CN115414355B - 灵菌红素在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用和治疗多发性骨髓瘤的药物 - Google Patents

灵菌红素在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用和治疗多发性骨髓瘤的药物 Download PDF

Info

Publication number
CN115414355B
CN115414355B CN202210990603.5A CN202210990603A CN115414355B CN 115414355 B CN115414355 B CN 115414355B CN 202210990603 A CN202210990603 A CN 202210990603A CN 115414355 B CN115414355 B CN 115414355B
Authority
CN
China
Prior art keywords
multiple myeloma
cells
prodigiosin
myeloma cells
medicine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210990603.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115414355A (zh
Inventor
冯湘玲
杨飞
史瑞
杜婉晴
周文
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Central South University
Original Assignee
Central South University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Central South University filed Critical Central South University
Priority to CN202210990603.5A priority Critical patent/CN115414355B/zh
Publication of CN115414355A publication Critical patent/CN115414355A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115414355B publication Critical patent/CN115414355B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/4025—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. cromakalim
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/4816—Wall or shell material
    • A61K9/4825—Proteins, e.g. gelatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了灵菌红素在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用。首次发现灵菌红素对多发性骨髓瘤细胞和正常B细胞具有选择性杀伤作用，能抑制多发性骨髓瘤细胞增殖、诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡，抑制人多发性骨髓瘤细胞在雌性B‑NDG小鼠骨髓内的定植和生长，证实了灵菌红素具有抑制多发性骨髓瘤细胞发生发展的作用，在制备多发性骨髓瘤治疗药物中具重要价值。灵菌红素制备的新的多发性骨髓瘤增殖抑制剂或治疗药物，有助于减轻多发性骨髓瘤患者经济负担，对于多发性骨髓瘤的基础研究和临床治疗应用研究具有重要的意义。

