CN113413386B - 香兰素衍生物在制备治疗结直肠癌合并具核梭杆菌感染药物中的应用 - Google Patents

香兰素衍生物在制备治疗结直肠癌合并具核梭杆菌感染药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药领域，具体涉及一种香兰素衍生物在制备治疗结直肠癌合并具核梭杆菌感染药物中的应用。本发明意外发现，香兰素衍生物IPM711和IPM712能够破坏具核梭杆菌细胞壁结构，对具核梭杆菌具有显著地抑菌活性；所述香兰素衍生物IPM711和IPM712能够在合并具核梭杆菌感染情况下，能够更有效的抑制结直肠癌转移和侵袭，抑制由具核梭杆菌感染的HCT116癌细胞中相关基因的表达；相较于现有的药物处理具核梭杆菌感染后的结直肠癌存在耐药性的问题，本发明所述的IPM711和IPM712显著提高了结直肠癌合并具核梭杆菌感染后的疗效，解决了具核梭杆菌感染导致的耐药性问题，可用于治疗结直肠癌合并具核梭杆菌感染。

Description

香兰素衍生物在制备治疗结直肠癌合并具核梭杆菌感染药物 中的应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种香兰素衍生物在制备治疗结直肠癌合并具核梭杆菌感染药物中的应用。
背景技术
结直肠癌(CRC)是全球第三大常见癌症，也是癌症相关死亡的第二大原因。晚期大肠癌患者化疗的目的是缩小肿瘤体积，减少肿瘤生长，抑制肿瘤转移。其中常用药物包括5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨、奥沙利铂、顺铂、伊立替康等，其中5-氟尿嘧啶(5-FU)和卡培他滨用于抑制DNA复制过程中胸苷酸合成酶的活性；奥沙利铂通过共价结合DNA和形成铂-DNA加合物抑制肿瘤细胞生长并导致细胞G2期阻滞。这些化疗药物的联合广泛应用于CRC的治疗，但是大多数晚期大肠癌患者最初对联合化疗有反应。然而，由于耐药，患者最终会经历肿瘤复发。
具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)最初作为一种口腔致病菌被发现，研究发现其能够促进结直肠癌的发展、转移，产生毒素诱导细胞癌变，可诱导肿瘤对化疗药物产生耐药，导致化疗抗性。其中文献(Yu T C，Guo F，u Y，et al.Fusobacterium nucleatumPromotes Chemoresistance to Colorectal Cancer by Modulating Autophagy.Cell，2017，170(3):548.)公开了具核梭杆菌感染结直肠癌细胞后，导致顺铂、伊立替康、5-FU等化疗药物的耐药性，降低疗效。因此研发一种既能抗结直肠癌，又能抗具核梭杆菌的药物，则对于具核梭杆菌所导致的临床耐药具有重要意义。
天然产物是药物开发的重要来源，具有低毒、高效等优点。酚类化合物带来的各种益处吸引了研究人员对包含这些化合物的天然产品的兴趣。这些化合物对健康的益处已得到证明，包括抗炎，抗微生物，抗氧化剂和抗肿瘤作用。香兰素作为一种酚类化合物，可在各种食品中用作基本调味剂。有研究表明，香兰素经过结构改造的衍生物显示出很好地抗结直肠癌效果。
本发明意外发现，香兰素衍生物IPM711和IPM712能够破坏具核梭杆菌细胞壁结构，对具核梭杆菌具有显著地抑菌活性；并且相较于常用的化疗药物顺铂、伊立替康、5-FU等，香兰素衍生物IPM711和IPM712在合并具核梭杆菌感染情况下，能够更有效的抑制结直肠癌转移和侵袭，显著提高了结直肠癌合并具核梭杆菌感染后的疗效，解决了具核梭杆菌感染导致的耐药性问题，可用于治疗结直肠癌合并具核梭杆菌感染。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的在于解决常用的化疗药物顺铂、伊立替康、5-FU对于具核梭杆菌感染的结直肠癌耐药的问题，提供一种显著提高了结直肠癌合并具核梭杆菌感染后的疗效的药物，具体包括以下内容：
第一方面，本发明提供了一种香兰素衍生物或其药学上可接受的盐在制备抑制具核梭杆菌感染药物中的应用。
优选地，所述香兰素衍生物为IPM711，所述IPM711的结构式如式(Ⅰ)所示：
Figure BDA0003152739230000021
优选地，所述香兰素衍生物为IPM712，所述IPM712的结构式如式(Ⅱ)所示：
Figure BDA0003152739230000022
优选地，所述香兰素衍生物或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂、混悬剂的任一种剂型。
