CN115317493A

CN115317493A - 一种硼酸类小分子化合物在制备增强免疫检查点抑制剂疗效及治疗白血病药物中的应用

Info

Publication number: CN115317493A
Application number: CN202210713434.0A
Authority: CN
Inventors: 张小雷; 王元相; 刘培庆; 莫建珊; 邓琳; 彭可人
Original assignee: Sun Yat Sen University; Guangzhou Zhongda Nansha Technology Innovation Industrial Park Co Ltd
Current assignee: Sun Yat Sen University; Guangzhou Zhongda Nansha Technology Innovation Industrial Park Co Ltd
Priority date: 2022-06-22
Filing date: 2022-06-22
Publication date: 2022-11-11
Anticipated expiration: 2042-06-22
Also published as: CN115317493B; WO2023245847A1

Abstract

本发明公开了一种硼酸类小分子化合物在制备增强免疫检查点抑制剂疗效及治疗白血病药物中的应用。该硼酸类小分子化合物可增强免疫检查点抑制剂的疗效，且对白血病具有较好的治疗效果，在制备增强免疫检查点抑制剂疗效的药物方面及制备治疗白血病的药物方面具有广泛的用途。

Description

一种硼酸类小分子化合物在制备增强免疫检查点抑制剂疗效及治疗白血病药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种硼酸类小分子化合物在制备增强免疫检查点抑制剂疗效及治疗白血病药物中的应用。

背景技术

白血病是常见的血液系统恶性肿瘤，也是一种常见的造血系统异常的恶性克隆性疾病，以增殖、克隆、低分化或异常分化的造血细胞浸润骨髓、血液以及其它组织为特征。白血病是造成癌症相关死亡的十大恶性肿瘤之一。在我国，白血病的发病率约为每百万人3～4例，由于我国人口基数大，因此，白血病的发病人群仍非常庞大，严重危害病人的生命安全，为患者和社会带来极大的医疗负担。由于白血病自身疾病性质所限制，手术切除的治疗策略并不适用，目前针对白血病的治疗策略主要以传统的化疗为主，还有造血干细胞移植、分子靶向治疗、免疫疗法等策略。但是由于化疗方法容易产生耐药性以及对某些病人不耐受，化疗方法并不能很好的治疗白血病，而且还可能会带来预后更差的复发性难治性白血病。而造血干细胞移植受到供体来源，以及耗费大、容易产生免疫排异反应等原因的限制，并不能很好的适用于所有白血病病人。因此，急需研究出新的治疗方法或药物用以治疗白血病，为白血病病患带来福音，减轻白血病治疗的医疗负担。

随着细胞生物学和各种组学的发展，在精准医疗的大背景下，癌症治疗也转向分子靶向治疗和免疫治疗。分子靶向药物具有靶点和药效明确、选择性高、副作用小、能够提高患者总生存期等优点，目前已变成癌症治疗药物开发研究中的热点。此外，免疫检查点抑制剂也是目前癌症治疗中的一大热点，在许多癌症中取得了巨大的成功，它们能够调动机体的免疫系统，提高抗肿瘤免疫反应，从而达到治疗癌种的效果。但是现存的分子靶向药物，仅适用于某些基因突变或表达改变的病人，应用范围有限，而免疫检查点抑制剂在白血病中进行单药治疗时，存在响应率低、应用困难以及副作用等问题，限制了它们在临床上的进一步应用。而越来越多的研究表明，联合用药尤其是联合免疫调节剂和免疫检查点抑制剂，在治疗癌症中会获得意想不到的效果。

STAT3(signal transducer and activators of transcription 3，信号转导与转录激活因子3)是一个存在于胞浆的信号转导与转录激活因子，被激活后转入核内与靶基因结合，从而调节下游靶基因的表达，在细胞内起到信号转导与转录激活的双重作用。临床研究表明，超过70％的人类肿瘤与STAT3的持续激活有关。在多种癌细胞中，STAT3过度激活，从而调节包括 Cyclin D1，c-Myc，Bcl-xL，Mcl1，p53等在内的下游靶基因的表达，进而参与癌症的增殖、存活、凋亡、浸润、血管生成及免疫抑制等过程。在白血病中，STAT3也是过活化的，且与白血病的预后负相关。此外，STAT3还是一种重要的免疫调节分子，可以调节包括PD-L1在内的众多免疫检查点的表达，从而对肿瘤微环境中的免疫系统造成影响，这为STAT3抑制剂在增强免疫检查点抑制剂治疗癌症中的疗效提供了科学依据。因此，靶向STAT3可以开发出具有潜力的治疗白血病的药物，一方面可以通过抑制STAT3下游致癌基因的表达从而抑制白血病细胞的增殖和存活，另一方面，可通过增强免疫检查点抑制剂的疗效，从而激活免疫系统对白血病细胞的杀伤作用。

现有的STAT3抑制剂包括核苷酸类、多肽类、天然产物、合成小分子类，但是由于它们存在生物利用度低、稳定性差、毒副作用大、代谢稳定性差、疗效不明确等缺点，限制了它们进一步开发成药的潜能。硼酸是一种良好的药效基团，已经成功应用于药物开发领域，用于治疗多发性骨髓瘤的硼替佐米就是一个很好的例子。硼酸作为羧酸的生物电子等排体，他们结构类似，但由于硼酸具有较高的pKa使其在生理pH值下不电离，仍以分子形式存在，这使得带硼酸基团的脂溶性升高，细胞膜透过率增大，开发成为药物的潜能增大。此外，硼酸基团还可以模拟STAT3蛋白结构中pY口袋的四面体结构，与STAT3结合更牢靠，提高对 STAT3的靶向性和结合力。

因此，进一步研究新的白血病治疗药物，并且利用STAT3抑制剂激活免疫系统，增强免疫检查点抑制剂的疗效，有可能是治疗白血病中非常有效且可行的治疗策略，对白血病的临床治疗具有非常重要的研究意义和临床应用价值。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷或不足，提供一种硼酸类小分子化合物及其药学上可接受的盐在制备增强免疫检查点抑制剂疗效的药物中的应用。本发明研究发现硼酸类小分子化合物可增强免疫检查点抑制剂的疗效，进而在制备增强免疫检查点抑制剂疗效的药物方面具有广泛的用途。

