CN104906143A

CN104906143A - 一种灭活的乳酸菌液体制剂及其制备方法

Info

Publication number: CN104906143A
Application number: CN201510259592.3A
Authority: CN
Inventors: 张家学; 王蔚淼; 齐振雄
Original assignee: QINGYUAN HAIBEI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: QINGYUAN HAIBEI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2015-05-19
Filing date: 2015-05-19
Publication date: 2015-09-16
Anticipated expiration: 2035-05-19
Also published as: CN104906143B

Abstract

本发明针对灭活乳酸菌制剂成本高、有效成分能回收率低的技术问题，提供一种稳定高效且成本低的灭活乳酸菌液体制剂，选用甜菜碱盐酸盐、氨基葡萄糖盐酸盐、γ-氨基丁酸等酸性添加剂作为灭活剂，这种灭活方式的成本显著低于其他灭活方式，在灭活乳酸菌的细胞回收率、对人体癌细胞的粘附性能、促进动物生长等生理活性方面显著优于热灭活乳酸菌制剂，且其生产成本显著降低，提高灭活乳酸菌制剂的性价比。

Description

一种灭活的乳酸菌液体制剂及其制备方法

【技术领域】

本发明涉及一种人用或饲用微生态制剂，具体涉及一种灭活的乳酸菌液体制剂及其制备方法，属于微生态制剂领域。

【背景技术】

随着人们对食品安全问题和养殖环境问题的重视，养殖过程中滥用抗生素的种种弊端得到广泛关注。自从欧盟全面禁止抗生素作为饲料添加剂后，相关替代品得到广泛研究，微生态制剂就是其中最重要的研究方向之一。

微生态制剂是一种由有益微生物及其代谢产物组成的，具有改善人和动物肠道微生态平衡，提高人和动物免疫能力，提升人和动物健康状况的产品。目前微生态制剂已经广泛应用于人和动物肠道保健和辅助治疗领域，其中乳酸菌是目前研究和应用最多的菌株。其作用主要包括：(1)竞争性粘附，通过在肠道与特定的位点结合，形成生物保护膜，阻碍病原菌的定植；(2)抑菌效应，如乳酸菌能产生类似抗生素的物质，杀灭病原菌，而且在发酵过程中产生酸性物质能降低肠道pH，抑制病原菌生长；(3)免疫活性功能，益生菌能分泌特定物质或其细胞表面存在特定的抗原物质，能激发人或动物的免疫系统。

尽管微生态制剂的效果已经被广泛认可，但是活菌型微生态制剂特别是乳酸菌制剂在生产转化过程中还存在许多不稳定的因素。首先普通的乳酸菌活菌制剂在保存过程中容易失活和变质，导致使用效果不稳定，或者需要低温保存不便于流通。其次乳酸菌活菌抗逆性较差，在饲料加工过程中会大量灭活，并且在饲料流通过程中活菌还会进一步衰减，进而影响产品使用效果。另外在环境中长期使用同一种活菌制剂，导致噬菌体感染与暴发的风险增加，进而影响活菌产品的使用效果。

已有大量研究表明，乳酸菌的死菌体也能发挥活菌制剂的部分功能，而且还存在一定的剂量相关性。因此灭活乳酸菌制剂为微生态制剂的产业化提供另外一个相对稳定的方向。

目前灭活制剂的制备工艺多采用热灭活或冷冻灭活或直接用有一定毒性的化学物质灭活，然后再通过冷冻干燥的方式制备固体制剂。例如申请号为200810068138.X、发明名称为“灭活的乳酸菌微生态制剂及其制备方法”的中国专利中公开了一种灭活乳酸菌制剂的制备方法，其中灭活的方法为热灭活、冷冻灭活和甲醛灭活等，在灭活后采用了冷冻干燥方法，制备冻干粉，在批量生产时，热灭活和冷冻灭活过程中均会出现菌体裂解和活性成分降低的情况，而且灭活成本相对较高，而专利中所述的化学灭活方法是采用甲醛等杀菌剂进行灭活，产品的安全性没有保证，此外乳酸菌灭活后采用浓缩后冷冻干燥的方法经行制备，成本较高。另外在韩国细胞生物技术公司的专利(申请号为：201180004722.9)中也是采用热灭活的处理方式，然后在进行离心浓缩和冷冻干燥处理。日本好侍健康食品株式会社的专利(申请号为：200910206343.2)也采用热灭活工艺。

综上所述，目前灭活乳酸菌制剂的灭活工艺普遍采用成本较高的灭活方式，而且固体剂型均是高成本的冻干工艺，此外在干燥过程中乳酸菌挥发性物质损失严重，这大大降低了该类产品的竞争力。