Description

灵菌红素在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用和治疗多 发性骨髓瘤的药物
技术领域
本发明属于生物医药领域，尤其涉及灵菌红素在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用，以及一种治疗多发性骨髓瘤的药物。
背景技术
多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM)是一种终末分化浆细胞的恶性增殖性疾病，是第二大常见血液系统恶性肿瘤，多见于老年人群。MM作为一种恶性肿瘤，不能治愈，其中位生存时间常在5-7年。其生物学特征是骨髓微环境中恶性浆细胞的无限增殖、血液或尿液中的单克隆蛋白及相关器官功能障碍等。有研究表明MM发病除人种差异外，与生活环境和生活方式关系密切，随着人口不断老龄化，生活习惯的改变，以及环境污染，MM的患者逐渐呈上升趋势；并且MM常见的症状和体征贫血、骨痛、肾功能不全、疲劳、高钙、感染和体重减轻这些给患者带来了很大的身体、经济负担。因此，MM的防范治疗受到了广泛的关注。
目前MM的治疗方式仍以药物治疗或药物辅助化疗为主，随着蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂等靶向药物的应用，MM患者的中位生存期由过去的3-5年提高至目前的5-7年，靶向药物主要包括硼替佐米、沙利度胺、来那度胺等，含有蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂这些新药方案的疗效明显优于传统方案，但这些新药的价格普遍比较昂贵；同时MM患者极易复发，耐药患者的比例也在逐步增多，并且MM复发耐药的机制尚不清楚，这为MM的靶向治疗带来困难。因此，寻找一种安全有效、价格低廉，对MM作用明确的药物或新的治疗策略，在减轻病人疾病负担，提高MM治疗效果，提高患者的生活质量等方面具有十分重要意义。
灵菌红素(Prodigiosin,PG)是由一些放射菌、沙雷菌及其他细菌微生物产生的一种典型的生物碱类次级代谢产物，是一类具有三吡咯环的天然色素的总称。PG具有多种生物活性，包括免疫抑制、抗菌、抗真菌、抗疟疾、抗细胞毒性、抗癌、抗衰老等多种生物学功能。近年来，研究发现PG在癌症治疗方面具有一定功效。PG诱导多种肿瘤细胞发生凋亡，但是对非恶性的肿瘤细胞并未产生毒性反应。目前，有很多研究表明PG具有抗肿瘤活性，但是PG抗肿瘤的作用机制仍不明确，且PG在MM中的应用尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，目前MM治疗药物价格昂贵、容易复发耐药等不足，提供一种灵菌红素在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用，以及一种治疗多发性骨髓瘤的药物。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
提供灵菌红素在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用。
上述的应用，优选的，所述治疗多发性骨髓瘤的药物包括抑制多发性骨髓瘤细胞增殖的药物和/或诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡的药物。
本发明实验结果显示：灵菌红素对多发性骨髓瘤细胞增殖抑制作用具有剂量依赖性，时间依赖性；灵菌红素对多发性骨髓瘤凋亡诱导作用具有剂量依赖性，剂量越大，凋亡率越高。
更优选的，所述抑制多发性骨髓瘤细胞增殖的药物中所含灵菌红素的药物浓度为50-200nmol/L，更优选为100-200nmol/L。
更优选的，所述诱导多发性骨髓瘤凋亡的药物中所含灵菌红素的药物浓度为100-500nmol/L，更优选为200-500nmol/L。
更优选的，所述抑制人多发性骨髓瘤细胞在雌性B-NDG小鼠骨髓内的定植和/或生长的药物中所含灵菌红素的药物剂量为0.5mg/kg。
灵菌红素对正常B细胞GM12878的半数抑制浓度是3,010.0nmol/L；灵菌红素对MM1.s、H929、ARP1、OCI-MY5、XG1、U266、8226的半数抑制浓度分别是：485.0、426.9、409.7、408.7、779.4、595.6、209.7nmol/L。由此可见，灵菌红素对不同类型的多发性骨髓瘤细胞的IC50值在209.7nmol/L-779.4nmol/L之间，并且在该浓度下灵菌红素对正常B细胞GM12878几乎无杀伤作用。
