CN116333913A - 一种唾液乳杆菌、含有其的益生菌组合物及其应用 - Google Patents
一种唾液乳杆菌、含有其的益生菌组合物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种唾液乳杆菌、含有其的益生菌组合物及其应用，涉及微生物及其应用技术领域。所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC NO:M2022848。本发明提供的唾液乳杆菌是从北极狐肠道中分离得到的一株具有较强产酸能力，能在人工胃、肠液等酸性环境中生存，且具有沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌活性的一株益生菌菌株，此外，该菌株对引起口腔龋齿的变异链球菌具有优异的抑菌作用，可用于防治包括龋齿症在内的龋病；本发明的菌株能够降低血清甘油三酯、乳酸脱氢酶，促进抗炎因子表达；抑制促炎因子的表达；对于调节肝脏代谢，提升免疫力有重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及微生物及其应用技术领域，尤其是涉及一种唾液乳杆菌、含有其的益生菌组合物及其应用。
背景技术
益生菌被定义为“活的微生物，当给予足够的剂量时，会给宿主健康带来有益影响”。益生菌在人类用于预防和治疗传染性和非传染性疾病以及在家禽、牲畜、水产养殖中有广泛的应用。乳酸菌是目前应用较为广泛的一类益生菌，研究表明乳酸菌具有抗氧化作用、可降低血糖、血脂浓度、抗过敏作用、抗炎活性、免疫刺激等作用。
最近的研究表明，益生菌在维持口腔健康方面发挥着重要作用，它们通过产生有机酸、细菌素、过氧化氢和抗粘附分子赋予抗菌和抗生物膜特性从而发挥防龋作用。龋齿被认为是最普遍的非传染性疾病，多种环境因素包括口腔卫生、饮食、口腔状况、口腔细菌等，都会导致龋齿的发生。龋齿形成的主要原因是由糖基转移酶(GTFs)催化合成葡聚糖在牙齿表面形成一种致龋生物膜。变异链球菌是与龋齿密切相关的口腔细菌。作为早期的口腔殖民者，变异链球菌利用种间的共聚来促进后续物种的定殖并影响微生物的发病机理。如变异链球菌可发酵代谢碳水化合物产酸，大量的细菌使口腔环境过度酸化，与龋齿发生直接相关。变异链球菌分泌糖基转移酶(GTFs)，将蔗糖转化为胞内多糖(IPS)和胞外多糖(EPSs)。EPS有助于变异链球菌与牙齿表面的粘附和细胞与细胞之间的相互作用，从而增加牙菌斑厚度。蔗糖在产EPS和产酸中的作用使其被认为是最容易引起龋齿的碳水化合物。目前，最常用的预防龋齿的化合物是氟化钠和氯已定。虽然氟化钠和氯己定具有抑制GTF作用，常被用于抗生膜治疗，但有研究表明氟化物的使用会导致变异链球菌产生耐药性，变异为耐药菌株。
北极狐为犬科动物狐，对其肠道微生物的研究较少。前期研究表明北极狐肠道存在复杂的微生物区系，在北极狐营养物质消化利用、维护机体健康和免疫功能方面发挥重要作用。现有研究已经在健康北极狐肠道中分离获得多种益生性能良好的益生菌。研究表明，来自特定宿主的益生菌能更好地适应该宿主的环境。因此，有必要研究北极狐来源的益生菌是否对于口腔健康有重要的益生功能。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种唾液乳杆菌、含有其的益生菌组合物及其应用。本发明从健康北极狐肠道分离得到了唾液乳杆菌菌株ZJBF 005，该菌株性能良好，对人工胃液和小肠液等酸性环境具有耐受性，对食源性致病菌的抑制活性，并对变异链球菌具有抑菌作用，在龋病的防治中具有重要意义。
本发明提供的技术方案如下：
在一个方面，本发明提供了一种唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)菌株ZJBF005，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC NO:M 2022848。
本发明分离获得了唾液乳杆菌的生物纯培养物，结合16Sr RNA和生理生化鉴定结果将其命名为唾液乳杆菌ZJBF005。唾液乳杆菌ZJBF005在MRS培养基中生长迅速，具有较强的产酸能力；在pH 4.0～7.0之间生长良好，pH低于2.0生长受到抑制；在人工胃、肠液条件下培养3h后的存活率分别为40.96％和86.70％；可在0.2％的胆盐环境中生长；可抑制沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的生长；对青霉素G、氯霉素、头孢孟多、克林霉素、环丙沙星等抗生素敏感，经过灌胃小鼠体重变化正常、无死亡、剖检无病理性变化。
在一个方面，本发明提供了一种益生菌组合物，所述益生菌组合物含有前述的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)菌株、其培养基或其培养上清液作为活性成分；
