CN108947879B - Prmt i型抑制剂及其制备方法和用途 - Google Patents

Prmt i型抑制剂及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种PRMT I型抑制剂及其制备方法和用途，该PRMT I型抑制剂具有如式I所示的结构，式中各取代基的定义如说明书和权利要求书所述。本发明的化合物能够制备治疗或预防与调节PRMT I型异常相关的人和哺乳动物疾病的药物。

Description

PRMT I型抑制剂及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种多取代的蛋白质精氨酸甲基转移酶PRMTI型的活性抑制类化合物、其制备方法、药物组合物及其用途。
背景技术
蛋白质精氨酸甲基转移酶PRMT能够催化体内包括组蛋白H4在内的众多蛋白的甲基化修饰。在真核生物中精氨酸甲基化是一种广泛存在的翻译后修饰，参与包括组蛋白甲基化内的众多的蛋白功能的调控。甲基化的水平与细胞的生理状态息息相关，进而影响疾病的发生发展。因此，对体内甲基化水平的调控显得尤为重要。在哺乳动物中，精氨酸的甲基化修饰主要由精氨酸甲基转移酶PRMT完成。
目前已知的精氨酸甲基转移酶共有9种，分为四种大类，共同完成精氨酸上的一甲基化，对称二甲基化和不对称二甲基化的催化过程。其中一类精氨酸甲基转移酶PRMTⅠ包括PRMT1，3，4，6，8，主要负责催化精氨酸上的一甲基化和不对称二甲基化，而PRMT1在这中间发挥主要的催化作用，细胞内多达85％的甲基转移酶催化反应由PRMT1承担，PRMT1主要催化组蛋白H4R3上的不对称二甲基化。精氨酸甲基转移酶(PRMTs)与甲基供体(S-腺苷甲硫氨酸，SAM)结合，将甲基供体SAM上的甲基转移到组蛋白精氨酸底物上，催化底物的甲基化。因此，一类PRMTs家族有着十分保守的催化酶活性核心结构域。
组蛋白甲基化修饰作为表观修饰的一种，甲基化水平的变化影响着生物体的生长发育，在疾病的发生发展中扮演这重要的角色。在一类PRMTs中，又以PRMT1的催化功能最为重要，因此，PRMT1的甲基化调控与众多的疾病发生密切相关。例如，在前列腺癌中癌症的发生与H4R3的甲基化水平有关，在结肠癌中PRMT1的一种剪切变异体在癌症病人中高表达，在病变的乳房组织中PRMT1的不同亚型有着不同与正常组织的表达水平，PRMT1也是混合谱系白血病发生的转录酶复合物中的重要组成。此外，PRMT1和PRMT3，PRMT6能够催化核酸poly(A)结合蛋白(nuclear ploy(A)-binding protein，PABPN1)C末端区域的甲基化，与眼咽肌营养不良(oculopharyngeal muscular dystrophy)的发生有关；PRMT1和PRMT6的异常调节会推动膀胱癌和肺癌的发生；敲减PRMT1和PRMT6能够有效抑制乳腺癌细胞的生长，表明PRMT1和PRMT6与乳腺癌的发生有着密切的联系；在三期的乳腺癌，结肠癌和前列腺癌中也可检测到PRMT4的高表达，敲减PRMT4也可观察到明显抑制对应细胞系的生长。由于一类PRMTs主要催化不对称二甲基化，体内不对称二甲基化的水平的改变与心血管疾病，糖尿病，肾功能衰竭以及慢性肺部疾病有密不可分的联系。PRMT8的氨基酸序列与同家族的PRMT1有将近80％的相似度。在细胞中，N端豆蔻酰化的PRMT8可以与细胞膜结合，并且相关研究表明N端的结构域可以调控PRMT8的活性。PRMT8组织特异性的高表达在脑组织中，尤其在躯体感觉和边缘系统核团存在较高的PRMT8mRNA表达。特别地，PRMT8被发现存在于有丝分裂后期的神经元中，提示其可能参与了神经发育过程。PRMT8还可以调控突触神经元周围网络的一个组分腱生蛋白，而腱生蛋白可以保护神经网络中突触连接的结构完整性，这与突触成熟及发育相关的神经可塑性密切相关。