本发明所述的灵菌红素(Prodigiosin,PG)是一种含有三吡咯环的红色化合物，分子式为C20H25N3O，分子质量为323.42Da，全称为4-甲氧基-2,2'-二吡咯-5-甲戊基吡咯，是由粘质沙雷氏菌中提取的红色化合物，结构式如下：
灵菌红素的制备方法，包括如下步骤：复苏粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)，发酵扩大培养，离心后乙酸乙酯甲醇萃取，硅胶柱层析获得红色产物，旋转蒸发后液相色谱C18柱进一步纯化，真空低温冷冻干燥后，即得。
基于一个总的发明构思，本发明还提供一种治疗多发性骨髓瘤的药物，所述治疗多发性骨髓瘤的药物中包含灵菌红素。
上述的疗多发性骨髓瘤的药物，优选的，所述治疗多发性骨髓瘤的药物为胶囊制剂，每粒胶囊中包含0.125mg灵菌红素粉末，胶囊壳为明胶胶囊壳。
更优选的，所述疗多发性骨髓瘤的药物包括抑制多发性骨髓瘤细胞增殖的药物、诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡的药物或抑制人多发性骨髓瘤细胞在雌性B-NDG小鼠骨髓内定植和/或生长的药物。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明首次发现灵菌红素对多发性骨髓瘤细胞和正常B细胞具有选择性杀伤作用，可抑制多发性骨髓瘤生长，具体包括可抑制多发性骨髓瘤细胞增殖和/或诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡和/或抑制多发性骨髓瘤瘤体积生长，经过大量实验验证，能够准确反映灵菌红素对多发性骨髓瘤的作用效果，在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用方面具有重要的临床应用和研究价值，为多发性骨髓瘤的临床治疗提供一种新的药物和治疗思路。
(2)本发明的治疗多发性骨髓瘤的药物，包含有灵菌红素，灵菌红素是从粘质沙雷氏菌中提取的天然化合物，广泛存在于自然界，毒副作用小；灵菌红素的提取所用周期短，且产量大，灵菌红素在制备上方便快速，具有很大优势；灵菌红素相对于传统的多发性骨髓瘤治疗药物其价格经济便宜，在减轻多发性骨髓瘤患者经济压力方面具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为PG对MM细胞的毒性实验，结果显示PG对各MM细胞系IC50值大于对正常B淋巴细胞IC50值，PG对MM细胞具有选择性杀伤作用。
图2为PG抑制MM细胞(ARP1，OCI-MY5)增殖随时间改变情况实验结果。
图3为PG抑制MM细胞(H929)克隆形成实验结果。
图4和图5为PG诱导MM细胞(H929，ARP1，XG1，OCI-MY5)凋亡实验结果。
图6为PG诱导MM细胞(H929，ARP1)凋亡分子表达实验结果。
图7为PG可显著抑制小鼠体内肿瘤细胞的生长实验结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1：
一种灵菌红素在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用。
治疗多发性骨髓瘤的药物包括抑制多发性骨髓瘤细胞增殖的药物、诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡的药物。其中，抑制多发性骨髓瘤细胞增殖的药物中所含灵菌红素的药物浓度为50-200nmol/L，诱导多发性骨髓瘤凋亡的药物中所含灵菌红素的药物浓度为100-500nmol/L，抑制人多发性骨髓瘤细胞在雌性B-NDG小鼠骨髓内的定植和/或生长的药物中所含灵菌红素的药物剂量为0.5mg/kg。
为了进一步研究验证PG对MM细胞发生发展的作用，本发明开展了以下实验：
实验1：PG对MM细胞的毒性实验
一、材料
1、细胞
所有细胞株均由中南大学肿瘤研究所周文教授课题组惠赠。
GM12878为正常人B细胞，悬浮生长，实验中用作对照，H929、MM1.s、8226、U266、XG1、ARP1、OCI-MY5为人MM细胞系，悬浮生长，OCI-MY5-LUC细胞系为实验室前期构建的带有荧光素酶报告基因的人MM细胞系。其中H929生长需要用50nmol/Lβ-巯基乙醇维持、XG1生长需要使用5mg/L的IL-6维持、OCI-MY5-LUC培养过程中需要使用200mg/L的G418维持。
2、药物及试剂
