酪乳杆菌ADP-1虽也能在一定程度上降低具核梭杆菌的数量，但效果不如鼠李糖乳杆菌CCFM1138，尤其是副干酪乳杆菌ADP-1较模型组没有显著性差别。对于牙龈卟啉单胞菌而言，洗必泰组的定植量略低于其他组别(P<0.05)。而模型组、鼠李糖乳杆菌CCFM1138组和副干酪乳杆菌ADP-1组无显著性差异。相较于第一次采样，第二次采样时各组别中的具核梭杆菌与牙龈卟啉单胞菌的数量均有所上升。其中，副干酪乳杆菌ADP-1对具核梭杆菌的增殖不具有抑制作用。相较于模型组，鼠李糖乳杆菌CCFM1138使牙龈卟啉单胞菌的数量减少了约1个数量级，效果显著。对于具核梭杆菌，CCFM1138也能降低约0.5个数量级，为实验组中最优。洗必泰虽也能在一定程度上减少具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌的定植和增殖，但效果不如鼠李糖乳杆菌CCFM1138。副干酪乳杆菌ADP-1虽对牙龈卟啉单胞菌在口腔中的生长具有细微的影响，但在整个过程中对具核梭杆菌的定植生长没有任何抑制作用。
综上，定期保持摄入鼠李糖乳杆菌CCFM1138可以有效抑制牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌在口腔中的定植与增殖。并且，鼠李糖乳杆菌CCFM1138对牙周炎致病菌牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的抑制效果强于洗必泰和副干酪乳杆菌ADP-1。
4、鼠李糖乳杆菌对牙周炎大鼠牙槽骨吸收量的影响
实验结束后，取下大鼠左侧上颌骨，置于10％(v/v)的多聚甲醛溶液中固定3天，而后用清水漂洗并去除牙槽骨周围的软组织，保留硬组织。用体式显微镜观察大鼠牙槽骨吸收的情况，于20放大倍数下进行拍摄，结果如图5。测量第二磨牙的釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离，每牙测量6个位点：颊侧的近、中、远3点和舌侧的近、中、远3点。各位点测量值之和为该牙的总牙槽骨吸收值，结果见表6。
结合表6和图5可知，空白组和各实验组间存在显著差异(P<0.05)。空白组牙槽骨光滑完整，牙齿排列紧密，无明显缝隙。釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离小。而模型组牙槽骨吸收严重，呈疏松多孔状态。牙根部暴露，牙齿出现松动和掉落的倾向，釉牙骨质界到牙槽嵴顶的平均距离为6.841mm，远大于其他实验组。相较于模型组，鼠李糖乳杆菌CCFM1138呈现出对牙周炎良好的控制效果，CCFM1138能有效减少牙槽骨的吸收和牙骨质的流失。鼠李糖乳杆菌CCFM1138组的釉牙骨质界到牙槽嵴顶的平均距离为2.561mm，显著小于模型组(P<0.05)。而洗必泰和副干酪乳杆菌ADP-1虽对牙周炎也具有一定的防治作用，但效果不如鼠李糖乳杆菌CCFM1138。两组的牙槽骨标本都出现了一定程度的弹坑状吸收和牙骨质流失的情况。并且两组釉牙骨质界到牙槽嵴顶的平均距离均大于鼠李糖乳杆菌CCFM1138组。
综上，鼠李糖乳杆菌CCFM1138对牙槽骨吸收具有良好的防治作用，长期摄入可以减少由于牙周炎引起的牙骨质流失和牙槽骨破坏，并且治疗效果优于洗必泰和副干酪乳杆菌ADP-1。鼠李糖乳杆菌CCFM1138具有作为治疗牙周炎的益生菌的潜力。
表3大鼠分组情况
组别 数量 饮食
空白组 6 正常饮食
模型组 6 饲料Keyes 2000加10％蔗糖水
洗必泰组 6 饲料Keyes 2000加10％蔗糖水
CCFM1138组 6 饲料Keyes 2000加10％蔗糖水
ADP-1组 6 饲料Keyes 2000加10％蔗糖水
表4各组大鼠的牙龈指数和探诊深度
Figure BDA0002715155400000101
Figure BDA0002715155400000111
表5各组大鼠牙具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌的计数结果
Figure BDA0002715155400000112
表6各组大鼠的牙槽骨吸收量
组别 牙槽骨吸收量
空白组 1.256±0.473<sup>a</sup>
模型组 6.841±0.355<sup>c</sup>
洗必泰组 4.751±0.783<sup>b</sup>
CCFM1138组 2.561±0.460<sup>ab</sup>
ADP-1组 4.142±0.591<sup>b</sup>
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一株能够预防和/或治疗牙周炎的鼠李糖乳杆菌及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1103
<212> DNA
<213> 鼠李糖乳杆菌
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(8)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(13)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (662)..(662)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1061)..(1061)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1085)..(1085)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1089)..(1089)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1103)..(1103)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