优选地，所述益生菌组合物中，所述唾液乳杆菌的活菌数不低于1×108CFU/mL或1×108CFU/g。
在一个实施方案中，所述益生菌组合物包括固体组合物和液体组合物。例如所述益生菌组合物可以为液体、冷冻或干燥粉末形式。
在一个实施方案中，所述益生菌组合物还可包含其他适用于口腔健康的益生菌类型。
在一个方面，本发明提供了唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)菌株或含有其的益生菌组合物在制备预防和/或治疗变形链球菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和/或枯草芽孢杆菌中的一种或多种引起的感染性疾病的药物中的应用。
本发明提供的唾液乳杆菌可抑制沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的生长，对变异链球菌也具有抑菌活性；因此，可用于制备预防和/或治疗由以上这些菌种中的一种或多种引起的疾病。
在一个方面，本发明提供了唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)菌株或含有其所述的益生菌组合物在制备预防和/或治疗龋病的药物或口腔护理品中的应用。
在一个实施方案中，所述口腔护理品包括牙膏、漱口液、口香糖、牙线、口腔清洗剂及口腔喷雾剂中的一种或多种。
本发明中，可以在漱口或使用其他口腔清洁产品的同时，使用含有唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)菌株或所述益生菌组合物的护理产品，进而抑制龋齿菌与牙菌斑的产生，降低蛀牙与牙周病发生率。
在一个实施方案中，所述龋病包括龋齿症、牙周炎和牙髓炎中的一种或多种。龋病俗称虫牙、蛀牙，是细菌性疾病，可以继发牙髓炎和根尖周炎，甚至能引起牙槽骨和颌骨炎症。龋病中龋齿病和牙周炎的发生与口腔菌群失调密切相关，而变异链球菌是重要的口腔致病菌，是口腔主要的致龋齿菌之一。发明提供的唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)菌株具有较强的抑制变异链球菌生长的能力，可利用其来调整减少病原菌的生长、聚集，改善口腔微生态平衡，预防和治疗龋齿和牙周炎。
在一个实施方案中，所述龋病为变形链球菌(Streptococcus mutans)引起的龋病。
在一个实施方案中，含有所述唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)菌株的菌剂的制备方法包括：
(a)将所述唾液乳杆菌接种于乳酸细菌(Man Rogosa Sharpe，MRS)液体培养基，厌氧条件下37℃恒温培养24h后进行传代、计数(浓度为1×1010CFU/mL)；
(b)按1:4、1:8和1:16的稀释比例(所述菌液和所述乳酸细菌培养基的体积比为1:4、1:8和1:16)，优选为1:4、1:8的稀释比，获得唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)菌株的培养液(原菌液)或其上清液。
本发明中，采用牛津杯法检测唾液乳杆菌对变异链球菌的生长抑制作用；通过梯度稀释法筛选抑菌浓度，当唾液乳杆菌菌液稀释比例为1:4和1:8时抑菌活性较佳，抑菌圈直径分别为26、23mm；低浓度涂抹组、高浓度涂抹组和预防组龋齿评分达到阳性药物组水平(龋病编码≤1)，与阴性对照组有显著性差异(P＜0.05)。
在一个实施方案中，所述药物的剂型包括胶囊剂、散剂、颗粒剂、片剂、丸剂、膏剂、口服液、喷雾剂中的一种或多种。
在一个实施方案中，所述药物含有至少一种赋形剂；
优选地，所述赋形剂包括润滑剂、粘合剂、崩解剂、悬浮剂、防腐剂、表面活性剂、着色剂、甘油、调味剂或乳化剂中的一种或多种。
本发明提供了唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)菌株或含有其所述的益生菌组合物也可用于制备抗龋病的功能性食品，例如食品或饮料，例如咀嚼片、含片等。
本发明中，采用唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)菌株的菌液处理(特别是高浓度灌胃处理)可以显著降低大鼠血清中的甘油三酯水平以及乳酸脱氢酶水平；显著升高大鼠血清抗炎因子(IL-4和IL-10)的水平，并且能够降低促炎因子(IL-6和肿瘤坏死因子)的水平。本发明的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)菌株或含有其的益生菌组合物具有降甘油三酯的功能，可用于制备具有降甘油三酯功能的药品。