PG标准品购买于阿拉丁公司(CAS号：82-89-3)，利用DMSO溶解，浓度为1mg/ml。实验室提取纯化鉴定后的PG利用此标准品进行定量，-20℃冰箱中存储待用。CellTiterAQueous MTS Rea gent Powder购买于Promega公司，RPMI-1640购买于Gibico公司，胎牛血清购买于Gibico公司，青霉素-链霉素溶液购买于北京鼎国，PBS缓冲液购买于Gibico公司
3、仪器
全波长酶标仪：美国赛默飞公司
二、方法：PG对MM细胞的毒性实验采用MTS法
(1)细胞铺板：收集对数生长期MM细胞，1,000rpm离心5min后，弃上清，加入20％FBS的RPMI-1640培基重悬，显微镜下计数。96孔板中每孔接种5,000个细胞，体积为50μL。每组细胞每个浓度确保三个副孔；
(2)配制系列PG浓度溶液：将PG使用无血清培养基配置成浓度为25,600、12,800、6,400、3,200、1,600、800、400、200、100nmol/L的PG药物；
(3)加入PG处理细胞：将含有不同浓度的PG溶液加到铺有细胞的96孔板中，每孔50μL，使每孔培养基血清的终浓度为10％。药物浓度为12,800、6,400、3,200、1,600、800、400、200、100、50nmol/L，同时设置对照孔，每组三个副孔，放入培养箱中培养；
(4)培养72h后取出96孔板每孔加入20μL MTS溶液，37℃孵育4h，490nmol/L处测量各孔的OD值(注意避光操作)；
(5)利用公式将得到的吸光度值输入GraphPad 9中拟合曲线，求其IC50值。
三、结果与评价
图1和表1为实验结果。
表1：PG对正常B细胞及不同MM细胞IC50值(nmol/L)
结果显示PG对正常B细胞GM12878的半数抑制浓度是3,010.0nmol/L；PG对MM1.s、H929、ARP1、OCI-MY5、XG1、U266、8226的半数抑制浓度分别是：485.0、426.9、409.7、408.7、779.4、595.6、209.7nmol/L。由此可见，PG对不同类型的MM细胞的IC50值在209.7nmol/L-779.4nmol/L之间，并且在该浓度下PG对正常B细胞GM12878几乎无杀伤作用。
实验2：PG抑制MM细胞增殖随时间改变情况
一、材料
ARP1细胞，OCI-MY5细胞(同实验1)
二、方法：细胞计数法
为研究PG抑制MM细胞增殖随时间变化情况，利用不同浓度PG处理MM细胞，每24h计数，连续1周。
(1)细胞铺板：收集对数生长期MM细胞，1,000rpm离心5min后，弃上清，加入20％FBS的RPMI-1640培基重悬，显微镜下计数。24孔板中每孔接种2×104个细胞，体积为1mL。每组细胞每个浓度两个副孔；
(2)配制PG浓度溶液：将PG使用无血清培养基配置成浓度为50、100、200μmol/L的PG药物；
(3)加入PG处理细胞：药物终浓度为0、50、100、200nmol/L，两个个副孔，放入培养箱中培养；
(4)细胞计数：每24h进行一次细胞计数，连续计数1周。
三、结果与评价
图2为实验结果。
图2显示PG对MM细胞ARP1、OCI-MY5的抑制具有时间依赖，PG 50nM,100nM,200nM生长速度依次减慢。
实验3：PG抑制MM细胞克隆形成实验
一、材料
H929细胞(同实验1)
二、方法：软琼脂克隆形成实验
(1)超纯水配制3.5％和1.66％浓度的琼脂糖凝胶，灭菌后4℃保存备用；
(2)将凝固的琼脂糖凝胶置于微波炉中加热至完全溶解后，使用浓度为3.5％的琼脂糖凝胶配制下层胶，并于42℃的水浴锅中维持温度防止凝固。将3.5％的琼脂糖凝胶与完全培养基(RPMI-1640+20％FBS)按照1:5的比例充分混匀，在12孔板中每孔加入1mL下层胶，注意加入时避免产生气泡，以及动作尽量迅速防止在加入过程中胶凝固。加完后放置20min等待胶凝固；
(3)将PG用含完全培养基(RPMI-1640+20％FBS)调节浓度为100nmol/L、200nmol/L备用；
(4)利用浓度为1.66％的琼脂糖凝胶配制上层胶，将上层胶以及培养基置于37℃水浴锅中保温，将待铺板的MM细胞离心后完全培养基(RPMI-1640+20％FBS)重悬，显微镜下计数后加入细胞悬液1,000个/孔，同时加入不同浓度的PG，琼脂糖凝胶与培养基的比例也按照1:5进行，在12孔板中每孔加入0.5mL的上层胶、细胞、培养基以及药物的混合物，注意不要产生气泡，以及操作迅速防止在加入过程中凝固；
(5)胶冷却凝固后，放入培养箱中培养，每三天补充20μL含对应浓度PG的培养基。培养2-3周后值肉眼可见细胞克隆，镜下计数含50个细胞以上的克隆，计算克隆形成率，并作统计学分析。