另外有研究将PRMT8与电压门控钠通道高通一同转染至细胞进行共表达发现，钠离子通道的电流增加了3倍，提示PRMT8可能与神经兴奋及癫痫等疾病相关。同时有研究发现PRMT8可以作为磷脂酶直接水解卵磷脂，生成胆碱和磷脂酸，这对浦肯野细胞树突状结构及运动协调具有调控作用。在人真皮成纤维细胞中研究发现存在PRMT8的变体型基因，siRNA敲减实验表明这个变体型为人类皮肤成纤维细胞和四级恶性胶质瘤细胞的生长所必需。另外，在有原发性脑肿瘤(PBT)患者的家族中存在PRMT8基因序列的单核苷酸多态性(SNP)，这可能是PBT患者家属中易得神经胶质瘤的原因。PRMT8还可以与原癌基因产物尤文肉瘤蛋白(EWS)相互作用，这种相互作用独立于EWS蛋白的甲基化状态，提示PRMT8不仅起到甲基转移酶的作用，还可能具有调控甲基化状态的EWS的作用。有研究表明，在子宫内膜异位症中PRMT8基因的启动子区域存在高甲基化，提示PRMT8可能参与到卵细胞成熟等过程，这与子宫内膜异位症所致的不孕不育有密切关联。PRMT8还被发现在多功能干细胞中表达，并且其转录受多功能转录因子如Sox2的调控，暗示其除了在神经系统中的功能外，还可能在多功能干细胞中发挥作用。综上所述，PRMTⅠ型蛋白调节异常相关的疾病，包括但不局限于癌症(如前列腺癌、结肠癌、混合谱系白血病、膀胱癌、肺癌、乳腺癌等)、心血管疾病、神经退行性疾病、疟疾、艾滋病、痛风、糖尿病、肾功能衰竭、慢性肺部疾病、眼咽肌营养不良、可卡因成瘾等疾病。
目前为止，已有的靶向PRMTs的多为甲基供体SAM类似物，但因SAM同时是体内其他甲基转移酶的甲基供体，因此这类抑制剂缺乏选择性，存在严重的脱靶问题。第一个被报道的具有选择性的小分子抑制剂为AMI-1，IC50值在微摩尔的数量级，其他许多小分子抑制剂如DCLX069，DB75和MHI-21等，这些抑制剂活性都无较大改观，细胞过膜性差，分子骨架成药性不佳。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有选择性的活性具有较大改观的PRMT I型抑制剂。
本发明的第一方面，提供一种式(I)化合物，其异构体、其外消旋体、或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0001297206520000031
其中，X选自：NH、O、S、C＝O、C＝S、-S(O)-、O＝S＝O、S-S、-C＝NH-、-(C＝O)-NH-、-(C＝O)-O-、-(C＝O)-S-、-(C＝S)-NH-、-(C＝S)-O-或-(C＝S)-S-；
C1选自C＝O或CH2；
R1为卤素；
R2为H或甲基；
R3、R4各自独立地为H、C1-12烷基、部分或全部卤代的C1-12烷基或C3-10环烷基，且R3和R4不同时为甲基；
虚线为化学键或无，任意相邻两虚线不同时为化学键；
A1、A2、A3和A4各自独立地为O、S、N、NH或CH；且A1、A2、A3或A4独立地任选地被R5取代，其中各R5独立地为卤素、C1-6烷基、C3-10环烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基、C1-6烷氨基、部分或全部卤代的C1-6烷基、或含N和/或O的取代或未取代的六元芳环或六元杂环；或A1、A2、A3、A4其中任意两个与R5形成包含3-16个碳原子的芳环、芳杂环或非芳香环；
B1、B2、B3、B4和B5各自独立地为O、S、N、NH、CH或CH2；且B1、B2、B3、B4和B5独立地任选地被R6取代，其中各R6独立地为卤素、C1-6烷基、C3-10环烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基、C1-6烷氨基、部分或全部卤代的C1-6烷基、或含N和/或O的取代或未取代的六元芳环或六元杂环；或B1、B2、B3、B4和B5其中任意两个与R6形成包含5-16个碳原子的芳环、芳杂环或非芳香环。