本发明还提供了所述唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)菌株或含有其的所述益生菌组合物在制备药物的应用，所述药物包括以下一种或多种功能：
(a)降低甘油三酯；
(b)降低乳酸脱氢酶；
(c)促进抗炎因子表达；优选所述抗炎因子包括：白介素4和白介素10；
(d)抑制促炎因子表达；优选所述促炎因子包括：白介素6和肿瘤坏死因子；
(e)调节免疫力。
有益效果：
本发明提供了一株新的性能良好的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)菌株，该菌在胃pH值和肠胆汁等酸性环境中的生存能力良好，并且能够抑制有害细菌生长，对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌具有抑菌活性；该菌具有益生菌所必需的特性，对动物无毒副作用；
本发明菌株对口腔致病菌变异链球菌较强的抑制能力，具备在口腔环境良好存活的能力；通过利用变异链球菌建立大鼠龋齿模型，证实该菌在低浓度和高浓度涂抹时对变异链球菌所引起的龋病有抑制作用；
本发明可用于改善口腔的微生态体系，预防和/或治疗龋齿和牙周炎，本发明为应用于犬科动物提供理论基础，也为龋齿的治疗提供了新的方向；
本发明的菌株能够降低血清甘油三酯、乳酸脱氢酶，促进抗炎因子表达；抑制促炎因子的表达；对于调节肝脏代谢，提升免疫力有重要作用。
保藏信息：
本发明唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)菌株ZJBF005保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC NO:M 2022848。保藏日期为2022年06月09日；保藏地址为：中国，武汉，武汉大学；经保藏中心于2022年06月16日检测为存活菌株。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的菌株ZJBF005的菌落形态(左)及细胞特征(右1000×)；
图2为本发明提供的菌株ZJBF005基于16S rRNA基因序列比对结果以Oenococcusoeni JCM 6125(AB022924.1)为外枝构建的Neighbor-Joining系统发育树；
图3为本发明提供的唾液乳杆菌ZJBF005在不同温度下的生长曲线；
图4为本发明提供的唾液乳杆菌ZJBF005的产酸(左)及耐酸曲线(右)；
图5为本发明提供的唾液乳杆菌ZJBF005的胆盐耐受性；
图6为本发明提供的唾液乳杆菌L.salivarius菌液在1:4稀释比例(左)和1:8稀释比例(右)对S.mutans的抑制情况；
图7为不同处理组大鼠龋齿情况；
图8为不同处理组大鼠龋齿情况(解剖图片)；
图9为本发明提供的唾液乳杆菌ZJBF005对龋齿大鼠肝脏的影响。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1.唾液乳杆菌ZJBF005的分离鉴定与体外益生潜能的评价
试验材料：
样品采集：于长白山野生生物资源重点野外科学观测试验站采集冬毛期健康北极狐的肠道内容物。
菌株和细胞：唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)ZJBF 005、大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 25922、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)ATCC14028、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、北极狐小肠上皮原代细胞均由发明人所在实验室分离、鉴定和保存。
试验动物：21日龄SPF-雌性昆明小鼠20只，体重(22±2)g，将大鼠随机分为2组，每组10只。小鼠购自辽宁长生生物技术股份有限公司，动物生产许可证号：SCXK(辽)2020-0001。
1.1试验方法：
1.1.1菌株的分离培养
采集北极狐空肠肠段内容物1mL装于5mL离心管，低温条件下运输回实验室。将离心管置于生物安全柜内操作，离心管内加入适量磷酸盐缓冲液(PBS)进行振荡混匀，吸取100μL混合液进行梯度稀释，随即取10-5、10-6、10-7稀释液100μL分别涂于MRS平板，置于恒温培养箱，设置条件为37℃，48h。挑取单菌落在MRS平板中反复平板划线以获得纯化菌株，筛选和保存革兰氏阳性菌株，对纯化后的菌株进行冻干保存。
1.1.2菌落形态及染色
取冻干菌粉于MRS液体试管中，37℃恒温培养48h后传代，蘸取少量菌液采用平板划线法培养单菌落，观察菌落颜色和形态，采用革兰氏染色法进行染色后，显微镜观察。
1.1.3 16S rRNA基因序列检测