三、结果与评价
图3为实验结果。
PG处理H929细胞后，对照组中H929细胞的软琼脂克隆数为120.0±10.0；用50nmol/L PG培养细胞后，其克隆数为31.0±3.6；而用100nmol/LPG培养细胞后，其克隆数为16.3±2.5。提示PG可抑制H929细胞的克隆形成能力，并随药物浓度增加，抑制效应更加明显，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实验4：PG诱导MM细胞凋亡实验
一、材料
ARP1、H929、XG1、OCI-MY5细胞(同实验1)，凋亡试剂盒购买于美国BD公司，流式细胞仪：美国BD公司。
二、方法：流式细胞术
(1)收集对数生长期的MM细胞，将细胞按1×105个/孔的量接种至六孔板，加相应浓度的PG，放入培养箱中培养48h-72h；
(2)收集1×106个PG处理后的MM细胞，1,000rpm离心5min，弃上清，预冷的PBS重悬细胞后2,000rpm，4℃离心5min，弃上清后重复一次；
(3)使用100μL 1×Binding Buffer重悬细胞，加入2μLAnnexin V-APC室温孵育30min，再加入4μL 7-AAD，室温孵育15min，注意避光操作；
(4)加入300μL 1×Binding Buffer终止反应，上机检测。所有细胞尽量在孵育完成后1h内检测完毕。
三、结果与评价
图4和图5为实验结果。
结果显示对照组H929细胞的凋亡率为3.51％±0.23％，100nmol/L、200nmol/LPG处理后的细胞凋亡率分别为10.65％±0.32％，23.43％±0.32％，与对照组相比差异均具有统计学意义(P<0.05)；对照组ARP1细胞凋亡率为6.48％±0.02％，100nmol/L，200nmol/LPG处理后的凋亡率分别为13.36％±0.20％，40.26％±1.06％，与对照组相比差异均具有统计学意义(P<0.05)；对照组XG1细胞凋亡率为2.82％±0.25％，100nmol/L、200nmol/L PG处理后的凋亡率分别为2.50％±0.87％，6.84％±0.50％，与对照组相比200nmol/LPG处理组具有统计学意义(P<0.05)；对照组OCI-MY5细胞凋亡率为5.91％±0.11％，100nmol/L、200nmol/L PG处理后细胞凋亡率为17.79％±0.35％，32.06％±0.59％，与对照组相比差异均具有统计学意义(P<0.05)。结果显示PG可诱导MM细胞凋亡。
实验5：PG诱导MM细胞凋亡分子表达实验
一、材料
ARP1、H929细胞(同实验1)，RIPA裂解液(江苏康为)，蛋白酶抑制剂(Sigma公司)，30％丙烯酰胺(北京鼎国)，1.5M Tris-HCl(PH＝6.8、8.8)(北京索莱宝)，SDS、过硫酸铵(APS)(北京鼎国)，TEMED(上海麦克林)，脱脂牛奶(北京鼎国)，抗体稀释液(武汉博士德)，Western显影液(Thermo公司)，吐温20(北京索莱宝)，GAPDH抗体(Proteintech)，PARP抗体(Santa Cruz Biotechnology)，Cleaved Caspase抗体(Santa Cruz Biotechnology)，β-actin抗体(Cell Signaling Technology)，兔二抗(Signalway)，电泳槽、转膜仪(上海伯乐)
二、方法：蛋白免疫印记(western blot，WB)
1、蛋白提取：收集MM细胞，离心后计数，根据计数结果每106个细胞加入100μL细胞裂解液(裂解液按RIPALysis Buffer：100×Cocktail＝100:1配制)，冰上裂解30min，注意振荡使其充分裂解，4℃13,000rpm离心15min取上清，待变性。
2、蛋白变性及浓度测定：加入1/4体积的5×SDS，95℃变性10min，使用Nanodrop仪器蛋白定量。
3、配制SDS-PAGE胶
4、上样及电泳：用1×的SDS将蛋白样品上样体积调整成一致，每孔推荐的上样量为40μg，在电泳槽内倒入1×的电泳液，轻轻拔掉梳子后赶走孔中的气泡，上样，注意第一孔和最后一个孔可以用来加入marker，其余蛋白样品按照实验设计从左到右加入。上样完成后调节电压开始电泳，直到溴酚蓝跑到底部后停止。
5、转膜：配制转膜液混匀后放入-20℃冰箱中预冷；根据胶的大小裁剪PVDF膜，将膜放在甲醇中活化15s后备用；三明治夹心法进行转膜，注意在转膜的过程中赶走气泡以及电极正反，冰上200mA恒流转120min。