第二方面，本发明提供了一种香兰素衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗结直肠癌合并具核梭杆菌感染药物中的应用。
优选地，所述香兰素衍生物为IPM711，所述IPM711的结构式如式(Ⅰ)所示：
Figure BDA0003152739230000031
优选地，所述香兰素衍生物为IPM712，所述IPM712的结构式如式(Ⅱ)所示：
Figure BDA0003152739230000032
优选地，所述香兰素衍生物或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂、混悬剂的任一种剂型。
本发明的有益效果是：①本发明意外发现，香兰素衍生物IPM711和IPM712能够破坏具核梭杆菌细胞壁结构，对具核梭杆菌具有显著地抑菌活性；②相较于常用的化疗药物顺铂、伊立替康、5-FU等，香兰素衍生物IPM711和IPM712在合并具核梭杆菌感染情况下，能够更有效的抑制结直肠癌转移和侵袭，显著提高了结直肠癌合并具核梭杆菌感染后的疗效，解决了具核梭杆菌感染导致的耐药性问题，可用于治疗结直肠癌合并具核梭杆菌感染。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1具核梭杆菌标准曲线，其中A为吸光度与稀释倍数的标准曲线，B为吸光度与菌落数的换算标准曲线；
图2梯度稀释法测试香兰素及其衍生物的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度结果图；
图3MTT法检测具核梭杆菌的细菌数目结果图，其中A为具核梭杆菌梯度稀释下的颜色变化，B为梯度稀释后的吸光度(490nm)；
图4MTT法检测香兰素其衍生物对具核梭杆菌的抑制率结果图，其中A为不同浓度的IPM711，IPM712及双抗处理具核梭杆菌后的MTT溶液颜色变化，B为IPM711，IPM712及双抗对具核梭杆菌的抑制率；
图5香兰素衍生物增加具核梭杆菌膜渗透性的结果图，其中A、D、H、K、N为香兰素，IPM711，IPM712和双抗处理后，先多聚甲醛固定后染色的20倍视野；B、E、I、L、O为直接染色的20倍视野；C、F、J、M、P为直接染色的40倍视野；
图6香兰素衍生物破坏具核梭杆菌细胞壁结构的结果图，其中A为EG培养基处理，B为香兰素处理，C为IPM711处理，D为IPM712处理；
图7EMSA法检测香兰素衍生物与基因组结合活性结果图；
图8具核梭杆菌促进结直肠癌发展的生物信息学分析结果图，其中A为不同批次数据的分位数标准化预处理，B为基因表达火山图，C为RASA基因在健康人群与结直肠癌患者的表达差异，D为RASA基因高表达与低表达患者生存曲线；
图9IPM711和IPM712靶向具核梭杆菌结果图，其中A为RASA，MYD88，E-cadherin，PI3KCA，β-catenin，AKT，GSK-3β基因的凝胶电泳图，B和C为qPCR融解曲线；
图10不同处理后HCT116细胞的基因表达变化。
图11不同处理后HCT116细胞的蛋白表达变化。
图12Fn感染前后用IPM711和IPM712处理后的迁移图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下实施例所用的Fusobacterium nucleatum购自中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)，编号1.2526，其原始菌株来自于Fusobacterium nucleatum subsp.nucleatumATCC 25586，本实验室保藏。
以下实施例所用的细胞为实验室保藏的结直肠癌细胞系HCT116。
MTT噻唑蓝(北京索莱宝科技有限公司)；碘化丙啶PI(北京索莱宝科技有限公司)；青链霉素混合液(100×)(北京索莱宝科技有限公司)；Gluta固定液(电镜专用，2.5％)(北京索莱宝科技有限公司)；4％组织细胞固定液(北京索莱宝科技有限公司)；可溶性淀粉(北京索莱宝科技有限公司)；酵母提取物(北京索莱宝科技有限公司)；琼脂糖Agarose(北京索莱宝科技有限公司)；脱纤维马血(无菌)(北京索莱宝科技有限公司)；L-盐酸半胱氨酸(北京索莱宝科技有限公司)；二甲基亚砜(北京索莱宝科技有限公司)；牛肉浸粉(北京奥博星生物技术有限责任公司)；蛋白胨(北京奥博星生物技术有限责任公司)；无水葡萄糖(国药集团化学试剂有限公司)；十