对分离得到的菌株进行纯化培养，培养24h后提取细菌基因组DNA。以细菌基因组DNA为模板，采用细菌16S rDNA通用引物进行16S rDNA的PCR扩增。引物为通用引物27F/1492R；反应体系见表1。
PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，菌株的保守序列约为1500bp，将片段长度正确的PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。从GenBank中获取与之有较高同源性的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA软件进行系统发育分析，利用邻接法建立系统进化树。
表1.PCR反应体系
1.1.4生理生化试验
对分离得到的乳酸菌进行生理生化特性鉴定，具体步骤参照《乳酸细菌分类鉴定及试验方法》。将菌株接种培养24h后，使用吲哚试验、过氧化氢酶试验、V-P试验、糖发酵试验等。
1.1.5温度试验
将培养24h的菌悬液以2.0％的接种量接种于MRS液体培养基中，分别于20℃、37℃和55℃恒温厌氧培养，分别于0、1、2、3、4、5、6、8、10、12、14、24、36、48h测定其在600nm处的吸光度，每组3个平行。测定完成后取3组平行试验结果的平均值绘制统计图。
1.1.6产酸、耐酸性能试验
将培养24h的菌悬液以2.0％的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃恒温厌氧培养。分别于0、2、4、6、8、10、12、14、24h利用pH计测定培养液pH值，根据测定结果绘制产酸速率曲线。
将培养24h的菌悬液以2.0％的接种量接种于初始pH分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的MRS液体培养基中,37℃恒温厌氧培养，分别于0、3、6、12h测定其在600nm处的吸光度，每组3个平行。测定完成后取3组平行试验结果的平均值绘制统计图。
1.1.7人工胃液和人工肠液耐受性试验
取培养24h的菌悬液1mL离心弃上清并加入生理盐水重悬，向重悬后的菌悬液中分别加入1mL经滤膜过滤除菌的人工胃液和人工肠液，37℃恒温厌氧培养，分别于0h和3h时各取100μL菌液梯度稀释后涂布，用平板菌落计数法计算活菌数，以0h为对照，计算存活率，测定菌株在胃液中的耐受性。人工胃液和人工肠液配制方法参照2020版《中国药典》。
存活率(％)＝100×lgNt/lgN0。
式中：Nt为0h活菌数；N0为3.0h活菌数。
1.1.8胆盐耐受性试验
将培养24h的菌悬液以2.0％的接种量接种于胆盐浓度分别为0％、0.2％、0.4％的MRS液体培养基中，37℃恒温厌氧培养，分别于0、3、6h测定其在600nm处的吸光度，每组3个平行。测定完成后取3组平行试验结果的平均值绘制统计图。
1.1.9抑菌试验
将培养24h的菌悬液离心取上清液备用，分别取200μL活化好的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌菌悬液均匀涂布于LB平板上，上清液通过牛津杯琼脂扩散法进行抑菌试验，测定抑菌圈。牛津杯直径为8mm，故设抑菌圈直径大于9.0mm的为具有抑菌性，小于等于9.0mm视为无抑菌性。
1.1.10耐药性试验
取培养24h的菌悬液200μL均匀涂布于MRS平板上，利用纸片扩散法测定菌株对青霉素G、头孢孟多、四环素、阿奇霉素、环丙沙星、万古霉素、氯霉素、克林霉素、庆大霉素、甲氧苄啶、甲硝唑和磷霉素12种抗生素的耐药性。药敏片直径为6mm，故设抑菌圈直径大于7.0mm的为具有抑菌性，小于等于7.0mm视为无抑菌性。
1.1.11安全性试验
将体重(22±2)g的昆明系雌性小鼠20只随机分为2组，实验组一次性腹腔注射0.3mL的菌液(调节菌液浓度为1×109CFU/mL),对照组腹腔注射等量的生理盐水,连续观察7d,记录观察期内小鼠的体重变化、死亡情况,实验结束后剖检观察各组小鼠内脏器官的病理性变化。
1.2、结果分析：
结果以“平均值±标准差”表示，数据通过SAS 9.4中配对T检验和析因设计方差分析进行分析，其中P＜0.05为差异显著。
1.2.1菌株形态学分析
在MRS培养基中分离出多株乳酸菌，将其中一株命名为ZJBF005，进行后续分析与鉴定。菌落呈乳白色、圆形、不透明状，大而平坦，表面光滑，边缘整齐(图1)。菌株ZJBF005为直或微弯杆状、两端钝圆、单个或成对存在、无芽孢的革兰氏染色阳性细菌。
1.2.2菌株同源比对分析
菌株的16S rRNA基因序列如以下SEQ ID No.1所示：