在另一优选例中，所述药学上可接受的盐为式(I)化合物与酸形成的盐，所述的酸选自：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸、天冬氨酸、谷氨酸。
在另一优选例中，X为NH，O，S，C＝O，C＝S，-S(O)-，O＝S＝O或-S-S-。
在另一优选例中，X为NH、O、S、-S(O)-、O＝S＝O、或S-S，较佳为NH，O，S，C＝O，C＝S，S＝O，进一步优选NH，O，S，S＝O，特别优选NH，O，S。
在另一优选例中，C1为CH2；R2为甲基；
R3为H、C1-6烷基、部分或全部卤代的C1-6烷基或C3-6环烷基；
R4为H、C1-6烷基、部分或全部卤代的C1-6烷基或C3-6环烷基。
在另一优选例中，所述的式(I)化合物具有如下所述的式(II)结构：
Figure BDA0001297206520000041
R7为H、F、Cl、Br或I；R2、R3、R4、R5、R6、X、A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3和B4的定义权利要求1所述。
在另一优选例中，X为NH、O、S、-S(O)-、O＝S＝O、或S-S；R2为甲基；R3为甲基；R4为H；A1、A2、A3或A4独立地任选地被R5取代，其中各R5独立地为F、Cl、Br、I、部分或全部卤代的C1-3烷基；B2、B3和B4独立地任选地被R6取代，其中各R6独立地为卤素、C1-3烷基、部分或全部卤代的C1-3烷基。
在另一优选例中，所述式(I)化合物具有如下所述的式(III)结构：
Figure BDA0001297206520000042
R2、R3、R4、R5、R7、A1、A2、A3和A4的定义如上所述。
在另一优选例中，R1为卤素，较佳为Cl。
在另一优选例中，R2为甲基。
在另一优选例中，-NR3R4为-NH2或-NHCH3。
在另一优选例中，C1为-CH2-。
在另一优选例中，
Figure BDA0001297206520000043
为苯环、吡啶环、嘧啶环、苯并四氢吡咯基、苯并吡啶环或苯并嘧啶环，其中苯环、吡啶环、嘧啶环、苯并四氢吡咯基、苯并吡啶环或苯并嘧啶环上任选地具有一个或两个取代基，各取代基独立地为卤素、C1-C3卤代烷基(如三氟甲基)、吗啉基、C1-C3烷基、四氢呋喃基、六氢吡啶基。
在另一优选例中，
Figure BDA0001297206520000051
为苯环、吡啶环、C3-C7环烷基环、C3-C6杂环烷基环、苯并吡啶环或苯并嘧啶环，其中苯环、吡啶环、C3-C7环烷基环、C3-C6杂环烷基环、苯并吡啶环或苯并嘧啶环上任选地具有一个或两个取代基，各取代基独立地为卤素、C1-C3卤代烷基(如三氟甲基)、吗啉基、C1-C3烷基、四氢呋喃基、六氢吡啶基。在另一优选例中C3-C7环烷基环为环己基环。在另一优选例中，C3-C6杂环烷基环为四氢吡喃环或六氢吡啶环。
在另一优选例中，所述的式(I)化合物为：
Figure BDA0001297206520000052
Figure BDA0001297206520000061
Figure BDA0001297206520000071
本发明的第二方面，提供第一方面所述的式(I)化合物，其异构体、其外消旋体、或其药学上可接受的盐的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
Figure BDA0001297206520000072
a)式IV所示的化合物与甲基磺酰氯或SOCl2反应的得到式V所示的化合物；
b)式V所示的化合物与式VI所示的化合物反应得到式(I)化合物，
其中，R1、R2、R5、R6，A1、A2、A3、A4，B1、B2、B3、B4、B5，C1的定义如权利要求1所述；