【发明内容】

针对上述灭活乳酸菌制剂成本高、有效成分能回收率低的问题，本发明的目的是提供一种稳定高效且成本低的灭活乳酸菌液体制剂。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种灭活的乳酸菌液体制剂，包含如下质量配比的组分：具有灭活功能的添加剂2～4份、乳酸菌发酵液96～98份，其中，乳酸菌细胞含量为10⁹～10¹⁰个/mL。

优选的，所述乳酸菌选自植物乳杆菌、干酪乳杆菌、戊糖片球菌、粪链球菌、嗜酸乳杆菌中的一种或多种。

优选的，所述具有灭活功能的添加剂为酸性添加剂。

所述具有灭活功能的添加剂为甜菜碱盐酸盐、氨基葡萄糖盐酸盐、γ-氨基丁酸中的一种或多种。

本发明的另一目的在于提供一种上述灭活乳酸菌液体制剂的制备方法。

一种灭活乳酸菌液体制剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)菌种的制备：配置MRS液体培养基，调节pH为6.2～6.4，115℃灭菌20分钟，冷却至37℃，然后将乳酸菌接种至液体MRS培养基中，37℃静置培养16～18小时，即获得乳酸菌的液体种子；

(2)乳酸菌发酵液的制备：配置液体MRS培养基，调节pH为6.2～6.4，115℃灭菌20分钟，冷却至37℃，按照0.1％～0.2％的体积比接入步骤(1)得到的乳酸菌菌种，37℃，不通气，50rpm搅拌培养36～48小时，当发酵液pH达到4.5以下，OD_600nm达到4.0以上时发酵结束，即获得乳酸菌发酵液；

(3)灭活处理：在步骤(2)得到的发酵液中加入酸性灭活添加剂，边搅拌边添加，添加完毕后，将发酵液pH调节至1.5-2.5，持续搅拌5分钟即可；

(4)灌装：在洁净的条件下将步骤(3)得到的灭活乳酸菌液体灌装至指定容器，密封即可。

优选的，所述步骤(1)中的乳酸菌选自植物乳杆菌、干酪乳杆菌、戊糖片球菌、粪链球菌、嗜酸乳杆菌中的一种或多种。

优选的，所述步骤(2)中的酸性灭活添加剂为甜菜碱盐酸盐、氨基葡萄糖盐酸盐、γ-氨基丁酸中的一种或多种。

优选的，所述步骤(2)中的酸性灭活添加剂的质量分数最好为2-4％。

本发明的有益效果在于：本发明的灭活乳酸菌液体制剂不仅具有活的乳酸菌制剂相同的功效，而且还复合其他添加剂的保健和促生长的功能。选用甜菜碱盐酸盐、氨基葡萄糖盐酸盐、γ-氨基丁酸等酸性添加剂作为灭活剂，这种灭活方式的成本显著低于其他灭活方式，在灭活乳酸菌的细胞回收率、对人体癌细胞的粘附性能、促进动物生长等生理活性方面显著优于热灭活乳酸菌制剂，且其生产成本显著降低，提高灭活乳酸菌制剂的性价比。

【具体实施方式】

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。在未作说明的情况下，本发明中所涉及到的方法均为常规方法，所涉及到的原料均为市售产品。

实施例1灭活干酪乳杆菌液体制剂及其制备

一种灭活的乳酸菌液体制剂，包括98％的干酪乳杆菌发酵液、1％的氨基葡萄糖盐酸和1％甜菜碱盐酸盐，其中，乳酸菌细胞含量为10⁹个/mL。

其制备方法如下：

(1)菌种的制备：配置MRS液体培养基，调节pH为6.2，115℃灭菌20分钟，冷却至37℃，在超净工作台中，用接种环从干酪乳杆菌的斜面上挑取2环菌苔，然后接种至液体MRS培养基中，37℃静置培养16小时，即获得干酪乳杆菌的液体种子；

(2)干酪乳杆菌发酵液制备：配置液体MRS培养基，调节pH为6.2，115℃灭菌20分钟，冷却至37℃，按照0.1％的体积比接入步骤(1)得到的干酪乳杆菌菌种，37℃，不通气，50rpm搅拌培养36小时，当发酵液pH为4.5，OD_600nm为4.0时发酵结束，即获得干酪乳杆菌发酵液；

(3)灭活处理：在步骤(2)得到的发酵液中加入质量分数1％的氨基葡萄糖盐酸和1％甜菜碱盐酸盐，边搅拌边添加，添加完毕后，将发酵液pH调节至1.5，持续搅拌5分钟即可；

实施例2灭活乳糖片球菌液体制剂及其制备

一种灭活的乳酸菌液体制剂，包括97％的戊糖片球菌发酵液、3％的甜菜碱盐酸盐，其中，乳酸菌细胞含量为10¹⁰个/mL。

其制备方法如下：

(1)菌种的制备：配置MRS液体培养基，调节pH为6.3，115℃灭菌20分钟，冷却至37℃，在超净工作台中，用接种环从戊糖片球菌的斜面上挑取2环菌苔，然后接种至液体MRS培养基中，然后37℃静置培养17小时，即获得戊糖片球菌的液体种子；