二水硫酸钠(国药集团化学试剂有限公司)；液体石蜡(国药集团化学试剂有限公司)；甘油(国药集团化学试剂有限公司)；RPMI-1640培养基(HyClone)；胰蛋白酶(HyClone)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；RNAsimple总RNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)；FastKing一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂(北京天根生化科技有限公司)；细菌基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)；2.5L厌氧产气袋(日本三菱MGC株式会社)；革兰氏染色液试剂盒(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)；其他试剂均为市售。
371型细胞培养箱(美国ThermoFisher Scientific公司)；低速冷冻离心机L530R(湘仪离心机仪器有限公司)；台式高速冷冻离心机H1850R(湘仪离心机仪器有限公司)；细胞培养及细胞膜转移摇床振荡器(北京天创尚邦仪器设备有限公司)；CK4060型低速离心机(Bioteke公司)；680型酶标仪(美国Bio-Rad公司)；紫外可见分光光度计(上海荆和分析仪器有限公司)；CKX41型倒置显微镜(美国奥利巴斯公司)；2.5L密封厌氧培养罐(日本三菱MGC株式会社)；扫描电子显微镜(3400N，NEC)。
实施例1香兰素衍生物抗具核梭杆菌活性测定
为避免液体菌株的污染，在每次实验之前对培养菌液进行革兰氏染色，然后油镜观察，当确认具核梭杆菌形态正常，呈粉红色梭形，无杂菌污染，方可用于进一步的实验。
为后续实验的菌悬液快速计数，首先构建了OD600吸光度值与稀释倍数之间的标准曲线，以及OD600吸光度值与菌落数之间的标准曲线，如图1所示，其中A为OD600吸光度值与稀释倍数符合方程y＝0.0286+0.9497x，且R2>0.999，线性合格，吸光度在0.1-1.0之间，保证了吸光度值的准确性。为了将OD600值转换成菌落数，对初始菌悬液进行平板计数，然后将横坐标准换成CFU数，如图1中B所示，OD600吸光度值与菌落数符合方程y＝0.0286+0.1151x，当菌悬液OD600值约为1.0时，其所含的菌株浓度约为8.5×107CFU/mL。
首先测试了化合物在EG液体培养基中的溶解度：其中香兰素在1000μM时完全溶解，IPM711和IPM712在400μM时浑浊，在200μM时完全溶解。因此，设置最大测试浓度为200μM。
所有结果均表示为独立实验的平均值±标准差。使用OriginPro software(OriginLab Corporation，United States)软件及R Project for StatisticalComputing environment进行绘图与统计。qPCR数据使用QuantStudioTM Design&AnalysisSoftware(赛默飞世尔科技有限公司)进行分析。通过对独立样本进行数据t检验来分析统计差异。当P<0.05时，表示对照组和实验组之间的差异具有统计学显著性。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
1.香兰素衍生物抗具核梭杆菌MIC与MBC测定
采用梯度稀释法测试香兰素及其衍生物的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度，具体操作如下：
(1)取对数生长期的具核梭杆菌菌液，10,000r/min离心5min，弃上清，用1×PBS调节OD值约1.0，然后用EG液体培养基稀释至2×106CFU/mL；
(2)称取香兰素，IPM711和IPM712用DMSO溶解，配置成50mM的母液，0.22μm滤膜过滤除菌，避光，4℃保存备用；取香兰素，IPM711和IPM712母液，用EG液体培养基(不含马血)分别配置成200，160，120，80，40μM的溶液；取100×的抗生素溶液(10,000U，青霉素-链霉素)，用EG液体培养基配置成100，10，5，2.5，1.25，0.625，0.3125U的溶液；
(3)取96孔板，每孔加入50μL的具核梭杆菌菌液，再分别加入50μL不同浓度的香兰素、IPM711、IPM712溶液；以EG液体培养基加具核梭杆菌菌液为阴性对照，EG液体培养基为空白对照，EG液体培养基加0.4％DMSO为溶剂对照，EG液体培养基加抗生素溶液作为阳性对照；96孔板放置在厌氧盒，37℃培养箱培养48h；
