JP4540664B2

JP4540664B2 - グルタミン産生能を有する新規のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株

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Publication number: JP4540664B2
Application number: JP2006502776A
Authority: JP
Inventors: ゴーランモーリン; シヴアールネ; ベントジェップソン
Original assignee: プロビエービー
Priority date: 2003-01-31
Filing date: 2004-01-27
Publication date: 2010-09-08
Anticipated expiration: 2024-01-27
Also published as: EP1587913B1; DK1587913T3; SE526711C2; BRPI0407176A; CN1777670A; AU2004208084A1; US20060269533A1; AU2004208084B2; BRPI0407176B8; ATE496115T1; PL378435A1; CA2514659C; CN100558883C; WO2004067731A1; BRPI0407176B1; ES2362496T3; SE0300245L; DE602004031079D1; RU2352628C2; ZA200505777B

Description

発明の分野
本発明は、ｉｎｖｉｖｏでグルタミン及び必要に応じてアルギニンを産生する能力を有する新規のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株に関する。

発明の背景
グルタミンは、体内で最も豊富なアミノ酸である。それは、組織間の「窒素シャトル（Ｎｉｔｒｏｇｅｎｓｈｕｔｔｌｅ）」及び腸細胞、結腸細胞（ｃｏｌｏｎｏｃｙｔｅ）、リンパ球及び増殖細胞の燃料である。グルタミン欠乏患者においては消化管の機能が害され、これは特に、腸管内腔から門脈循環への細菌及び／またはエンドトキシンのトランスロケーションに対する保護が損なわれているためである。グルタミンが欠乏すると、深刻な疾患の及び損傷を受けた患者となり、そして、高頻度の感染や筋肉の消耗の一因となり得る。

グルタミンを腸に投与することにより、あらゆる症状の患者に健康的で有益な効果をもたらしている。集中治療室の多臓器不全患者においてグルタミン投与は、患者における感染症の併発が減少した（Houdijk et al., Lancet, 352:772-776, 1998）。同様の効果が、グルタミンを補充した非経口的栄養を受ける骨髄移植を行った患者において観察された（Ziegler et al., Annals Internal Medicine, 116:821-828, 1992）。他の例は短小腸症候群の患者でみられ、これはグルタミン補給後に吸収能が相当改善した（Byrne et al., Annals of Surgery, 222:243-255, 1995）。化学療法中及び後の経口グルタミン補給も、化学療法が関与する口内炎の持続時間及び重篤度の両方が著しく減少することが示された。経口グルタミンは、集中的癌化学療法の結果として口腔潰瘍発生のハイリスクの多くの患者の快適性を増加する単純及び有用な手段のようであると結論付けられた（Anderson et al., Cancer 1998; 83:1433-9）。激しい運動の後のグルタミンの栄養補給も、感染症の発生、特に、上気道感染を減少している（Castell , Amino acids 2001; 20（1）:49-61）。しかし、免疫抑制に対するグルタミンの正確な効果はいまだ確立されていない。

グルタミンに関する主な技術的な困難性は、加工及び保存中にグルタミンは容易にグルタミン酸（グルタメート）に変化することであり、すなわち、グルタミンは、経口投与を目的とする製剤に組み込むことが困難な比較的不安定な化合物である。さらに、経口投与したグルタミンは、胃の酸性環境ではかなりの割合がグルタミン酸に変化し、そして、決して腸に到達せず、そしてグルタミンとして吸収され得ない。

アルギニンは免疫機能を高め、創傷治癒を助長する。アルギニン投与は、術後の患者及び集中治療下の患者に対して使用される。多くの臨床研究において、アルギニンはＲＮＡ及び魚油のような他の物質と共に投与されている。アルギニン投与は、術後の免疫応答を調節することが指摘されている。Daly, John E., et al. Surgery 112:55-67, 1992では、アルギニン、ＲＮＡ及びオメガ−３−脂肪酸を補足した経腸栄養剤を術後の患者に投与すると、種々のメカニズムを通して免疫防御が改善することを示している。アルギニンは、化学放射線療法及び手術を受けた患者の合併症を軽減し（Tepaske et al., 2001; Lancet 358: 696-701）、そして、患者が集中治療室に滞在する期間を短縮する（Bauer et al., 1995, Critical Case Medicine 23: 436-449）。

生存期間の増加は、アルギニン補給食を摂取させた動物において観察され得た。定量的なコロニー数及び残存している生菌の算出率は、アルギニンを摂取した動物において、移動した生物体を殺す能力がかなり高くなっていることを示している（Adawi, D., et al., 1997, Hepatology 25: 642-647）。

Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐｐ．菌株、すなわちビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）は、ヒトの大腸、特に母乳育ちの赤ん坊に、たいてい多数存在する。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐｐ．由来の細菌は、プロバイオティクス（すなわち、摂取することにより宿主に健康的で有益な効果を提供する生きている細菌）とみなされている。大腸中の多数のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐｐ．は、健康的で有益な効果を有すると主張されている。しかし、前記の有益な効果の作用機構はほとんど知られていない。

先行技術
Matteuzzi et al. ［Ann. Microbiol.（Inst. Pasteur）1978; 129 B, 175-181］は異なる生息地由来の多数のビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏ−ｂａｃｔｅｒｉａ）において、培養液中に遊離アミノ酸を放出するそれらの能力について調査した。得られたデータは、Ｂｉｆｉｄｏ−ｂａｃｔｅｒｉａの幾つかの種は増殖に必要な全てのアミノ酸を合成でき、そしてまた、培養液中に前記化合物を放出できることを示した。Ｂ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ及びＢ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓは最も優れた生産菌であることが分かり、そして、培養液中に最も一般的に見られるアミノ酸は主にアラニン、バリン及びアスパラギン酸であった。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐｐ．は消化管のアミノ酸代謝を担うと推測された。

ＷＯ０１／８３７００（メリーランド大学）は、胃腸障害、新生児壊死性腸炎（ＮＥＣ）及び細菌性敗血症の治療及び予防用の組成物及び方法を開示している。該組成物はグラム（＋）細菌（特に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）とグルタミンの組み合わせを含有しており、そして、経口的に及び鼻口的に投与されるべきである。該組成物はグラム（−）細菌のような細菌性因子の移動を妨害すると言われている。

静脈を経由して投与したグルタミンは非常に効果的だが、高価で煩雑である。グルタミンを投与するより良い方法は、当然、腸内でかなりの量のグルタミンを産生できる能力を有する細菌株を使用することであろう。しかし、これまでに、このような菌株についての記載はない。

本発明の要約
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの特定の菌株がヒト大腸内の環境を模倣した増殖培地中でグルタミンを産生できることを驚くべきことに今日発見した。そして、前記の菌株は、哺乳類、特にヒトに対して経口で、または、腸に投与した後にｉｎｖｉｖｏでグルタミンを産生するために使用し得る。菌株によってはアルギニンも産生し得る。

本発明の記載
本発明は、腸管内で生存する能力及びｉｎｖｉｖｏでグルタミンを産生する能力を有するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株に関する。特に、グルタミンはヒトの大腸で産生される。このような環境で生存するということは、各個体由来の糞便において、異なるサンプリング時に、細菌株が分離されることを意味する。従って、細菌は、しばらくの間、それらの宿主内で明らかに増殖し、そして生存する。本発明のビフィドバクテリウム菌株（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｓｔｒａｉｎｓ）は、ｐＨ７以下、特に５．５−６．５の栄養培地で増殖できる。ロゴサ寒天培地（Ｒｏｇｏｓａａｇａｒ）はこのような培地の一例であり、もう一つはＭＲＳである。

好ましい側面に従うと、新規の菌株はアンモニアを同化する能力も有する。

本発明は特に、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓ種に属する菌株に関する。

特定の側面に従うと、本発明はまた、染色体ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、続いてアガロースゲル電気泳動により断片を分離し、そして、サザンブロットハイブリダイゼーションを利用して、Ｌ．ｃａｓｅｉｓｕｂｓｐ．ｐｓｅｕｄｏｐｌａｎｔａｒｕｍＤＳＭ２０００８の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をＤＩＧ標識した４２０ｂｐ断片プローブ（Ｅ.ｃｏｌｉ番号付けで、位置５０６〜９２６）とのハイブリダイゼーションにより得た、分子サイズ約２８４０ｋｂのシングルＤＮＡ断片上に位置する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株に関する。このような菌株は、例えば、the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHに2002年8月23日に寄託された菌株、ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ１９（ＤＳＭ１５１５８）；ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ２１（ＤＳＭ１５１５９）；ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ２６（ＤＳＭ１５１６０）；ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ２８（ＤＳＭ１５１６１）；ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ２９（ＤＳＭ１５１６２）である。

他の側面に従うと、本発明は、染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、続いてアガロースゲル電気泳動により断片を分離し、そして、サザンブロットハイブリダイゼーションを利用して、Ｌ．ｃａｓｅｉｓｕｂｓｐ．ｐｓｅｕｄｏｐｌａｎｔａｒｕｍＤＳＭ２０００８の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をＤＩＧ標識した４２０ｂｐ断片プローブ（Ｅ.ｃｏｌｉ番号付けで位置５０６〜９２６）とのハイブリダイゼーションにより得た、分子サイズ約８９５ｋｂのシングルＤＮＡ断片上に位置する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株にも関する。好ましい側面に従うと、前記菌株はグルタミン酸を減少させることなくグルタミンを産生できる。

