CN116478147A - 抑制rna解旋酶dhx33活性的氘代化合物、合成方法、药物组合物及用途 - Google Patents

抑制rna解旋酶dhx33活性的氘代化合物、合成方法、药物组合物及用途 Download PDF

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CN116478147A CN202310472343.7A CN202310472343A CN116478147A CN 116478147 A CN116478147 A CN 116478147A CN 202310472343 A CN202310472343 A CN 202310472343A CN 116478147 A CN116478147 A CN 116478147A
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Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种抑制RNA解旋酶DHX33活性的氘代化合物及其合成方法，还涉及包含该化合物的药物组合物以及该化合物在制备用于预防和/或治疗DHX33相关疾病的药物中的用途。氘代化合物结构式为：

Description

抑制RNA解旋酶DHX33活性的氘代化合物、合成方法、药物组合 物及用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及抑制RNA解旋酶DHX33活性的氘代化合物和其制备方法，还涉及包含该氘代化合物的药物组合物以及该氘代化合物在制备用于预防和/或治疗DHX33相关疾病的药物中的用途。
背景技术
DHX33属于含有DEAD/H盒的RNA解旋酶蛋白家族，其中DEAD/H代表氨基酸的缩写Asp-Glu-Ala-Asp/His，这一序列连同其他多个保守性氨基酸序列，出现在RNA解旋酶家族成员的蛋白序列中，高度参与核酸底物结合以及ATP水解。虽然这些家族成员共有这些相同的序列，但是每个RNA解旋酶都有各自特定的专一性和独特的生物功能。人DHX33蛋白的分子量是72kDa，具有解旋核酸的功能，它利用ATP水解所释放的生物能来驱动改变RNA和蛋白质复合物的构象，进而参与多种RNA的代谢活动，具体地，从RNA转录、剪切、编辑、翻译到降解等一系列生物过程。DHX33的功能并不仅仅局限于对RNA分子的修饰，研究表明，除了解旋RNA双链之外，DHX33蛋白也参与到DNA的代谢。具体，DHX33蛋白可以解开DNA的双链结构，并在基因表达过程中起重要作用。在体外的酶反应体系中，DHX33蛋白还被发现可以解开DNA/RNA的杂合双链结构。
研究表明，DHX33通过结合在多种癌症相关的基因启动子，影响了DNA的甲基化状态，进而在基因组水平调控多种癌症基因的表达和肿瘤发展相关的信号通路，对细胞生长、增殖、迁移、凋亡、糖代谢等多种细胞活动有至关重要的作用。此外，发现DHX33可以感受外来双链RNA分子的侵入并在细胞的先天免疫中发挥重要作用。DHX33作为十分重要的细胞生长调控基因，在多种癌症中高度表达，比如肺癌、淋巴瘤、神经胶质母细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、肝癌等。多种癌症的发生发展依赖于DHX33蛋白的高度表达。DHX33的遗传敲除可以显著抑制RAS癌基因驱动的肺癌发生发展；体内和体外实验证实，抑制DHX33蛋白后，多种癌症如乳腺癌、结肠癌、脑胶质瘤、淋巴瘤等癌症的发生发展都受到明显抑制。
研究表明，DHX33的蛋白功能依赖于其解旋酶活力。DHX33的解旋酶活力缺失突变体不具有DHX33蛋白的功能，无法替代野生型DHX33基因的功能。目前针对DHX33作为靶点的小分子抑制剂较为稀少，因此迫切需要开发一类活性高、成药性好的DHX33抑制剂药物。
发明内容
本发明通过大量的研究，发现了抑制DHX33的RNA解旋酶活性的氘代化合物，可以用于预防和/或治疗DHX33相关疾病，例如癌症。
一方面，本发明提供了式I所示的抑制DHX33的RNA解旋酶活性的氘代化合物：