本发明的另一目的在于提供一种硼酸类小分子化合物及其药学上可接受的盐在制备治疗白血病的药物中的应用。本发明研究发现硼酸类小分子化合物对白血病具有较好的治疗效果，进而在制备治疗白血病的药物方面具有广泛的用途。

本发明的另一目的在于提供一种联合药物。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种硼酸类小分子化合物及其药学上可接受的盐在制备增强免疫检查点抑制剂疗效的药物中的应用，所述硼酸类小分子化合物具有如式(Ⅰ)所示结构：

本发明的发明人在前期研究(2022102289627)中，开发出了一系列的硼酸类化合物，该系列硼酸化合物对STAT3蛋白具有高活性，通过抑制STAT3磷酸化、STAT3二聚体与DNA 的结合等机制显著抑制STAT3过表达的细胞活性，且化合物与STAT3靶点的结合力高，可以选择性的抑制STAT。

经进一步研究发现，这系列硼酸类化合物中，具有式(Ⅰ)所示结构的硼酸类小分子化合物能够明显增强免疫检查点抑制剂的疗效(例如在抗白血病中的疗效)。

该硼酸类小分子化合物对本领域常规的免疫检查点抑制剂均具有增强疗效的作用。

优选地，所述免疫检查点抑制剂为PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、VISTA抑制剂、CTLA-4 抑制剂、TIM-3抑制剂或LAG3抑制剂中的一种或几种。

更为优选地，所述免疫检查点抑制剂为PD-L1抑制剂或VISTA抑制剂中的一种或几种。

优选地，所述增强免疫检查点抑制剂疗效的药物为增强免疫检查点抑制剂对T细胞杀伤效应的药物。

优选地，所述增强免疫检查点抑制剂疗效的药物为增强免疫检查点抑制剂激活抗肿瘤免疫反应的药物。

本发明的发明人在前期研究(CN202210228962.7)中发现该硼酸类小分子化合物可以抑制pY705-STAT3的磷酸化及下游基因的表达，进而对胃癌有较好的治疗效果。

经进一步研究发现，该硼酸类小分子化合物能够与STAT3蛋白结合并抑制STAT3-Y705 位点的磷酸化，和下游与白血病进展相关基因的表达，具有更好的抑制白血病细胞增殖、生长，促进白血病细胞凋亡的效果。

本发明还请求保护一种硼酸类小分子化合物及其药学上可接受的盐在制备治疗白血病的药物中的应用，所述硼酸类小分子化合物具有如式(Ⅰ)所示结构：

优选地，所述白血病为急性白血病、慢性白血病或特殊类型白血病中的一种或多种。

优选地，所述硼酸类小分子化合物及其药学上可接受的盐在制备抑制白血病细胞增殖和/ 或生长的药物中的应用。

优选地，所述硼酸类小分子化合物及其药学上可接受的盐在制备促进白血病细胞凋亡的药物中的应用。

本发明还请求保护一种联合药物。

一种联合药物，包括硼酸类小分子化合物及其药学上可接受的盐，和免疫检查点抑制剂。。

该硼酸类小分子化合物除了本身具有较好的治疗白血病疗效外，其还可与免疫检查点抑制剂联用，进而具有更佳的治疗白血病疗效。

优选地，所述药物中硼酸类小分子化合物和免疫检查点抑制剂的质量比为1:0.1～10。

优选地，所述联合药物的剂型为注射剂、胶囊剂、片剂、丸剂或颗粒剂。本发明中提及的药物/联合药物的剂型均可为这几类。

本发明中提及的联合药物/药物还可包括药学上可接受的载体。

术语“药学上可接受的”是指某载体、运载物、稀释剂、辅料，和/或所形成的盐通常在化学上或物理上与构成某药物剂型的其它成分相兼容，并在生理上与受体相兼容。

术语“盐”、“药学上可接受的盐”是指上述化合物或其立体异构体，与无机和/或有机酸和碱形成的酸式和/或碱式盐，也包括两性离子盐(内盐)，还包括季铵盐，例如烷基铵盐。这些盐可以是在化合物的最后分离和纯化中直接得到。也可以是通过将上述化合物，或其立体异构体，与一定数量的酸或碱适当(例如等当量)进行混合而得到。这些盐可能在溶液中形成沉淀而以过滤方法收集，或在溶剂蒸发后回收而得到，或在水介质中反应后冷冻干燥制得。

具体地，药学上可接受的盐包括但不限于：硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐，甲烷磺酸盐(甲磺酸盐)、乙烷磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、和双羟萘酸盐；或者铵盐(例如伯胺盐、仲胺盐、叔胺盐、季铵盐)、金属盐(例如钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、锰盐、铁盐、锌盐、铜盐、锂盐、铝盐)。

相对于现有技术，本发明具有如下的优点及效果：

本发明提供的硼酸类小分子化合物与STAT3有更强亲和力，更能靶向STAT3蛋白，作用靶点和作用机制明确，能够显著抑制STAT3-Y705位点的磷酸化和下游与白血病进展相关基因的表达，具有更好的抑制白血病细胞生长、促进白血病细胞凋亡的效果，还能通过调节免疫反应，增强免疫检查点抑制剂在抗白血病中的效果。本发明为靶向STAT3蛋白开发出新的治疗白血病新药提供了重要参考，在制备白血病治疗药物中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1表示W1046抑制白血病细胞株生长的结果图；其中，图(1A)CCK8结果显示W1046处理72h后，能够剂量依赖性地抑制白血病细胞株的生长；图(1B)EdU结果显示W1046 能够明显抑制白血病细胞株的增殖；图(1C)是图(1B)的抑制白血病细胞株增殖的结果统计图。

图2表示W1046促进白血病细胞株凋亡的结果图；其中，图(2A)流式结果显示W1046能够促进白血病细胞株的凋亡；图(2B)为图(2A)流式凋亡结果的统计图；图(2C)WesternBlot检测凋亡标志蛋白的表达，其中促凋亡蛋白Bax表达增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低，凋亡活性蛋白cleaved-Caspase 7表达增加，说明W1046可以明显促进白血病细胞株的凋亡。

