CN103981123A - 含有植物乳杆菌、乳双歧杆菌的益生菌剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含有植物乳杆菌、乳双歧杆菌的益生菌剂及其制备方法，属于饲料微生物技术领域。所述益生菌剂采用植物乳杆菌HM-10和乳双歧杆菌V9进行固态发酵豆粕、麸皮和玉米粉，从而制备一种益生菌剂，具有特殊的酸香味，含有的活菌数高，同时豆粕、麸皮、玉米粉中蛋白质的降解率也得以提高；此方法还具有生产成本低、操作简单的特点。采用混菌分段固态发酵，能够利用菌株间的互利共栖协同作用，提高产率和菌体浓度；本发明利用发酵前期植物乳杆菌HM-10的生长、增殖及新陈代谢能够为乳双歧杆菌V9的增殖提供丰富的营养物质及必要的厌氧环境，而助于乳双歧杆菌V9的生长，且植物乳杆菌HM-10的活菌数量也有所增加。

Description

含有植物乳杆菌、乳双歧杆菌的益生菌剂及其制备方法

技术领域

本发明属于饲料微生物技术领域，涉及一种以豆粕、麸皮、玉米粉为基质，应用固态发酵技术制备含有植物乳杆菌和乳双歧杆菌的益生菌剂。 

背景技术

目前，益生菌制品多采用益生菌直接与液态牛乳和豆乳发酵，得到功能性的酸牛奶或者酸豆奶，其余则采用液态发酵，直接收集益生菌菌体，制作成益生菌粉剂、片剂或者胶囊。采用液态发酵会产生大量的废水，对环境污染较大，后处理比较困难，机器设备操作繁琐。由于益生菌能够改善宿主微生态平衡，提高宿主健康水平和健康状态的活菌制剂及代谢产物，因此，现在对益生菌的研究已经非常深入和细致化，并且已经广泛应用于工业、农业、环保、家庭等各个项领域。 

现将益生菌制品应用于动物微生物制剂、添加至动物饲料中也已较为常见；例如，名称为《一种有效预防及改善牛乳房炎的复合乳酸菌微生态制剂》的中国专利，申请号为201310094615.0，该专利公开一种预防及改善牛乳房炎的复合微生态制剂，该复合微生态制剂中干酪乳杆菌HM-09(L.casei HM-09)质量分数为10%，植物乳杆菌HM-10（L.plantarum HM-10）质量分数为10%，其余80%为沸石粉，同时复合微生态制剂中L.casei HM-09活菌数量≥2.5×10⁸cfu/g，L.plantarum HM-10活菌数量≥2.5×10⁸cfu/g；所述干酪乳杆菌和植物乳杆菌已于2012年10月29日在地址为北京市大屯路，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，干酪乳杆菌HM-09(L.casei HM-09)保藏号：CGMCC No.6736；植物乳杆菌HM-10（L.plantarum HM-10）保藏号：CGMCC No.6741。名称为《用于饲料添加剂益生菌固体发酵的干酪乳杆菌、动物双歧杆菌、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌》的发明专利，申请号为01310321977.9，该发明公开了用于饲料添加剂益生菌固体发酵的干酪乳杆菌、动物双歧杆菌、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌HM-66、干酪乳杆菌F-08、植物乳杆菌HM-20和动物双歧杆菌乳亚种V9保藏号分别为CGMCCNo.6733、CGMCCNo.6735、CGMCCNo.6744和CGMCCNo.5470，其中动物双歧杆菌乳亚种V9于2011年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，其他菌株于2012年10月29日保藏；本发明还公开了其应用方法。 

由上述专利文献中所述，在制备发酵饲料时目前多采用固态发酵法，固态发酵法 虽克服了传统液态发酵制作饲料时存在的成本高、环境污染高、后处理困难、机器设备操作繁琐等缺陷，但由于同时将益生菌剂加入混合发酵，如果菌种选用不当，易造成菌种之间的竞争性排斥，影响发酵制品中有益成分的彻底分解，降低饲料的利用率，增大成本，并且不利于机体吸收。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）HM-10和乳双歧杆菌（Bifidobacterium animalis subsp.lactis）V9进行分段固态发酵豆粕、麸皮和玉米粉，从而制备一种含有植物乳杆菌HM-10、乳双歧杆菌V9的益生菌剂，所述益生菌剂具有特殊的酸香味，含有的活菌数高，同时豆粕、麸皮、玉米粉中蛋白质的降解率也得以提高；此方法还具有生产成本低、操作简单的特点。 