其中，所述氘代化合物的分子式为C21H16D3N5O2S，分子量为408.49。
在第二方面，本发明提供了一种药物组合物，包含上述氘代化合物或其药学上可接受的盐或前药，以及一种或多种药学上可接受的载体。
在第三方面，本发明提供了上述化合物或其药学上可接受的盐或前药在制备用于预防和/或治疗至少部分由DHX33介导的疾病或病症的药物中的用途。
在第三方面的实施方案中，至少部分由DHX33介导的疾病或病症可以是癌症。
在第四方面，本发明提供了合成氘代化合物的方法，包括以下步骤：
在第四方面的实施方案中，所述化合物4与所述化合物A的摩尔比为2.23：2.35，反应温度为90℃，反应时间为16h。
在第四方面的实施方案中，所述化合物4的合成方法包括以下步骤：
在第四方面的实施方案中，所述化合物1合成化合物2的方法是向Na在CD3OD的溶液中加入化合物1，将反应混合物在80℃搅拌16h。
与现有技术相比，本发明具有有益的技术效果。具体而言，本发明提供的氘代化合物相比氘代之前的化合物(AB)即如式Ⅱ所示，具有更好的代谢稳定性。
术语定义
除非另有说明，下列术语在本发明中的含义如下。
术语“包含”、“包括”、“具有”或“含有”或其任何其它变体旨在涵盖非排他性或开放式的包含内容。例如，包含一系列元素的组合物、方法或装置不一定仅限于已明确列出的元素，而是可能还包含其它未明确列出的元素或上述组合物、方法或装置所固有的元素。
术语“药物组合物”是指可以用作药物的组合物，其包含药物活性成分(或治疗剂)以及可选的一种或多种药学上可接受载体。术语“药学上可接受的载体”是指与治疗剂一同给药的辅料，并且其在合理的医学判断的范围内适于接触人类和/或其它动物的组织而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或与合理的益处/风险比相应的其它问题或并发症。在本发明中可使用的药学上可接受的载体包括但不限于：a)稀释剂；b)润滑剂；c)粘合剂；d)崩解剂；e)吸收剂、着色剂、调味剂和/或甜味剂；f)乳化剂或分散剂；和/或g)增强化合物的吸收的物质等。
上述药物组合物可以系统地作用和/或局部地作用。为此目的，它们可以通过适合的途径给药，例如通过胃肠外、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、真皮内、经皮、直肠、颅内、腹膜内、鼻内、肌内途径或作为吸入剂给药。
上述给药途径可以通过适合的剂型来实现。在本发明中可使用的剂型包括但不限于：片剂、胶囊剂、锭剂、硬糖剂、散剂、喷雾剂、乳膏剂、软膏剂、栓剂、凝胶剂、糊剂、洗剂、软膏剂、水性混悬剂、可注射溶液剂、酏剂、糖浆剂等。
当口服给药时，可将上述药物组合物制成任意口服可接受的制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊剂、水溶液剂、水混悬剂等。
上述药物组合物还可以无菌注射剂的形式给药，包括无菌注射水或油混悬剂，或者无菌注射水或油溶液剂。其中，可使用的载体包括但不限于：水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。
上述药物组合物可以包含0.01mg至1000mg的至少一种式I所示的氘代化合物或其药学上可接受盐或其前药。
术语“至少部分由DHX33介导的疾病或病症”是指发病机理中至少包含一部分与DHX33有关的因素的疾病，例如癌症，例如前列腺癌或膀胱癌。
术语“有效量”是指能够诱发细胞、组织、器官或生物体(例如个体)产生生物或医学反应，并且足以实现所需预防和/或治疗效果的剂量。
可调整给药方案以提供最佳所需响应。例如，可单次给药，可随时间分剂量给药，或可根据实际情况按比例减少或增加剂量后给药。可以理解的是，对于任何特定个体，具体的给药方案应根据需要以及给药组合物或监督组合物的给药人员的专业判断而调整。
术语“对其有需求”是指医生或其它护理人员对个体需要或者将要从预防和/或治疗过程中获益的判断，该判断的得出基于医生或其它护理人员在其专长领域中的各种因素。