(4)取出96孔板观察，以溶液澄清的孔中最低药物浓度作为最低抑菌浓度(MIC)。然后从不同药物浓度的澄清的孔中取50μL溶液加入EG培养基平板，三个复孔对应涂布三块平板，涂布均匀，空白培养基平板作为阴性对照，以具核梭杆菌菌液涂布作为阳性对照，放置在厌氧盒，37℃培养箱培养48h；
(5)取出培养基平板观察，阴性对照无菌落生长，阳性平板有菌落生长，以无菌落生长的最低药物浓度平板作为最小杀菌浓度(MBC)；实验重复三次。
结果如图2所示，香兰素对具核梭杆菌的抑菌性较差，而香兰素衍生物IPM711在60μM时能够抑制具核梭杆菌的生长，其MIC值为80μM，MBC值为80μM；香兰素衍生物IPM712在60μM时完全抑制具核梭杆菌的生长，其MIC值为60μM，MBC值为80μM；同样，阳性对照抗生素采用2倍稀释法进行测试，其MIC值为0.6U，MBC值为0.6U；溶剂对照组结果表明，DMSO在0.4％时无抑制具核梭杆菌作用。综上结果表明，香兰素衍生物IPM712和IPM711具有显著的抗具核梭杆菌的作用，且香兰素衍生物IPM712效果最优。
2.MTT法检测抑制率
活细胞中线粒体内存在琥珀酸脱氢酶，可以还原MTT，生成不溶于水的甲臜，在DMSO中溶解，并在490nm具有最大吸光度。而死细胞无法还原MTT。因此可以检测活细胞数目。然而，具核梭杆菌为原核生物，不存在线粒体，但是其细胞内仍存在琥珀酸脱氢酶，活菌可以还原MTT，死的细菌无法还原MTT，理论上可以用于细菌计数。
为了检验MTT法是否可以用于检测细菌数目，构建了梯度稀释后菌液还原MTT的吸光度值变化。由于EG培养基中L-半膀氨酸具有还原性，因此所用EG培养基不含L-半膀氨酸。具体步骤如下：
(1)取对数生长期的具核梭杆菌菌液，10,000r/min离心5min，弃上清，用EG培养基(不含马血，L-半膀氨酸和可溶性淀粉)调节OD值约0.2，备用；配置5mg/mL的MTT溶液，0.22μm滤膜过滤除菌，包裹锡纸避光，4℃保存；取香兰素衍生物IPM 711和IPM 712母液，用EG液体培养基分别配置成200，160，120，80，40μM的溶液。取100×的抗生素溶液(10,000U)，用EG液体培养基配置成100，10，5，2.5，1.25，0.625，0.3125U的溶液；
(2)取96孔板，将具核梭杆菌菌液加入孔中，3个复孔，每孔50μL。然后每孔加入50μL不同浓度的香兰素衍生物IPM711和IPM712溶液；EG液体培养基加具核梭杆菌菌液作为阴性对照；EG液体培养基作为空白对照；EG液体培养基加0.4％DMSO作为溶剂对照；EG液体培养基加抗生素溶液作为阳性对照。放置在厌氧盒，37℃培养箱培养24h；
(3)培养24h后，每孔加入10μL MTT，37℃放置培养4h，然后4000r/min离心10min，弃上清，每孔加入100μLDMSO，震荡摇匀30min；
(4)用酶标仪测量490nm波长处的吸光度值。结果以平均值±标准差表示。按照公式：抑制率(％)＝(OD阴性对照-OD实验组-2×OD空白对照)/(OD阴性对照-OD空白对照)*％，计算抑制率；实验独立重三次。
结果如图3所示，随着菌液被梯度稀释，还原MTT后的溶液颜色逐渐变浅，表明菌的数目和溶液颜色呈正相关关系(图3，A所示)；进一步用酶标仪测定490nm波长处的吸光度值并绘制标准曲线，OD490值与稀释倍数符合方程y＝1.007x-0.007，并且R2>0.99，线性合格，表明MTT法可以用于检测细菌数目(图3，B所示)。
在MTT标准曲线的基础上，进一步地探究了香兰素衍生物IPM711、IPM712对具核梭杆菌的抑制率，以抗生素作为阳性对照。结果如图4所示，随着香兰素衍生物浓度增加，具核梭杆菌数目减少，还原MTT所产生的紫色逐渐变浅(图4，A所示)；香兰素衍生物IPM711和IPM712在80μM浓度时抑制率分别达到了88.09％，88.00％；而抗生素在50U浓度时，抑制率为87.25％(图4，B所示)。上述结果表明香兰素衍生物IPM711和IPM712对具核梭杆菌具有良好的抗菌活性，并且具有浓度依赖性。
3.香兰素衍生物对细菌膜渗透性的影响
碘化丙啶(PI)是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。PI虽然不能穿透完整细胞膜，但能够穿透凋亡晚期细胞和死细胞的破损细胞膜。因此采用PI染色研究香兰素及其衍生物对具核梭杆菌细胞膜渗透性的影响。具体操作如下：