图3表示W1046抑制白血病病人样本生长的结果图；其中，图(3A)CCK8结果显示W1046处理病人骨髓来源样本72h后，能够剂量依赖性地抑制病人样本的生长；图(3B)流式结果显示W1046能够明显促进病人骨髓来源样本的凋亡；图(3C)为图(3B)流式凋亡结果的统计图。

图4表示W1046靶向白血病细胞内的STAT3并影响STAT3信号通路的结果图；其中图(4A)Western Blot结果显示W1046能够明显抑制白血病细胞内STAT3-Y705位点的磷酸化，降低下游与白血病进展相关的c-Myc、Bcl-xL基因的表达；图(4B)报告基因结果显示W1046能够剂量依赖性地抑制STAT3的转录活性。

图5表示W1046联合VISTA单抗或PD-L1单抗在体外共培养模型中增强T细胞杀伤效应的结果图；其中图(5A)结果显示W1046联合VISTA单抗能够激活抗肿瘤免疫反应，增强T细胞杀伤效应，从而增强免疫检查点抑制剂的抗白血病疗效；图(5B)结果显示，在不同E/T(E:Effector cells；T:Target cells)比例下，W1046联合VISTA单抗均能够增强T细胞杀伤效应，增强免疫检查点抑制剂在抗白血病中的效果；图(5C)结果显示，W1046联合 PD-L1单抗能够增强T细胞杀伤效应；图(5D)结果显示，在不同E/T比例下，W1046联合 PD-L1单抗能够增强T细胞杀伤效应，增强免疫检查点抑制剂在抗白血病中的效果。

图6表示W1046联合VISTA单抗在体外共培养模型中对T细胞增殖和分化的影响；其中图(6A)结果显示W1046联合VISTA单抗能够促进CD4+T细胞的分化，且效果明显优于比单药处理组；图(6B)结果显示W1046联合VISTA单抗能够促进CD8+T细胞的分化，且效果明显优于单药处理组；图(6C)CFSE细胞增殖结果显示W1046联合VISTA单抗能够促进T细胞的增殖，且效果明显优于单药处理组。

图7表示W1046联合VISTA单抗在体外共培养模型中能够促进T细胞分泌抗肿瘤细胞因子IFN-γ和IL-2；其中图(7A)ELISA结果显示W1046联合VISTA单抗能够促进T细胞分泌细胞因子IFN-γ，且联合用药组的效果比单药处理组效果好；图(7B)ELISA结果显示W1046联合VISTA单抗能够促进T细胞分泌细胞因子IL-2，且联合用药组的效果比单药处理组效果好。

图8表示W1046联合PD-L1单抗在动物模型上抑制白血病进展的结果图；其中图(8A) 为小鼠活体成像检测各处理组中AML的进展情况；图(8B)为流式检测骨髓中浸润的白血病细胞比例；图(8C)为AML小鼠经不同治疗后的生存曲线；图(8D)表示给药两周后小鼠骨髓中浸润的CD8+效应T细胞的比例。

具体实施方式

以下结合实施例和附图进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例1硼酸类小分子化合物W1046的制备

(4-(N-(4-环己基苄基)-2-((2,3,4,5,6-五氟-N-甲基苯基)磺酰氨基)乙酰氨基)苯基)硼酸 (W1046)的结构及制备过程如下：

具体制备过程为：

步骤1：制备叔丁基甲基(2-氧代-2-((4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧苯并呋喃-2-基)苯基)氨基)乙基)氨基甲酸酯(1a)

将4-氨基苯硼酸频哪醇酯(4.0g,18.26mmol)、叔丁氧羰酰基肌氨酸(4.16g,21.91mmol)、 HATU(8.33g,21.91mmol)和N,N-二异丙基乙胺(9.5ml,54.78mmol)溶于适量的N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌过夜。反应完成，乙酸乙酯以及水萃取，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂得粗产品。柱层析得白色固体4.27g，产率为60％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.77(d,J＝8.1 Hz,2H),7.51(d,J＝8.2Hz,2H),3.96(s,2H),3.01(s,3H),1.49(s,9H),1.33(s,12H).LCMS:m/ z(M+H+):390.23.

步骤2：制备叔丁基(2-((4-环己基苄基)(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧苯甲醛-2-基)苯基)氨基)-2-氧乙基(甲基)氨基甲酸酯(1b)

取氢化钠(1.23g,30.75mmol)，加入适量的超干四氢呋喃，冰浴条件下缓慢加入化合物1a (4.0g,10.25mmol)，搅拌1h后，加入4-环己基苄溴(2.6g,10.25mmol)，室温搅拌过夜。反应完成后，加水淬灭，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂得粗产品。柱层析得白色固体 4.09g，产率为70％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.77(dd,J＝12.5,8.0Hz,2H),7.10(dd,J ＝14.2,6.8Hz,4H),7.06–6.92(m,2H),4.82(d,J＝5.5Hz,2H),3.64(d,J＝52.1Hz,2H),2.88(d, J＝12.5Hz,3H),2.45(s,1H),1.78(dd,J＝41.3,12.0Hz,6H),1.44(s,4H),1.40(d,J＝18.5Hz, 9H),1.33(t,J＝5.0Hz,12H).LCMS:m/z(M+H+):562.36.

步骤3：制备N-(4-环己基苄基)-2-((2,3,4,5,6-五氟-N-甲基苯基)磺酰胺)-N-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧苯甲醛-2-基)苯基)乙酰胺(1c)

取化合物1b(3.5g,6.22mmol)，加入适量的二氯甲烷溶解，冰浴条件下加入三氟乙酸(4.6ml, 62.24mmol)，搅拌1小时。反应完全后，乙酸乙酯萃取，旋干，用适量乙腈溶解，加入N,N- 二异丙基乙胺(2.3ml,31.12mmol)、五氟苯磺酰氯(1.02ml,6.85mmol)，室温搅拌。反应完成后，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂得粗产品。柱层析得白色固体1.91g，产率为62％。 1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.69(d,J＝7.7Hz,2H),7.19(d,J＝8.2Hz,2H),7.11(d,J＝7.9 Hz,2H),7.01(d,J＝7.6Hz,2H),4.75(s,2H),3.98(s,2H),2.99(s,3H),2.44(s,1H),1.78–1.66 (m,5H),1.35(dd,J＝21.2,9.7Hz,5H),1.28(s,12H).LCMS:m/z(M+H+):692.25.