6、封闭、孵育及显影
用5％的牛奶中摇床上室温封闭1h，根据marker剪膜，加入对应的一抗溶液，4℃摇床过夜孵育；次日回收一抗，洗膜3次，每次10min；1：10,000稀释二抗，室温孵育1.5h；回收二抗，洗膜3次，每次10min；显影，注意避光操作。
三、结果与评价
图6为实验结果。
结果显示PG处理ARP1细胞后，200nmol/L、500nmol/LPG处理组中凋亡标志蛋白活化型Caspase 3与PARP的灰度比值均显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；PG处理H929细胞后，200nmol/L、500nmol/LPG处理组中活化型PARP的灰度比值显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，500nmol/LPG处理组中活化型Caspase 3的灰度比值显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，证实PG处理后，MM细胞发生凋亡。
实施例6：PG可显著抑制小鼠体内肿瘤细胞的生长实验
一、材料
实验使用的小鼠为6周龄的雌性重度免疫缺陷型B-NDG小鼠，购买于北京百奥赛图基因生物技术有限公司，检疫合格，于湖南师范大学SPF级动物房寄养，所有动物的实验饲养方法以及实验操作步骤经由湖南师范大学动物及伦理委员会的批准(伦理号：D2022002)，Nano-Luciferase Assay Substrate购买于美国Promage公司，异氟烷购买于深圳市瑞沃德公司。
二、方法：荧光素酶法
B-NDG小鼠人MM细胞异种移植模型构建
小鼠饲养在湖南师范大学SPF级动物房内，饲养条件及实验操作严格按照湖南师范大学动物饲养的规章制度和操作规程进行。
将B-NDG小鼠(雌性，6周龄，18g-20g)，随机分为2个组：PG治疗组、治疗对照组，每组5只。对于治疗组首先将建好系的OCI-MY5-LUC细胞按照每只小鼠1×106个/200μL的接种量注射到小鼠的侧尾静脉处，建立B-NDG小鼠人MM细胞异种移植模型后，随机分为实验组和对照组。接种细胞一周后，给实验组小鼠腹腔注射0.5mg/kg剂量的PG(由含40％DMSO的PBS溶液配制)，隔两天接种一次，同时对照组接种溶剂作为对照，用药4周后终止实验。
接种瘤细胞后每周对小鼠进行活体成像检测。将待检测的小鼠按照每只10μL/g的剂量腹腔注射D-luciferase工作液，反应三分钟后，将小鼠放入充满异氟烷麻醉气体的小室中，麻醉两分钟。当小鼠完全麻醉后，拔开三通的按钮将异氟烷气体充满整个主机，将小鼠腹部朝上摆放整齐好后，整体动物成像，观察小鼠荧光信号强度。
三、结果与评价
图7为实验结果。
将OCI-MY5-Luciferase细胞按照每只小鼠1×106个细胞的量尾静脉注射到小鼠体内，一周后开始给药。每三天给一次药，活体成像观察小鼠肿瘤负荷情况。用药四周后终止实验，结果显示对照组中每只小鼠的平均荧光强度值为(15.03±3.12)×109，PG给药组平均荧光强度值为(3.87±0.70)×109，差异具有统计学意义。免疫荧光及流式细胞术实验对小鼠骨髓中的人CD138+细胞数量进行检测发现，与对照组相比，PG给药组小鼠骨髓中的人CD138+细胞数量明显降低，差异具有统计学意义。以上结果提示PG可抑制OCI-MY5-Luciferase细胞在小鼠体内的增殖。
总的来说，本发明首次发现PG对MM细胞和正常B细胞具有选择性杀伤作用，能抑制MM细胞增殖、诱导MM细胞凋亡，抑制人MM细胞在雌性B-NDG小鼠骨髓内的定植和生长，证实了PG具有抑制MM细胞发生发展的作用。本发明公开了PG对MM的治疗效果，在制备MM治疗药物中具重要价值。本发明的优点在于开发了新的MM增殖抑制剂或治疗药物，有助于减轻MM患者经济负担，对于MM的基础研究和临床治疗应用研究具有重要的意义。
实施例2：
一种治疗多发性骨髓瘤的药物为胶囊制剂，每粒胶囊中包含0.125mg灵菌红素粉末，胶囊壳为明胶胶囊壳。
通过人与动物体表面积计算法计算人体的使用剂量。根据许文生氏公式计算一身高1.70m，体重60kg的成年人体表面积为1.653m2，根据Meeh-Rubner公式计算一体重为20g小鼠的体表面积为0.067m2，小鼠的PG剂量为0.5mg/kg，通过换算可知小鼠的PG剂量为0.149mg/m2，因此一体表面积为1.653m2的成年人的药物剂量为0.247mg。因此根据使用剂量的一半制备成规格为0.125mg的胶囊。