术语“个体”(或称受试者)是指人类或非人动物。本发明的个体包括患有疾病和/或病症的个体(患者)和正常的个体。本发明的非人动物包括所有脊椎动物，例如非哺乳动物，例如鸟类、两栖类、爬行类等，和哺乳动物，例如非人灵长类、家畜和/或驯化动物(例如绵羊、犬、猫、奶牛、猪等)。
术语“治疗”是指减轻或消除所针对的疾病或病症。如果个体接受了治疗量的本发明的化合物或其药学上可接受的形式或者本发明的药物组合物，该个体的至少一种指标和症状表现出可观察到的和/或可检测出的缓解和/或改善，则表明该个体已被成功地“治疗”。可以理解的是，治疗不仅包括完全地治疗，还包括未达到完全地治疗，但实现了一些生物学或医学相关的结果。具体而言，“治疗”表示本发明的化合物或其药学上可接受的形式或者本发明的药物组合物可以实现下列效果中的至少一种，例如：(1)在可能有疾病倾向，但尚未经历或显示疾病病理学或症状学的动物中防止疾病发生；(2)在正在经历或显示疾病病理学或症状学的动物中抑制疾病(即阻止病理学和/或症状学的进一步发展)；(3)在正在经历或显示疾病病理学或症状学的动物中改善疾病(即逆转病理学和/或症状学)。
术语“药学上可接受的盐”是指对生物体基本上无毒性的，本发明的化合物的盐。药学上可接受的盐通常包括但不限于本发明的化合物与药学上可接受的无机/有机酸或无机/有机碱反应而形成的盐，此类盐又被称为酸加成盐或碱加成盐。适合的盐的综述参见，例如，Jusiak,Soczewinski,et al.,Remington’s Pharmaceutical Sciences[M],MackPublishing Company,2005和Stahl,Wermuth,Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,andUse[M],Wiley-VCH,2002。用于制备本发明的化合物的药学上可接受的盐的方法是本领域技术人员已知的。
本发明涵盖本发明的化合物的所有可能的代谢物形式，即在施用本发明的化合物的个体体内形成的物质。化合物的代谢物可以通过所属领域的公知技术来鉴定，其活性可以通过试验来表征。
附图说明
图1显示了本发明氘代化合物的HPLC色谱图。
图2显示了本发明氘代化合物的1HNMR图谱。
图3显示了本发明氘代化合物的质谱图。
图4显示了本发明氘代化合物对比已知化合物的HPLC洗脱时间的差异。
图5显示了本发明氘代化合物抑制癌细胞PC-3活性的分析。
图6显示了本发明氘代化合物抑制癌细胞5637活性的分析。
图7显示了式Ⅱ所示化合物抑制上述两种癌细胞的活性分析。
图8显示了本发明氘代化合物在人体肝脏微粒体中的代谢稳定性分析曲线。
图9显示了本发明氘代化合物在犬肝脏微粒体中的代谢稳定性的分析曲线。
图10显示了本发明氘代化合物在人和犬肝脏微粒体中的代谢稳定性的重要参数。
图11显示了式Ⅱ所示化合物在人体肝脏微粒体中的代谢稳定性分析曲线
图12显示了式Ⅱ所示化合物在犬肝脏微粒体中的代谢稳定性分析曲线。
图13显示了式Ⅱ所示化合物在人和犬肝微粒体代谢稳定性的重要参数。
具体实施方式
为了使本发明的目的和技术方案更加清楚，以下结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
实施例中所使用的试剂或仪器均为可以通过市购获得的常规产品。未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行。本发明中所使用的术语“室温”是指20℃±5℃。在用于修饰某一数值或数值范围时，本发明中所使用的术语“约”是指包括该数值或数值范围以及该数值或数值范围的本领域技术人员可接受的误差范围，例如该误差范围为±10％、±5％、±4％、±3％、±2％、±1％、±0.5％等。
以下实施例中记载的化合物的结构通过核磁共振(NMR)和/或质谱(MS)来确定。
核磁共振(NMR)的测定仪器使用Bruker400 MHz核磁共振仪，测定溶剂为氘代甲醇(CD3OD)、氘代氯仿(CDCl3)、六氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)，内标物质为四甲基硅烷(TMS)。
以下实施例中的核磁共振(NMR)数据中的缩写代表的含义如下：
s：单峰、d：二重峰、t：三重峰、q：四重峰、dd：双二重峰、qd：四二重峰、ddd：双双二重峰、ddt：双双三重峰、dddd：双双双二重峰、m：多重峰、br：宽峰、J：偶合常数、Hz：赫兹、δ：化学位移。
全部化学位移(δ)值以百万分之一(ppm)的单位给出。
质谱(MS)的测定仪器使用Agilent 6120B质谱仪，离子源为电喷雾离子源(ESI)。
HPLC的测定使用Waters 2695-2996高压液相色谱仪(Gimini C18，150X4.6mm，5μm色谱柱)。
薄层层析硅胶板使用青岛海洋GF254硅胶板，薄层色谱法(TLC)使用的硅胶板采用的规格是0.15mm-0.2mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm-0.5mm硅胶板。
柱层析一般使用青岛海洋200-300目硅胶为载体。
实施例中的反应进程的监测采用薄层色谱法(TLC)，反应所使用的展开剂的体系有A：二氯甲烷和甲醇体系；B：石油醚和乙酸乙酯体系，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节。
纯化化合物采用的柱层析的洗脱剂的体系和薄层色谱法的展开剂的体系包括A：二氯甲烷和甲醇体系；B：石油醚和乙酸乙酯体系，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节，也可以加入少量的三乙胺和酸性或碱性试剂等进行调节。
实施例1氘代化合物的合成
本实施例提供了氘代化合物(AB25867)的合成合成路线，如下所述：
a.化合物2的制备
向Na(2.0g,86.93mmol,3.0eq)在CD3OD(50ml)的溶液中加入化合物1(5g,29.98mmol,1.0eq)，将反应混合物在80℃搅拌16h。反应混合物在减压下浓缩。残余物用水(20ml)淬灭，在二氯甲烷(30ml)和水(50ml)之间分配。水相用二氯甲烷(20ml)提取两次，合并有机相，用饱和NaCl(aq)(20ml)洗涤，在Na2SO4上干燥，并蒸发至干燥，得到为浅黄色固体的化合物2(4.03g，产率：98.8％)。
TLC:PE/EA＝5/1,
Rf(化合物1)＝0.20,
Rf(化合物2)＝0.40；
LCMS:172.15[M+H]+。
b.化合物3的制备
将化合物2(500mg,2.29mmol,1.0eq)和Pd/C(100mg,20％w/w)在甲醇(60ml)中的混合物在1大气压(H2)、室温(RT)下搅拌2h。过滤反应混合物并浓缩滤液，得到为棕色固体的化合物3(363.9mg,产率：97.0％)。
TLC:DCM/MeOH＝10/1,
Rf(化合物2)＝0.80,
Rf(化合物3)＝0.20；
LCMS:142.10[M+H]+。
请注意，化合物3可能不稳定，最好现场使用。
c.化合物4的制备
向化合物3(400mg,2.84mmol,1.0eq.)在MeOH(5ml)和H2O(5ml)中的溶液中加入溴化氰(451mg,4.30mmol,1.5eq)，将反应混合物在50℃下搅拌16h。浓缩反应混合物，并将残余物用NaOH(aq)调节到pH＝9。水相用乙酸乙酯萃取(20ml)，合并有机相，用饱和NaCl(aq)(10ml)洗涤，在Na2SO4上干燥，并蒸发至干燥。残余物通过用DCM:MeOH＝10:1洗脱的硅胶色谱法纯化，得到为灰白色固体的化合物4(265.1mg,产率：56.3％)。+
TLC:DCM/MeOH＝10/1,
Rf(化合物3)＝0.20,
Rf(化合物4)＝0.10；
LCMS:167.05[M+H]+。
d.氘代化合物(AB25867)的制备
向化合物A(611mg,2.35mmol,1.0eq.)在乙酸乙酯(5ml)和DIPEA(1.22g,9.38mmol,4.0eq)的溶液中加入化合物4(370mg,2.23mmol,0.95eq)和PyBop(1.35g,2.58mmol,1.1eq)，将反应混合物在90℃下搅拌16h。反应混合物在减压下浓缩。将残余物溶解于丙酮(3ml)，加入H2O(9ml)，在RT搅拌30min并过滤。滤饼在真空下干燥，得到400mg粗AB25867。DIPEA为N,N-二异丙基乙胺，PyBop为六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷。
AB25867的纯化
将残余物溶解于THF(3.2ml,8v)中，并加入甲磺酸(94.1mg,1.0eq)，将反应混合物搅拌2h并过滤。将滤饼滤饼溶解于NaOH(aq)和二氯甲烷中，将溶液再搅拌30min。分离反应混合物，有机相在减压下浓缩，得到为浅黄色固体的化合物AB25867(330mg,产率：34.4％)。
TLC:DCM/MeOH＝10/1,
Rf(化合物4)＝0.10,
Rf(化合物5)＝0.60；
LCMS:409.05[M+H]+；
氘代化合物AB25867的核磁氢谱图如图2所示，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.32–7.26(m,2H),6.97(s,1H),6.87(s,1H),6.68(dd,J＝8.7,2.4Hz,1H),2.51(d,J＝1.2Hz,3H),2.37(s,3H),2.02(s,3H)。
实施例2氘代化合物结构纯度的鉴定
使用LC-MS对氘代化合物进行检测。
(1)色谱条件
色谱柱：Shim-Pack GIST C18 5um。
流速：1.0mL/min。采集时间：15min。测定波长：254nm。柱温：25℃。进样器温度为室温。进样体积：2uL。
稀释剂为DMSO。
流动相：A泵：0.1％甲酸水溶液，B泵：乙腈。
流动相梯度如下。
离子源：电喷雾离子源(ESI)
扫描方式：正离子
结果如图1与图3所示。按照一般的液相-质量联合分析的手段，对洗脱下来的物质进行质谱的分子量鉴定，通过计算目的物质的分子量，为：409.05[M+H]+，并通过主要目的物质的出峰面积确定目前分子的纯度或含量。
实施例3氘代化合物与已知化合物对比的HPLC存留时间分析
在确定氘代化合物已经合成并且达到目标纯度之后，使用岛津高效液相LC-2050测定氘代化合物(AB25867)与式Ⅱ所示的已知化合物的保留时间对比。色谱的条件与上面表述的一致，具体如下：
色谱柱：Shim-Pack GIST C18 5um。
流速：1.0mL/min。采集时间：15min。测定波长：254nm。柱温：25℃。进样器温度为室温。进样体积：2uL。
稀释剂为DMSO。
流动相：A泵：0.1％甲酸水溶液，B泵：乙腈。
流动相梯度如下。
将测定氘代化合物AB25867与式Ⅱ所示的化合物的保留时间进行比对，结果如图4所示。图中显示的已知化合物的保留时间为7.797分钟，而氘代化合物在相同的色谱条件下，其保留时间为：7.493分钟，相对于已知化合物而言，具有稍微增强的疏水性，符合预期。
实施例4氘代化合物的细胞半抑制浓度(IC50)测定
在确定氘代化合物已经成功合成的前提下，我们进一步分析了化合物的活性。通常的条件下，氘代化合物不影响已知物质的活性。但本研究中，我们依然采用癌细胞的半抑制浓度的分析方法对比氘代化合物和已知化合物的活性。
人前列腺癌细胞PC-3或者人胃癌细胞SGC7901购自中科院细胞库。用含有10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺以及链霉素和青霉素的RPMI-1640培养基培养，生长条件设定为37℃、5％的CO2带有湿度的细胞培养箱中。细胞每隔3天传代一次，传代10次之后丢弃不用。将过表达DHX33的癌症细胞株PC-3或者SGC7901细胞以1×104/100μl/孔铺到96孔板上。等待细胞贴壁完全，将本申请实施例1制备的氘代化合物(AB25867)以5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、250nM、500nM、1000nM、2000nM的浓度添加到细胞RPMI-1640的完全培养基中，用多通道排枪混合均匀。等待化合物和细胞温育时间达到48h后，用CCK-8试剂(上海翌圣生物公司)按照标准流程添加到96孔板的培养基中，温育2个小时后，用酶标仪读板(OD＝450nm)，将实验重复三次，并绘制化合物在不同浓度下的抑制曲线，计算本申请实施例1制备的氘代化合物的半抑制浓度(IC50)。结果显示，氘代化合物在PC-3细胞中的半抑制浓度为34nM，在SGC7901细胞中的半抑制浓度为16nM。
图6所示为式Ⅱ所示的已知化合物在PC-3细胞跟SGC7901细胞的IC50值作为对照。式Ⅱ所示的已知化合物在PC-3中的半抑制浓度为50nM(图7-a)，在SGC7901中的半抑制浓度为20nM(图7-b)。
测定的本申请实施例1制备的氘代化合物相对于已知化合物具有略微增强的活性。
实施例5氘代化合物在肝脏微粒体中的代谢稳定性分析
用pH为7.41的5mM MgCl2预热100mM K-buffer，得到K/M-buffer。氘代化合物(AB25867)和参比溶液的500μM稀释溶液配制：将5μL10mm化合物AB25867原液和参比溶液加入95μL ACN中，即得。1.5M微粒体溶液(0.75mg/mL)：将1.5μL上述的氘代化合物(AB25867)和参比溶液的500μM稀释溶液和18.75μL的20mg/mL肝脏微粒体(北京汇智和源生物技术有限公司)加入到479.75μL K/Mg-buffer中。NADPH原液(6mM，5mg/mL)是将NADPH溶解到K/Mg-buffer中制备的。将30μL含0.75mg/mL微粒体溶液的1.5μM溶液分配到指定的检测板上，用于不同的时间点(0，5，15，30，45min)检测。在37℃下预孵育5min。在0min时，在孔中先加入150μL含IS(内标)的ACN，再加入15μL的NADPH原液(6mM)。对于其他时间点，在孔中加入15μL的NADPH原液(6mM)，开始反应并计时。在5min、15min、30min、45min分别向相应板孔中加入150μL含IS的ACN，使反应停止。淬火后，摇10min(600转/min)，然后以6000转/min离心15min。从每孔取80μL上清液，转入96孔含有140μL纯水的样品板，进行LC/MS分析。用同样的方法分析检测Ⅱ所示已知化合物(AB24386)，结果如图8-图13所示。从图8-图13可以看出，本申请的氘代化合物(AB25867)的代谢稳定性相比已知化合物有显著的提高。半衰期T1/2的数据在犬和人体的肝微粒体中显著延长。
综上，这些数据显示氘代化合物相比于已知化合物具有更佳的活力和成药性，方便后续的药物开发和应用。

Claims (9)

1.抑制DHX33的RNA解旋酶活性的氘代化合物，其特性在于，具有下述式I：
2.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的氘代化合物或其药学上可接受的盐或前药，以及一种或多种药学上可接受的载体。
3.权利要求1所述的氘代化合物或其药学上可接受的盐或前药在制备用于预防和/或治疗至少部分由DHX33介导的疾病或病症的药物中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述疾病或病症是癌症。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述癌症为DHX33蛋白高表达癌症。
6.合成权利要求1所述氘代化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求7所述的合成氘代化合物的方法，其特征在于，所述化合物4与所述化合物A的摩尔比为2.23：2.35，反应温度为90℃，反应时间为16h。
8.根据权利要求6所述的合成氘代化合物的方法，其特征在于，所述化合物4的合成方法包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的合成氘代化合物的方法，其特征在于，所述化合物1合成化合物2的方法是向Na在CD3OD的溶液中加入化合物1，将反应混合物在80℃搅拌16h。
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