本発明は特に、菌株ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ２１及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ２６（これらはthe Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH に2002年8月23日に寄託され、そして、それぞれ、アクセッション番号ＤＳＭ１５１５９及びＤＳＭ１５１６０が与えられている）、またはこれらの変異株に関する。前記菌株は、グルタミン酸を減少させることなくグルタミンを産生できる。

もう一つの側面に従うと、本発明は、染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、続いてアガロースゲル電気泳動により断片を分離し、そして、サザンブロットハイブリダイゼーションを利用して、Ｌ．ｃａｓｅｉｓｕｂｓｐ．ｐｓｅｕｄｏｐｌａｎｔａｒｕｍＤＳＭ２０００８の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤＩＧ標識した４２０ｂｐ断片プローブ（Ｅ.ｃｏｌｉ番号付け、位置５０６〜９２６）とのハイブリダイゼーションにより得た、分子サイズ約３４２０ｋｂのシングルＤＮＡ断片上に位置する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株にも関する。好ましい側面に従うと、前記菌株はアルギニン産生能を有する。

本発明は特に以下の菌株（これらは全てthe Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH に2002年8月23日に寄託され、そして寄託番号が与えられており、それはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ１９、ＤＳＭ１５１５８、ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ２８、ＤＳＭ１５１６１及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ２９、ＤＳＭ１５１６２である菌株）、及び、これらの変異株にも関する。前記菌株は、グルタミンに加えてアルギニンも産生できる。

新規の菌株は、全て幼い子供由来の糞便から分離し、そして、ｐＨ７以下の寒天上で培養することにより選択した。該菌株は、その後、リポタイピング及びＲＥＡにより特徴づけられた。

本発明のもう一つの目的は、１以上の本発明のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株を担体と組み合わせて含有する組成物である。担体の例は、オートミールかゆ、乳酸発酵食品、イヌリン、ラクツロース、フルクトオリゴ糖、レジスタントスターチ（ｒｅｓｉｓｔｅｎｔｓｔａｒｃｈ）、β−グルカン及びグアーガムである。ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）の増殖を促進し、そしてグルタミン及びアルギニンのそれぞれの産生量を増加させ、大腸でのアンモニア同化を高めるために、食物繊維も組成物に加えられるべきである。食物繊維は、例えばイヌリン、フルクトオリゴ糖、マルトデキストリン、β−グルカン及びグアーガムである。このように、本発明は、さらに食物繊維を含有する記載したような組成物にも関する。

本発明の組成物（懸濁液、錠剤、カプセル、粉末のような）は経口投与され得る。これらは浣腸剤としても投与され得る。

本発明の組成物は、担体が食品である食品組成物であり得る。グルタミン産生Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株は、若い子供、年配者、筋肉機能を改善して健康を保つこと及び運動後の免疫低下を回避することを望む運動競技や通常の消費者に与えられ得る。アルギニン産生Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株は、健康を保ち、そして免疫機能における良くない影響を避けることを望む通常の消費者に与えられ得る。

本発明の組成物は薬学的組成物であり得、ここで、担体は、治療的に許容される担体である。グルタミン産生株は（アルギニン産生株と同様に）、さらに経腸栄養法の様式で使用され得る。

本発明のアンモニアを同化するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株は、手術及び合併症の後の、あるいは重篤な感染症、中毒のような他の疾患の後の、集中治療下の患者にみられるような一時的な腎不全を有する患者に与えられ得る。このような場合、腎機能が回復することが予測でき、そして、消化官から負荷される窒素を減少させることを目的とする治療により、透析の必要性を回避し得る。アンモニアを同化する菌株は、肝疾患や脳症（例えば、肝炎または中毒あるいはそれに続くアルコール乱用）の患者に投与され得る。消化官からの窒素含有物質の吸収が低下すると、これらの状況において、脳症及び肝機能が改善し得る。アンモニアを同化するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株は、若い子供、年配者または、アンモニアを尿素に変換する肝臓の働きを妨害する疾患を患っている、または、消化管からの窒素の吸収が増加している消費者（例えば、移植または透析の必要がまだない軽度から中程度の慢性の腎または肝不全患者）に与えられ得る。

特定の側面に従うと、本発明の組成物は１以上のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌株も含有し得る。

Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉの任意の有益な効果に加えて、前記細菌が酸素の有害な影響からビフィズス菌（ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）を保護し得る。

もう一方の側面に従うと、本発明は、治療での使用のための、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓ種に属する１以上の菌株に関する。