步骤4：制备(4-(N-(4-环己基苄基)-2-((2,3,4,5,6-五氟-N-甲基苯基)磺酰氨基)乙酰氨基)苯基)硼酸

取化合物1c(1.9g,2.74mmol)，加入适量的四氢呋喃和水溶解，加入高碘酸钠(1.76g, 8.23mmol)和2ml 2M稀盐酸溶液，室温搅拌。反应完成后，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂得粗产品。柱层析得白色固体1.59g，产率为95.5％。1H NMR(400MHz,DMSO) δ7.85(dd,J＝25.2,7.6Hz,2H),7.17–7.06(m,4H),7.01(d,J＝7.3Hz,2H),4.74(s,2H), 4.01(s,2H),3.02(s,3H),2.48–2.40(m,1H),1.71(dd,J＝29.9,10.5Hz,5H),1.38–1.19(m,5H). HRMS(ESI)calcd for C28H28N2O5BF5S(M+H+):611.1810；found 611.1808.

实施例2硼酸类小分子化合物W1046抑制白血病细胞的增殖

(1)细胞培养

本发明所用的人源白血病细胞株MOLM-13、Mv4-11、THP-1、K562均培养于含有10％胎牛血清和1％双抗青霉素与链霉素的RPIM-1640培养基中，HL60培养于含有10％胎牛血清和1％双抗青霉素与链霉素的IMDM培养基中，鼠源的白血病病细胞株C1498培养于含有10％胎牛血清和1％双抗青霉素与链霉素的RPIM-1640培养基中；所有细胞培养于37℃，5％CO₂的恒温培养箱中。

(2)CCK8法检测细胞增殖

取对数生长期的白血病细胞，以(5～10)×10³/孔，100μL/孔的细胞密度接种于96孔板中，培养12～24h后，设置不加药对照组、空白组和给药组，不加药对照组细胞只加等体积培养基；空白组不加细胞，也不加药，只有培养基；给药组细胞加入不同浓度的小分子化合物W1046，继续培养72h，然后往96孔板中避光加入10μL/孔的CCK8检测试剂，37℃避光孵育1～4h，用酶标仪检测450nm波长下的吸光度值(OD)。实验独立重复三次。细胞活力(％)＝[OD(加药)-OD(空白)]/[OD(对照)-OD(空白)]×100％。最后用GraphPad Prism 8软件进行非线性回归得到对应的半数抑制浓度(IC₅₀)。

(3)EdU法检测细胞增殖

取对数生长期的细胞，以(20～30)×10⁴/孔接种于六孔板中，培养12～24h后加入不同浓度的W1046进行处理，继续培养72h，然后加入适合浓度的EdU工作液，继续培养2h，将细胞转移到离心管中，离心弃去培养基，留少量培养基重悬细胞，加入1mL 4％多聚甲醛固定液，室温固定15min，离心弃去上清。加入3％BSA洗涤液，洗涤5min，离心弃去上清，洗三次。去除洗涤液，加入1mL 0.3％Triton X-100通透液，室温孵育15min。离心弃去通透液，加入洗涤液，洗涤5min，洗涤2次。配制Click反应液(以1份样品为例：Click ReactionBuffer:430μL，CuSO4:20μL，Azide 555:1μL，Click Additive Solution:50μL)，弃去上一步的洗涤液，加入Click反应液，轻轻混匀，室温避光孵育30min。吸除Click反应液，用洗涤液洗涤3次，每次5min。用流式细胞仪检测细胞增殖情况。

(4)实验结果

实验结果如图1所示，图(1A)结果显示W1046在不同浓度下处理MOLM-13、Mv4-11、THP-1、K562、HL60、C1498这些白血病细胞株72h后，均能够明显的剂量依赖性地抑制这些白血病细胞的生长，经过拟合各细胞在药物处理下的抑制增殖曲线，这些白血病细胞株的IC₅₀分别为1.86、0.95、3.24、0.94、1.39、5.01μM；图(1B)显示EdU法检测W1046抑制白血病细胞株增殖的影响，结果显示，W1046处理后，随着剂量增大能够明显抑制白血病细胞的增殖；图(1C)为图(1B)的统计图，结果显示W1046处理后，与对照组相比，细胞增殖具有统计学差异。

实施例3硼酸类小分子化合物W1046促进白血病细胞的凋亡

(1)流式检测细胞凋亡

取经过W1046处理的细胞，因所用白血病细胞株均为悬浮细胞，所以用移液枪将细胞轻柔地转移到离心管中(避免大力造成细胞过度机械损伤)，离心去除培养基，用预冷的PBS 洗两次，尽可能去除PBS。用400μL 1×Annexin V结合液重悬细胞，浓度大约为1×10⁶cells/mL，置于冰上。在细胞悬浮液中加入5μL Annexin V-FITC染色液，轻轻混匀后静置于冰上避光孵育15min，然后加入10μL PI染色液，轻轻混匀后，冰上避光孵育5min，立即用流式细胞仪进行检测。

(2)蛋白质免疫印记(Western Blot)检测凋亡相关蛋白的表达

收集经过W1046处理72h后白血病细胞，离心弃去上清，加入1mL PBS洗涤一次，离心弃去PBS，然后加入裂解液(RIPA:PMSF:phosphatase A:phosphatase B＝100:1:1:1)，冰上静置15min进行裂解，每5min涡旋一次，然后4℃，15000rpm离心15min，取上清进行蛋白定量，加入5×Loading Buffer，100℃煮沸5min。然后用聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE电泳分离蛋白样品，然后转移至硝酸纤维素薄膜(PVDF膜)上，经5％BSA封闭1h后，分别用 Bax、Bcl-2和β-Actin的一抗在4℃下孵育过夜，再分别用带有荧光标记的兔二抗、鼠二抗室温孵育1h，ECL化学发光液避光孵育2min，最后用Bio-RAD显影仪检测蛋白的表达水平。