本发明是通过下述技术方案实现的： 

一种含有植物乳杆菌、乳双歧杆菌的益生菌剂，其制备方法包括如下步骤： 

种子液的制备：将接有植物乳杆菌HM-10与乳双歧杆菌V9的种子培养基于恒温箱中37℃静置培养24h； 

所述植物乳杆菌HM-10和乳双歧杆菌V9的种子培养基为：蛋白胨1%，葡萄糖2%，加水至100%，pH7.0-7.2。 

发酵培养条件：将植物乳杆菌HM-10种子液添加到固体培养基中进行混合、发酵，控制发酵温度为34-38℃，湿度在45-55%，初始pH6.8-7.2，发酵6-12h后添加乳双歧杆菌V9种子液继续发酵22-26h，控制发酵温度为32-36℃，湿度在50-55%；发酵结束其游离氨基态氮含量在260umol/g以上； 

所述固体发酵培养基为：29%豆粕，29%麸皮，2%玉米粉，水分含量40%。 

所述植物乳杆菌HM-10种子液的添加量为固体培养基总重量的5-8%，乳双歧杆菌V9种子液的添加量为固体培养基总重量的2-5%。 

所制备益生菌剂中植物乳杆菌HM-10活菌数为（2.27-2.98）×10⁹CFU/g，乳双歧杆菌V9活菌数为（5.81-7.46）×10⁸CFU/g。 

本发明产品在饲料中的添加量为30-60g/kg。 

有益效果 

本发明采用植物乳杆菌HM-10和乳双歧杆菌V9对豆粕、麸皮和玉米粉进行分段固态发酵，生产成本低、处理方便，污染小，易操作，可广泛应用于微生态领域的益生菌固体发酵技术；采用植物乳杆菌HM-10进行前期发酵，可以产生乳酸及乙酸等酸味 小分子物质，这些小分子物质赋予产品特有的酸香味、色泽和口感，提高了发酵产品的适口性；乳双歧杆菌V9具有优异的抗胃肠道消化液耐受能力；能够有效拮抗肠道致病菌，提高肠道抗致病菌感染能力；有效预防缓解腹泻、便秘、腹痛、腹胀等肠易激综合症。 

采用混菌分段固态发酵，能够利用菌株间的互利共栖协同作用，提高产率和菌体浓度；本发明利用发酵前期植物乳杆菌HM-10的生长、增殖及新陈代谢能够为乳双歧杆菌V9的增殖提供丰富的营养物质及必要的厌氧环境，有助于乳双歧杆菌V9的生长，且植物乳杆菌HM-10的活菌数量也有所增加。同时，多菌株的产酶、产酸和产营养物质能力、对基质的分解能力等要显著优于单菌发酵；混菌分段固态发酵还具有获得纯种发酵无法获得的产物，其生长速度快，对底物利用率高，可多级转化，发酵后的微生物群体稳定，省工节能，简化工艺及发酵设备和易控制等诸多优点，且不易染菌。 

本发明产品对反刍动物具有特殊的功能，可促进瘤胃微生物生长繁殖，加速蛋白质合成，提高饲料利用率；将本发明产品使用在奶牛饲料中，可有效预防及改善牛乳房炎，减少应激反应，同时能够增强动物机体免疫，有效降低患乳房炎牛乳中的体细胞数，提高牛奶品质。 

具体实施方式

下面结合实例，对本发明进一步说明，下述实例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实例来限定本发明的保护范围。 

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)HM-10，于2012年10月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号：CGMCC No.6741。所述乳双歧杆菌为动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)V9，于2011年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏号：CGMCC No.5470。 

实施例1 

一种含有植物乳杆菌、乳双歧杆菌的益生菌剂，其制备方法包括如下步骤： 

种子液的制备：将植物乳杆菌HM-10，乳双歧杆菌V9分别从冻藏的甘油管中接种至装有液体种子培养基的瓶中，于恒温箱中37℃静置培养24h； 

植物乳杆菌HM-10和乳双歧杆菌V9的种子培养基为：蛋白胨1%，葡萄糖2%， 加水至100%，pH7.0-7.2。 

发酵培养条件：将植物乳杆菌HM-10种子液添加到固体培养基中进行混合、发酵，控制发酵温度为36℃，湿度在50%，初始pH7.0，发酵8h后添加乳双歧杆菌V9种子液继续发酵24h，控制发酵温度为34℃，湿度在52%；发酵结束其游离氨基态氮含量在278umol/g； 