(1)取对数生长期的具核梭杆菌菌液，10,000r/min离心5min，弃上清，用EG培养基(不含马血)调节OD值约0.4，备用。取香兰素衍生物IPM711和IPM712母液，用EG液体培养基(不含马血)分别配置成MIC浓度的溶液。取100×的抗生素溶液(10,000U)，用EG液体培养基(不含马血，L-半膀氨酸和可溶性淀粉)配置成MIC浓度的溶液。取PI溶液，用蒸馏水配置成20μg/mL溶液，包锡箔纸避光，现配现用。
(2)取2mL离心管，加入0.5mL具核梭杆菌菌液和0.5mL香兰素衍生物IPM711和IPM712溶液，EG液体培养基(不含马血)作为阴性对照；抗生素作为阳性对照；各两支(两套)。放置在厌氧盒，37℃培养箱培养24h。
(3)培养24h后，其中一套，10,000r/min离心5min，弃上清，加入1×PBS 0.5mL重悬，然后加入50μLPI染色15min。10,000r/min离心5min，弃上清，加入1×PBS洗涤2遍，最后用1mL1×PBS重悬。另外一套，先用4％多聚甲醛固定20min，然后10,000r/min离心5min，弃上清，加入1×PBS 0.5mL重悬，然后加入50μL PI染色15min。10,000r/min离心5min，弃上清，加入1×PBS洗涤2遍，最后用1mL 1×PBS重悬。
(4)吸取20μL菌液于载玻片，加盖玻片。用荧光显微镜观察染色情况。
结果如图5所示，根据A(阴性对照组双抗处理后PI染色20倍视野)，D(香兰素加双抗处理后PI染色20倍视野)，H(香兰素衍生物IPM711加双抗处理后PI染色20倍视野)，K(香兰素衍生物IPM712加双抗处理后PI染色20倍视野)，N(抗生素加双抗处理后PI染色20倍视野)可知，香兰素对具核梭杆菌几乎无抑制作用，香兰素衍生物IPM711，IPM712和抗生素在MBC浓度时明显减少具核梭杆菌，即红色变少；根据B(阴性对照组直接PI染色20倍视野)、C(阴性对照组直接PI染色40倍视野)、E(香兰素处理后直接PI染色20倍视野)、F(香兰素处理后直接PI染色40倍视野)可知，红色较少，表明大部分细菌为活菌；根据I(香兰素衍生物IPM711处理后直接PI染色20倍视野)、J(香兰素衍生物IPM711处理后直接PI染色40倍视野)，L(香兰素衍生物IPM712处理后直接PI染色20倍视野)、M(香兰素衍生物IPM712处理后直接PI染色40倍视野)、O(抗生素处理后直接PI染色20倍视野)、P(抗生素处理后直接PI染色40倍视野)可知，红色较多较亮，和H、K、N分别相比，红色部分几乎相等，表明香兰素衍生物IPM711、IPM712和抗生素在MBC浓度时能够增加具核梭杆菌细胞膜渗透性，使细菌DNA被PI染色。当具核梭杆菌细胞膜渗透性增加，导致内容物流出，进一步导致细菌死亡。
4.香兰素衍生物对细菌壁的影响
荧光染色实验表明香兰素衍生物IPM711和IPM712能够增加细胞膜渗透性，但是无法确定细胞完整性是否改变。为了能够直接地观察药物作用于具核梭杆菌后细胞完整性的变化，采用扫描电镜进行直观的观察，具体操作如下所示：
(1)取对数生长期的具核梭杆菌菌液，10,000r/min离心5min，弃上清，用EG培养基(不含马血)调节OD值约0.4，备用。取香兰素，香兰素衍生物IPM711和IPM712母液，用EG液体培养基(不含马血)分别配置成MIC浓度的溶液。
(2)取2mL离心管，每支离心管加入0.5mL菌液，0.5mL药液，混匀，37℃孵育3h。
(3)孵育结束后，10,000r/min离心5min，弃上清，加入1mL 2.5％戊二醛溶液，混匀，4℃固定4h；10,000r/min离心5min，弃上清，用1mL 1×PBS洗1遍。
(4)依次用20％，50％，80％，100％，100％，100％乙醇脱水15min。最后用无水乙醇重悬至合适的浓度。
(5)冷冻干燥4h，喷金，扫描电镜观察。
结果如图6所示，阴性对照组的具核梭杆菌表面光滑，结构完整(图6，A所示)；香兰素对具核梭杆菌几乎无影响，其结构仍然保持完整光滑(图6，B所示)；香兰素衍生物IPM711和IPM712作用于具核梭杆菌后，细菌表面不再光滑(药物粒子吸附到细菌外表面)，细胞完整性被破坏，菌体出现断裂，破裂，内容物外泄(图6，C和D所示)。上述结果表明，香兰素衍生物IPM711和IPM712能够破坏具核梭杆菌细胞壁/细胞膜的完整性，从而导致细菌死亡。
5.香兰素衍生物与具核梭杆菌DNA的相互作用
