CN107802652A - 灭活乳酸菌在防治细菌性疾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种灭活乳酸菌在防治细菌性疾病中的新用途，属于生物医药领域。这种药物的主要成分是灭活乳酸菌，可以通过将活的乳酸菌经过常规方法灭活制备。灭活乳酸菌静脉给药可以用于人或动物的各种细菌性疾病的预防、治疗或辅助治疗，具有广阔的应用前景。

Description

灭活乳酸菌在防治细菌性疾病药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，尤其涉及灭活乳酸菌在防治细菌性疾病中的新用途。

背景技术

细菌性疾病对人和动物危害巨大。在临床上各种病原微生物常引起人和动物的呼吸道、消化道、内脏器官和皮肤等感染，使机体出现炎症反应、出血、化脓和组织坏死等病理损伤，严重时发生败血症、脓毒症、感染性休克和死亡。人医临床上发生的细菌性疾病包括：伤寒、霍乱、痢疾、肺结核、猩红热、百日咳、布鲁氏菌病、流行性脑脊髓膜炎、白喉、鼠疫、炭疽等。兽医临床上发生的细菌性疾病有：马接触传染性子宫炎、马鼻疽、马腺疫、马破伤风、牛生殖器弯曲杆菌病、牛大肠杆菌病、牛结核病、牛布氏杆菌病、牛出血性败血病、奶牛乳房炎、奶牛子宫内膜炎、牛传染性胸膜肺炎、牛放线菌病、羊梭菌病、羊快疫、羊猝狙、羊布氏杆菌病、羊接触染性胸膜肺炎、羊巴氏杆菌病、羊沙门氏菌病、猪水肿病、仔猪黄痢、仔猪白痢、猪副伤寒、猪巴氏杆菌病、猪丹毒、猪传染性萎缩性鼻炎、猪链球菌病、猪李氏杆菌病、猪传染性胸膜肺炎、猪梭菌性肠炎、猪增生性肠炎、猪副嗜血杆菌病、猪支原体肺炎、禽巴氏杆菌病、鹅霍乱、鸭传染性浆膜炎、鸭传染性窦炎、鸡大肠杆菌病、鸡沙门氏菌病、鸡传染性鼻炎、鸡慢性呼吸道病、犬钩端螺旋体病、犬布氏杆菌病、犬副伤寒、犬弯杆菌病、犬肉毒梭菌病、犬细菌性腹泻、犬细菌性肺炎等。以上可以看出细菌性疾病种类繁多，而且一些细菌病发病率也较高。

目前针对细菌性疾病主要通过抗菌药治疗，如β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、氯霉素类、大环内脂类、林可胺类、多肽类、喹诺酮类等。另外，中药及其提取物在细菌性疾病治疗中也经常使用，如黄连素片、鱼腥草注射液、穿心莲注射液、四黄止泻颗粒、白头翁散、杨树花口服液等用于人和畜禽细菌性疾病防治。此外，发现一些生物制剂也具有一定的抗菌作用，如杆菌肽、溶菌酶、防御素、噬菌体等。针对肠道感染的一些细菌性疾病，还可以通过口服益生菌(如乳酸菌)或乳酸菌提取物(如乳酸菌素)进行防治。虽然目前临床上抗菌类药物种类较多，但细菌耐药性问题仍面临严重挑战。一些细菌性疾病由于细菌耐药性问题而治愈难度大，如人结核病、奶牛乳房炎、鸡大肠杆菌病等。全球范围内超级耐药菌不断产生，给临床治疗带来极大困难。

因此，寻找新的应对细菌性疾病的药物非常重要。本发明发现将灭活乳酸菌进行静脉给药可以达到有效防治细菌性疾病的目的。这是一种全新的可用于细菌性疾病防治的药物，未来具有广阔的应用前景。这种药物未来可能用于耐药性致病菌的防治。

发明内容

本发明提供了一种全新的可以用于细菌性疾病防治的灭活乳酸菌混悬液，这种药物的主要成分为灭活的乳酸菌。该药物通过静脉给药可以有效防治细菌性疾病。

灭活乳酸菌在制备防治细菌性疾病药物中的用途，其特征在于，对所述的灭活乳酸菌进行革兰氏染色，在油镜下观察，灭活乳酸菌保持完整菌体形态，药物的给药方式为注射给药。此处所述的保持完整菌体形态是指与灭活前活菌菌体的轮廓和形态基本一致。所说的基本一致实质上是指乳酸菌灭活过程中菌体细胞壁可能会出现轻微变化，比如部分表面成分的流失，但这种变化微乎其微或很少发生。