TGCTATACATGCAAGTCGAACGAAACTTTCTTACACCGAATGCTTGCATTCACCGTAAGAAGTTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTAAAAGAAGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATATCTCTAAGGATCGCATGATCCTTAGATGAAAGATGGTTCTGCTATCGCTTTTAGATGGACCCGCGGCGTATTAACTAGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGTGATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTCTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACACGAGTGAGAGTAACTGTTCATTCGATGACGGTATCTAACCAGCAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGGGAACGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGTAGTGCATTGGAAACTGGAAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGTTCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCAATAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCACCTAAGAGATTAGGCTTTCCCTTCGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTGTCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGCGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCGAGACCGCGAGGTTTAGCTAATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGCCGGTGGGGTAACCGCAAGGAGCCAGCCGTCTAAGTGACAGA。
菌株ZJBF005基于16S rRNA基因序列比对结果以Oenococcus oeni JCM 6125(AB022924.1)为外枝构建的Neighbor-Joining系统发育树，见图2。
1.2.3生理生化鉴定结果
对菌株ZJBF005进行生理生化鉴定，结果如表2所示，菌株ZJBF005可利用单糖(甘露糖、山梨糖、半乳糖、乳糖、木糖、果糖、鼠李糖、葡萄糖等)、二糖(纤维二糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖等)和多糖(棉子糖等)产酸。葡萄糖产气试验、过氧化氢酶试验、硫化氢试验、硝酸盐试验、吲哚试验和淀粉水解试验等均为阴性，V-P试验、MR试验和明胶液化试验结果呈阳性，此外菌株ZJBF005具有运动性。经与《伯杰细菌鉴定手册》对照初步判断菌株ZJBF005为唾液乳杆菌。
表2.菌株ZJBF005的生理生化特性
1.2.4菌株最适生长温度
对在20、37和55℃环境下生长的唾液乳杆菌进行OD600值监测，结果如图3所示。唾液乳杆菌ZJBF005在三种温度下皆可生长，最适宜生长温度为37℃，其最大OD600值可达1.7。接种2h后进入对数生长期，培养至25h后进入生长平台期。
1.2.5菌株产酸及耐酸特性
由图4可知，唾液乳杆菌ZJBF005在MRS培养液中迅速产酸，6h内pH从5.97下降至3.28，此阶段对应该菌株的生长对数期；6～24h内培养液pH略微降低，直至稳定在3.14。
同样从图4可知，唾液乳杆菌ZJBF005的菌体数量随着pH值的升高而增加。菌株在pH为1和2的培养液中无法生长；在pH为3的培养液中生长缓慢；当pH提高为4或者更高时，菌体生长速度明显加快，菌体在pH为7的培养液中生长最佳。
1.2.6菌株对人工胃肠液的耐受特性
唾液乳杆菌ZJBF005对模拟胃肠道条件的存活率结果如表3所示，经3h人工胃液培养后菌落数从8.39lg(CFU/mL)(0h)降至3.44lg(CFU/mL)(3h)，存活率为(40.96±0.21)％。经3h人工肠液培养后菌落数从8.23lg(CFU/mL)(0h)降至7.14lg(CFU/mL)(3h)，存活率为(86.70±0.14)％。
表3.唾液乳杆菌ZJBF005在人工胃肠液中的存活率
1.2.7菌株对胆盐的耐受特性
对唾液乳杆菌ZJBF005进行胆盐耐受性试验(图5)，在无胆盐培养基中菌体正常生长；在含有0.2％的胆盐条件下培养至3h时生长较为良好，随时间的推移菌体生长受到了抑制；在含有0.4％的胆盐条件下菌体生长完全受到抑制。
1.2.8菌株对常见致病菌的抑制作用
