CN116099004B - Rna解旋酶dhx33抑制剂在制备用于治疗膀胱癌的药物中的应用 - Google Patents

Rna解旋酶dhx33抑制剂在制备用于治疗膀胱癌的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药领域，公开了RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗或者辅助治疗膀胱癌药物中的应用。本发明确立了DHX33蛋白在膀胱癌发展中的重要作用，提供的RNA解旋酶DHX33抑制剂具有抑制DHX33解旋酶活力的作用，进而导致由DHX33缺失所介导的脂质过氧化，该抑制剂可以快速诱导经由脂类代谢异常所导致的癌细胞铁死亡，对膀胱癌细胞具有显著的抑制性，因此具有重要的医药开发价值。

Description

RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗膀胱癌的药物中的 应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地说，涉及RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗膀胱癌的药物中的应用。
背景技术
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，主要包括尿路上皮癌、鳞状细胞癌、腺癌等，其中，尿路上皮癌占所有膀胱癌的90％。2020年，膀胱癌是全球癌症新发病例数排名第十位的癌症，占比3％，约为57万。中国2020年膀胱癌新发患者人数8.6万，占全球14.9％，在2020年度死亡病例占18.5％，新发和死亡病例数均位居全球第一。
目前，膀胱癌的发病因素尚无确切定论，但已有报道称可能与患者长期接触芳香胺类物质、长期异物刺激引起的膀胱慢性感染、抽烟和遗传等因素引起的基因突变有关。膀胱癌有多种癌基因参与，且很容易激活突变，典型的突变包括FGFR3、KRAS、TP53、PIK3CA、ERBB2、HRAS、PD1/PD-L1等。此外，相关研究还发现膀胱癌的基因突变信息主要集中在细胞周期、染色质调控、激酶相关信号通路上，且这些基因的异常突变可能与某些治疗药物的疗效有关。
由于膀胱癌的高度异质性特征，在临床上可分为非肌层浸润型膀胱癌和肌层浸润型膀胱癌，针对不同的分子分型采取的治疗方式有所不同。目前，膀胱癌的治疗手段多样，包括手术切除、化疗、靶向治疗等。但在临床上以经尿道膀胱肿瘤切除术为代表的外科治疗仍然是膀胱癌的首选治疗方法。随着研究的逐步推进与发展，新辅助化疗以缩小肿瘤体积而争取到可能的手术机会，同时控制和治疗体内微小转移灶，减少复发率，在临床上已取得较为良好的疗效。但早期诊断手段的缺乏、经尿道膀胱肿瘤切除的高复发率、根治性膀胱切除术中的高发性并发症和预后差，以及部分患者对化疗药物的不敏感性，使得防治膀胱癌有效手段的利用陷入了瓶颈。
随着医学技术的不断发展，更多的膀胱癌患者选择靶向药和免疫治疗。近年来，靶向药物、免疫检查点抑制剂(ICIs)已成功应用在晚期尿路上皮癌治疗中，为广大膀胱癌患者带来了新的治疗选择。厄达替尼是美国FDA批准的第一种FGFR激酶抑制剂，用于携带易感FGFR3或FGFR2基因改变、并且接受至少一种含铂化疗期间或之后(包括新辅助或辅助含铂化疗12个月内)病情进展的局部晚期或转移性UC成人患者。87位FGFR3或FGFR2基因突变膀胱癌患者的临床试验数据表明，完全缓解率为2.3％，部分缓解率为29.9％。结果还显示，接受厄达替尼治疗的患者中，中位缓解持续时间(DoR)为5.4个月(95％CI:4.3-6.9)。
阿替利珠单抗是首个获批的PD-L1抗体。2016年5月，FDA批准用于治疗PD-1或者PDL-1阳性的尿路上皮癌，在含铂类化疗方案治疗中或治疗后疾病出现进展或在含铂类化疗方案术前新辅助或术后辅助治疗的12个月内。
除了上述几种常用靶药物之外，针对有NTRK融合基因突变的膀胱癌患者，拉罗替尼也具有很好的治疗价值，NTRK出现在多种实体瘤中，靶向NTRK融合蛋白的抑制剂是泛癌中的肿瘤抑制剂。虽然有上述多种针对膀胱癌的靶向药物，但整体上，有这些特定基因突变或者蛋白表达的膀胱癌毕竟不占绝大部分。总体，在膀胱癌的治疗领域依然缺乏行之有效的靶点和抑制剂。
发明内容
本发明的目的是，提供RNA解旋酶DHX33抑制剂及其在制备用于治疗或者辅助治疗膀胱癌的药物或组合物中的应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供了用于治疗或辅助治疗膀胱癌癌的RNA解旋酶DHX33抑制剂。在本发明中，RNA解旋酶DHX33抑制剂(即DHX33蛋白抑制剂)选自化合物A、B、C或其药学上可接受的盐或者前药中的至少一种：
本发明首次公开了DHX33蛋白质可以作为靶点进行膀胱癌的治疗，因此在第二方面，本发明提供了上述RNA解旋酶DHX33作为新型膀胱癌治疗靶点的应用。
在第三方面，本发明提供了RNA解旋酶DHX33作为一种新型的膀胱癌病理组织的诊断及检测标志物的应用。
第四方面，本发明提供了一种用于治疗或者辅助治疗膀胱癌的靶向药物，其中所述药物的靶点是RNA解旋酶DHX33，该靶向药物可以抑制DHX33解旋酶的活力，进而影响由DHX33蛋白所调控的癌细胞铁死亡过程。该靶向药物的有效成分为化合物A、B、C或者其药学上可接受的盐或者前药中的至少一种。
在第五方面，本发明提供了上述RNA解旋酶抑制剂在抑制膀胱癌细胞中脂肪酸代谢去饱和酶SCD1、FADS1或FADS2中的应用。
本发明提供了RNA解旋酶DHX33抑制剂作为由DHX33(DHX33基因)调控的膀胱癌细胞铁死亡诱导剂的应用，即DHX33抑制剂可以快速诱导膀胱癌细胞的铁死亡。铁死亡(ferroptosis)是铁离子依赖性的细胞死亡，是不同于细胞凋亡、细胞自噬的新型细胞死亡方式。脂肪酸代谢与细胞的铁死亡密切关联。脂肪酸代谢主要包括脂肪酸从头合成、脂肪酸氧化、脂肪酸的去饱和及加长而生成不同饱和程度和不同碳链长度的脂肪酸，其中，脂肪酸的去饱和酶主要包括：SCD1、FADS1、FADS2，而SCD1是其中的限速步骤酶。研究表明，脂肪酸代谢在癌症细胞中出现异常，很多癌症细胞有这几个脂肪酸去饱和酶的过表达。抑制SCD可以导致细胞质膜的脂类过氧化物生成，并进一步诱导细胞进入铁死亡。这一过程伴随铁离子的蓄积，是铁离子依赖的。
DHX33基因在NCBI上的参考序列编号为：NM_020162.4。
在第七方面，本发明提供了上述RNA解旋酶DHX33抑制剂在治疗或者辅助治疗膀胱癌中的应用。
第八方面，本发明提供了上述RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗或者辅助治疗膀胱癌的药物或药物组合物中的应用。
在本发明的实施方案中，膀胱癌为DHX33蛋白表达阳性的。在本发明的实施方案中，膀胱癌可以为前期化疗或者靶向药耐药性膀胱癌。在本发明的实施方案中，膀胱癌可以含有以下基因的突变：FGFR3、KRAS、TP53、PIK3CA、ERBB2、HRAS、PD1/PD-L1。
在第九方面，本发明提供了上述RNA解旋酶DHX33抑制剂作为膀胱癌治疗中的癌细胞铁死亡诱导剂的应用，其中，所述癌细胞是DHX33解旋酶依赖型。
在本发明的实施方案中，RNA解旋酶DHX33抑制剂的摄入频率或剂量可以由医师根据个体的身体状况、年龄、性别、体重等因素来确定。在具体实施方案中，摄入频率范围可以是一天一次到三次。在本发明的实施方案中，RNA解旋酶DHX33抑制剂的摄入剂量需要保证药物的有效暴露量范围达到每天5000-7500ng·h/mL。在具体实施方案中，在小鼠中，RNA解旋酶DHX33抑制剂的口服剂量可以为25mg-300mg/kg一次，静脉注射剂量可以为每次2.5mg-25mg/kg。在具体实施方案中，在小鼠中，RNA解旋酶DHX33抑制剂的口服摄入剂量可以为每次例如35mg-290mg/kg，45mg-280mg/kg，55mg-270mg/kg，65mg-260mg/kg，75mg-250mg/kg，85mg-240mg/kg，95mg-230mg/kg，105mg-220mg/kg，115mg-210mg/kg，125mg-200mg/kg，135mg-190mg/kg，145mg-180mg/kg，或155mg-170mg/kg。当通过静脉注射施用时，在小鼠中，RNA解旋酶DHX33抑制剂注射一次的剂量可以为3.0mg-24.5mg/kg、3.5mg-24mg/kg、4.0mg-23.5mg/kg、4.5mg-23mg/kg、5.0mg-22.5mg/kg、5.5mg-22mg/kg、6.0mg-21.5mg/kg、6.5mg-21mg/kg、7.0mg-20.5mg/kg、7.5mg-20mg/kg、8.0mg-19.5mg/kg、8.5mg-19mg/kg、9.0mg-18.5mg/kg、9.5mg-18mg/kg、10.0mg-17.5mg/kg、10.5mg-17.0mg/kg、11.0mg-16.5mg/kg、11.5mg-16mg/kg、12.0mg-15.5mg/kg、12.5mg-15.0mg/kg或13.0mg-14.5mg/kg。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明确立了DHX33蛋白在膀胱癌发生发展中的重要作用，提供的DHX33抑制剂具有抑制DHX33解旋酶活力的作用，进而诱导膀胱癌细胞的细胞铁死亡。该抑制剂可以在体外和体内显著的抑制皮肤膀胱癌细胞的生长，从而达到治疗膀胱癌的目的，并因此具有重要的医药开发价值。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中代表性人类膀胱癌组织相比于正常膀胱组织的DHX33蛋白表达量明显偏高。
图2为本发明较佳实施例中用DHX33抑制剂A-C处理后的T24细胞半抑制浓度分析，其中图2-1：化合物A的半抑制浓度14.2nM，图2-2：化合物B的半抑制浓度19.7nM，图2-3：化合物C的半抑制浓度：104.7nM。
图3为本发明较佳实施例中用DHX33抑制剂A-C处理后的5637细胞半抑制浓度分析，其中图3-1：化合物A的半抑制浓度12nM，图3-2：化合物B的半抑制浓度17.3nM，图3-3：化合物C的半抑制浓度：152nM。
图4为本发明较佳实施例中用DHX33抑制剂B处理后的T24细胞克隆生长的分析结果。
图5为本发明较佳实施例中用DHX33抑制剂B处理后的5637细胞克隆生长的分析结果。
图6为本发明较佳实施例中用DHX33抑制剂B处理后的T24软琼脂实验---悬浮独立生长的分析结果。
图7为本发明较佳实施例中用DHX33抑制剂B处理后的5637软琼脂实验---悬浮独立生长的分析结果。
图8为本发明较佳实施例中T24细胞用DHX33抑制剂B处理24h后的流式细胞点状图和用AnnexinV(膜联蛋白V)染色的流式细胞凋亡比率分析结果。
图9本发明较佳实施例中T24细胞用DHX33抑制剂B处理48h后的流式细胞点状图和用AnnexinV染色的流式细胞凋亡比率分析结果。
图10本发明较佳实施例中T24细胞用DHX33抑制剂B处理72h后的流式细胞点状图和用PI染色的流式细胞总体死亡比率分析结果。
图11本发明较佳实施例中5637细胞用DHX33抑制剂B处理48h后的流式细胞点状图和用AnnexinV染色的流式细胞凋亡比率分析结果。
图12本发明较佳实施例中5637细胞用DHX33抑制剂B处理72h后的流式细胞点状图和用AnnexinV染色的流式细胞凋亡比率分析结果。
图13为本发明较佳实施例中不同时间DHX33抑制剂B处理的膀胱癌细胞T24中脂质代谢去饱和酶基因的转录水平变化。
图14为本发明较佳实施例中在不同剂量用DHX33抑制剂B处理的膀胱癌细胞T24中脂质代谢去饱和酶基因的转录水平变化。
图15为本发明较佳实施例中不同剂量的DHX33抑制剂B处理的膀胱癌细胞5637中脂质代谢去饱和酶基因的转录水平变化。
图16为本发明较佳实施例中分析的DHX33抑制剂B处理下膀胱癌细胞5637中分析的脂质代谢去饱和酶FADS1、FADS2蛋白水平变化。
图17为本发明较佳实施例中T24细胞用DHX33抑制剂B处理16h后的细胞活性氧ROS的定量分析图。
图18为本发明较佳实施例中T24细胞用DHX33抑制剂B处理8h后的细胞活性氧ROS的定量分析图。
图19为本发明较佳实施例中5637细胞用DHX33抑制剂B处理8h后的细胞活性氧ROS的定量分析图。
图20为本发明较佳实施例中T24细胞用DHX33抑制剂B处理16h后的细胞脂类过氧化物(LPO)的定量分析图
图21为本发明较佳实施例中5637细胞用DHX33抑制剂B处理16h后的细胞脂类过氧化物(LPO)的定量分析图
图22为本发明较佳实施例中5637细胞用DHX33抑制剂B处理16h后的细胞亚铁离子的定量分析图。
图23为本发明实施例中分析DHX33抑制剂B口服后的小鼠药物代谢暴露量分析数据。
图24为本发明较佳实施例中DHX33抑制剂B对人膀胱癌荷瘤生长抑制性分析(肿瘤体积曲线)。
图25为本发明较佳实施例中DHX33抑制剂B对人膀胱癌荷瘤的生长抑制---实验终点分析重量及体积增长指数。
图26为本发明较佳实施例中对DHX33抑制剂B处理的小鼠的体重监测分析。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
1.细胞培养
人膀胱癌细胞株T24及5637等购自碧云天生物技术有限公司(上海)。T24细胞用McCoy 5A培养基培养，其含有10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、非必须氨基酸和链霉素、青霉素。膀胱癌细胞株5737用添加了上述成份(即10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、非必须氨基酸和链霉素、青霉素)的RPMI-1640培养基培养。培养条件为37℃的二氧化碳培养箱，湿度60-70％。
2.实时定量PCR
为了分析DHX33蛋白促进膀胱癌细胞生长的分子机理，使用定量PCR(SYBR greensupermix(Bio-Rad))分析癌细胞中重要的基因的表达变化。将待分析的细胞以合适密度铺到6孔板，第二天将适当浓度的化合物加入培养基，化合物处理细胞的时间为0h、4h、6h或者8h，然后收获细胞提取RNA。之后对RNA样本进行定量PCR分析。待分析的几个目的基因为：FADS1、FADS2和SCD。引物均由IDT(http：//sg.idtdna.com/site)在线“realtime PCRtool”设计，购自BGI(深圳)公司。
针对人体细胞中参与细胞铁死亡基因的引物序列如下(所有引物都从5'-3')：
引物名称 序列
H3.3-Forward TGTGGCGCTCCGTGAAATTAG
H3.3-Reverse CTGCAAAGCACCGATAGCTG
SCD-Forward CCTGGTTTCACTTGGAGCTGTG
SCD-Reverse TGTGGTGAAGTTGATGTGCCAGC
FADS1-Forward CTGTCGGTCTTCAGCACCTCAA
FADS1-Reverse CTGGGTCTTTGCGGAAGCAGTT
FADS2-Forward TGCAACGTGGAGCAGTCCTTCT
FADS2-Reverse GGCACATAGAGACTTCACCAGC
3.细胞半抑制浓度IC50值测定
将膀胱癌细胞株T24、5637细胞以1X104个细胞/100μL/孔铺到96孔板上，等待细胞贴壁完全，将化合物以19nM、39nM、78nM、156nM、312nM、625nM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM的浓度添加到细胞培养基中，用多通道排枪混合均匀。待化合物和细胞孵育时间达到72h后，用CCK-8试剂(上海翊圣生物科技有限公司)按照标准流程添加到96孔板的培养基中，孵育1h后，用酶标仪读板(OD450nm)，将实验重复3次，并绘制化合物在不同浓度下的抑制曲线(如图2所示)，计算化合物的细胞半抑制浓度(IC50)。图中曲线的纵坐标是细胞活度指数，横坐标是化合物浓度(μM)的LOG10值。
4.免疫组化分析
组织芯片购自上海卓立生物科技有限公司(ZL-BlaU961)。总共有48例癌症组织及其对应的癌旁组织。使用前需先60℃烤片半小时。将芯片中的组织在脱蜡液中脱石蜡并在一系列乙醇浓度逐渐降低的溶液中再水合。在蒸锅中用Tris缓冲液(pH 9.0)呈现抗原。然后将组织在含有1％H2O2的水醇溶液中孵育以灭活内源性过氧化物酶。在室温下用5％FBS-PBS封闭30min后，将组织与第一抗体在4℃孵育过夜。然后根据制造商的建议使用DAKO试剂盒(丹麦DAKO公司)按照说明书进行。使用的抗体如下：anti-DHX33(购自SantaCruz生物技术公司)。
5.细胞亚铁离子检测
根据细胞亚铁比色法检测试剂盒(Elabscience公司)的流程进行亚铁离子检测，用酶标仪读板(OD590nm),计算细胞样本的亚铁离子含量。Fe2+测定中处理细胞先用PBS缓冲液清洗，再用胰蛋白酶消化细胞，1ml培养基吹打并收集细胞于1.5ml EP管中，每106个细胞加入试剂盒中配制好的0.2ml的试剂一，混匀，置于冰上裂解10min，离心10min(15000xg),取80μl于96孔板对应孔中，再像对照孔中加入试剂盒中配制好的试剂二，测定孔中加入试剂盒中配置好的试剂三，混匀，37℃孵育10min，最后在酶标仪593nm处测定其OD值。
6.脂质过氧化物(LPO)
根据脂质过氧化物比色法检测试剂盒(Elabscience公司)的说明书进行脂质过氧化物含量的检测，用酶标仪读板(OD590nm),按蛋白浓度计算LPO含量。测定中，先将细胞用PBS缓冲液清洗，加胰蛋白酶消化，用培养基重悬，并收集于1.5ml的EP管中，细胞数量达到5×106个后，于4℃条件下离心10min(1000×g)，去掉培养基后加入300～500μl的PBS缓冲液，用超声破碎仪(宁波新芝)进行充分的超声破碎，再于4℃条件下离心10min(1500×g)，留取部分上清用于蛋白浓度测定。取上清液200μl于1.5ml EP管中，加入试剂盒中按比例配制的显色工作液，混匀，再加入试剂盒中的试剂三，混匀后45℃水浴60min，然后离心10min(1100xg)，取上清液200μl于96孔板中，用酶标仪在586nm处测定其OD值，并按公式计算分析。
7.活性氧检测(ROS)
将癌细胞细胞以1×105个细胞/2ml/孔铺到6孔板上，等待细胞完全贴壁，将化合物以不同的浓度添加到培养基中，利用活性氧荧光法检测试剂盒(Elabscience公司)中提供的阳性(Positive)参考(铁死亡诱导剂作为阳性参考)。待化合物处理一定时间后，用/>活性氧荧光法检测试剂盒进行活性氧检测，设置3个复孔，试剂DCFH-DA经过一系列的化学反应成为不能透过细胞膜的荧光物质DCF，用多功能酶标仪(PerkinElmer)绘制化合物在不同浓度下的活性氧含量的柱状图，通过OD值分析癌细胞的活性氧情况。DHX33抑制剂能够增加ROS含量，从而损害细胞甚至诱导细胞死亡。
8.软琼脂试验
将1.0×104个细胞与4.0mL含0.3％琼脂和10％FBS的DMEM培养基混合，并加在基础琼脂上(4.0mL凝固的含0.6％琼脂和10％FBS的DMEM培养基)。将平板在37℃孵育，每3天检查一次，每周加入2.0mL含0.3％琼脂和10％FBS的DMEM培养基。观察菌落生长情况，2-3周后计数。
9.细胞的克隆生长(Foci)
将2.0×103个细胞用10.0mL添加或者不添加DHX33抑制剂的完全培养基种培养(100mm细胞培养皿)，在37℃的二氧化碳培养箱中孵育，每周更新培养基。观察细胞克隆生长情况，2-3周后，待细胞克隆长到足够大小，采用吉姆萨染色(Geimsa staining)，拍照记录统计。
10.小鼠异种移植模型
所有小鼠实验均遵循广东省实验动物操作标准指南。SPF级别的Balb/c Nude雌性小鼠购自北京维多利华实验动物有限公司并接受标准的机构护理。待接种的细胞用胰蛋白酶消化并用PBS重悬至终浓度为每毫升1×108个细胞。对6周龄裸鼠(Balb/c)小鼠进行皮下注射，沿其侧翼注射1×107个细胞。待肿瘤生长到一定大小，小鼠经药物处理一段时间后，处死小鼠并解剖肿瘤进行拍照。
11.细胞凋亡分析
根据制造商的方案用凋亡试剂盒(上海Yeasen公司)进行凋亡测定。将细胞用胰蛋白酶(索莱宝生物技术有限公司)消化并重悬浮于细胞培养基中以产生单细胞悬浮液，进行细胞计数。每个样本计数100万个细胞，沉淀细胞并用磷酸缓冲液洗涤两次，然后用试剂盒中的结合液重悬。然后重悬于含有AnnexinV的工作溶液中，避光孵育15min，然后用低速离心(1000rpm离心5min)，用磷酸缓冲液清洗一次。将细胞通过35μm过滤膜(BectonDickinson)过滤，然后进行流式细胞分选仪(FACS)分析。
12.蛋白质印迹分析
用添加有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Thermo Fisher)的RIPA缓冲液裂解细胞。在冰上孵育10min后，通过超声处理进一步破坏细胞裂解物。然后将全细胞提取物进行SDS-PAGE凝胶，每个样品的加载量为50μg蛋白质。然后将蛋白质转印到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。将膜在5％脱脂奶中封闭，将其在1×TBST缓冲液中在室温下孵育1h。在5％FBS中稀释一抗(用1×TBST稀释)，使之与膜在4℃孵育过夜。然后将膜用1×TBST缓冲液冲洗多次，并在室温下与5％FBS(用1×TBST稀释)中的HRP(辣根过氧化物酶)标记的二抗一起孵育2h。用ECL试剂盒(Thermo Fisher)显示印迹。抗体如下：抗GAPDH，Absin(abs830030)；抗FADS1,ABclonal(A0178)；抗FADS2，ABclonal(A10270)。
13.本发明化合物A、B、C的合成
本发明化合物B的合成方法可参见中国专利申请第2021062902433420号；化合物A和C的制备方法介绍如下。
化合物A(AB29588)的合成
(1)化合物2的合成
将化合物1(350mg,2.52mmol,1.00eq)溶解到乙醇(2.00mL)和水(0.40mL)中，在20℃下将溴化氰(0.26g,2.45mmol,180μL,1.10eq)慢慢加入到上述混合液中。将反应液在70℃下搅拌2h。LCMS显示出化合物1被消耗完，并检测到所需的化合物分子量。将反应液在真空下浓缩。通过薄层色谱(二氯甲烷：甲醇＝5：1，2.00mL氨水)进行纯化。得到化合物2(80.0mg,487μmol,产率19.3％)为褐色油。LCMS:Ms：M+H+＝165。
(2)化合物A(AB29558)的合成
将化合物2(69.3mg,266μmol,1.00eq)溶解到N,N-二甲基甲酰胺(2.00mL)中，加入化合物5(70.0mg)和N,N-二异丙基乙胺(137mg,1.07mmol,185μL,4.00eq)，将六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷(152mg,293μmol,1.10eq)加入到反应液中，将反应混合液在100℃下搅拌12h。LCMS显示原料消耗完，并检测到所需的化合物分子量。将反应液在真空下浓缩。通过高效液相色谱进行第一次纯化(column:Welch Xtimate C18 150*25mm*5μm；流动相：[water(NH3H2O)-ACN]；B％:25％-55％,8min)。通过高效液相色谱进行第二次纯化(column:Welch Xtimate C18 150*25mm*5μm；流动相：[water(HCl)-ACN]；B％:16％-46％,8min)。得到化合物AB29558(8.68mg,19.4μmol，产率：7.28％，纯度：99％，盐酸盐)为白色固体。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 11.68-11.92(m,1.00H),8.27(br s,1.00H),7.25(d,J＝1.13Hz,1.00H),6.96-7.06(m,1.00H),6.86(s,1.00H),3.89(s,3.00H),2.44(d,J＝1.00Hz,3.00H),2.31(s,3.00H),1.97(s,3.00H).LCMS:Ms：M+H+＝407。
化合物C(AB29564)的合成
化合物AB29564和AB29565的合成
在化合物1(100mg,246μmol,1.00eq)中加入二甲基亚砜(1.00mL)，将叔丁醇钾(60.9mg,542μmol,2.20eq)加入到反应液中，然后将三甲基氯乙酸氯甲酯(74.3mg,493μmol,71.4μL,2.00eq)加入到反应液中，反应液在30℃下搅拌反应5h。LCMS显示有5％左右的原料剩余，检测到目标产物主峰生成。反应液中加入水(10.0mL)，用乙酸乙酯萃取两次(20.0mL*2)，合并有机相用饱和食盐水反洗一次(10.0mL)，分出有机相用无水硫酸钠干燥后浓缩。粗品通过高效液相色谱分离纯化(column:Welch Xtimate C18 150*25mm*5μm；流动相：[water(NH3H2O)-ACN]；B％:55％-85％，8min)，得到的产物再经SFC分离(column:DAICEL CHIRALCEL OD(250mm*30mm,10μm)；流动相：[0.1％NH3H2O MeOH]；B％:35％-35％,C7.5；60min)，得到化合物AB29564(5.36mg,9.62μmol,收率3.90％，纯度93.2％)为灰白色固体，并且得到化合物AB29565(5.39mg,9.81μmol，收率3.98％，纯度94.6％)为灰白色固体。
化合物AB29564：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 7.38(br d,J＝8.63Hz,1H),7.25(s,1H),7.12(s,1H),6.79-6.94(m,1H),6.52(s,1H),6.06-6.30(m,2H),3.82(s,3H),2.55(s,3H),2.49(br s,3H),2.07(s,3H),1.14(s,9H).LCMS:Ms:M+H+＝520。
14.化合物针对靶点的抑制性分析
使用一系列浓度的化合物(浓度范围设定为1nM、5nM、10nM、20nM、50nM、100nM、250nM、500nM、1000nM)进行体外DHX33蛋白解旋酶活力测定。DHX33蛋白的提取、解旋酶活力分析的具体方法参见CN112661754A。使用上述方法进一步分析化合物对DHX33解旋酶活力的抑制性。
本发明的化合物对DHX33解旋酶活力的半抑制浓度如表1所示。从表1可以看出，本发明的化合物对DHX33蛋白解旋酶的活力具有显著的抑制作用。
表1：化合物A、化合物B和化合物C对DHX33蛋白解旋酶活力的抑制性分析
*代表半抑制浓度≥400nM；**代表100nM≤半抑制浓度＜400nM；***代表20nM≤半抑制浓度＜100nM；****代表半抑制浓度＜20nM。
15.数据统计分析
数据表示为平均值+SD。使用斯氏t检验(Student’s test)确定统计学显著性，P值<0.05表示差异显著，用*标示；如果P值<0.01，用**标示；如果P值<0.001，用***标示。
实施例1.DHX33蛋白在多种膀胱癌症组织中高效表达
免疫组织化学分析DHX33蛋白在人膀胱癌组织中的表达
从上海卓立生物科技有限公司购买了人膀胱癌组织的石蜡组织切片的微列阵，一共包括48种不同的人体膀胱癌组织。将石蜡包埋的组织芯片首先在60℃烘箱中孵育30min，然后迅速在二甲苯中脱石蜡，并在一系列乙醇浓度(100％、95％、70％、50％和25％)逐渐降低的溶液中逐渐水合(每次轻轻摇动5min，每个浓度的乙醇溶液重复处理一次)，最在蒸馏水中继续水合10min。然后在蒸汽器中用50mM的Tris盐酸缓冲液(pH9.0)呈现抗原，蒸汽加热40min，随后冷却到室温。然后将组织在含1％H2O2的甲醇溶液中孵育以灭活内源性过氧化物酶。在室温下用10％FBS封闭1h后，将组织与一抗在4℃孵育过夜。然后根据制造商的建议使用DAKO试剂盒(丹麦DAKO公司)进行标准方案。使用的抗体来源如下：anti-DHX33，SantaCruz(购自SantaCruz生物技术公司)。实验结果(图1中显示染色的暗色圆形区域)显示DHX33蛋白在多种人类膀胱癌组织(尤其在细胞核中)发生高表达。下文的表2同时提供了针对48种癌组织的数据，从这个统计数据可见，大概有25例病理组织有DHX33蛋白的高效表达，占总病理样本数52％的膀胱癌病人的病理组织中有DHX33蛋白的高效表达。从病理切片的分析结果看，非肿瘤的组织区域和周边非增生的正常组织中，DHX33表达较低。
表2.48种膀胱癌组织及癌旁组织的DHX33蛋白表达分析
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实施例2.DHX33抑制剂可以有效抑制膀胱癌细胞的生长增殖
为了分析DHX33蛋白对膀胱癌细胞的抑制作用，我们选择了三种不同的DHX33抑制剂(化合物A、B和C)来处理不同的人体膀胱癌细胞。这几种化合物的合成方法和针对DHX33解旋酶活力的抑制数据如前所述。我们分别选择二种不同的代表性膀胱癌细胞株T24、5637开展化合物的细胞抑制性试验。如图2-3所示，DHX33抑制剂对前述两种不同的膀胱癌细胞均具有纳摩尔级别的细胞抑制性，而且细胞的抑制曲线显示下降幅度均可以超过50％。在这三种化合物中，化合物A具有相对较高的细胞抑制性，即活性较高，化合物C的活性最低，但也可以达到100纳摩尔左右的半抑制浓度。对于后期代表性的分析，我们主要选择化合物B来开展，化合物B的活性排在化合物A和化合物C中间。除了细胞的半抑制浓度之外，我们也进行了细胞的克隆生长的测试分析，其具体方法如前所述，我们选择这两种膀胱癌细胞T24和5637来开展实验。在采用20nM的浓度下，我们发现DHX33抑制剂B可以显著抑制这两种膀胱癌细胞的生长(图4和5)。除了这些细胞二维培养体系的分析之外，我们也在三维细胞培养体系中分析DHX33抑制剂B对膀胱癌细胞的抑制性，这个实验是在软琼脂体系中开展的，如前所述。悬浮独立生长是癌细胞的一个主要特征，在DHX33抑制剂(20nM)的处理下，我们发现膀胱癌细胞几乎完全丧失了在软琼脂中进行悬浮独立生长的能力，不能形成聚集性增殖或者克隆(图6和7)。以上实验的结果表明，DHX33的抑制剂对膀胱癌细胞具有显著的抑制作用。
实施例3.DHX33抑制剂可以部分诱导膀胱癌细胞的凋亡
为了分析DHX33抑制剂对膀胱癌细胞抑制性的分子机理，首先我们用不同浓度的化合物处理膀胱癌细胞，分析细胞的凋亡指数。将癌细胞用不同剂量的化合物B分别处理24h、48h或72h，收获细胞后，用凋亡染色试剂盒(上海Yeasen公司)分析细胞的凋亡比率。如图8-10所示，实验数据显示，抑制DHX33蛋白后，T24细胞发生了显著的细胞凋亡，但是只在较高浓度和长时间药物处理的条件下，即在100nM浓度下处理48h，才可以看到有显著的凋亡(增加30％左右)，而在药物处理的早期时间点，如24h，凋亡并不明显。更长的处理时间，如72h，100nM的化合物B处理T24细胞，可见50％左右细胞死亡率。此外，在另外的一种膀胱癌细胞5637中看到更加明显的细胞凋亡，比如48h 100nM的化合物B处理5637细胞，可以看到44％左右的细胞凋亡(图11-12)。图11-12中的数据分别呈现了细胞的散点图，凋亡细胞集群比率(不同样品的细胞在图上标示了不同浓度或者处理时间)。凋亡比率用数字标示出来。
上述实验结果证明，DHX33抑制剂对膀胱癌细胞具有一定的诱导凋亡作用，而且一般不是在早期的药物处理条件下。
实施例4.DHX33抑制剂可以调控膀胱癌细胞中的脂肪酸代谢酶---脂肪酸去饱和酶的表达
细胞生长离不开细胞膜的合成，尤其在癌细胞中，膜生成效率显著提高。研究表明，脂肪酸代谢对癌细胞的增殖至关重要。在多种癌细胞中，脂肪酸的合成异常活跃，尤其是细胞中脂肪酸的一些重要调控酶，例如脂肪酸去饱和酶，例如SCD1、FADS1、FADS2，都有高表达的现象。为了分析DHX33抑制剂是否可以调控这些重要基因的表达，我们对DHX33抑制剂处理的细胞进行了实时定量PCR分析。将T24细胞用DHX33抑制剂(化合物B)处理不同时间，即0h、4h、6h、8h，从细胞中提取总RNA后，用逆转录酶转换成其互补DNA分子，我们利用实时定量PCR技术，用这些DNA作为模板分析上述各种基因的转录本水平，引物的序列如前述。如图13所示，在DHX33受到抑制的T24细胞内，我们发现几个参与脂肪酸代谢的酶，特别是脂肪酸合成中的限速步骤酶SCD1和FADS1及FADS2，均发生了基因表达的下调。这一信号通路在现在技术中是没有报道过的。为了确定DHX33蛋白的抑制是否是影响脂肪酸去饱和过程重要因素，我们进一步分析了不同剂量的化合物B对T24细胞中脂肪酸去饱和酶的调控作用。如图14所示，随着化合物剂量的增加，脂肪酸去饱和酶的转录出现了显著的下调。对于另外一株5637细胞，我们进一步分析了不同剂量的抑制剂处理时SCD1、FADS1、FADS2的转录本水平。如图15所示，人膀胱癌细胞(5637)在DHX33抑制剂B的处理下，随着浓度的增加，脂肪酸去饱和酶的转录均发生了显著的表达抑制。为了确定DHX33抑制剂B的确可以抑制脂肪酸去饱和酶在蛋白质水平的表达，我们选择了二个代表性的蛋白质即FADS1和FADS2来开展分析。利用蛋白质免疫分析技术(Western Blot)分析了不同剂量化合物B处理5637细胞24h后的FADS1和FADS2蛋白水平的变化，发现随着剂量的增加，二者呈现剂量依赖性下调，尤其以FADS1变化最为显著，在较低的化合物B处理下就能看到显著的下调(图16)。
实施例5.DHX33抑制剂可以诱导膀胱癌细胞的铁死亡
铁死亡，最早于2012年由Scott JDixon提出，一种铁依赖的区别于细胞凋亡、细胞坏死和细胞自噬的新的细胞程序性死亡模式，具有铁死亡特征的细胞死亡的报道可以追溯到上世纪50年代。铁死亡的敏感性与许多生物过程紧密相关，例如，与多不饱和脂肪酸代谢有密切关联。近期数据指向铁死亡中磷脂/脂质过氧化是主要的发生因素。所以多不饱和脂肪酸的代谢与癌细胞铁死亡的特殊敏感性密切关联。前期研究中也发现SCD1、FADS等基因的表达可以保护癌细胞铁死亡的影响。而我们已经发现DHX33促进膀胱癌细胞中多种重要的脂肪酸去饱和酶的高表达，DHX33抑制剂处理后的癌细胞其SCD1、FADS1、FADS2表达降低，所以这些基因的表达下调可能会诱导癌细胞的铁死亡。为了分析DHX33抑制剂是否引发膀胱癌细胞的铁死亡相关通路，我们开展几个代表性的分析测试。首先，在铁死亡途径中，标志性的物质是活性氧(ROS)的指标有显著的上升。我们用化合物B处理T24细胞，首先用不同剂量的化合物B处理T24细胞16h，与阳性参照对比，我们发现按照同等数量的癌细胞计算，DHX33抑制剂可以显著诱导ROS的生成(图17)。我们进一步缩短了药物处理的时间，即从16h降到8h处理，处理T24细胞8h，发现DHX33抑制剂同样可以导致ROS上升(图18)。我们也在另外一株膀胱癌细胞5637中用化合物B处理分析了活性氧含量。化合物B处理细胞仅6h，与阳性参照对比，我们发现按照同等数量的癌细胞计算，DHX33抑制剂可以显著诱导ROS的生成(图19)。铁死亡途径的主要因素是脂类过氧化物的生成和积累导致的，所以我们继续分析了DHX33抑制剂处理16h之下的细胞质膜中的脂类过氧化物(LPO)的含量。这个实验我们是使用了LPO的检测试剂盒(ELABSCIENCE公司)，如图20所示，用化合物B处理T24细胞16h后，LPO的水平有显著的提高，这个分析是在比较等量的总细胞蛋白量的水平下进行的。我们进一步分析了药物处理5637细胞16h之下的细胞质膜中的脂类过氧化物(LPO)的含量，结果如图21所示，LPO的水平有显著的提高。我们进一步在药物处理16h后的5637细胞中分析了亚铁离子含量，如图22所示，可以看到铁离子的蓄积和浓度增加。由此，我们得出结论，DHX33的抑制剂可以诱导膀胱癌细胞的脂类过氧化物的生成，进而导致细胞的铁死亡，这个过程有铁离子的积累和依赖。
实施例6.DHX33抑制剂的动物体内药代动力学分析
本发明的化合物虽然可以在体外明显抑制癌的细胞生长，但是其在体内的药效发挥会受到体内药代动力学的影响，选择化合物B进行药代动力学分析。针对化合物B，进行小鼠体内的药物代谢动力学分析。静脉注射用化合物样品的制备：用PEG400溶解化合物B，然后加入HS-15(BASF)，混合为均一溶液后，再加入无菌生理盐水配成澄清的溶液，最终的化合物B的浓度为0.5mg/ml，各物质的比例为：8％PEG400，2％HS-15,90％生理盐水。药物制剂澄清后，用于小鼠尾静脉注射，注射剂量为5mg/kg。灌胃化合物样品的制备：将化合物B溶解PEG400中，加入Phorsal 50PG(购自上海新睿生物科技有限公司)，使得最终辅料比率为20％PEG400+80％Phorsal 50PG，用于小鼠的灌胃，灌胃剂量为50ml/kg。小鼠来源：北京维通利华实验动物技术有限公司(中国北京)。
小鼠数量：共6只，3只用于静脉注射，3只用于口服灌胃。
血浆样品收集：
静脉注射：注射后0.083h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h和24h。
口服灌胃：口服后0.25h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h和24h。
血浆样品收集及操作步骤：小鼠给药后进行静脉取血，每个时间点取血0.2mL。将血液样品放置于冰上含有EDTA的小管中，直至离心。血液样品在取血后的1h内用离心机以6800g离心6min，然后迅速置于-80℃冰箱内，剩余的血液处理掉。
样品分析和数据处理：
分析结果通过质量检验后确定。大于66.7％的质量检验的样品的准确度应该保持在已知数据的80-120％范围内。
标准参数，包括曲线下面积(AUC(0-t)和AUC(0-∞))通过FDA认证的药代程序Phoenix WinNonlin 7.0(Pharsight,USA)进行分析。图23显示了DHX33抑制剂B在小鼠给药后的各种药物暴露量，按照50mg/kg的口服给药剂量，其暴露量大约为2000ng*h/ml。从图22可见，化合物B在摄入小鼠体内后，具有一定的生物吸收度，口服的生物利用度平均为10％。
实施例7.DHX33抑制剂可以有效抑制膀胱癌的生长和增殖。
1、动物信息
种属及品系：Balb/c Nude小鼠。
性别及周龄：雌性，6周龄。
体重：18-22g，偏差约为体重均值的±20％。
接种动物数：10只。
动物来源：浙江维通利华实验动物技术有限公司。
2、动物饲养
居住条件：SPF环境，IVC小鼠笼，每笼4只。
温度：20-26℃。
湿度：40-70％。
光照：12h昼夜交替。
饲料：辐照大小鼠饲料，购自北京科澳协力饲料有限公司，自由进食。
饮用水：城市自来水，经过滤、高压灭菌后饮用。
垫料：玉米芯，购自北京科澳协力饲料有限公司，经高压灭菌后使用，每周更换一次。
适应性饲养：实验前给予小鼠不低于7天的适应性饲养期。
动物识别：每个鼠笼均挂有实验信息标示卡，其中包括小鼠信息、细胞接种信息、动物实验信息及实验人员信息等，小鼠用耳标法进行标记。
所有实验动物的操作和管理均严格遵守实验动物使用和管理指导原则。
3、溶媒处方及给药溶液储存条件
(1)受试物(化合物B)
化合物配置：称取适量粉末状态药物，先用DMSO在常温下溶解，然后溶解在含有20％PEG400/80％Phorsal 50PG辅料的水溶液中，获得5mg/ml的溶液。
给药溶液保存条件：-20℃保存(一次配置7天的药物，17天的实验周期内一共配制3次药物。需要分装好，放置在-20℃冰箱)。
(2)细胞株
人膀胱癌细胞5637购自中科院细胞库。
(3)培养基
RPMI-1640培养基和胎牛血清(FBS)均购自GIBCO公司(Grand Island,NY,USA)，基质胶(Matrigel)购自BD公司(Franklin lake,NJ,USA)。
4、实验设计
实验设计如表1所示：
表1.受试物对人膀胱癌细胞5637Balb/c裸鼠异种移植瘤生长抑制作用研究方案
注：NA表示不适用，PO表示灌胃，BID表示一天两次灌胃，Vehicle表示溶媒组。
5、实验方法
(1)模型建立
将5637细胞培养于含10％FBS的RPMI-1640培养基，维持在含5％CO2的37℃饱和湿度培养箱中。收集对数生长期细胞，调整细胞浓度至每毫升5×107个细胞。在无菌条件下，接种0.1mL细胞悬液至小鼠右侧背部皮下，接种浓度为5×106个细胞/0.1mL/小鼠。
(2)分组及给药观察
在肿瘤平均体积达到50mm3时，将动物按肿瘤体积随机分组，使各组肿瘤体积差异小于均值的10％，分组当日记为Day 0，并按照动物体重开始给药。给药期间，每周2次测定动物体重，每日观察记录动物临床症状。个别动物体重如果与Day 0相比下降超过15％(BWL≥15％)，将做停药处理，直至动物体重恢复后(BWL<15％)，恢复给药。
实验终点说明：
实验终点最后一次称量结束后，用CO2安乐死处死剩余动物，取瘤称重并拍照记录。
从图24～图25可见，DHX33抑制剂即化合物B处理后的小鼠肿瘤，与对照组相比，有明显的抑制现象。对照组和实验组小鼠在起始时间点(即开始分组，化合物处理之前)的肿瘤平均体积都是50mm3左右，但在17天药物处理之后，肿瘤的增长指数对照组明显大于给药组小鼠。值得一提的是，本实验中使用化合物B的体内药物代谢数据不是在最佳条件下获得的。针对该化合物的机体摄入频率和剂量没有进行最佳组合分析，显示生物利用度偏低，但依然可以检测到化合物B在体内对肿瘤的抑制性。
用较高剂量(50mg/kg，一天两次)的DHX33抑制剂(化合物B)处理小鼠17天的过程中，也对各组小鼠的体重进行跟踪监测。检测结果显示(图26)，小鼠没有明显的体重减低现象。与对照组相比，小鼠的行为和体重正常。以上实验数据表明，DHX33抑制剂对人体的膀胱癌具有显著的体内和体外抑制性，并且在使用的剂量范围内，没有看到对个体有明显毒副作用。DHX33抑制剂可以作为治疗人膀胱癌的一种新型的治疗手段。

Claims (8)

1.RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗或者辅助治疗膀胱癌的药物中的应用，其特征在于所述抑制剂选自化合物A、B、C或其药学上可接受的盐中的至少一种，
化合物C
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述膀胱癌为DHX33蛋白表达阳性的。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述膀胱癌为前期化疗或者靶向药耐药性膀胱癌。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述膀胱癌含有以下基因的突变：FGFR3、KRAS、TP53、PIK3CA、ERBB2、HRAS、PD1/PD-L1。
5.RNA解旋酶DHX33抑制剂在制备用于治疗或者辅助治疗膀胱癌的药物组合物中的应用，其特征在于所述抑制剂选自化合物A、B、C或其药学上可接受的盐中的至少一种，
化合物C
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述膀胱癌为DHX33蛋白表达阳性的。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述膀胱癌为前期化疗或者靶向药耐药性膀胱癌。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述膀胱癌含有以下基因的突变：FGFR3、KRAS、TP53、PIK3CA、ERBB2、HRAS、PD1/PD-L1。
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