(3)实验结果

实验结果如图2所示，图(2A)结果显示W1046在不同浓度处理白血病细胞株后，流式结果显示能够明显促进细胞的凋亡；图(2B)为图(2A)的统计结果图，结果显示与不加药对照组相比，W1046促进白血病细胞株凋亡具有统计学差异；图(2C)Western Blot结果显示，W1046处理后，促凋亡蛋白Bax表达升高，抗凋亡蛋白Bcl-xL表达降低，凋亡活性蛋白Cleaved-Caspase-7表达升高，说明凋亡标志性蛋白发生改变，蛋白凋亡途径被激活。综上所述，W1046能够显著促进白血病细胞株的凋亡。

实施例4硼酸类小分子化合物W1046抑制白血病病人样本的生长

(1)白血病病人样本细胞的分离与培养

1)准备病人样本培养基

骨髓标本收集自中山大学附属第三医院收治的白血病患者，该实验已经通过中山大学附属第三医院医学伦理委员会批准，所有患者签署了知情同意书。

用含有10％胎牛血清的RPIM-1640培养基培养5637细胞，置于37℃，5％CO₂的恒温培养箱中。待细胞长到汇合度60％时，吸去培养基，加入新鲜的含有20％胎牛血清的RPIM-1640 培养基，继续培养72h后，收集培养基上清用0.2μM滤膜过滤，得到含有多种细胞因子和生长因子的培养基。白血病病人样本细胞需要培养在含20％胎牛血清+20％5637细胞培养基上清+1％ITS细胞添加剂的RPIM-1640培养基中。

2)骨髓来源白血病细胞的分离

在5mL离心管中，往白血病病人骨髓液中加入2倍体积的PBS，充分混匀。用无菌滴管将稀释后的病人样本沿着管壁缓缓加入预先装有与稀释后样本等体积的淋巴细胞分离液的 15mL离心管中(切勿打破淋巴细胞分离液界面)，800×g，离心30min，注意缓慢降速，轻拿轻放。离心后的样本分为4层，最上层黄色透明状液体为血清层，中间层白色浑浊物为淋巴细胞或单核细胞，下层透明液体为混有血小板等其他血液成分的细胞分离液层，最下层为红细胞层。预先在新的离心管中加入2倍体积的PBS，将单核细胞层吸出(切勿吸到其他层) 加入离心管中，800×g，离心10min，弃上清。加入适量红细胞裂解液裂解残余红细胞，冰上裂解5min，加入2倍体积PBS终止反应，800×g，离心5min,弃上清。加入病人样本培养基继续培养或者冻存。

(2)CCK8法检测白血病病人样本增殖

方法实施案例2所示。

(3)流式检测白血病病人样本凋亡

方法如实施案例3所示。

(4)实验结果

实验结果如图3所示，图(3A)表示利用CCK8法检测W1046对白血病病人样本增殖的影响，结果显示W1046在不同浓度下处理白血病病人样本72h后，能够明显剂量依赖性地抑制病人样本的生长，经过拟合各细胞在药物处理下的抑制增殖曲线，W1046在白血病病人样本上的IC₅₀为5.37μM；图(3B)为流式检测W1046对白血病病人样本凋亡的影响，结果显示，流式结果显示W1046能够明显促进细胞的凋亡；图(3C)为图(3B)的统计结果图，结果显示与不加药对照组相比，W1046促进白血病细胞株凋亡具有统计学差异。

实施例5 W1046靶向白血病细胞内的STAT3并影响STAT3信号通路

(1)蛋白质免疫印记(Western Blot)检测W1046对STAT3信号通路相关蛋白的影响

Western Blot具体实施步骤参照实施例3，取经W1046处理过24h后的白血病细胞株，经过提取总蛋白、SDS-PAGE电泳分离、转移至硝酸纤维素薄膜(PVDF膜)上之后，检测pY705-STAT3、T-STAT3、c-Myc、Bcl-xL、β-actin的表达。

(2)报告基因检测STAT3转录活性

293T细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM中，取对数生长期的细胞消化，计数，将细胞以1～2×10⁴个/100μL的密度接种于96孔板中，将细胞培养于5％CO₂，37℃培养箱中，待细胞贴壁长到汇合度70％～80％时，进行细胞转染。分别在无菌的1.5mL EP管中配制A、 B两种混合溶液(以下为每一孔的用量：A:0.25μL Lipo 2000+OPTI-MEMI培养基，体积为 5μL；B:50ng pGL3-STAT3-promoter质粒+50ng STAT3C质粒+40ng TKRL(海肾萤光素报告基因质粒)+OPTI-MEM培养基，体积为5μL)，轻轻混匀，静置5min，再将A溶液转移到B管中，轻轻混匀，室温静置15min。用移液枪将10μL配制好的转染液滴加至96孔板中，置于细胞培养箱中继续培养。转染24h后，加入不同浓度的W1046化合物继续处理24h。将萤火虫萤光素酶检测试剂和海肾萤光素酶检测缓冲液融解至室温，海肾萤光素酶检测底物 (100X)置于冰浴上备用；按照每孔25μL用量，取适量海肾萤光素酶检测缓冲液，按照1:100 加入海肾萤光素酶检测底物(100X)配制成海肾萤光素酶检测工作液；取出96孔板，弃去培养基，每孔加入50μL报告基因细胞裂解液，震荡混匀10min；取25μL裂解液至96孔白板中，每孔再加入25μL萤火虫萤光素酶检测试剂，震荡混匀5min，检测得到RLU1；在完成上述测定萤火虫萤光素酶步骤后，每孔加入25μL海肾萤光素酶检测工作液，震荡混匀5 min，检测得到RLU2；得到RLU1/RLU2的比值。