R3、R4各自独立地为H、C1-12烷基、部分或全部卤代的C1-12烷基或C3-10环烷基、或叔丁氧羰基，且R3和R4不同时为甲基；
R8为氯或甲基磺酸酯基。
在另一优选例中，式IV所示的化合物加至二氯甲烷中，加入三乙胺，降温，滴加甲基磺酰氯，加完撤去水浴，室温反应1h，TLC检测无新点，MS检测反应体系，有产物生成，升温至30℃反应过夜，停止反应，加入饱和碳酸氢钠溶液，分液，萃取，合并有机相，饱和食盐水洗，干燥，浓缩得式V所示的化合物，为淡黄色油状物。
在另一优选例中，三乙胺加入量为式IV所示的化合物的摩尔量的1.2～2.5倍；所述甲基磺酰氯的加入量为式IV所示的化合物的摩尔量的1～4倍。
在另一优选例中，将式IV所示的化合物，催化剂吡啶溶于干燥的DCM中，冰浴冷却下滴加SOCl2，加毕升至室温反应2h，TLC检测原料反应完全，反应液倒入水中，分出有机层，盐水洗，干燥浓缩后得到式V所示的化合物，为油状物。
在另一优选例中，吡啶加入量为式IV所示的化合物的摩尔量的1.2～2.5倍；所述SOCl2的加入量为式IV所示的化合物的摩尔量的1～4倍。
在另一优选例中，将式VI所示的乙二胺化合物，K2CO3溶于干燥的DMF中，滴加原料1eq当量的DMF溶液，加毕室温反应2h，TLC检测原料反应完全，反应液倒入水中，萃取，有机层盐水洗，干燥浓缩后过柱纯化白色固体。
任选地，白色固体在二氯甲烷溶剂中，在甲烷磺酸的存在下，进行脱Boc反应得到式(I)化合物；
任选地，将式(I)化合物与酸成盐获得相应地盐类化合物。
步骤(b)中所述式VI所示的乙二胺化合物加入量为式V所示化合物的摩尔量的1.0～1.5倍；缚酸剂K2CO3的加入量为式V所示化合物的摩尔量的1.2～2.5倍。
在另一优选例中，当X选自：NH，O，S，C＝O，C＝S，S＝O，O＝S＝O，-C＝NH-，-(C＝O)-NH-，-(C＝O)-O-，-(C＝O)-S-，-(C＝S)-NH-，-(C＝S)-O-或-(C＝S)-S-，C1为CH2时，所述的式IV化合物采用如下的反应步骤制备得到：
Figure BDA0001297206520000081
所示式VII化合物(1eq)与NaBH4(1.5～3eq)反应获得相应IV式结构化合物，其中R1、R5、R6、B1、B2、B3、B4、B5和A1、A2、A3或A4的定义如上所述。
所示式VII化合物(1eq)，在合适干燥溶剂中，与NaBH4(1.5～3eq)反应获得相应IV式结构化合物，所述合适干燥溶剂为甲醇、乙醇等溶剂或混合溶剂。
在另一优选例中，当X选自：NH，O，S，C＝O，C＝S，S＝O，O＝S＝O，-S-S-，-C＝NH-，-(C＝O)-NH-，-(C＝O)-O-，-(C＝O)-S-，-(C＝S)-NH-，-(C＝S)-O-或-(C＝S)-S-，C1为C＝O时，所述的式IV化合物采用如下的反应步骤制备得到：
Figure BDA0001297206520000091
所示式VIII化合物，其中R1、R5和A1、A2、A3或A4的定义如上所述，Z为F或Cl，与所示式IX化合物，其中R6、B1、B2、B3、B4、B5的定义如上所述，在Cu，K2CO3条件下缩合得到相应式IV结构化合物。
在另一优选例中，当X选自：-S-S-，C1为C＝O或CH2时，所述的式IV化合物采用如下的反应步骤制备得到：
Figure BDA0001297206520000092
所示式XI化合物，其中R1、R5和A1、A2、A3或A4的定义如上所述，与所示式XII化合物，其中R6、B1、B2、B3、B4、B5、Y的定义如上所述，在三乙胺作为缚酸剂条件下缩合得到相应式IV结构化合物。
本发明的第三方面，提供一种药物组合物，包含：第一方面所述的式(I)化合物，其异构体、其外消旋体、或其药学上可接受的盐作为药物活性成分；和
药学上可接受的载体。
本发明的第四方面，提供第一方面所述的式(I)化合物，其异构体、其外消旋体、或其药学上可接受的盐的用途，用于制备：