(2)戊糖片球菌发酵液制备：配置液体MRS培养基，调节pH为6.2～6.4，115℃灭菌20分钟，冷却至37℃，按照0.15％的体积比接入步骤(1)得到的戊糖片球菌菌种，37℃，不通气，50rpm搅拌培养42小时，当发酵液pH为4.4，OD_600nm为4.1时发酵结束，即获得戊糖片球菌发酵液；

(3)灭活处理：在步骤(2)得到的发酵液中加入质量分数3％的甜菜碱盐酸盐，边搅拌边添加，添加完毕后，将发酵液pH调节至2.0，持续搅拌5分钟即可；

实施例3灭活复合乳酸菌液体制剂及其制备

一种灭活的乳酸菌液体制剂，包括96％的复合乳酸菌发酵液、2％的γ-氨基丁酸、2％甜菜碱盐酸盐，其中，乳酸菌细胞含量为10⁹个/mL。

其制备方法如下：

(1)菌种的制备：配置MRS液体培养基，调节pH为6.4，115℃灭菌20分钟，冷却至37℃，在超净工作台中，用接种植物乳杆菌的斜面上挑取2环菌苔，然后接种至液体MRS培养基中，然后37℃静置培养18小时，即获得植物乳杆菌的液体种子，以相同的方式制备干酪乳杆菌液体种子、粪链球菌液体种子和嗜酸乳杆菌液体种子。

(2)复合乳酸菌发酵液制备：配置液体MRS培养基，调节pH为6.4，115℃灭菌20分钟，冷却至37℃，按照0.05％的体积比分别依次接入步骤(1)得到的植物乳杆菌、干酪乳杆菌、粪链球菌和嗜酸乳杆菌液体菌种，37℃，不通气，50rpm搅拌培养48小时，当发酵液pH为4.3，OD_600nm为4.2时发酵结束，即获得复合乳酸菌发酵液。

(3)灭活处理：在步骤(2)得到的发酵液中加入质量分数2％的γ-氨基丁酸和2％的甜菜碱盐酸盐，边搅拌边添加，添加完毕后，将发酵液pH调节至2.5，持续搅拌5分钟即可。

实施例4对细胞回收率和粘附性能的影响实验：

取实施例3中步骤(2)培养结束的活的乳酸菌发酵液，用无菌的0.75％的生理盐水10倍梯度稀释至10^-6，记为活菌对照组，放入4度冰箱备用；

取实施例3中步骤(2)培养结束的活的乳酸菌发酵液，模拟规模化(5吨/批)生产时发酵液的升温速率对样品进行加热灭活。从常温升温至灭活温度(80℃)，升温过程约20分钟，然后在80℃并维持约30分钟，灭活完成后取灭活发酵液，用无菌的0.75％生理盐水10倍梯度稀释至10^-6，记为热灭活对照组，放入4度冰箱备用；

取实施例3制得的灭活的发酵液，用无菌的0.75％生理盐水10倍梯度稀释至10^-6，记为实验组，放入4度冰箱备用。

利用流式细胞仪检测上述3个稀释样品的细胞数量，检测结果如下表所示：

组别	活菌对照组(个/mL)	热灭活对照组(个/mL)	实验组(个/mL)
				重复1	2932	2104	2746
重复2	3021	2350	2724

重复3	2896	2218	2801
				平均值	2950	2224	2757

由上表可知，经过热灭活的乳酸菌发酵液中完整的细胞数量减少约25％，而按照本申请中实施例1所说的方法制得的灭活乳酸菌液体制剂，其细胞回收率达到90％以上。

同时将上述活菌对照组、热灭活对照组和实验组样品送检，测试3个样品对人结肠腺癌细胞Caco-2细胞的粘附性能，检测结果如下表所示：

组别	活菌对照组	热灭活对照组	实验组
				黏附菌数(个/细胞)	10.02±0.35	8.90±0.10	9.61±0.49

由上表可知，采用本申请所述的灭活方式不会显著降低菌体的粘附性能，而热灭活的方式能使复合乳酸菌的粘附性能下降约10％。

实施例5对南美白对虾生长性能的影响实验：

实验设3个组，分别为负对照组、正对照组和实验组，其中负对照组的虾饲料不填加乳酸菌、正对照组的虾饲料添加实施例1中步骤(2)制得的活乳酸菌发酵液(3×10⁹cfu/mL)、实验组的虾饲料添加实施例1制得的灭活乳酸菌液体制剂(3×10⁹cfu/mL)，每组6个平行。