灭活乳酸菌为一种或两种以上灭活乳酸菌混合物。所述的每单位剂量药物中包含灭活乳酸菌完整菌体数量为10⁵—10¹²个。所述的注射给药为静脉注射给药。

所述乳酸菌包括：(1)乳杆菌属：德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)、瑞士乳杆菌(L.helviticus)、嗜酸乳杆菌(L.acidophlus)、格氏乳杆菌(L.gasseri)、唾液乳杆菌(L.salivarius)、植物乳杆菌(L.plantarum)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、短乳杆菌(L.brevis)、干酪乳杆菌(L.casei)、发酵乳杆菌(L.fementi)等；(2)片球菌属：如乳酸片球菌(P.acidi1actic)、戊糖片球菌(P.pentasiaceus)、小片球菌(P.parvulus)等；(3)明串球菌属：肠膜明串球菌(L.mesenteroides)及其乳脂亚种(L.cremoris)和葡聚糖亚种(Leuc.dextranicun)、乳酸明串球菌(L.lactis)、酒明串球菌(L.oenos)等；(4)肠球菌属：屎肠球菌(E.faecium)、粪肠球菌(E.faecalis)等；(5)乳球菌属：乳酸乳球菌乳酸亚种(L.lactis subsp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(L.lactissubsp.cremoris)、乳酸乳球菌叶蝉亚种(L.lactis subsp.hordniae)等；(6)链球菌属：乳酸链球菌(S.lactis)、丁二酮乳酸链球菌(S.diacetilactis)、乳酪链球菌(S.creamoris)、嗜热乳链球菌(S.thermophilus)等；(7)双歧杆菌属：两歧双歧杆菌(B.bifidum)、长双歧杆菌(B.longum)、短双歧杆菌(B.breve)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、青春双歧杆菌(B.adolescentis)、动物双歧杆菌(B.animalis)等；(8)其他种属的乳酸菌。

优选的，乳酸菌选自乳酸乳球菌乳酸亚种(拉丁名称：Lactococcus lactissubsp.Lactis，保藏编号：CICC 6246)、植物乳杆菌植物亚种(拉丁名称：Lactobacillusplantarum subsp.Plantarum，保藏编号：CICC 6240)、长双歧杆菌(拉丁名称：Bifidobacterium longum，保藏编号：CICC 6196)、短乳杆菌(拉丁名称：Lactobacillusbrevis，保藏编号：CICC 6239)、屎肠球菌(拉丁名称：Enterococcus faecium，保藏编号：CICC 6049)。

用于本发明的制备灭活乳酸菌混悬液的方法包括：包括高温高压灭活、紫外线灭活、化学试剂灭活、辐射灭活等。

用于本发明的制备灭活乳酸菌静脉给药的剂型包括：粉针剂、混悬注射剂等各种剂型。用于本发明的灭活乳酸菌混悬液的给药方式包括：静脉推注和静脉滴注等。

本发明从中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)购买了3种乳酸菌，分别是：乳酸乳球菌乳酸亚种(拉丁名称：Lactococcus lactis subsp.Lactis，保藏编号：CICC6246)、植物乳杆菌植物亚种(拉丁名称：Lactobacillus plantarum subsp.Plantarum，保藏编号：CICC 6240)、长双歧杆菌(拉丁名称：Bifidobacterium longum，保藏编号：CICC6196)，又自行分离鉴定得到了2种乳酸菌，分别是：短乳杆菌和屎肠球菌。分别对以上5种乳酸菌进行常规方法灭活，然后对小鼠尾静脉给药，发现以上5种灭活乳酸菌及混合物经静脉给药均可有效地降低致病菌对小鼠的致死率。此后，选择了分离得到的屎肠球菌又进行了详细研究，发现灭活的屎肠球菌仍然可以进行革兰氏染色，油镜下观察灭活的屎肠球菌与活的屎肠球菌保持一致的菌体轮廓和形态。然后对灭活屎肠球菌生理盐水混悬液进行离心，弃上清留沉淀，提取DNA，采用PCR技术仍可以扩增出16S rDNA基因片段，通过测序还可以进行乳酸菌种类鉴别。进一步开展了灭活屎肠球菌对小鼠尾静脉给药对致病菌感染的预防性和治疗性实验，发现无论预防性给药和还是治疗性给药，均可有效降低小鼠死亡数。另外，还发现灭活乳酸菌静脉给药对奶牛的乳房炎和子宫内膜炎也有效。以上说明，灭活乳酸菌混悬液对致病菌感染具有良好的防治作用。

本发明的灭活乳酸菌混悬液可以用于各种病原微生物引起的感染性疾病的防治，包括：(1)所有具有致病作用的革兰氏阳性菌，如金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、肺炎球菌、炭疽杆菌、蜡样杆菌、破伤风杆菌、产气荚膜杆菌、肉毒杆菌、难辨梭菌、李斯特杆菌、魏氏梭菌、丹毒杆菌、化脓棒状杆菌等；(2)所有具有致病作用的革兰氏阴性菌，如脑膜炎球菌、淋球菌、不动杆菌、绿脓杆菌、百日咳杆菌、布氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、变形杆菌、白喉杆菌、结核杆菌、麻风杆菌等；(3)其他致病菌还包括螺旋体、支原体、立克次氏体、衣原体和放线菌等。

静脉注射灭活乳酸菌防治细菌性疾病的机制目前尚不完全清楚，推测可能的机制是：灭活乳酸菌静脉给药，可能与致病菌发生相互作用，阻断致病菌感染组织器官；也可能灭活乳酸菌静脉给药后经机体代谢产生了抗菌物质；或者灭活乳酸菌静脉给药后可激活机体免疫系统，间接发挥抗菌作用等。

附图说明

图1奶牛患乳房炎照片

图2灭活乳酸菌静脉给药后症状明显减轻照片

具体实施方式

实施例1

将屎肠球菌(购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，拉丁名称：Enterococcusfaecium，保藏编号：CICC 6049)接种于MRS培养基，于37℃温箱培养24小时，然后3000转离心5分钟，去除上层培养液保留沉淀，加入无菌生理盐水清洗沉淀，离心5分钟，重复清洗3次后，加入无菌生理盐水，与沉淀混匀。取一定量的屎肠球菌生理盐水混悬液，于分光光度计690nm处测量其OD值，当用无菌生理盐水稀释的最终浓度的OD值为0.38时，将这样稀释浓度的屎肠球菌生理盐水混悬液作为1倍(1×)浓度，经过THOMA细菌计数板进行细菌计数测定该浓度下每mL混悬液中含有约10⁸个屎肠球菌菌体。取少量的1×浓度的屎肠球菌生理盐水混悬液，进行革兰氏染色，在油镜下观察活菌的形态。此后将配制好的1×浓度的屎肠球菌生理盐水混悬液于121℃、压力0.12MPa，灭活15min，得到灭活屎肠球菌混悬液，取少量灭活屎肠球菌混悬液进行革兰氏染色，在油镜下观察灭活菌体的形态，发现灭活乳酸菌保持完整菌体形态，与其灭活前活菌菌体轮廓和形态一致，细菌计数发现灭活前后菌体数量没有明显变化。

实施例2

使用实施例1制备的1×浓度的灭活屎肠球菌混悬液，检测灭活屎肠球菌混悬液预防给药对沙门氏菌感染小鼠致死作用的影响。将体重为18-22g的清洁级昆明种小白鼠分为3组，即正常对照组、沙门氏菌组和灭活屎肠球菌组，每组30只小鼠，雌雄各半。正常对照组和沙门氏菌组的小鼠尾静脉注射无菌生理盐水，灭活屎肠球菌组尾静脉注射1×浓度的灭活屎肠球菌混悬液，给药体积均为0.1mL/10g。给药1次后间隔24小时，沙门氏菌组和灭活屎肠球菌组的小鼠分别尾静脉注射肠炎沙门氏菌(购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心，拉丁名称：Salmonella enteritidis,保藏编号CVCC 3377)。连续观察7天，记录小鼠每天的死亡数。采用SPSS 11.5软件对实验数据进行卡方检验，结果见表1。由表1可知，与沙门氏菌对照组比较，灭活屎肠球菌组极显著地降低了小鼠的死亡数。说明灭活屎肠球菌静脉给药对沙门氏菌感染小鼠具有预防作用。

表1灭活屎肠球菌静脉给药预防沙门氏菌对小鼠致死作用的结果

注：**表示与正常对照组比较差异极显著P＜0.01，*表示与正常对照常组比较差异显著P＜0.05；△△表示与沙门氏菌组比较差异极显著P＜0.01，△表示与沙门氏菌组比较差异显著P＜0.05。

实施例3

使用实施例1制备1×浓度的灭活屎肠球菌混悬液，开展灭活屎肠球菌静脉给药治疗沙门氏菌感染小鼠作用的研究。将体重为18-22g的清洁级昆明种小白鼠分为3组，即正常对照组、沙门氏菌组和灭活屎肠球菌组，每组30只小鼠，雌雄各半。沙门氏菌组和灭活屎肠球菌组的小鼠腹腔注射肠炎沙门氏菌(购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心，拉丁名称：Salmonella enteritidis，保藏编号CVCC 3377)。灭活屎肠球菌组在小鼠腹腔接种肠炎沙门氏菌后，立即尾静脉注射1×浓度的灭活屎肠球菌混悬液；正常对照组和沙门氏菌组的小鼠立即尾静脉注射无菌生理盐水，各组给药体积均为0.1mL/10g。第一次给药后间隔6小时，再进行第二次给药。此后连续观察7天，记录各组小鼠每天的死亡数。采用SPSS 11.5软件对实验数据进行卡方检验，结果见表2。由表2可知，与沙门氏菌组相比较，灭活屎肠球菌组极显著地降低了小鼠死亡数。以上说明，灭活屎肠球菌静脉给药对沙门氏菌感染的小鼠具有治疗作用。

表2灭活屎肠球菌静脉给药治疗沙门氏菌对小鼠致死作用的结果

注：**表示与正常对照组比较差异极显著P＜0.01，*表示与正常对照常组比较差异显著P＜0.05；△△表示与沙门氏菌组比较差异极显著P＜0.01，△表示与沙门氏菌比较差异显著P＜0.05。

实施例4

本发明从中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)购买了5种乳酸菌，分别是：乳酸乳球菌乳酸亚种(拉丁名称：Lactococcus lactis subsp.Lactis，保藏编号：CICC6246)、植物乳杆菌植物亚种(拉丁名称：Lactobacillus plantarum subsp.Plantarum，保藏编号：CICC 6240)、长双歧杆菌(拉丁名称：Bifidobacterium longum，保藏编号：CICC6196)、短乳杆菌(拉丁名称：Lactobacillus brevis，保藏编号：CICC 6239)、屎肠球菌(拉丁名称：Enterococcus faecium，保藏编号：CICC 6049)。根据实施例1的方法分别制备上述5种乳酸菌的1×浓度的灭活乳酸菌混悬液，检测这5种灭活乳酸菌及混合物静脉给药对沙门氏菌感染小鼠致死作用的影响。将体重为18-22g的清洁级昆明种小白鼠分为正常对照组、沙门氏菌组、灭活乳酸乳球菌乳酸亚种组、灭活植物乳杆菌植物亚种组、灭活长双歧杆菌组、灭活短乳杆菌组、灭活屎肠球菌组、2种灭活乳酸菌混合组(即灭活屎肠球菌和灭活短乳杆菌等比例混合组)，每组30只小鼠，雌雄各半。正常对照组和沙门氏菌组的小鼠尾静脉注射无菌生理盐水，5种灭活乳酸菌组和2种灭活乳酸菌混合组分别尾静脉注射1×浓度的相应灭活乳酸菌混悬液和1×浓度的2种灭活乳酸菌混合的混悬液，给药体积均为0.1mL/10g。以上各组小鼠给药一次后间隔24小时，除正常对照组外，其他各组小鼠分别尾静脉注射肠炎沙门氏菌(购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心，拉丁名称：Salmonellaenteritidis,保藏编号CVCC 3377)。连续观察7天，记录各组小鼠每天的死亡数。采用SPSS11.5软件对实验数据进行卡方检验，结果见表3。由表3可知，与沙门氏菌组相比较，5种灭活乳酸菌组和2种灭活乳酸菌混合组均显著或极显著地降低了小鼠死亡率。说明灭活乳酸菌静脉给药对肠炎沙门氏菌感染的小鼠具有保护作用。

表3五种灭活乳酸菌及混合物静脉给药对沙门氏菌致死小鼠的保护作用结果

注：**表示与正常对照组比较差异极显著P＜0.01，*表示与正常对照常组比较差异显著P＜0.05；△△表示与沙门氏菌组比较差异极显著P＜0.01，△表示与沙门氏菌组比较差异显著P＜0.05。

实施例5

某奶牛场，奶牛患乳房炎，主要由金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、支原体等致病菌感染引起。该患病奶牛的奶乳汁有絮状物质(参见附图1)，已用过几个兽药厂的抗菌药治疗无明显效果。按照实施例1方法和使用的屎肠球菌制备20×浓度的灭活屎肠球菌混悬液，给该患病奶牛静脉推注了22毫升，第二天又推注了20毫升。发现用药两天后乳腺炎症状明显减轻，牛奶絮状物消失，手摸肿块变软，肿区变小(参见附图2)。

实施例6

某奶牛场，奶牛患子宫内膜炎，主要由化脓性放线菌、坏死梭杆菌、拟杆菌、大肠杆菌、溶血性链球菌、变形杆菌、假单胞菌、梭状芽孢杆菌等致病菌感染引起，该患病奶牛子宫内充满炎性分泌物且自动流出。使用与实施例1相同的方法制备20×浓度的灭活植物乳杆菌植物亚种混悬液，给奶牛颈静脉推注25毫升，第二天又推注了25毫升。发现用药3天后不见炎性分泌物流出，经手掏才有一些炎性分泌物，已经大大减少，由此可见效果明显。

Claims (10)

1.灭活乳酸菌在制备防治细菌性疾病药物中的用途，其特征在于，对所述的灭活乳酸菌进行革兰氏染色，在油镜下观察，灭活乳酸菌保持完整菌体形态，药物可制成混悬液或粉针剂，给药方式为注射给药。

2.根据权利要求1的用途，其特征在于，所述的乳酸菌选自乳杆菌属、肠球菌属、乳球菌属、双歧杆菌属、明串球菌属、链球菌属。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述乳酸菌选自乳酸乳球菌乳酸亚种(拉丁名称：Lactococcus lactis subsp.Lactis，保藏编号：CICC 6246)、植物乳杆菌植物亚种(拉丁名称：Lactobacillus plantarum subsp.Plantarum，保藏编号：CICC 6240)、长双歧杆菌(拉丁名称：Bifidobacterium longum，保藏编号：CICC 6196)、短乳杆菌(拉丁名称：Lactobacillus brevis，保藏编号：CICC 6239)、屎肠球菌(拉丁名称：Enterococcusfaecium，保藏编号：CICC 6049)。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，灭活乳酸菌为一种或两种以上灭活乳酸菌混合物。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，利用高温高压灭活、紫外线灭活、化学试剂灭活或辐射灭活中的任一种灭活方法得到所述灭活乳酸菌。

6.根据权利要求1-5任一项所述的用途，其特征在于，所述的注射给药为静脉注射给药。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，注射时，每ml剂量药物中包含灭活乳酸菌完整菌体数量为10⁵—10¹²个。

8.根据权利要求1-7任一项所述的用途，其特征在于，所述防治细菌性疾病药物可以制成粉针剂或混悬注射剂。

9.根据权利要求8所述的注射剂，其特征在于，所述的注射剂按照如下方法制备而成：将乳酸菌进行常规液体培养基培养12-36小时后，3000-5000转离心保留沉淀，再将沉淀充分清洗后，配制成所需浓度混悬液，于120-122℃、压力0.1-0.2MPa，灭活15-30min得到灭活乳酸菌注射剂。

10.根据权利要求1-7任一项所述的用途，其特征在于，所述的细菌性疾病包括：革兰氏阳性菌和具有致病作用的革兰氏阴性菌感染导致的疾病。