本発明は、多臓器不全及び腸不全を有する集中治療患者を治療するための、化学療法患者及び炎症性疾患を有する患者を予防するための、及び、大手術後に術後投与するための薬剤の調製のための、１以上の菌株ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ１９、ＤＳＭ１５１５８；ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ２１、ＤＳＭ１５１５９；ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ２６、ＤＳＭ１５１６０；ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ２８、ＤＳＭ１５１６１；ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ２９、ＤＳＭ１５１６２；またはこれらの変異株の使用に関する。

実験
菌株の分離
全ての菌株は若い子供（生後１週間〜１年）の糞便から分離した。糞便試料を希釈溶液（０．９％［ｗ／ｖ］ＮａＣｌ、０．１％［ｗ／ｖ］ペプトン、０．１％［ｗ／ｖ］Ｔｗｅｅｎ８０、０．０２％［ｗ／ｖ］システイン−ＨＣｌ）で連続的に希釈し、次に、ロゴサ寒天平板上に塗抹した。分離株はロゴサ寒天培地（ｐＨ５．４）上でのそれらの増殖能を考慮して選択し、そして、一個体から繰り返し分離した。３７℃で７２時間培養した後、ロゴサ寒天平板から分離株を採取した。これらを、属特異的なＰＣＲ（Roy et al., 2000; FEMS Microbiological Letters 191:17-24）により属レベルまで同定し、次いで、１６ＳｒＤＮＡシークエンスにより種レベルまで同定した（Pettersson et al., 2002; Systematic and Applied Microbiology 23:332-336）。菌株は、サンプリングの間１〜４週間に、同じ個体から少なくとも２回分離され得、これは、菌株が胃腸管（ＧＩ−ｔｒａｃｔ）にコロニーを形成する特定の能力を有することを強く示している。リボタイピング（すなわち、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の制限断片長多型（ＲＦＬＰ）である）により菌株を同定し、次いで、ＲＥＡ（すなわち、制限エンドヌクレアーゼ分析）により同定した。

以下の菌株を分離した。：
１）ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ１９；ロゴサ寒天上で増殖でき、そして、オートミールかゆをある程度まで発酵でき、発酵後は“すっぱい（ｓｏｕｒ）”においを発する。

２）ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＣＵＲＥ２０；ロゴサ寒天上で増殖でき、オートミールかゆをある程度まで発酵でき、発酵後は“すっぱい”においを発する。

３）ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ２１；ロゴサ寒天上で増殖でき、そして、オートミールかゆをある程度まで発酵でき、発酵後は“すっぱい”においを発する。

４）ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＣＵＲＥ２２；ロゴサ寒天上で増殖でき、そして、オートミールかゆをある程度まで発酵でき、発酵後は“よい（ｎｉｃｅ）”においを発する。

５）ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＣＵＲＥ２３；ロゴサ寒天上で増殖でき、そして、オートミールかゆをある程度まで発酵でき、発酵後は“よい”においを発する。

６）ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ２４；ロゴサ寒天上で増殖でき、そして、オートミールかゆをある程度まで発酵でき、発酵後は“よい”においを発する。

７）ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＣＵＲＥ２５；ロゴサ寒天上で増殖でき、そして、オートミールかゆを発酵できる。

８）ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ２６；ロゴサ寒天上で増殖でき、そして、オートミールかゆを発酵できる。

９）ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｅｎｔｉｕｍＣＵＲＥ２７；ロゴサ寒天上で増殖でき、そして、オートミールかゆを発酵できる。

１０）ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ２８；ロゴサ寒天上で増殖でき、そして、オートミールかゆを発酵できる。

１１）ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ２９；ロゴサ寒天上で増殖でき、そして、オートミールかゆを発酵できる。

１２）ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ３０；ロゴサ寒天上で増殖でき、そして、オートミールかゆを発酵できる。

グルタミン産生
以下の手順により、ブロスにおけるグルタミン産生について、分離株１−１２を試験した。

試験菌株を、Matteuzzi et al.（Ann. Microbil. （Inst. Pasteur, 1978, 129 B:175-181））により記載された培地を改良した増殖培地（ブロス）中、３７℃で４日間培養した。ブロスは以下から構成された：酢酸ナトリウム、１０ｇ／ｌ；アスコルビン酸、１０ｇ／ｌ；硫酸アンモニウム（（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４）、５ｇ／ｌ；リン酸水素二カリウム（Ｋ_２ＨＰＯ_４）、３ｇ／ｌ；リン酸二水素カリウム（ＫＨ_２ＰＯ_４）、３ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ、０．３２ｇ／ｌ；ＦｅＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ、０．０１ｇ／ｌ；ＭｎＳＯ_４Ｈ_２Ｏ、０．００７ｇ／ｌ；ＮａＣｌ、０．０１ｇ／ｌ；酵母エキス、０．５ｇ／ｌ；グルコース、２０ｇ／ｌ；Ｔｗｅｅｎ８０、１ｍｌ／ｌ。ｐＨは、オートクレーブの前に１ＭＮａＯＨで６．１８−６．２４に調整した。