荧光染色和SEM实验证实，香兰素衍生物IPM711和IPM712能够增加具核梭杆菌细胞膜渗透性，并破坏细胞完整性。因此，为了进一步探究香兰素衍生物IPM711和IPM712是否能够进入到细胞内和基因组DNA相结合来直接影响基因的转录，表达，从而影响细胞壁的合成或者细胞膜的完整性，本研究测试了药物和基因组DNA的结合活性。其中，EMSA实验用于评估基因组DNA与化合物的结合活性，结合药物的DNA复合物在凝胶中的迁移比未结合药物的DNA片段迁移地更慢，具体操作如下：
(1)取对数生长期的具核梭杆菌菌液，10,000r/min离心5min，弃上清，提取基因组DNA，用NanoDrop 2000测量DNA浓度。
(2)将总共40μL固定浓度(100ng/μL)的基因组DNA与香兰素衍生物混合(终浓度为MIC)。相同体积的EG培养基(不含马血)作为阴性对照。室温下一式三份孵育10min。
(3)取对数生长期的具核梭杆菌菌液，10,000r/min离心5min，弃上清，用EG培养基调节OD600至0.5，取香兰素，IPM711和IPM712母液，用EG液体培养基分别配置成MIC浓度的溶液。然后将1mL菌液与1mL药液混合，EG培养基作为阴性对照。厌氧条件下，37℃孵育24h。10,000r/min离心5min，弃上清，提取基因组DNA，用NanoDrop 2000测量DNA浓度。
(4)将总共5μL固定浓度(100ng/μL)的DNA与1μL的loading Buffer混合，上样检测。
(5)琼脂糖凝胶电泳用于检查化合物与基因组DNA之间的相互作用。
结果如图7所示，首先提取具核梭杆菌基因组DNA，然后和药物孵育并凝胶电泳，EG培养基和PBS作为阴性对照，抗生素作为阳性对照。所有基因组条带在同一水平，表明未与药物相结合(图7，A所示)；随后本研究进行了体内实验，先进行药物处理，在进行基因组提取和凝胶电泳，所有DNA条带几乎在同一水平，表明未与药物相结合。但是，香兰素衍生物IPM711和IPM712处理组的DNA条带明显比对照组暗，香兰素处理组的DNA条带较亮，从侧面反映出香兰素衍生物IPM711和IPM712对具核梭杆菌的抑制效果(图7，B所示)。EMSA实验结果表明，香兰素衍生物IPM711和IPM712并非直接和具核梭杆菌基因组相结合来影响基因的转录表达，导致细胞壁，细胞膜完整性改变，而是间接影响基因的表达，诱导细菌死亡。
实施例2香兰素衍生物抗结直肠癌活性测定
1.生物信息学分析
本研究选取GSE122182数据集，使用Affymetrix miRNA微阵列技术研究了感染了具核梭杆菌的结直肠癌及周围的正常组织的miRNA谱的表达数据。使用limma包进行探针筛选和分位数标准化预处理，使用ggplot2构建火山图。对应基因在健康人群和癌症患者中的表达差异与生存曲线使用在线网站GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)进行分析。
首先选取GSE122182数据集进行分析，该数据集来自于受具核梭杆菌感染的结直肠癌组织及其邻近正常组织的RNA测序，寻找受具核梭杆菌感染后表达改变的基因。如图8中A图所示，首先对不同批次的测序数据进行分位数标准化处理，消除批次间的背景差异。然后注释探针获得基因名称，计算所有基因的表达倍数变化，如图8中B所示，通过构建火山图，寻找表达差异最明显的基因，为mRNA21，其对应的基因为RASA1。该基因编码的蛋白位于细胞质中，是GTPase激活蛋白的GAP1家族的一部分。该基因产物刺激正常RAS p21的GTPase活性，但不刺激其致癌对应物。该蛋白可作为RAS功能的抑制剂，增强RAS蛋白的弱内在GTP酶活性，从而导致RAS的GDP结合形式失活，从而控制细胞的增殖和分化。导致任一蛋白质结合位点改变的突变与基底细胞癌有关。如图8中C和图8中D所示，通过分析该基因在结直肠癌患者(箱线图左)和健康人群(箱线图右)中的表达，发现RASA1基因在癌症患者中高表达，在健康人群中的表达水平较低。尽管不具有统计学显著性，生存分析显示该基因高表达的患者具有更短的生存期(曲线图上线为高表达患者生存期，下线为低表达患者生存期)。
2.香兰素衍生物抑制结直肠癌合并具核梭杆菌感染
1.qPCR反应
为了研究香兰素衍生物IPM711和IPM712靶向具核梭杆菌，进行rt-qPCR实验，对RASA，MYD88，E-cadherin，PI3KCA，β-catenin，AKT，GSK-3β基因的特异性进行了验证。设置4个分组，RPMI-1640培养基组作为对照组，实验组均经过了具核梭杆菌孵育处理。具体操作如下：