固体发酵培养基为：29%豆粕，29%麸皮，2%玉米粉，水分含量40%。 

植物乳杆菌HM-10种子液的添加量为固体培养基总重量的7%，乳双歧杆菌V9种子液的添加量为固体培养基总重量的3.5%。 

所制备益生菌剂中植物乳杆菌HM-10活菌数为2.27×10⁹CFU/g，乳双歧杆菌V9活菌数为5.81×10⁸CFU/g。 

本发明产品在饲料中的添加量为45g/kg。 

实施例2 

一种含有植物乳杆菌、乳双歧杆菌的益生菌剂，其制备方法包括如下步骤： 

种子液的制备：将接有植物乳杆菌HM-10与乳双歧杆菌V9的种子培养基于恒温箱中37℃静置培养24h； 

植物乳杆菌HM-10和乳双歧杆菌V9的种子培养基为：蛋白胨1%，葡萄糖2%，加水至100%，pH7.0-7.2。 

发酵培养条件：将植物乳杆菌HM-10种子液添加到固体培养基中进行混合、发酵，控制发酵温度为34℃，湿度在55%，初始pH7.2，发酵12h后添加乳双歧杆菌V9种子液继续发酵22h，控制发酵温度为32℃，湿度在55%；发酵结束其游离氨基态氮含量在275umol/g； 

固体发酵培养基为：29%豆粕，29%麸皮，2%玉米粉，水分含量40%。 

植物乳杆菌HM-10种子液的添加量为固体培养基总重量的8%，乳双歧杆菌V9种子液的添加量为固体培养基总重量的2%。 

所制备益生菌剂中植物乳杆菌HM-10活菌数为2.98×10⁹CFU/g，乳双歧杆菌V9活菌数为6.92×10⁸CFU/g。 

本发明产品在饲料中的添加量为30g/kg。 

实施例3 

一种含有植物乳杆菌、乳双歧杆菌的益生菌剂，其制备方法包括如下步骤： 

种子液的制备：将接有植物乳杆菌HM-10与乳双歧杆菌V9的种子培养基于恒温箱中37℃静置培养24h； 

植物乳杆菌HM-10和乳双歧杆菌V9的种子培养基为：蛋白胨1%，葡萄糖2%，加水至100%，pH7.0-7.2。 

发酵培养条件：将植物乳杆菌HM-10种子液添加到固体培养基中进行混合、发酵，控制发酵温度为38℃，湿度在45%，初始pH6.8，发酵6h后添加乳双歧杆菌V9种子液继续发酵26h，控制发酵温度为36℃，湿度在50%；发酵结束其游离氨基态氮含量在289umol/g； 

固体发酵培养基为：29%豆粕，29%麸皮，2%玉米粉，水分含量40%。 

植物乳杆菌HM-10种子液的添加量为固体培养基总重量的5%，乳双歧杆菌V9种子液的添加量为固体培养基总重量的5%。 

所制备益生菌剂中植物乳杆菌HM-10活菌数为2.73×10⁹CFU/g，乳双歧杆菌V9活菌数为7.46×10⁸CFU/g。 

本发明产品在饲料中的添加量为50g/kg。 

实施例4 

一种含有植物乳杆菌的益生菌剂，其制备方法包括如下步骤： 

种子液的制备：将接有植物乳杆菌HM-10的种子培养基于恒温箱中37℃静置培养24h； 

植物乳杆菌HM-10种子培养基为：蛋白胨1%，葡萄糖2%，加水至100%，pH7.0-7.2。 

发酵培养条件：将植物乳杆菌HM-10添加到固体培养基中进行混合、发酵，控制温度为37℃，湿度在55%，初始pH7.0，持续发酵48h；发酵结束其游离氨基态氮含量在202umol/g； 

固体发酵培养基为：29%豆粕，29%麸皮，2%玉米粉，水分含量40%。 

植物乳杆菌HM-10种子液的添加量为固体培养基总重量的5%。 

所制备益生菌剂中植物乳杆菌HM-10活菌数为1.55×10⁹CFU/g。 

使用效果实验 

奶牛选自北京奶牛中心良种场，选择年龄、胎次、距离分娩期两个月的中国荷斯坦奶牛100头，随机分成2组，每组50头。试验组日粮中添加实施例1制得的本发明产品45g/kg，对照组为日常日粮。 

试验地点和时间：本试验在奶牛中心良种场进行;试验期(2013年5月1日至7月1日)。 

试验方法及饲养管理在试验过程中，对照组奶牛日粮按原配方进行。其饲料成分、比例及饲喂量与试验前一致;试验组从分娩前两个月开始在原来日粮的基础上添加本 发明产品。其余与对照组一致。每日3次，定时饲喂，自由饮水，先喂粗饲料，后喂精料。 

测定项目及记录；每日观察试验奶牛的食欲，记录分娩牛的泌乳量及分娩后初生牛犊的重量，并检测分娩后牛的健康状况。结果如表所示： 

项目	试验组	对照组
			日泌乳量（kg）	36.98	28.76
牛犊均重（kg）	85	76
			患乳房炎牛（头）	3	13

实验证明，使用本发明产品的奶牛乳房炎发病率比试验组降低20%，初生牛犊体重高，并且奶牛的日泌乳量高于对照组。 

Claims (8)