(1)制备抑制PRMT I型酶活性的药物或制备PRMT I型抑制剂；
(2)制备治疗或预防与PRMT I型蛋白调节异常有关的哺乳动物疾病的药物；
(3)体外抑制肿瘤细胞的增殖；
(4)制备降低精氨酸甲基化水平的药物；
(5)制备诱导肿瘤细胞凋亡的药物；
(6)制备下调泛性不对称二甲基化修饰(ADMA)以及组蛋白H4R3和/或H3R2的不对称二甲基化修饰(H4R3me2、H3R2me2)的药物；
(7)制备上调细胞内对称二甲基化修饰水平(SDMA)的药物；
(8)制备抑制白血病致病基因HOXA9、HOXA10、MEIS1的表达的药物；或
(9)制备上调髓系细胞分化相关基因MNDA的转录水平的药物。
在另一优选例中，所述PRMT I型抑制剂为PRMT1抑制剂、PRMT3抑制剂、PRMT4抑制剂、PRMT6抑制剂或PRMT8抑制剂。
在另一优选例中，所述疾病选自：癌症、心血管疾病、神经退行性疾病、疟疾、艾滋病、痛风、糖尿病、肾功能衰竭、慢性肺部疾病、眼咽肌营养不良、可卡因成瘾、肺动脉高压疾病、肌萎缩侧索硬化症、酒精性肝硬化失代偿症。
在另一优选例中，所述的癌症选自下组：淋巴瘤、脑癌、结肠癌、宫颈癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、肾癌、肺癌、纤维肉瘤、表皮鳞状细胞癌、前列腺癌、白血病、胰腺癌、口腔癌、胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、混合谱系白血病、恶性胶质瘤。
在另一优选例中，所述的肿瘤细胞为选自下组的肿瘤细胞：结肠癌细胞，宫颈癌细胞，乳腺癌细胞，肝癌细胞，胃癌细胞，肾癌细胞，肺癌细胞，纤维肉瘤细胞，表皮鳞状细胞癌细胞，前列腺癌细胞，白血病细胞，胰腺癌细胞，口腔癌细胞，胶质细胞瘤细胞，神经母细胞瘤细胞，耐紫杉醇肺癌细胞，耐长春新碱口腔癌细胞，耐阿霉素慢性粒细胞白血病细胞。
在另一优选例中，所述的肿瘤细胞选自下组：HCT116、Hela、MCF-7、LM3、NCI-N87、Caki-1、A549、HT1080、A431、PC3、HL60、Panc-1、KB、U87-MG、K562、Kasumi-1、THP-1、Jurkat、REH、Raji、RNK-16、KMS-1、P39、U118-MG、H4、SK-N-SH、SH-SY5Y、A549/Taxol、KB/VCR、K562/Adr。
在另一优选例中，泛性不对称二甲基化修饰(ADMA)、组蛋白H4R3和/或H3R2的不对称二甲基化修饰(H4R3me2、H3R2me2)、对称二甲基化修饰是指在白血病细胞MV4-11、肾癌细胞786-O、Caki-1、769-P、A498细胞内的泛性不对称二甲基化修饰(ADMA)、组蛋白H4R3和/或H3R2的不对称二甲基化修饰(H4R3me2、H3R2me2)、对称二甲基化修饰。
本发明还提供一种体外抑制肿瘤细胞增殖的方法、一种体外诱导肿瘤细胞凋亡的方法、一种体外下调细胞内泛性不对称二甲基化修饰(ADMA)以及组蛋白H4R3和/或H3R2的不对称二甲基化修饰(H4R3me2、H3R2me2)的方法、一种体外上调细胞内对称二甲基化修饰水平(SDMA)的方法、一种体外抑制白血病致病基因HOXA9、HOXA10、MEIS1的表达的方法以及一种体外上调髓系细胞分化相关基因MNDA的转录水平的方法，均包括在细胞培养基中加入式(I)化合物，其异构体、其外消旋体、或其药学上可接受的盐的步骤。
本发明提供的一类化合物是目前已知的靶向PRMT I型活性最强的化合物，分子水平抑制活性IC50达到皮摩尔级别，对PRMTⅡ型酶几乎无活性，类药性好，有望成为全新机制的1.1类抗肿瘤药物。同时，对于PRMT I型相关的其他疾病如心血管疾病、神经退行性疾病、可卡因成瘾等疾病也有一定治疗潜力。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了核磁共振实验(NMR)验证的PT-1和PT-2与PRMT1的结合及PRMT1底物口袋的结合验证。
图2显示了PT-1及PT-2对白血病细胞增殖的抑制及对正常细胞的影响结果图。
图3显示了敲减PRMT1对MV4-11白血病细胞增殖的影响结果图。
图4显示了PT-1对MLL型白血病MV4-11细胞增殖的抑制，对细胞内不对称二甲基化修饰水平的调控，对周期阻滞和凋亡的诱导作用，及对致白血病基因HOXA9、HOXA10、MEIS1转录的抑制。
图5及图6分别显示了PT-1对肾癌细胞株786-O、Caki-1、769-P、A498细胞增殖的抑制及细胞内不对称二甲基化修饰水平的调控结果图。
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究，首次发现了一类具有如式(I)所示结构的化合物，具有抑制蛋白质精氨酸甲基转移酶PRMT I型活性的效果，可以用于制备治疗或预防PRMT I型调节异常相关的哺乳动物疾病的药物。基于上述发现，发明人完成了本发明。
术语
在本文中，除特别说明之处，术语“C1-12烷基”指具有1～12个碳原子的直链或支链烷基，优选为具有1-6个碳原子的直链或支链C1-C6的烷基，进一步优选，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、或类似基团。
术语“取代”指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、三氟甲基、C1-12烷基或环烷基、C1-12烷氧基、氧原子(即＝O)、未取代或被C1-4烷胺基取代的C1-12烷胺基、C2-6酯基、C2-6酰基、C2-6酰胺基、硫代C1-12烷基、羧基、C5-12芳基或杂芳基、C5-12杂环基(含有1-5个，优选1-3个选自N、O或S的杂原子)。
术语“C3-12环烷基”指优选具有3～6个碳原子的环烷基，进一步优选为，环丙基、环丁基、环戊基或类似基团。
术语“C1-12烷氧基”指具有1-12个碳原子的直链或支链烷氧基，优选为具有1-6个碳原子的直链或支链烷氧基，进一步优选为甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、或类似基团。
术语“卤素”指F、Cl、Br和I。
术语“C1-12烷胺基”指被胺基取代的C1-6烷基，例如具有“C1-6烷基-NH-”或“(烷基)2-N-(碳原子总数为1-6)”、“-C1-6亚烷基-NH2”、“烷基-N-亚烷基-(碳原子总数为1-6)”、或“(烷基)2-N-亚烷基-(碳原子总数为1-6)”结构的基团，例如CH3NH-、C2H5NH-、C3H7NH-、(CH3)2N-、-CH2NH2、-C2H5NH2、-C3H7NH2、-C2H4N(CH3)2，或类似基团，其中，C1-6烷基的定义如前所述。
术语“芳基”(芳环)优选为苯基、萘基等，所述的芳基可以是取代或未取代的，所述取代的定义如上所述。
术语“杂芳基”(杂芳环)指具有1-3个自O、S和/或N的杂原子的杂芳基，优选4-6元杂芳基，所述的杂芳基可以是取代或未取代的，所述取代的定义如上所述。
术语“杂环基”指具有3-6个碳原子，优选1-3个选自O、S和/或N的杂原子的非芳香性环状基团，优选5-6元杂环基，所述的杂环基可以是取代或未取代的，所述取代的定义如上所述。
本发明中，术语“药学上可接受的”成分是指适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的物质。
本发明中，术语“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。
除非特别说明，本发明中，所有出现的化合物均意在包括所有可能的光学异构体，如单一手性的化合物，或各种不同手性化合物的混合物(即外消旋体)。本发明的所有化合物之中，各手性碳原子可以任选地为R构型或S构型，或R构型和S构型的混合物。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
药物组合物和施用方法
由于本发明化合物具有优异的对蛋白质精氨酸甲基转移酶PRMTⅠ型抑制活性，因此本发明化合物及其各种晶型，药学上可接受的无机或有机盐，水合物或溶剂合物，以及含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于治疗、预防以及缓解由PRMTⅠ型活性或表达量相关的疾病，尤其适用于蛋白质精氨酸甲基转移酶PRMTⅠ型或表达量均相关的疾病。根据现有技术，本发明化合物可用于治疗以下疾病：癌症、神经退行性疾病、疟疾、艾滋病、痛风、糖尿病等等。
本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有5-200mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。
“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如
Figure BDA0001297206520000131
)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选5～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
与现有技术相比，本发明的主要优点包括：
本发明提供了一类结构新颖的化合物，该类骨架结构目前尚未有报道。
所述的化合物首次发现具有蛋白质精氨酸甲基转移酶PRMTⅠ(PRMT1、PRMT3、PRMT4、PRMT6、PRMT8)型抑制活性，能够有效抑制PRMTⅠ蛋白，并且降低不对称二甲基化水平，进而能够治疗与PRMTⅠ型蛋白调节异常相关的疾病，包括但不局限于癌症(如前列腺癌、结肠癌、混合谱系白血病、膀胱癌、肺癌、乳腺癌等)、心血管疾病、神经退行性疾病、疟疾、艾滋病、痛风、糖尿病、肾功能衰竭、慢性肺部疾病、眼咽肌营养不良、可卡因成瘾等疾病，具有极高的药物开发价值。
本系列所述化合物与相关已报道的具有抗肿瘤化合物相比，其抗肿瘤活性提高了数十倍，甚至在数百倍以上。最好的化合物分子、细胞水平抑制活性IC50为个位纳摩级别；同时，对于PRMTⅡ类蛋白无抑制活性，这表明我们的化合物具有高度特性和选择性。与已有的PRMTⅠ抑制剂相比，本系列所述化合物活性强，选择性好，具有细胞过膜性好等成药性优点。
本系列化合物的合成方法新颖，以常用化学试剂即可实现如结构式(I)复杂化合物的结构合成。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件(如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件)或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
核磁共振氢谱用BrukerAMX-400型、Gemini-300型或AMX–600型核磁共振仪记录，化学位移d的单位为ppm。所有溶剂均为分析纯试剂。采用碘、紫外荧光等方法显色。减压蒸除有机溶剂在旋转蒸发仪中进行。本发明中用到的起始反应物未经特别说明，均为商业购买。
应当说明的是，下述实施例中，常规后处理方法是：反应完成后，在反应液中加入适量的有机溶剂和水，分离有机相和水相，合并有机相，并使用NaSO4干燥，过滤之后减压旋蒸干，得到粗产物，再经过柱层析分离纯化之后得到最终产物。
实施例1 PT-1化合物的制备
步骤i：
Figure BDA0001297206520000151