(1)HCT116细胞生长至80％时，用胰蛋白酶处理，收获细胞。1000r/min离心5min，弃上清，加入不含抗生素的RPMI-1640培养基，调节细胞浓度约为2×106。取6孔板，每孔加入1mL细胞和1mL1640培养基。放置在37℃细胞培养箱(5％CO2)培养24h。
(2)取对数生长期的具核梭杆菌菌液，10,000r/min离心5min，弃上清，用不含抗生素和胎牛血清的RPMI-1640培养基调节浓度至108CFU/mL。
(3)弃去培养皿上清，按照MOI＝1:100，将具核梭杆菌和HCT116细胞在37℃细胞培养箱(5％CO2)孵育2h，1640培养基(不含抗生素和胎牛血清)作为阴性对照。
(4)弃去上清中的具核梭杆菌，用1×PBS洗涤3遍，加入IC50浓度的香兰素衍生物IPM711和IPM712溶液，1640培养基作为阴性对照。在37℃细胞培养箱(5％CO2)培养48h。
(5)按照RNAsimple总RNA提取试剂盒(离心柱型)说明书提取细胞RNA,并保存在-80℃。
(6)使用NanoDrop2000测量RNA浓度。
(7)按照下列程序合成cDNA:
表1反转录反应体系
Figure BDA0003152739230000111
表2反转录反应条件
Figure BDA0003152739230000121
(8)使用NanoDrop 2000
测量cDNA浓度。用TE缓冲液稀释cDNA至相同浓度(100ng/μL)，所用引物序列见附表3。按照表3进行qPCR反应：
表3 qPCR反应程序
Figure BDA0003152739230000122
结果如图9所示，凝胶电泳实验显示，各基因PCR产物条带单一，片段大小正确，表明扩增准确。qPCR融解曲线均为单一峰，进一步表明引物特异性良好，可以用于后续实验分析。
基因表达结果如图10所示，其中每一组从左到右分别为对照组(Fn)、香兰素衍生物IPM711和IPM712。结果表明：(1)经过具核梭杆菌孵育，HCT116癌细胞的RASA1基因表达升高了1.29倍，在此基础上经过IPM711和IPM712的处理，该基因表达下调，和对照组相比，IPM711和IPM712疗效更好，该基因表达下调至0.18和0.32倍；(2)具核梭杆菌使得MY88基因表达下调，但香兰素衍生物IPM711和IPM712处理后，该基因无明显变化，表明药物不能作用于通路来影响具核梭杆菌诱导的结直肠癌进展；(3)E-cadherin，该基因编码钙粘蛋白超家族的钙粘蛋白。该基因功能的丧失可通过增加增殖，侵袭和/或转移来促进癌症进展，具核梭杆菌能够通过上调E-cadherin促进癌细胞转移、侵袭，香兰素衍生物IPM711和IPM712处理后使基因相对下调，抑制癌细胞的转移；(4)β-catenin，该基因编码的蛋白质是构成粘附连接(AJs)的蛋白质复合物的一部分，AJ通过调节细胞生长和细胞之间的粘附对于创建和维持上皮细胞层是必需的，具核梭杆菌能够通过β-catenin过表达，β-catenin蛋白在癌细胞中能够和FadA，E-cadherin，Annexin A1蛋白形成复合物，对于具核梭杆菌粘附细胞必不可少。香兰素衍生物IPM711和IPM712能可以β-catenin下调，减少具核梭杆菌粘附，达到治疗CRC的目标；(5)GSK-3β是一种进化保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，在许多细胞过程中起作用，包括细胞增殖，DNA修复，细胞周期，信号传导和代谢途径，具核梭杆菌能够诱导GSK-3β高表达，香兰素衍生物IPM711和IPM712相对降低了这种过表达效应；(6)AKT基因编码的蛋白可调节多种细胞功能，包括正常细胞和恶性细胞中的细胞增殖，存活，代谢和血管生成，香兰素衍生物IPM711和IPM712能够使AKT基因表达下调治疗CRC，但是具核梭杆菌孵育并不能使AKT过表达，即AKT基因不是药物靶向具核梭杆菌的靶点；(7)PIK3CA编码磷脂酰肌醇-4,5-双磷酸3-激酶催化亚基α，具核梭杆菌孵育使得PI3KCA基因表达显著上调1.74倍，IPM711和IPM712处理后明显下调，并且香兰素衍生物IPM712比IPM711具有更好的疗效(0.68倍VS 0.22倍)。上述结果表明，香兰素衍生物IPM712比IPM711能够显著抑制由具核梭杆菌感染合并的HCT116癌细胞中RASA，MYD88，E-cadherin，PI3KCA，β-catenin，AKT，GSK-3β基因，显著抑制结直肠癌合并具核梭杆菌感染。
2.Western Blot
采用Western Blot检测E-cadherin与β-catenin蛋白表达，具体操作如下：
将1×106细胞接种到6孔板中。共培养和处理与上述相同。然后用含有1％PMSF的RIPA缓冲液提取总蛋白并用Brasford法检测。使用10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离不同大小的蛋白质。之后，将蛋白质转移到0.22μm PVDF膜上，并与含有5％脱脂牛奶的Tris缓冲液一起孵育，进一步与一抗和二抗分别孵育12小时和1小时。随后，使用化学发光分析系统和ImageJ 1.43软件分析蛋白质的表达。GAPDH用作全细胞裂解物的对照。
结果如图11所示，具核梭杆菌处理后的HCT116细胞E-cadherin与β-catenin蛋白表达上调，使用IPM711和IPM712处理后，这两个蛋白表达下调，并且具有显著性，和qPCR结果一致。
3.细胞迁移
检测具核梭杆菌感染前后，HCT116细胞的迁移结果，具体操作如下：
取对数生长期的细胞用胰蛋白酶消化收集；将收集的细胞于1000rpm离心5min后使用低血清培养基(1％FBS)重悬细胞并计数；调整细胞密度为1×105/100μL；向低血清的细胞悬液中加入一定量的药物，使之成为特定浓度的含药细胞悬液；混匀后吸取100μL的含药细胞悬液加入上室，并在下室中加500μL含有20％FBS的培养基；于37℃、5％CO2培养孵育48h后；取出Transwell小室用PBS清洗2遍；使用4％多聚甲醛或甲醇固定20min；加入结晶紫(0.1％)染液染色(5～10min)，PBS洗2遍，用棉球擦去上表面细胞，晾干后于显微镜下取不同视野进行拍照并计数。统计不同浓度化合物处理对细胞迁移的影响，分别统计给药组与阴性组的统计学差异。
结果如图12所示，具核梭杆菌感染前，使用IPM711和IPM712处理HCT116细胞后，穿过小孔的细胞数量减少(图12中的Control组和1μM，2μM相比)，表明IPM711和IPM712能够抑制HCT116细胞的迁移；而经具核梭杆菌感染后，使用IPM711和IPM712处理HCT116细胞，穿过小孔的细胞数量明显减少(Fn+IPM711，Fn+IPM712组和1640组相比，细胞数量减少)，相对于具核梭杆菌感染前，IPM711和IPM712能够显著抑制具核梭杆菌感染后的HCT116细胞的迁移。现有的药物顺铂、伊立替康、5-FU等处理具核梭杆菌感染后的结直肠癌的疗效显著低于未经具核梭杆菌感染的疗效，存在耐药的问题。而本发明意外发现，相较于常用的化疗药物顺铂、伊立替康、5-FU等，香兰素衍生物IPM711和IPM712在合并具核梭杆菌感染情况下，能够更有效的抑制结直肠癌转移和侵袭，显著提高了结直肠癌合并具核梭杆菌感染后的疗效，解决了具核梭杆菌感染导致的耐药性问题，可用于治疗结直肠癌合并具核梭杆菌感染。
综上结果表明，香兰素衍生物IPM711和IPM712能够有效抑制具核梭杆菌的感染；且所述香兰素衍生物IPM711和IPM712在合并具核梭杆菌感染情况下，能够有效的抑制结直肠癌转移和侵袭，解决了现有化疗药物耐药的问题，可用于治疗结直肠癌合并具核梭杆菌感染。

Claims (4)

1.香兰素衍生物或其药学上可接受的盐在制备抑制具核梭杆菌感染药物中的应用，所述香兰素衍生物为IPM711或IPM712，所述IPM711的结构式如式(Ⅰ)所示，所述IPM712的结构式如式(Ⅱ)所示：
Figure FDA0003532489820000011
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述香兰素衍生物或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂、混悬剂的任一种剂型。
3.香兰素衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗结直肠癌合并具核梭杆菌感染药物中的应用，所述香兰素衍生物为IPM711或IPM712，所述IPM711的结构式如式(Ⅰ)所示，所述IPM712的结构式如式(Ⅱ)所示：
Figure FDA0003532489820000012
Figure FDA0003532489820000021
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述香兰素衍生物或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂、混悬剂的任一种剂型。
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