(3)实验结果

实验结果如图4所示，图(4A)蛋白质免疫印迹结果显示，W1046随着浓度的增加能够显著抑制STAT3-Y705的磷酸化水平，并且能够明显抑制STAT3信号通路下游与白血病进展相关的c-Myc、Bcl-xL基因的表达；图(4B)报告基因结果显示，W1046能够剂量依赖性地抑制STAT3的转录活性。

实施例6硼酸类小分子化合物W1046联合VISTA单抗或PD-L1单抗在体外共培养模型中增强T细胞杀伤效应

(1)MOLM-13-EGFP/Luc细胞株的构建

取对数生长期的MOLM-13以(25～35)×10⁴的量接种于六孔板中，体积为1mL。加入聚凝胺，使其终浓度为10μg/mL，加入1mL包裹了plenti-EGFP-Luc(可以表达EGFP绿色荧光和Luciferase萤火虫荧光素酶)质粒的慢病毒，于培养箱中继续培养12h；慢病毒感染 12h后，将细胞转移至2mL离心管中，1000rpm，离心2min，弃去培养基；加入新鲜培养基，转移至6孔板中继续培养；病毒感染48h后，加入嘌呤霉素，使终浓度为2.5μg/mL，连续筛选2周；利用细胞成像系统观察细胞的绿色荧光表达程度，或者利用Stedy-Glo对萤火虫荧光素酶活性进行检测，以验证细胞构建成功。

(2)T细胞介导的细胞杀伤实验

利用3μM的W1046处理对数生长期的MOLM-13-EGFP/Luc24 h。同时将PBMCs或者不同E/T(E：Effector cells,此处为激活的PBMCs细胞)比例接种于96孔板中，加入终浓度为1μg/mL的CD3和3μg/mL的CD28抗体，继续培养24h，以激活T细胞。将经过W1046处理或未经过W1046处理的MOLM-13-EGFP/Luc以5×10⁴的细胞数接种于培养着预先激活的 PBMCs的96孔板中，并在孔中加入VISTA单抗或PD-L1单抗，然后进行共培养，加入终浓度为1μg/mL的CD3和3μg/mL的CD28抗体，继续培养24h。共培养24h后，重悬细胞，将细胞转移至离心管中，1000rpm，离心3min，弃去培养基；加入50μL PBS重悬细胞，将 25μL细胞悬液加入96孔白板中，然后加入25μL Stedy-Glo检测试剂，振荡培养5min，检测得到萤火虫荧光素酶活性。分别与Control组比较，得出T细胞杀伤的效果。

(3)实验结果

结果如图5所示，图(5A)T细胞杀伤效应结果显示，W1046、VISTA单抗或者W1046 联合PD-L1单抗均能增强T细胞对白血病细胞的杀伤效应，但是W1046与VISTA单抗联用组增强T细胞杀伤的效果明显比对照组或单药处理组好，说明W1046能够增强VISTA单抗在抗白血病中的效果；图(5B)为不同T细胞比例下的细胞杀伤效果，结果显示，在不同E/T 比例下，W1046、VISTA单抗或者W1046联合VISTA单抗均能增强T细胞对白血病细胞的杀伤效应，但是W1046与VISTA单抗联用组始终是增强效果最强的，进一步验证了W1046 能够增强PD-L1单抗在抗白血病中的效果；图(5C)结果显示W1046联合PD-L1单抗均能增强T细胞对白血病细胞的杀伤效应；图(5D)结果显示，在不同E/T比例下，W1046、PD-L1 单抗或者W1046联合PD-L1单抗均能增强T细胞对白血病细胞的杀伤效应，但是W1046与 PD-L1单抗联用组始终是增强效果最强的。这些结果证明了W1046能够通过增强免疫检查点抑制剂如VISTA单抗或PD-L1单抗的效果，激活抗肿瘤免疫反应，进一步增强抗白血病效应。

实施例7硼酸类小分子化合物W1046联合VISTA单抗单抗在体外共培养模型对T细胞增殖和分化的影响

(1)流式抗体染色

将细胞(细胞系来源或者组织来源)用Cell Staining Buffer洗涤2次，4℃，500×g，离心5min，弃上清；加入100μL Cell Staining Buffer重悬细胞，加入相应的流式抗体，混匀，于冰上避光孵育15～20min；加入Cell Staining Buffer，4℃，500×g，离心5min，弃上清；加入Cell Staining Buffer洗2次，4℃，500×g，离心5min，弃上清；加入300μL CellStaining Buffer重悬细胞，并且加入5μL 7-AAD，终浓度约为0.25μg/million cells，避光孵育5min；立即用流式细胞仪进行检测。

(2)流式检测T细胞分群

利用3μM的W1046处理对数生长期的MOLM-13细胞24h；同时用含10％FBS的 RPIM-1640培养基重悬PBMCs、计数，以100×10⁴cells/孔，100μL/孔的密度接种于96孔板中，然后加入1μg/mL的anti-CD3和3μg/mL的anti-CD28抗体进行激活，继续培养24h； 24h后，将经过或未经过W1046处理的MOLM-13细胞重悬、计数，以10×10⁴cells/孔接种于含有激活的PBMCs的96孔板中，然后在相应的孔中加入VISTA单抗，继续培养72h；共培养72h后，将96孔板取出，将细胞转移至1.5mL EP管中，500×g，离心5min，弃去培养基；加入1mL PBS重悬细胞，4℃，500×g，离心5min，弃去PBS，重复洗涤1次；弃去PBS，加入100μL Cell StainingBuffer，重悬细胞，加入相应的流式抗体进行避光染色；加入Cell Staining Buffer洗涤2次后，用300μL的Cell Staining Buffer重悬，用流式细胞仪进行检测相应的CD4+和CD8+的T细胞分群。

(3)CFSE检测T细胞增殖

利用3μM的W1046处理对数生长期的MOLM-13细胞24h；将Jurkat细胞转移至15mL或50mL离心管中，1000rpm离心2min，弃去培养基；加入10mL PBS重悬细胞，1000rpm 离心2min，弃上清，重复洗涤一遍，弃去PBS。用PBS将CFSE染液稀释成5μM，往细胞中加入1mLCFSE染色液，重悬细胞，室温避光孵育10min；(注意：以下步骤均在避光环境下进行)；加入含10％FBS的RPIM-1640培养基终止染色，1000rpm离心2min，弃去培养基；加入10mL PBS重悬洗涤细胞，1000rpm离心2min，弃去PBS；共洗涤3次；弃去PBS，加入含10％FBS的RPIM-1640培养基重悬细胞并计数，以16×10⁴个/孔接种于96孔板中(100 μL/孔)，加入1μg/mL的anti-CD3和3μg/mL的anti-CD28抗体进行激活，继续培养24h；将经过或未经过W1046处理的MOLM-13细胞，以2×10⁴个/孔接种于含有激活的Jurkat细胞的96孔板中，然后在相应的孔里加入VISTA单抗，继续共培养72h。共培养72h后，利用流式检测被CFSE标记的Jurkat细胞的增殖情况。

(4)实验结果

实验结果如图6所示，其中图(6A-6B)流式结果显示，在共培养72h后，W1046、VISTA单抗或W1046联合VISTA单抗均能够促进T细胞向CD4+和CD8+T细胞分化，且W1046 联合VISTA单抗组增加CD4+和CD8+T细胞比例的效果明显优于对照组或任一单药应用组，说明W1046联合VISTA单抗能够促进T细胞向抗肿瘤效应T细胞分化；图(6C)CFSE流式结果显示，共培养72h后，W1046、VISTA单抗或W1046联合VISTA单抗均能够促进T 细胞增殖，且W1046联合VISTA单抗组促进T细胞增殖的效果比对照组或任一单药应用组好，说明W1046联合VISTA单抗能够激活T细胞。这些结果说明W1046能够增强VISTA 单抗在激活抗肿瘤效应T细胞方面的效果。

实施例8硼酸类小分子化合物W1046联合VISTA单抗在体外共培养模型促进T细胞分泌抗肿瘤细胞因子IFN-γ和IL-2

(1)ELISA检测IFN-γ的分泌

1)样本采集

用3μM的W1046处理对数生长期的MOLM-13细胞24h；同时将Jurkat以40×10⁴个/孔，100μL/孔接种于96孔板中，加入50ng/mL的PMA和1μg/mL的离子霉素刺激，继续培养24h；往被激活的Jurkat细胞中以4×10⁴个/孔密度加入经过或未经过W1046处理的 MOLM-13细胞，按照对应组别加入VISTA单抗，添加培养基至总体积为200μL，继续共培养72h；72h后，取出96孔板，离心300×g，离心10min，将上清转移至离心管中备用；

2)IFN-γ标准品的准备

将试剂盒里面的标准品粉末短暂离心，按照提示加入相应体积的ddH₂O溶解标准品，轻轻涡旋振荡，确保充分混匀；静置10～30min，冰上放置备用，用前混匀；梯度稀释标准品：取230μL浓缩的IFN-γ标准品，加入230μL新鲜含10％FBS的RPIM-1640培养基(后续稀释也用新鲜的含10％FBS的RPIM-1640培养基稀释)，此浓度为最高浓度，然后使用倍半稀释法将标准品稀释成一系列浓度的标准品样品。以稀释用的培养基作为零浓度。

3)检测步骤

①浸泡酶标板：往酶标板的孔中加入300μL 1×洗液，静置30s，然后倒掉洗液，倒扣在吸水纸上吸干；

②加标准品：在标准品孔中加入100μL稀释成一定浓度的标准品，在空白孔加入稀释用的培养基；

③加样品：往样品孔中加入100μL步骤“1)样品采集”中经过不同处理得到的样品；

④加检测抗体：每孔加入50μL稀释后的检测抗体(1:100稀释)；保证①②③④步骤在 15min内做完；

⑤孵育：使用封板膜封板，300rpm振荡，室温孵育2h；

⑥洗涤：弃掉液体，每孔加入300μL吸液洗板，每次振荡1min，弃去液体，倒扣在吸水纸上拍干；共洗涤6次；

⑦加酶孵育：在最后一次弃去洗液后，尽量拍干除掉孔中的液体，每孔加入100μL稀释后的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(1:100稀释)；

⑧孵育：使用新的封板膜封板，300rpm，室温孵育45min；

⑨洗涤：重复步骤⑥；

⑩加底物显色：每孔加入100μL显色底物TMB，避光，室温孵育5～30min，判断标准为低浓度标准品孔中的溶液变浅黄色；

加终止液：每孔加入100μL终止液，颜色由黄色变蓝色；

检测：30min内，使用酶标板进行双波长读数，首先检测450nm处最大吸收波长的读数，然后测定570nm处参考波长的读数。

绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品孔中IFN-γ的浓度。

(2)ELISA检测IL-2的分泌

1)样本采集

同“ELISA检测细胞因子IFN-γ的分泌”中“1)样本采集”所述步骤一致。

2)IL-2标准品的制备

往试剂盒里的IL-2标准品加入标示体积的ddH₂O，用移液枪轻轻混匀；静置10～30min，冰上静置备用，用前确保混匀充分；梯度稀释标准品：取500μL步骤②中的标准品于1.5mL EP管中，作为最高浓度，然后从最高浓度管中取250μL标准品，加入250μL新鲜的含10％ FBS的RPIM-1640培养基(此后标准品及样品稀释均用此培养基)；然后利用倍半稀释的方法配制一系列浓度的标准品；以稀释用的培养基作为零浓度点。

2)检测步骤

①抗体包被：在未包被抗体的酶标板中加入100μL稀释后的捕获抗体(1:250稀释)，4℃ 孵育过夜；

②洗涤：第二天，弃去板里面的液体，加入250μL Washing Buffer洗涤，300rpm振荡 1min，弃去洗涤液，倒扣在吸水纸上吸干，共洗涤3次；

③封闭：加入200μL ELISA/ELISPOT Diluent(1×)，室温振荡孵育1h；弃去封闭液，按照步骤②洗涤步骤洗涤2次；

④加样品：在标准品孔中加入100μL“2)标准品的制备”中制备的一系列浓度的标准品，在样品孔中加入100μL“1)样品采集”得到的样品；另外在空白孔中加入100μLELISA/ELISPOT Diluent(1×)作为阴性对照；