Claims (7)

1.灵菌红素在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗多发性骨髓瘤的药物包括抑制多发性骨髓瘤细胞增殖的药物、诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡的药物或抑制人多发性骨髓瘤细胞在雌性B-NDG小鼠骨髓内定植和/或生长的药物。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抑制多发性骨髓瘤细胞增殖的药物中所含灵菌红素的药物浓度为50-200 nmol/L。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抑制多发性骨髓瘤细胞增殖的药物中所含灵菌红素的药物浓度为100-200 nmol/L。
5. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述诱导多发性骨髓瘤凋亡的药物中所含灵菌红素的药物浓度为100-500 nmol/L。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述诱导多发性骨髓瘤凋亡的药物中所含灵菌红素的药物浓度为200-500 nmol/L。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抑制人多发性骨髓瘤细胞在雌性B-NDG小鼠骨髓内的定植和/或生长的药物以灵菌红素计的给药剂量为0.5mg/kg。
CN202210990603.5A 2022-08-18 2022-08-18 灵菌红素在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用和治疗多发性骨髓瘤的药物 Active CN115414355B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210990603.5A CN115414355B (zh) 2022-08-18 2022-08-18 灵菌红素在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用和治疗多发性骨髓瘤的药物

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210990603.5A CN115414355B (zh) 2022-08-18 2022-08-18 灵菌红素在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用和治疗多发性骨髓瘤的药物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115414355A CN115414355A (zh) 2022-12-02
CN115414355B true CN115414355B (zh) 2023-08-01

Family

ID=84198829

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210990603.5A Active CN115414355B (zh) 2022-08-18 2022-08-18 灵菌红素在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用和治疗多发性骨髓瘤的药物

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115414355B (zh)

Also Published As

Publication number Publication date
CN115414355A (zh) 2022-12-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2017157131A1 (zh) 绿原酸在制备治疗以lag-3为靶点的疾病的药物中的用途
CN112656795A (zh) 防己诺林碱在抗结膜黑色素瘤中的作用机制及应用
CN109453164B (zh) 一种抗肿瘤的联合用药物
CN115414355B (zh) 灵菌红素在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的应用和治疗多发性骨髓瘤的药物
CN107281172A (zh) 二甲双胍在制备宫颈癌的药物中的应用
CN117298121A (zh) 蒲公英甾醇在幽门螺旋杆菌诱导的胃炎或胃癌中的应用
CN111658655A (zh) 葫芦素b在制备铁死亡诱导剂及抗鼻咽癌药物中的应用
CN115177608B (zh) 长链酰基肉碱类化合物在制备预防和/或治疗肝癌的药物中的应用
CN115317493B (zh) 一种硼酸类小分子化合物在制备增强免疫检查点抑制剂疗效及治疗白血病药物中的应用
CN114917219B (zh) 异荭草素联合顺铂在制备逆转肺癌耐药的药物中的应用
CN112957357B (zh) 一种靶向klf4泛素化的小分子抑制剂及其应用
CN111000851B (zh) 丹参酮i在制备肿瘤细胞自噬诱导剂药物中的应用
CN108714149A (zh) 地榆活性成分在制备抗肿瘤的药物中的用途
CN108685906A (zh) 小分子化合物p7c3的新应用
CN114848617A (zh) 一种中药单体姜黄素在制备治疗肿瘤药物中的应用
CN104306373B (zh) 一种苯基恶唑类化合物在制备治疗癌症的药中的应用
CN109223801B (zh) 一种新的胃癌肿瘤干细胞杀伤剂及其应用
CN111803484A (zh) 奥替溴铵在制备抗肿瘤药物中的应用
CN111560433A (zh) 人nufip1的用途及相关产品
CN115531396B (zh) 胆酸类物质在制备抑制破骨细胞分化的药物中的应用
CN107349191A (zh) 伏立诺他在制备治疗肺癌的药物中的应用
CN113413386B (zh) 香兰素衍生物在制备治疗结直肠癌合并具核梭杆菌感染药物中的应用
CN115737645B (zh) At56联合索拉非尼在外周t细胞淋巴瘤中的应用
CN115286574B (zh) Blvrb酶功能抑制剂及其制备方法和用途
CN116099004B (zh) Rna解旋酶dhx33抑制剂在制备用于治疗膀胱癌的药物中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant