CN109810113B - 一种生物碱化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及杂环化合物的技术领域，具体涉及一种海洋真菌来源的生物碱化合物及其制备方法与应用。所述生物碱化合物的结构式如式（Ӏ）所示，该生物碱化合物具有抗脑胶质瘤活性，可应用于制备抗脑胶质瘤药物。所述生物碱化合物从真菌Trichobotrys effusa SYSU‑MS4729的发酵产物中分离提取得到；

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Description

一种生物碱化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及杂环化合物领域，更具体地，涉及一种生物碱化合物及其制备方法与应用。

背景技术

脑胶质瘤起源于神经胶质细胞，中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤,是破坏思维、运动等脑功能区域的一种致命疾病。脑胶质瘤的发病率为每年每10万人中约有6例，而美国国家癌症协会预估美国每年脑胶质瘤确诊病例大约19000例。脑胶质瘤占颅内肿瘤的35.2％～61.0％，平均49.7％。由于大多数胶质瘤呈浸润性生长，与周围脑组织边界不清，所以治疗十分困难。大多数恶性胶质瘤(如胶质母细胞瘤)在确诊后一年内死亡。近年来，美国FDA先后批准两个治疗胶质瘤的新药：可口服的替莫唑胺(temozolomide，TMZ)和注射用的贝伐单抗。相关研究显示，在放疗基础上加用替莫唑胺可以提高脑胶质瘤患者的生存，但随着临床应用发现，由于脑胶质瘤呈浸润性生长、对周围正常脑组织的放射性损伤、替莫唑胺等化疗药物的耐药等，都给脑胶质瘤的治疗带来极大的挑战，胶质瘤易复发、病死率高、治疗效果并不乐观，而具有抑制血管内皮生长因子作用的贝伐单抗，属于抗肿瘤血管生成治疗，但研究显示贝伐单抗不能改善胶质瘤患者的生存期，且不是所有的胶质瘤患者对贝伐单抗都敏感。因此迫切需要开发和研究治疗脑胶质瘤的新药。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够用于治疗脑胶质瘤的新型化合物，本发明从菌株Trichobotrys effusa SYSU-MS4729的发酵产物中分离得到一种生物碱化合物，发明人通过研究发现，该生物碱化合物具有抗脑胶质瘤活性，可应用于制备抗脑胶质瘤药物。

本发明的另一个目的是提供所述生物碱化合物的制备方法。

本发明的另一个目的是提供所述生物碱化合物的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种生物碱化合物，其结构式如式(I)所示：

本发明所述生物碱化合物的制备方法，包括如下步骤：

S1.将海洋真菌的菌株Trichobotrys effusa SYSU-MS4729接入种子培养基，摇床培养，得到种子培养液；

S2.将种子培养液接入发酵培养基中，静置培养得到发酵物；

S3.将所述发酵物分离菌体和菌液，用甲醇浸泡菌体，减压浓缩得到浸膏，所述浸膏用硅胶柱层析进行分离，分离时分别用体积比10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、100％的乙酸乙酯-石油醚梯度淋洗；

S4.收集40％乙酸乙酯-石油醚的洗脱液，采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析后，接着用硅胶柱层析，所得白色粉末即为式(I)化合物。

其中，所述菌株Trichobotrys effusa SYSU-MS4729已在广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏日期是2018年6月28日，保藏号是GDMCC 60401。

本发明所述菌株Trichobotrys effusa SYSU-MS4729的来源于采自广东省深圳大澳湾的海鞘，从海鞘上分离得到的海洋真菌，其分类命名为Trichobotrys effusa SYSU-MS4729。

优选地，步骤S4中，当进行葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析时，采用体积比为1:1的甲醇-二氯甲烷为洗脱剂进行洗脱。

优选地，步骤S4中，当进行硅胶柱层析时，采用40％乙酸乙酯-石油醚为洗脱剂进行洗脱。

优选地，所述种子培养基的组分包括马铃薯、葡萄糖和水；所述马铃薯、葡萄糖和水之间的用量之比为200g：20g：1L。

优选地，步骤S1中，所述摇床培养的条件是：28℃下，摇床转速180rpm，培养时间为120h。

优选地，步骤S2中，所述发酵培养基的组分包括大米、海盐、水；所述大米、海盐、水之间的用量之比为3000g：90g：3L。

优选地，步骤S2中，所述静置培养的条件是：静置培养的时间为28天，静置培养的温度为25℃。

经现有的抗脑胶质瘤测试发现，本发明所述生物碱化合物对脑胶质瘤细胞具有显著的抑制作用，可用于制备抗脑胶质瘤药物，治疗脑肿瘤。因此，其在制备抗脑胶质瘤药物中的应用，都应在本发明的保护范围之内。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明从菌株Trichobotrys effusa SYSU-MS4729的发酵产物中分离得到一种生物碱化合物，该生物碱化合物具有抗脑胶质瘤活性，可应用于制备抗脑胶质瘤药物，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明生物碱化合物的单晶数据。