⑤孵育：用封板膜封板，300rpm，室温孵育2h；

⑥洗涤：弃掉样品，按照步骤②洗涤酶标板3～5次，弃去洗涤液；

⑦孵育：加入100μL稀释好的检测抗体(1:250稀释)，300rpm，室温孵育1h；

⑧洗涤：按照步骤②所述洗涤3～5次，弃去洗涤液；

⑨孵育：加入100μL稀释好的Avidin-HRP(1:250稀释)，300rpm，室温孵育30min；

⑩洗涤：按照步骤②所述洗涤5～7次，弃去洗涤液；

加入100μL 1×TMB，室温孵育15min；

加入100μL Stop Solution；

检测：30min内，使用酶标板进行双波长读数，首先检测450nm处最大吸收波长的读数，然后测定570nm处参考波长的读数；

绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品的IL-2浓度。

(3)实验结果

结果如图7所示，在共培养72h后，W1046、VISTA单抗或W1046联合VISTA单抗能够明显促进T细胞分泌抗癌细胞因子IFN-γ和IL-2，且W1046联合VISTA单抗组促进T细胞分泌IFN-γ和IL-2的效果比对照组或任一单药应用组好。这些结果说明W1046能够增强VISTA单抗的效果，W1046联合VISTA单抗具有最好的抗白血病效果。

实施案例9硼酸类小分子化合物W1046联合VISTA单抗在动物模型上具有显著的抗白血病效果

(1)构建C1498-EGFP/Luc细胞株

将带有Plenti-EGFP/Luc质粒的慢病毒感染C1498细胞，慢病毒包裹步骤参照实施案例5，病毒感染12h后进行细胞换液，然后继续培养48h后加入2.5μg/mL嘌呤霉素进行筛选，两周后利用无限稀释法挑取细胞单克隆，然后在细胞成像系统下观察带有绿色荧光的阳性细胞克隆，继续培养扩增，得到成功转入了Plenti-EGFP/Luc质粒的C1498-EGFP/Luc细胞。

(2)W1046在动物模型上抑制白血病的进展

6～8周龄的C57BL/6小鼠，适应性喂养5天。取对数生长期的C1498-EGFP/Luc细胞，离心收集细胞，用预冷的PBS洗涤两遍，离心弃上清，加入PBS重悬，得到密度为3×10⁵cells/100μL的细胞悬液，用注射器以尾静脉注射的方式将100μL细胞悬液打入小鼠体内。造模一周后，给小鼠注射荧光素钾盐后，在小动物活体成像系统中拍照观察小鼠体内荧光分布以确定模型构建成功。将小鼠随机分成4组，然后分别腹腔注射溶剂、10mg/kgW1046溶液、10mg/kg VISTA单抗、10mg/kg W1046+10mg/kg VISTA单抗。W1046每天腹腔注射给药，VISTA单抗1周给2次药，在给药后不同周期利用小鼠活体成像检测各组老鼠体内白血病的进展情况。给药2周后，各组取出6只小鼠，分离出骨髓，用流式检测骨髓中残留的C1498-EGFP/Luc细胞以及浸润的CD8+效应T细胞的比例。然后每天记录各组剩余小鼠的死亡数量，用以统计小鼠生存期。

(3)实验结果

结果如图8所示，其中图(8A)结果显示，AML小鼠模型构建成功，并且经W1046、VISTA单抗、PD-L1单抗、W1046联合VISTA单抗、W1046联合PD-L1单抗治疗后，均能显著抑制AML的进展恶化，且联合用药组的抗AML效果更强。图(8B)结果显示，在给药两周后，用流式检测各组小鼠骨髓中AML细胞的残留量，结果发现W1046、VISTA单抗或 W1046联合VISTA单抗均能够减少小鼠骨髓中AML细胞的量，且W1046联合VISTA单抗应用效果比单药处理组的抑制效果更好。图(8C)结果显示，利用W1046、VISTA单抗或 W1046联合VISTA单抗处理后，均能够明显延长AML小鼠的生存期，且W1046联合VISTA 单抗治疗后，延长小鼠生存期的效果更明显。图(8D)结果显示，利用W1046、VISTA单抗或W1046联合VISTA单抗处理后，均能够促进AML小鼠骨髓中CD8+效应T细胞的浸润，且W1046联合VISTA单抗治疗促进的效果比单药治疗组效果好。这些结果说明W1046能够增强VISTA单抗的抗肿瘤免疫反应，W1046联合VISTA单抗具有最好的抗白血病效果。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims

1.一种硼酸类小分子化合物及其药学上可接受的盐在制备增强免疫检查点抑制剂疗效的药物中的应用，其特征在于，所述硼酸类小分子化合物具有如式(Ⅰ)所示结构：

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述免疫检查点抑制剂为PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、VISTA抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIM-3抑制剂或LAG3抑制剂中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述增强免疫检查点抑制剂疗效的药物为增强免疫检查点抑制剂对T细胞杀伤效应的药物。

4.一种硼酸类小分子化合物及其药学上可接受的盐在制备治疗白血病的药物中的应用，其特征在于，所述硼酸类小分子化合物具有如式(Ⅰ)所示结构：

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述白血病为急性白血病、慢性白血病或特殊类型白血病中的一种或多种。

6.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述硼酸类小分子化合物及其药学上可接受的盐在制备抑制白血病细胞增殖和/或生长的药物中的应用。

7.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述硼酸类小分子化合物及其药学上可接受的盐在制备促进白血病细胞凋亡的药物中的应用。

8.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂、胶囊剂、片剂、丸剂或颗粒剂。

9.一种联合药物，其特征在于，所述联合药物包括硼酸类小分子化合物及其药学上可接受的盐，和免疫检查点抑制剂。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述药物中硼酸类小分子化合物和免疫检查点抑制剂的质量比为1:0.1～10。