每次投喂前30min，正对照组和实验组分别用活的或灭活的乳酸菌液体加适量水稀释后均匀泼洒到虾料上，负对照组泼洒等量的充分曝气的自来水，搅拌均匀后，自然晾干半小时后投喂。拌喂剂量按照饲料重量的1％添加乳酸菌液体，每天早晚各拌料1餐。称量南美白对虾的初始体重和终末体重，并记录日常投喂饲料重量和死虾数量及重量，各组南美白对虾的生长性能如下表所示：

组别	初均重(g)	末均重(g)	存活率(％)	特定生长率(％)	饵料系数
						负对照	1.43±0.01	5.77±0.13	79.45±3.85	2.59±0.03	1.90±0.14
正对照	1.41±0.06	5.84±0.23	85.48±6.50	2.63±0.10	1.71±0.05
						实验组	1.41±0.05	6.09±0.24	92.00±3.33	2.71±0.07	1.61±0.03

其中，特定生长率(％)＝{[ln(末均重)-ln(初均重)]/饲养天数}×100；

存活率(％)＝(试验结束时虾尾数/试验开始时虾尾数)×100；

饵料系数＝摄食量/(终末虾体重+试验中死亡虾体重-初始虾体重)。

由上表可知，添加乳酸菌制剂组在存活率、饵料系数以及特定生长率方面都明显优于未添加乳酸菌制剂组，而且灭活乳酸菌制剂的效果要优于活的乳酸菌制剂，其中可能的原因是灭活剂与乳酸菌制剂具有协同作用。

实施例6对仔猪生长性能的影响试验

选择4周龄健康杜×长×大三元杂交断奶仔猪36头，随机分为3组，每组3个重复，每个重复4头，阉公猪与小母猪各1/2。仔猪预实验期为7天，进行正常的防疫和驱虫等工作，预实验期结束后进入实验期，实验期为8周，充分喂食、自由饮水。

实验设A、B、C三组，A组为对照组，饲喂普通商品日粮，B组为低剂量组，在普通商品日粮中每天按照日粮重量的0.5％添加实施2制得的灭活乳酸菌液体制剂拌喂，C组为高剂量组，在普通商品日粮中每天按照日粮重量的1％添加实施2制得的灭活乳酸菌液体制剂拌喂；仔猪在实验正式开始时称量个体体重，在实验进行8周后再次称量个体体重，记录体重和耗料量。在养殖过程中记录每个重复每日总腹泻头数，计算腹泻率，其中，腹泻率(％)＝实验期仔猪总腹泻头数之和/(仔猪头数×试验天数)×100。各组仔猪的生长性能如下表所示：

组别	平均日增重(g/d)	平均日采食量(g/d)	料比	腹泻率(％)
					A	302.77±17.89	820.33±46.05	2.70±0.02	1.9±0.63
B	349.21±7.80	873.56±23.15	2.51±0.03	1.64±0.43
					C	357.35±25.46	881.00±34.07	2.45±0.02	1.49±0.51

与对照组相比，高剂量组仔猪日增重提高18％，料比下降9.3％；低剂量组仔猪日增重提高15％，料比下降7.0％。实验结果表明，日粮中添加不同剂量的本申请所述灭活乳酸菌液体制剂均能改善仔猪的生长性能，日增重和饲料转化效率均有显著改善，而且高剂量组(1％添加量)的效果要优于低剂量组(0.5％添加量)。

Claims

1.一种灭活的乳酸菌液体制剂，其特征在于，包含如下质量配比的组分：具有灭活功能的添加剂2～4份、乳酸菌发酵液96～98份，其中，乳酸菌细胞含量为10⁹～10¹⁰个/mL。

2.根据权利要求1所述的灭活的乳酸菌液体制剂，其特征在于，所述乳酸菌选自植物乳杆菌、干酪乳杆菌、戊糖片球菌、粪链球菌、嗜酸乳杆菌中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的灭活的乳酸菌液体制剂，其特征在于，所述具有灭活功能的添加剂为酸性添加剂。

4.根据权利要求3所述的灭活的乳酸菌液体制剂，其特征在于，所述具有灭活功能的添加剂为甜菜碱盐酸盐、氨基葡萄糖盐酸盐、γ-氨基丁酸中的一种或多种。

5.一种灭活乳酸菌液体制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的灭活乳酸菌液体制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的乳酸菌选自植物乳杆菌、干酪乳杆菌、戊糖片球菌、粪链球菌、嗜酸乳杆菌中的一种或多种。

7.根据权利要求5所述的灭活乳酸菌液体制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的酸性灭活添加剂为甜菜碱盐酸盐、氨基葡萄糖盐酸盐、γ-氨基丁酸中的一种或多种。

8.根据权利要求5所述的灭活乳酸菌液体制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的酸性灭活添加剂的质量分数为2-4％。