图2为本发明生物碱化合物抑制脑胶质瘤细胞株U251增殖的数据柱形图(其中**表示p<0.05,***表示p<0.01)。

图3为本发明生物碱化合物抑制脑胶质瘤细胞株SNB19增殖的数据柱形图(其中**表示p<0.05,***表示p<0.01)。

图4为本发明生物碱化合物促进脑胶质瘤U251和SNB19细胞凋亡的流式图。

图5为本发明生物碱化合物促进脑胶质瘤U251和SNB19细胞凋亡的数据柱形图。

具体实施方式

下面结合具体说明书附图和实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。

实施例1化合物的获得与表征

1、化合物的具体制备步骤如下：

S1.种子培养液的制备

S11.配制种子培养基：

该种子培养基的组分及用量为：马铃薯200g、葡萄糖20g、去离子水1L，配制后平均分装于5个500mL锥形瓶，121℃灭30分钟。

S12.种子的培养：将海洋真菌的菌株Trichobotrys effusa SYSU-MS4729接入种子培养基，在28℃的温度下，置摇床上，以180rpm的转速培养120h，获得种子培养液。

S2.发酵培养：

S21.配制发酵培养基：

该发酵培养基的组分及用量为：大米3000g、海盐90g、去离子水3L，121℃灭30分钟。

S22.发酵培养：

采用无菌操作将种子培养液5mL接入装有发酵培养基的锥形瓶中，于25℃静置培养28天，得到发酵物。

S3.提取分离：

将发酵物分离出菌体和菌液，用甲醇浸泡菌体，浸泡液在低于50℃下减压浓缩，得浸膏3.5g，该浸膏经硅胶柱层析进行分离，分离时分别用体积比为10％，20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、100％的乙酸乙酯-石油醚梯度淋洗，分成9组分。

S4.其中收集40％乙酸乙酯-石油醚的洗脱液，对其采用葡聚糖凝胶SephadexLH-20层析，当进行葡聚糖凝胶SephadexLH-20层析时，采用体积比为1:1的甲醇-二氯甲烷为洗脱剂进行洗脱，再用硅胶柱层析，当进行硅胶柱层析时，采用40％乙酸乙酯-石油醚为洗脱剂，获得白色粉末(标记为化合物1)。

2、表征

对该白色粉末进行检测，经分析检测，该化合物结构的理化性质数据如下：

比旋光度：[α]2D0-28.1(c0.02,MeOH)；

紫外光谱数据：UV(MeOH)λ_max(logε):230(3.78),266(3.74)nm；

ECD(MeOH)λ_max(Δε):260(-35.9)nm。

HR-ESIMS(m/z)：554.29，分子式为C₃₅H₄₀NO₅。

核磁NMR的数据见表1。

单晶的数据见图1。

表1化合物1的NMR数据(100MHz/400MHz，TMS，ppm)

从上述测试结果分析可确定化合物1的结构式，其结构式如下：

实施例2化合物1的抗脑胶质瘤活性测试

对实施例1中所获得的生物碱化合物(化合物1)对两种脑胶质瘤细胞株U251和SNB19进行细胞毒活性实验，具体步骤如下：

1、实验材料

1.1四唑化合物(CCK-8)：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐，简称CCK-8。

1.2靶细胞的制备：脑胶质瘤细胞株U251和SNB19的复苏与培养。

a.从液氮罐中取出人脑胶质瘤细胞株U251和SNB19的冻存管,迅速置入37℃水浴箱中，不停摇动使之迅速溶化，无菌操作移入离心管中；

b.分别向人脑胶质瘤细胞株U251和SNB19加入DMEM完全培养液至10mL，转速1000rmp离心5min，弃掉上清液；

c.重复以上操作一次；

d.脑胶质瘤细胞株U251和SNB19以DMEM完全培养液吹打使细胞混匀后移入培养瓶中，置于5％CO₂、37℃的环境进行培养；

e.观察细胞生长情况，及时更换培养液，分瓶。

1.3细胞计数

a.选取对数生长期细胞，胰酶消化，培养基终止，移入离心管中，加培养基至10mL；

b.取10μl细胞悬液滴入计数板一侧凹槽中，显微镜下计数四大格的细胞总数，除以4，乘10⁴，即为每毫升培养液所含细胞数；

c.调整细胞数至1×10⁵/mL。

1.4化合物1溶液的配制：取生物碱化合物加入到DMEM完全培养液中，调整浓度为500μmol/mL，超声乳化，过滤除菌，4℃保存。

2、试验方法

a.在96孔板的各孔加入脑胶质瘤细胞株U251和SNB19，50μL(1×10⁵/mL)，置于5％CO₂、37℃的环境培养12h。

b.加入不同浓度受试对象50μL，对照加DMEM完全培养液50μL，继续培养72h。

c.加入CCK-8各10μL，继续培养1h。

d.酶标仪(TECAN，Switzerland)490nm下测定每孔的OD值。

e.计算抑制率：

肿瘤细胞杀伤率％＝[(对照组测定的平均OD值-加药组测定的平均OD值)/对照组测定的平均OD值]×100％。

3、试验结果

从图2和3可见本发明生物碱化合物处理胶质瘤细胞株U251和SNB19的结果，随着本发明生物碱化合物的浓度的增加和作用时间的延长，两种胶质瘤细胞的增殖抑制现象均愈发显著。具体地，本发明生物碱化合物作用于U251和SNB19，当作用时间为12h时只有10μmol的浓度对胶质瘤有抑制效果；当作用时间在24h时，低至1μmol的药物浓度即可显著抑制胶质瘤细胞增殖(p<0.05)，浓度为10μmol的生物碱化合物的抑制效果更加显著(p<0.01)；当生物碱化合物的作用时间延长到48h时，生物碱化合物对胶质瘤的抑制效果同24h时相似，各个浓度均显著抑制胶质瘤的增殖，其中浓度为10μmol的生物碱化合物对U251作用48h的效果相较于作用24h的效果差异无统计学意义(p＝0.0812)，表明可能达到了饱和浓度。

利用本发明生物碱化合物处理胶质瘤细胞株U251和SNB1924h后，收集细胞进行细胞凋亡的流式细胞术检测。如表2、图4和5所示，胶质瘤细胞U251和SNB19早期凋亡均显著增加，分别达到(14.52±0.85)％和(14.60±0.71)％；总凋亡也显著增加，分别为(25.36±1.36)％和(32.12±1.90)％。其中，U251-0表示胶质瘤细胞株U251、生物碱化合物的浓度为0μmol；U251-10表示胶质瘤细胞株U251、生物碱化合物的浓度为10μmol；SNB19-0表示胶质瘤细胞株SNB19、生物碱化合物的浓度为0μmol；SNB19-10表示胶质瘤细胞株SNB19、生物碱化合物的浓度为10μmol；UR表示晚期凋亡及死亡细胞；LR表示早期凋亡细胞。

表2细胞凋亡的流式细胞术检测的数据

综上，本发明所述生物碱化合物对脑胶质瘤细胞具有显著的抑制作用，可用于制备抗脑胶质瘤药物，治疗脑肿瘤。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种生物碱化合物，其特征在于，其结构式如式(I)所示：

2.权利要求1所述生物碱化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.将海洋真菌的菌株Trichobotrys effusa SYSU-MS4729接入种子培养基，摇床培养，得到种子培养液；所述种子培养基的组分包括马铃薯、葡萄糖和水；所述马铃薯、葡萄糖和水之间的用量之比为200g：20g：1L；所述摇床培养的条件是：28℃下，摇床转速180rpm，培养时间为120h；

S2.将种子培养液接入发酵培养基中，静置培养得到发酵物；所述发酵培养基的组分包括大米、海盐、水；所述大米、海盐、水之间的用量之比为3000g：90g：3L；所述静置培养的条件是：静置培养的时间为28天，静置培养的温度为25℃；

S3.将所述发酵物分离菌体和菌液，用甲醇浸泡菌体，减压浓缩得到浸膏，所述浸膏用硅胶柱层析进行分离，分离时分别用体积比10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、100％的乙酸乙酯-石油醚梯度淋洗；

S4.收集40％乙酸乙酯-石油醚的洗脱液，采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析后，接着用硅胶柱层析，所得白色粉末即为式(I)化合物；当进行葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析时，采用体积比为1:1的甲醇-二氯甲烷为洗脱剂进行洗脱；当进行硅胶柱层析时，采用40％乙酸乙酯-石油醚为洗脱剂进行洗脱。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述菌株Trichobotrys effusaSYSU-MS4729已在广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏日期是2018年6月28日，保藏号是GDMCC 60401。

4.权利要求1所述生物碱化合物在制备抗脑胶质瘤药物中的应用。

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