通过牛津杯法抑菌试验得到以下结果，如表4所示，除大肠杆菌外，唾液乳杆菌ZJBF005对其他三株致病菌菌具有生长抑制作用。其中枯草芽孢杆菌的生长受到较为强烈地抑制，抑菌圈直径可达(20±0.65)mm；唾液乳杆菌ZJBF005对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑制程度相同，抑菌圈直径分别为(14±1.04)和(13±0.97)mm。
表4.唾液乳杆菌ZJBF005抑菌试验结果
抑菌程度用抑菌圈大小表示，+++、++和+分别表示抑菌圈大小为23～30mm、16～23mm和9～16mm，-表示无抑菌圈。
1.2.9.菌株的抗生素敏感性
利用纸片扩散法测定唾液乳杆菌ZJBF005对12种抗生素的耐药性，结果如表5所示。唾液乳杆菌ZJBF005对青霉素G、氯霉素、头孢孟多、克林霉素、环丙沙星等抗生素敏感；而对四环素、庆大霉素、阿奇霉素、甲氧苄啶、甲硝唑、万古霉素和磷霉素等抗生素不敏感。
表5.唾液乳杆菌ZJBF005抗生素敏感试验结果
敏感度用抑菌圈大小表示，+++、++和+分别表示抑菌圈大小为23～31、15～23和7～15，-表示无抑菌圈。
1.2.10动物安全性试验
试验期间，两组间小鼠体重无显著性差异，无生病或者死亡；剖检后观察其内脏均无出血现象，肝脏、脾脏均无眼观病变。这表明唾液乳杆菌ZJBF005对小鼠无毒副作用。
实施例2.唾液乳杆菌ZJBF005对变异链球菌致龋的抑制作用
2.1试验材料：
菌株：唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)源于健康北极狐肠道，由实验室前期分离鉴定(中国农业科学院特产研究所，吉林省)，保藏号：CCTCC M 2022848；变异链球菌(Streptococcus mutans)336931购自北纳生物-河南省工业微生物菌种工程技术研究中心。
动物：21日龄SPF-Wister大鼠42只，体重56～64g，雌雄各半。将大鼠随机分为7组，每组6只。大鼠购自辽宁长生生物技术股份有限公司，动物生产许可证号：SCXK(辽)2020-0001。
日粮：试验采用两种日粮：正常大鼠维持日粮(北京科澳协力饲料有限公司)；高糖致龋齿日粮(江苏省协同医药生物工程有限责任公司)，营养成分见表6。
表6.高糖致龋齿日粮
2.2试验方法：
2.2.1体外抑菌试验
取变异链球菌(S.mutans)复苏36h，接种于脑心浸液肉汤(Brain HeartInfusion，BHI)固体培养基，好氧条件下37℃恒温培养24h，涂片检查为纯培养后于BHI液体培养基中进行传代，备用。L.salivarius接种于乳酸细菌(Man Rogosa Sharpe，MRS)液体培养基，厌氧条件下37℃恒温培养24h后进行传代、计数(浓度为1×1010CFU/mL)，备用。
牛津杯法抑菌试验：取200μL S.mutans(浓度为1×107CFU/mL)均匀涂布于BHI固体培养基中，牛津杯中分别加200μL稀释比例为1:4、1:8和1:16的唾液乳杆菌(L.salivarius)和L.salivarius上清液。37℃培养36h后测量抑菌圈直径，以上每组操作重复3次，取平均值。
2.2.2龋齿动物模型
22～24d为适应期，正常饲喂饮水。25～28d为洗脱期，饮水中添加青霉素(200mg/L)及链霉素(1500mg/L)抑制口腔细菌生长。自29d起，除空白组外，其他各组换喂高糖致龋齿饲料；用无菌棉签蘸取S.mutans(1mL/只)接种于大鼠口腔(磨牙、舌面、硬腭)，5min/只，处理完2h内禁止饮食，每日处理2次(早、晚7点各一次)；饮水中添加100mL/L S.mutans。两周后，检测大鼠口腔中S.mutans定植数量(≥1×1011CFU/mL)；根据国际龋病检测与评估系统(ICDAS)对大鼠磨牙进行龋齿评分(≥1)。
2.2.3动物试验
(1)菌液或药物处理
自43d起，各组大鼠分别用生理盐水、S.mutans、0.12％洗必泰(CHX)和不同浓度的L.salivarius对大鼠磨牙和口腔内其他软组织进行涂抹，5min/只，处理完2h内禁止饮食，每日处理2次(早、晚7点各一次)，试验期持续5周。同时设置高浓度灌胃组(以了解通过灌胃改善肠道菌群组成对龋病有没有预防作用)和高浓度预防组(在涂抹变形链球菌之前先用唾液乳杆菌涂抹处理，以了解预防效果)。
(2)大鼠口腔变异链球菌定植活菌数的检测
自79d起采集大鼠刺激性唾液(腹腔注射毛果芸香碱0.75mg/100g)，用细胞刮刮取牙齿、颊面、舌面和硬腭黏膜液混于唾液中，按不同浓度稀释后涂于轻唾琼脂培养基(MitisSalinarius,MS)，好氧条件下37℃恒温培养24h后记录S.mutans定植数。取样前2h禁止饮食。
(3)大鼠磨牙龋损程度的检测与评分
第81d，采用ICDAS检测方法对大鼠口腔进行评分，清洁大鼠口腔，使用牙科专用高压气枪检测大鼠牙齿健康情况，评分参照ICDAS编码标准。检测前2h禁止饮食。
2.3、结果与分析
采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan法进行平均值间的多重比较，p<0.05为差异显著，描述性统计值以平均值±标准差(mean±SD)表示。
2.3.1体外抑菌测定结果
体外抑菌测定结果见图6，L.salivarius菌液在稀释比例为1:4和1:8时对S.mutans的抑制直径分别为26、23mm；其上清液在稀释比例为1:4和1:8时对S.mutans的抑制直径分别为20、13mm；L.salivarius的稀释比例为1:16时，其菌液或上清液对S.mutans均无抑制作用。
2.3.2大鼠龋齿模型试验结果
2.3.2.1大鼠ICDAS评分
评分结果见表7，阴性对照组与其他各组相比差异有统计学意义(p<0.05)，高浓度灌胃处理组与其他处理组相比差异无统计学意义(p＞0.05)，但龋齿编码水平达到1。
表7.不同处理水平对大鼠牙齿的影响
2.3.2.2大鼠磨牙表面形态
大鼠磨牙龋损程度见图7，与空白对照组(图7中A)相比，其他各组磨牙有不同程度的色素沉着，牙釉质表面粗糙。阴性对照组(图7中B)磨牙有明显的不透明性变和变色，明显的牙本质暗影和牙菌斑；低浓度处理组(图7中D)和高浓度灌胃组(图7中F)磨牙表面有褐色龋损变色，牙釉质凹凸不平；预防组(图7中G)、高浓度处理分组(图7中E)和洗必泰药物组(图7中C)磨牙色素沉积情况较轻，牙釉质表层相对光滑。
如图7所示，将大鼠牙颌骨从口腔中分离，观察其龋齿发展情况。阴性对照组(图8中B)大鼠牙齿表象明显不同于空白对照组(图8中A)，可见龋损的不透明性变，牙齿出现脱矿现象，窝沟形态较原先变得更加宽敞；相比较洗必泰药物组(图8中C)，低浓度处理组(图8中D)和高浓度处理组(图8中E)牙齿表面略显粗糙，但无不透明性变和牙本质黑影；高浓度灌胃组(图8中F)牙釉质更薄更具半透明性，可观察到牙本质阴影(潮湿状态下)；预防组(图8中G)釉质未发现龋损迹象，有轻微窝沟着色情况。
实施例3.唾液乳杆菌ZJBF005对代谢的影响
3.1试验材料：
同以上2.1。
3.2试验方法：
3.2.1体外抑菌试验
取S.mutans复苏36h，接种于脑心浸液肉汤(Brain Heart Infusion，BHI)固体培养基，好氧条件下37℃恒温培养24h，涂片检查为纯培养后于BHI液体培养基中进行传代，备用。L.salivarius接种于乳酸细菌(Man Rogosa Sharpe，MRS)液体培养基，厌氧条件下37℃恒温培养24h后进行传代、计数(浓度为1×1010CFU/mL)，备用。
3.2.2龋齿动物模型
同2.2.2.
3.2.3动物试验
(1)菌液或药物处理
自43d起，各组大鼠分别用生理盐水、S.mutans、0.12％洗必泰(CHX)和不同浓度的L.salivarius对大鼠磨牙和口腔内其他软组织进行涂抹，5min/只，处理完2h内禁止饮食[15]，每日处理2次(早、晚7点各一次)，试验期持续5周。同时设置高浓度灌胃组(以了解通过灌胃改善肠道菌群组成对龋病有没有预防作用)和高浓度预防组(在涂抹变形链球菌之前先用唾液乳杆菌涂抹处理，以了解预防效果)。
(2)大鼠口腔变异链球菌定植活菌数的检测
自79d起采集大鼠刺激性唾液(腹腔注射毛果芸香碱0.75㎎/100g)，用细胞刮刮取牙齿、颊面、舌面和硬腭黏膜液混于唾液中，按不同浓度稀释后涂于轻唾琼脂培养基(MitisSalinarius，MS)，好氧条件下37℃恒温培养24h后记录S.mutans定植数。取样前2h禁止饮食。
(3)大鼠磨牙龋损程度的检测与评分
第81d，采用ICDAS检测方法对大鼠口腔进行评分，清洁大鼠口腔，使用牙科专用高压气枪检测大鼠牙齿健康情况，评分参照ICDAS编码标准。检测前2h禁止饮食。
3.2.4样品采集与指标测定
试验期结束后将42只大鼠麻醉，每只大鼠心脏采血10mL于促凝采血管中，3500r/min离心5min，将分离出的血清分装于无RNA酶1.5mL的Eppendorf管中，-20℃保存。胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、乳酸脱氢酶、丙氨酸基转移酶、碱性磷酸酶和谷草转氨酶的测定采用试剂盒，以上试剂盒均购自中北控生物科技股份有限公司，按照试剂盒说明，使用VITALIB-E全自动生化分析仪测定。
白介素4(IL-4)、白介素(IL-10)、分泌型免疫球蛋白A(sIgA)、干扰素(γ-IFN)、白介素6(IL-6)、白介素17A(IL-17A)和抗肿瘤坏死因子(TNF-α)的测定采用ELISA试剂盒，以上试剂盒均购自江苏晶美生物科技有限公司，所有测试均按照制造商的说明进行。