nnnnnnnngg nnngctaata catgcnagtc gaacgagttc tgattattga aaggtgcttg 60
catcttgatt taattttgaa cgagtggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgccc 120
ttaagtgggg gataacattt ggaaacagat gctaataccg cataaatcca agaaccgcat 180
ggttcttggc tgaaagatgg cgtaagctat cgcttttgga tggacccgcg gcgtattagc 240
tagttggtga ggtaacggct caccaaggca atgatacgta gccgaactga gaggttgatc 300
ggccacattg ggactgagac acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt 360
ccacaatgga cgcaagtctg atggagcaac gccgcgtgag tgaagaaggc tttcgggtcg 420
taaaactctg ttgttggaga agaatggtcg gcagagtaac tgttgtcggc gtgacggtat 480
ccaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag 540
cgttatccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg ttttttaagt ctgatgtgaa 600
agccctcggc ttaaccgagg aagtgcatcg gaaactggga aacttgagtg cagaagagga 660
cngtggaact ccatgtgtag cggtgaaatg cgtagatata tggaagaaca ccagtggcga 720
aggcggctgt ctggtctgta actgacgctg aggctcgaaa gcatgggtag cgaacaggat 780
tagataccct ggtagtccat gccgtaaacg atgaatgcta ggtgttggag ggtttccgcc 840
cttcagtgcc gcagctaacg cattaagcat tccgcctggg ggagtacgac cgcaaggttg 900
aaactcaaaa ggaatttgac cgggggcccg cacaagcggt ggagcattgt ggttttaatt 960
cgaagcaacg cgaagaacct taccaagtct tgacattctt ttgatcacct gagagatcag 1020
gtttcccctt cggggtcaaa attgacaagt gatgcatggt ngtcgtcacc tcgtgtcgtg 1080
agaangttng gattaagttc acn 1103

Claims (10)

1.一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的分类学命名为Lactobacillus rhamnosus，已于2020年08月01日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.61115。
2.一种用于预防和/或治疗牙周炎的产品，其特征在于，所述产品含有权利要求1所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)。
3.如权利要求2所述的产品，其特征在于，所述产品为药品、食品或日化产品。
4.如权利要求3所述的产品，其特征在于，所述药品的成分包含权利要求1所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)以及载体。
5.如权利要求4所述的产品，其特征在于，所述食品为含有权利要求1所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的酸奶或口香糖。
6.如权利要求5所述的产品，其特征在于，所述日化产品为含有权利要求1所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的漱口水或牙膏。
7.一种制备用于预防和/或治疗牙周炎的产品的方法，其特征在于，所述方法为使用权利要求1所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述产品为药品、食品或日化产品。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述药品的成分包含权利要求1所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)以及载体；所述食品为含有权利要求1所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的酸奶或口香糖；所述日化产品为含有权利要求1所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的漱口水或牙膏。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述载体为药学上可接受的载体。
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