ブロス中のグルタミン濃度は、細菌の接種前及び試験菌株の増殖後に測定した。増殖後、培養液を遠心分離し、次いで、無菌的にろ過し、その後、細胞のない上清を−８０℃で冷凍した。スルホサリチル酸を添加し、そして水酸化リチウムでｐＨを調整した後に、アミノ酸を自動アナライザー（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ２０、ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）で分析した。

種々の試験菌株が増殖した後のブロス中のグルタミン及びグルタミン酸濃度の増加を、以下の表１に示す。

全ての試験菌株が幾分かのグルタミンを産生したが、１２の試験菌株のうち７菌株だけが比較的多量のグルタミンを産生した（＞２０μｍｏｌ／ｌ）。２菌株（ＣＵＲＥ２１及びＣＵＲＥ２６）を除く全てにおいて、培地中のグルタミン酸のかなりの減少に伴いグルタミンが増加した。細菌を添加していない培地では、グルタミン酸の平均初期濃度は２２３μｍｏｌ／ｌであり、一方、グルタミン含有量は０であった。ＣＵＲＥ２０、ＣＵＲＥ２３及びＣＵＲＥ２４の３菌株は、培地中の全ての利用可能なグルタミン酸を消費し、一方、ＣＵＲＥ２８では２４７μｍｏｌ／ｌ、ＣＵＲＥ２９では２２０μｍｏｌ／ｌ、ＣＵＲＥ２２では１８７μｍｏｌ／ｌ、ＣＵＲＥ１９では１２８μｍｏｌ／ｌ、ＣＵＲＥ３０では１６０μｍｏｌ／ｌ、ＣＵＲＥ２７では１５１μｍｏｌ／ｌ及びＣＵＲＥ２５では４７μｍｏｌ／ｌでグルタミン酸濃度が減少した。これらの細菌がグルタミン酸をグルタミンに変換したかどうか推測し得る。２つの菌株（ＣＵＲＥ２１及びＣＵＲＥ２６）は培地中のグルタミン酸濃度を全く低下させることなくグルタミンを産生した。他の菌株とは対照的に、それらはブロス中のグルタミン酸濃度を高めた。

アルギニン産生
各試験菌株のアミノ酸産生は、Matteuzzi et al.（1978）により記載された培地を改良した増殖培地（ブロス）中、３７℃で４日間試験菌株を増殖させた後に測定した。該ブロスは以下を含む：酢酸ナトリウム、１０ｇ／ｌ；アスコルビン酸、１０ｇ／ｌ；硫酸アンモニウム（（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４）、５ｇ／ｌ；リン酸水素二カリウム（Ｋ_２ＨＰＯ_４）、３ｇ／ｌ；リン酸二水素カリウム（ＫＨ_２ＰＯ_４）、３ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ、０．３２ｇ／ｌ；ＦｅＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ、０．０１ｇ／ｌ；ＭｎＳＯ_４Ｈ_２Ｏ、０．００７ｇ／ｌ；ＮａＣｌ、０．０１ｇ／ｌ；酵母エキス、０．５ｇ／ｌ；グルコース、２０ｇ／ｌ；Ｔｗｅｅｎ８０、１ｍｌ／ｌ。ｐＨは、オートクレーブ処理の前に１ＭＮａＯＨで６．１８−６．２４に調整した。

該ブロス中のアミノ酸濃度は、細菌を接種する前及び試験菌株の増殖後に測定した。増殖後、培養液を遠心分離し、次いで無菌的にろ過し、続いて細胞のない上清を−８０℃で冷凍した。アミノ酸はスルホサリチル酸を添加し、そして水酸化リチウムでｐＨを調整した後に、自動アナライザー（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ２０、ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）で分析した。

種々の試験菌株の増殖後のブロス中のアルギニン及びシトルリンの濃度の増加を、表２に示す。

１２の試験菌株のうち３株では、アルギニン濃度が１０μｍｏｌ／ｌより多く増加した（すなわち、ＣＵＲＥ１９、ＣＵＲＥ２８及びＣＵＲＥ２９）。前記菌株のうち２つは、シトルリンもかなり多量に産生した（＞１００μｍｏｌ／ｌ）（すなわち、ＣＵＲＥ１９及びＣＵＲＥ２８）。シトルリンはアルギニンの脱アミノ化によって、もしくは、ＮＯ−合成酵素及びＮＯ産生のいずれかによって産生される。シトルリン産生はまた、初期段階におけるアルギニン産生を反映する。

また、試験菌株の増殖中、ブロス中に他のアミノ酸も浸透した（表３参照）。ＣＵＲＥ２１はシトルリンまたはアルギニンのいずれも産生しなかったが、多量のアスパラギン酸及びチロシンを産生した。ＣＵＲＥ２６はシトルリンは全く産生しなかったが、非常に少量のアルギニン、及び、広範囲のスペクトルにおいて種々のアミノ酸を産生した。さらに、ＣＵＲＥ２６は、ブロス中のプロリン濃度を増加させた唯一の試験菌株であった。全ての試験菌株はトレオニンを産生した。

値は、３つまたは２つのそれぞれの培養物由来の３つまたは２つの試料の平均値を表す。

遺伝子型の同定
ＲＥＡ
菌株は、染色体ＤＮＡの切断パターンについて、制限エンドヌクレアーゼ分析−ＲＥＡ−法（Stahl M, Molin G, Persson A, Ahrne S及びStahl S, International Journal of Systematic Bacteriology, 40:189-193, 1990に従う、及び、さらにJohansson, M-L., et al., International Journal of Systematic Bacteriology, 45:670-675, 1995により開発された方法）により試験した。ＲＥＡについて、以下のように概略を示し得る：本研究に伴う菌株由来の染色体ＤＮＡを準備し、次いで、制限エンドヌクレアーゼにより切断した。０．７５μｇの各ＤＮＡは、１０ユニットのＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて、３７℃で４時間それぞれ消化した；各エンドヌクレアーゼは別々に使用した。切断されたＤＮＡ断片は、サブマージ水平型アガロース平板ゲル（ｓｕｂｍｅｒｇｅｄｈｏｒｉｚｏｎｔａｌａｇａｒｏｓｅｓｌａｂｇｅｌｓ）を使用したゲル電気泳動によりサイズについて分離した。ゲルは１５０ｍｌの０．９％アガロースからなり（超純粋ＤＮＡグレード；低電気浸透（ｌｏｗｅｌｅｃｔｒｏｅｎｄｏｏｓｍｏｓｉｓ）；ＢｉｏＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＭＤ，ＵＳＡ）、そして平板ゲルとしてキャストされた（１５０×２３５ｍｍ）。０．２μｇの高分子量ＤＮＡマーカー（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＭＤ，ＵＳＡ）は、０．５μｇのＤＮＡ分子量マーカーＶＩ（Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に、スタンダードとして使用した。フィコールローディングバッファー（Ｆｉｃｏｌｌｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ）（２ｇのフィコール、８ｍｌの水、０．２５％のブロムフェノール）中で試料のＤＮＡをアプライすることにより、最小のバンドの歪みと最大の鮮明さを達成した。

約６−８℃で１８時間、４０Ｖの一定圧でゲルを泳動した。泳動中に、バッファー（８９ｍＭＴｒｉｓ、２３ｍＭＨ_３ＰＯ_４、２ｍＭＥＤＴＡナトリウム、ｐＨ８．３）を再循環させた。その後、ゲルをエチジウムブロマイド（２μｇ／ｍｌ）で２０分間染色し、次いで蒸留水で汚れを落とし、ＵＶトランスイルミネーター（ＵＶＰＩｎｃ．，ＳａｎＧａｂｒｉｅｌ，ＵＳＡ）により３０２ｎｍで可視化し、そして写真を撮った。ゲル電気泳動を行うこの方法では、分子量１．２×１０^６に至るまで良好に分散し及び比較的良好に分離されたバンドが得られる。

１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＲＦＬＰ（リボタイピング）
染色体の調製及び染色体ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ分析は、先に述べたように行った（Stahl et al., 1990, Stahl et al., 1994）。

プローブはＬ．ｃａｓｅｉｓｐｐ．ｐｓｅｕｄｏｐｌａｎｔａｒｕｍＤＳＭ２０００８の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の４２０ｂｐの断片（Ｅ.ｃｏｌｉ番号付けで、位置５０６〜９２６）であり、これは、ＰＣＲにより得られ、製造業者（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｂｒｏｍｍａ，Ｓｗｅｄｅｎ）により供給される使用説明書に従ったＤＩＧＤＮＡ標識技術により標識した。反応に使用したプローブ量は５０ｎｇであった。

サザンブロットハイブリダイゼーション．１μｇの染色体ＤＮＡを１０ＵのＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）で３７℃で４時間消化した。アガロースゲル電気泳動による制限断片の分離は、Stahl et al., 1994に従って行った。ＤＩＧ−標識分子量ＤＮＡマーカーＩＩ及び分子量ＤＮＡマーカーＶＩは、スタンダードとして使用した（Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。ＤＮＡは、正に帯電したナイロン膜（Ｒｏｃｈｅ）上に１２０℃で３０分間ベーキングすることにより固定した。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション及び基質ＣＳＰＧ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ）を使用したケモルミネッセント検出は、製造業者により提供される使用説明書に従って行った。ハイブリダイゼーション温度は６８℃であった。試験の結果、染色体ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで切断した場合、全ての菌株（ＣＵＲＥ１９、２１、２６、２８及び２９）において、分子量約２８４０ｋｂの１つのシングルバンドが生じた。染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断した場合、菌株ＣＵＲＥ２１及び２６において、分子量約８９５ｋｂのシングル断片上に１６ＳｒＲＮＡに関する遺伝子が存在し、一方、分子量約３４２０ｋｂのもう１つのシングルバンドが、ＣＵＲＥ１９、２８及び２９において得られた。

ｉｎｖｉｖｏでの試験
試験１．ラットの大腸炎を誘発するＤＤＳに対するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株の影響
本研究の目的は、ラットの大腸炎を誘発するＤＤＳ（デキストラン硫酸ナトリウム（Dextran Sodium Sulfate））に対するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株の効果を比較することであった。

ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙラットを６つの群に分け、１つは対照群（細菌を投与しない大腸炎）、そして、５つの群は異なる細菌株（それぞれ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ２９９ｖ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ８７００：２、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉＬＧ１、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ３Ｂ１及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ１９）を投与した。大腸炎を誘発する前に、細菌株を７日間経口投与し（０日）、そして、ＤＤＳ（５％ｗ／ｖとなるよう水に溶解）と組み合わせて連続的に７日間投与した。大腸炎の程度は毎日ＤＡＩ（疾患活動指数（ＤｉｓｅａｓｅＡｃｔｉｖｉｔｙＩｎｄｅｘ））で決定した。サンプリングは１４日間行い、そして、腸における細菌の移動や量を測定した。

Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ２９９ｖ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ３Ｂ１及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＣＵＲＥ１９を投与した群において、ＤＡＩは、対照群と比較して、４、５、６及び７日目に有意に減少した。さらに、６及び７日後、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ８７００：２及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉＬＧ１を受けた群と比較して、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ１９を受けた群ではＤＡＩが有意に低下した。対照の大腸炎と比較すると、腸間膜リンパ節への細菌のトランスロケーションは、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅの肝臓への移動と同様に、全ての群において有意に低下した。

結論として、細菌株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ２９９ｖ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ８７００：２、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉＬＧ１、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ３Ｂ１及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ１９を経口投与すると、ラットにおける実験的な大腸炎でのトランスロケーションを減少することによって、ポジティブな効果を及ぼし得る。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ２９９ｖ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ３Ｂ１及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ１９は、ＤＤＳにより誘発された大腸炎のラットのＤＡＩを向上する上で、最も顕著な効果を示した。ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ１９は、投与後６日目及び７日目に、大腸炎を抑制する上で他のものより多少効果的であった。図６を参照のこと。

試験２．経口投与後の胃腸管におけるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及び／またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの生存
ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓまたはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを経口投与すると種々のポジティブな効果がもたらされ、例えば、抗生物質が関与した下痢を予防する（D’ Souza et al., 2002, BMJ 324:1361）。

細菌が経口投与で生存し、そして、腸内で生存及び増殖する能力を有する場合に、ポジティブな効果が達成され得る。プロバイオティクスとして使用し得る適切な菌株を見出すために、多数の可能な見込みのありそうな菌株を健康な被験体に経口投与する。糞便中の投与した菌株の割合を測定することにより、高い生存能を有する菌株を同定した。本研究の目的は、ヒトの胃腸管内で生存及び増殖するための優れた能力を有している経口投与が可能な菌株を見出すことである。

本願の構想
４週間、１４のボランティアの被験体に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの約２０の種々の菌株の混合物を飲ませる。全ての菌株は、ヒトまたは乳酸産生食品に生息する代表的な菌株である。糞便の採取は投与前、投与した３週間後、そして、投与後の１週間に行う。細菌フローラは生菌数測定及びＲＡＰＤ（ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲａｎｄｏｍｌｙＡｍｐｌｉｆｉｅｄＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ）；Johansson et al., 1995）により決定する。

結論
選択した菌株（すなわち、ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ１９、ＤＳＭ１５１５８；ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＣＵＲＥ２１、ＤＳＭ１５１５９；ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ２６、ＤＳＭ１５１６０；ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ２８、ＤＳＭ１５１６１；及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ２９、ＤＳＭ１５１６２）は、経口投与した後、胃腸管を通過して生存し得るという結果を示している。ラットにおける研究はまた、実験的な大腸炎に対してポジティブな効果を発揮する可能性があることも示している。

図１は、染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩでそれそれ切断し、そして、サザンブロットハイブリダイゼーションを利用して、Ｌ．ｃａｓｅｉｓｕｂｓｐ．ｐｓｅｕｄｏｐｌａｎｔａｒｕｍＤＳＭ２０００８の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤＩＧ標識した４２０ｂｐ断片プローブ（Ｅ.ｃｏｌｉ番号付けで位置５０６〜９２６）とハイブリダイゼーションすることにより得た菌株ＣＵＲＥ１９、ＣＵＲＥ２１、ＣＵＲＥ２６、ＣＵＲＥ２８及びＣＵＲＥ２９に関して、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）で得た電気泳動パターンの略図である。Ｄｉｇ標識分子量ＤＮＡマーカーＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）及び分子量ＤＮＡマーカーＶＩ（Ｒｏｃｈｅ）はスタンダードとして使用した。図２は、菌株ＣＵＲＥ１９（レーン１）、ＣＵＲＥ２９（レーン２）及びＣＵＲＥ２８（レーン３）の染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（制限エンドヌクレアーゼ分析、ＲＥＡ）で切断することにより得た分離したＤＮＡ断片の写真を示す。高分子量ＤＮＡマーカー（ＢＲＬ）及びＤＮＡ分子量マーカーＶＩ（Ｒｏｃｈｅ）をスタンダードとして使用した（レーン４）。図３は、菌株ＣＵＲＥ１９（レーン２）、ＣＵＲＥ２８（レーン３）及びＣＵＲＥ２９（レーン４）の染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断することにより得た分離したＤＮＡ断片の写真を示す。高分子量ＤＮＡマーカー（ＢＲＬ）及びＤＮＡ分子量マーカーＶＩ（Ｒｏｃｈｅ）をスタンダードとして使用した（レーン１及び５）。図４は、菌株ＣＵＲＥ２１（レーン１）及びＣＵＲＥ２６（レーン２）の染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断することにより得た分離したＤＮＡ断片の写真を示す。高分子量ＤＮＡマーカー（ＭＤ、ＵＳＡ）及びＤＮＡ分子量マーカーＶＩ（Ｒｏｃｈｅ）をスタンダードとして使用した（レーン３）。図５は、菌株ＣＵＲＥ２１（レーン２）及びＣＵＲＥ２６（レーン３）の染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断することにより得た分離したＤＮＡ断片の写真を示す。高分子量ＤＮＡマーカー（ＭＤ、ＵＳＡ）及びＤＮＡ分子量マーカーＶＩ（Ｒｏｃｈｅ）をスタンダードとして使用した（レーン１及び４）。図６．４、５、６及び７日目の疾患活動指数。＊は大腸炎コントロールと比較してｐ＜０．０５を意味する。

はＬ．ｇａｓｓｅｒｉと比較してｐ＜０．０５を意味し、＃はＬ．ｐａｒａｃａｓｉｅと比較してｐ＜０．０５を意味する。

Claims

腸管内で生存する、及び、ｉｎｖｉｖｏでグルタミンを産生する能力を有するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓ菌株であって、当該菌株がＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ１９、ＤＳＭ１５１５８、ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ２１、ＤＳＭ１５１５９、ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ２６、ＤＳＭ１５１６０、ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ２８、ＤＳＭ１５１６１、及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ２９、ＤＳＭ１５１６２からなる群から選択される、菌株。
腸管内で生存する、及び、ｉｎｖｉｖｏでグルタミン及びアルギニンを産生する能力を有するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓ菌株であって、当該菌株がＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ１９、ＤＳＭ１５１５８、ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ２８、ＤＳＭ１５１６１、及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ２９、ＤＳＭ１５１６２からなる群から選択される、菌株。
アンモニアを同化する能力を有する請求項１または２に記載のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓ菌株。
担体と組み合わせた請求請１−３のいずれか１項に記載の１菌株以上のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓを含む組成物。
担体がオートミールかゆであることを特徴とする請求項４に記載の組成物。
組成物が食物繊維も含有することを特徴とする請求項４に記載の組成物。
組成物が食品組成物であることを特徴とする請求項４に記載の組成物。
組成物が薬学的組成物であることを特徴とし、ここで、担体が治療的に許容される担体であることを特徴とする請求項４に記載の組成物。
組成物が１以上のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌株もまた含有することを特徴とする請求項４に記載の組成物。
薬剤として使用するための請求項１または２に記載の１以上のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株。
多臓器不全及び腸不全を有する患者の集中治療処理のための、化学療法患者及び炎症性疾患を有する患者における予防のための、または大手術後の術後投与のための薬剤を調製するための、腸管内で生存し及びｉｎｖｉｖｏでグルタミンを産生する能力を有する１以上の菌株ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ１９、ＤＳＭ１５１５８、ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ２１、ＤＳＭ１５１５９、ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ２６、ＤＳＭ１５１６０、ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ２８、ＤＳＭ１５１６１、またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓＣＵＲＥ２９、ＤＳＭ１５１６２の使用。