采血后将所有大鼠进行解剖，采集每组大鼠的肝脏组织于装有4％甲醛溶液的50mL离心管中，固定过夜。将在4％甲醛固定后的肝脏组织进行石蜡包埋、切片和烤片，苏木精-伊红(H&E)染色。切片在数字病理切片扫描仪(滨松，日本)下观察。
3.3试验结果：
表8.唾液乳杆菌对龋齿大鼠脂代谢指标的影响
由于龋齿的发生与糖含量的有关，而肝脏又是糖代谢的主要器官，所以我们对龋齿大鼠的肝脏以及有关肝脏功能的指标进行检测(表8)。
过多的葡萄糖在体内会转变成低密度脂类物质，使血中甘油三酯等脂肪物质增多。我们可从表中看出CHX组和阴性对照组的甘油三酯水平较高，高浓度灌胃组可显著降低龋齿大鼠血清中甘油三酯的水平。其他脂代谢指标没有显著性变化。
表9.唾液乳杆菌对龋齿大鼠肝脏功能指标的影响
各组之间肝功能指标(表9)差异较为显著性。阴性对照组和CHX组血清中的乳酸脱氢酶水平最高，高浓度灌胃组乳酸脱氢酶水平显著性降低。阴性对照组中丙氨酸氨基转移酶含量升高，与其他各组有显著性差异。4种试验处理组碱性磷酸酶水平升高，但谷草转氨酶没有显著性变化，因此前者的升高对肝脏的影响意义不大。
若肝脏合成的甘油三酯不能及时转运，会异成大小不一的脂肪空泡。如图9中红色箭头所指。与其他处理组相比，两组高浓度处理组肝脏组织较为正常。
表10.唾液乳杆菌对龋齿大鼠血清抗炎因子水平的影响
考虑到龋齿发生时口腔菌群紊乱，菌群异位定植于肠道的可能性增加，因此我们对大鼠的肠道组织形态以及一些免疫指标进行检测(表10)。白介素4和白介素10经这几组处理后水平显著性升高。分泌型免疫球蛋白A和干扰素虽然在各组中没有显著性差异，但这两种抗炎因子的水平在阴性对照组中都有所降低。
表11.唾液乳杆菌对龋齿大鼠血清促炎因子水平的影响
阴性对照组中(表11)白介素6和肿瘤坏死因子的水平较高，经菌液处理后这三组的促炎因子水平有不同程度的降低。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)菌株ZJBF005，其特征在于，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC NO:M 2022848。
2.一种益生菌组合物，其特征在于，所述益生菌组合物含有权利要求1所述的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)菌株、其培养基或其培养上清液作为活性成分；
优选地，所述益生菌组合物中，所述唾液乳杆菌的活菌数不低于1×108CFU/mL或1×108CFU/g。
3.根据权利要求2所述的益生菌组合物，其特征在于，所述益生菌组合物包括固体组合物和液体组合物。
4.权利要求1所述的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)菌株或权利要求2或3所述的益生菌组合物在制备预防和/或治疗变形链球菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和/或枯草芽孢杆菌中的一种或多种引起的感染性疾病的药物中的应用。
5.权利要求1所述的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)菌株或权利要求2或3所述的益生菌组合物在制备预防和/或治疗龋病的药物或口腔护理品中的应用。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述口腔护理品包括牙膏、漱口液、口香糖、牙线、口腔清洗剂及口腔喷雾剂中的一种或多种；
优选地，所述龋病包括龋齿症、牙周炎和牙髓炎中的一种或多种。
7.根据权利要求4或7所述的应用，其特征在于，所述龋病为变形链球菌(Streptococcus mutans)引起的龋病。
8.权利要求1所述的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)菌株或权利要求2或3所述的益生菌组合物在制备药物的应用，所述药物包括以下一种或多种功能：
(a)降低甘油三酯；
(b)降低乳酸脱氢酶；
(c)促进抗炎因子表达；优选所述抗炎因子包括：白介素4和白介素10；
(d)抑制促炎因子表达；优选所述促炎因子包括：白介素6和肿瘤坏死因子；
(e)调节免疫力。
9.根据权利要求4或8所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括胶囊剂、散剂、颗粒剂、片剂、丸剂、膏剂、口服液、喷雾剂中的一种或多种。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物含有至少一种赋形剂；
优选地，所述赋形剂包括润滑剂、粘合剂、崩解剂、悬浮剂、防腐剂、表面活性剂、着色剂、甘油、调味剂或乳化剂中的一种或多种。
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