1.一种含有植物乳杆菌、乳双歧杆菌的益生菌剂，由以下方法制备：

种子液的制备：将接有植物乳杆菌HM-10与乳双歧杆菌V9的种子培养基于恒温箱中37℃静置培养24h；

所述植物乳杆菌HM-10和乳双歧杆菌V9的种子培养基为：蛋白胨1%，葡萄糖2%，加水至100%，pH7.0-7.2；

发酵培养条件：将植物乳杆菌HM-10种子液添加到固体培养基中进行混合、发酵，控制发酵温度为34-38℃，湿度在45-55%，初始pH6.8-7.2，发酵6-12h后添加乳双歧杆菌V9种子液继续发酵22-26h，控制发酵温度为32-36℃，湿度在50-55%；发酵结束其游离氨基态氮含量在260umol/g以上；

所述植物乳杆菌HM-10保藏编号为CGMCC No.6741，乳双歧杆菌的保藏编号为CGMCCNo.5470。

2.根据权利要求1所述的一种含有植物乳杆菌、乳双歧杆菌的益生菌剂，其特征在于，所述固体发酵培养基为：29%豆粕，29%麸皮，2%玉米粉，水分含量40%。

3.根据权利要求1所述的一种含有植物乳杆菌、乳双歧杆菌的益生菌剂，其特征在于，所述植物乳杆菌HM-10种子液的添加量为固体培养基总重量的5-8%，乳双歧杆菌V9种子液的添加量为固体培养基总重量的2-5%。

4.根据权利要求3所述的一种含有植物乳杆菌、乳双歧杆菌的益生菌剂，其特征在于，植物乳杆菌HM-10种子液的添加量为固体培养基总重量的7%，乳双歧杆菌V9种子液的添加量为固体培养基总重量的3.5%。

5.一种含有植物乳杆菌、乳双歧杆菌的益生菌剂的制备方法，包括如下步骤：

种子液的制备：将接有植物乳杆菌HM-10与乳双歧杆菌V9的种子培养基于恒温箱中37℃静置培养24h；

所述植物乳杆菌HM-10和乳双歧杆菌V9的种子培养基为：蛋白胨1%，葡萄糖2%，加水至100%，pH7.0-7.2；

发酵培养条件：将植物乳杆菌HM-10种子液添加到固体培养基中进行混合、发酵，控制发酵温度为34-38℃，湿度在45-55%，初始pH6.8-7.2，发酵6-12h后添加乳双歧杆菌V9种子液继续发酵22-26h，控制发酵温度为32-36℃，湿度在50-55%；发酵结束其游离氨基态氮含量在260umol/g以上；

所述固体发酵培养基为：29%豆粕，29%麸皮，2%玉米粉，水分含量40%；

所述植物乳杆菌HM-10保藏编号为CGMCC No.6741，乳双歧杆菌的保藏编号为CGMCCNo.5470。

6.根据权利要求5所述的一种含有植物乳杆菌、乳双歧杆菌的益生菌剂的制备方法，其特征在于，所述植物乳杆菌HM-10种子液的添加量为固体培养基总重量的5-8%，乳双歧杆菌V9种子液的添加量为固体培养基总重量的2-5%。

7.根据权利要求6所述的一种含有植物乳杆菌、乳双歧杆菌的益生菌剂的制备方法，其特征在于，植物乳杆菌HM-10种子液的添加量为固体培养基总重量的7%，乳双歧杆菌V9种子液的添加量为固体培养基总重量的3.5%。

8.根据权利要求5所述的一种含有植物乳杆菌、乳双歧杆菌的益生菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

种子液的制备：将植物乳杆菌HM-10，乳双歧杆菌V9分别从冻藏的甘油管中接种至装有液体种子培养基的瓶中，于恒温箱中37℃静置培养24h；

植物乳杆菌HM-10和乳双歧杆菌V9的种子培养基为：蛋白胨1%，葡萄糖2%，加水至100%，pH7.0-7.2；

发酵培养条件：将植物乳杆菌HM-10种子液添加到固体培养基中进行混合、发酵，控制发酵温度为36℃，湿度在50%，初始pH7.0，发酵8h后添加乳双歧杆菌V9种子液继续发酵24h，控制发酵温度为34℃，湿度在52%；发酵结束其游离氨基态氮含量在278umol/g；

固体发酵培养基为：29%豆粕，29%麸皮，2%玉米粉，水分含量40%；

植物乳杆菌HM-10种子液的添加量为固体培养基总重量的7%，乳双歧杆菌V9种子液的添加量为固体培养基总重量的3.5%。