氮气保护下，将邻氯苯甲醛(14.6克，1当量)，邻氯苯硫酚(30克，2当量)和碳酸钾(43.8克，3当量)分别加入到DMF(200毫升)中，油浴加热至90度搅拌过夜。原料全部转化完毕。冷却，倒入2升水中，用甲基叔丁基醚萃取3次。合并的有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩，粗品经柱层析分离得到23.5克黄色固体产品。
步骤ii：
Figure BDA0001297206520000161
将原料(15克，1当量)溶于200毫升无水甲醇中，降温至0度，分批加入硼氢化钠(3克，1.3当量)。升至室温继续搅拌20分钟。降温至0度，加饱和氯化铵溶液淬灭反应，用甲基叔丁基醚萃取3次。合并的有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩得到15.9克淡黄色液体产品。
步骤iii：
Figure BDA0001297206520000162
氮气保护下，将原料(15.9克，1当量)溶于100毫升无水二氯甲烷，降温至0度，分别滴加氯化亚砜(9.8克，1.3当量)和吡啶(5克，1当量)。升至室温继续搅拌1小时。降温，滴加水淬灭反应，用甲基叔丁基醚萃取3次。合并的有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩，粗品经柱层析分离得到6.7克淡黄色液体产品。
步骤iv:
Figure BDA0001297206520000163
氮气保护下，将氯化物(6.7克，1.1当量)，胺(3.9克，1当量)和碳酸钾(7.5克，2.4当量)分别加入到50毫升DMF中，室温搅拌过夜。将反应液倒入500毫升水中，用甲基叔丁基醚萃取3次，合并的有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩，粗品经柱层析分离得到8.8克油状产品。
步骤v：
Figure BDA0001297206520000164
将原料(8.8克，1当量)溶于100毫升无水二氯甲烷，滴加甲磺酸(10.4克，5当量)。完毕后在室温搅拌2小时。加100毫升水分层，分出水相，水相用乙酸乙酯萃取一次，然后加氢氧化钠溶液调节pH＝13，用二氯甲烷萃取3次，合并的有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩得到6克无色油状物。化合物的表征数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.51–7.45(m,1H),7.38(dd,J＝7.5,1.8Hz,1H),7.34–7.18(m,3H),7.16–7.05(m,2H),6.97–6.91(m,1H),3.63(s,2H),2.81–2.67(m,2H),2.46(t,J＝5.8Hz,2H),2.17(s,3H)。13C NMR(125MHz,MeOD)δ135.40(2C),134.68,134.02,132.94,132.79,131.24,129.93,129.84,129.74,128.12,127.69,58.22,52.63,39.68,34.42；LRMS(ESI)m/z Calcd for C16H20ClN2S[M+H]+,307.1；Found,307.1；HRMS(ESI)m/z Calcd for C16H20ClN2S[M+H]+,307.1030；Found,307.1025；Purity:99.1％。
实施例2 PT-1A草酸盐的制备
Figure BDA0001297206520000171
将胺(200毫克，1当量)溶于1毫升乙酸乙酯，滴加草酸(59毫克，1当量)的乙酸乙酯溶液(3毫升)，有沉淀析出，继续搅拌30分钟。过滤，用乙酸乙酯洗涤，收集，干燥得到253毫克白色固体产品，表征数据：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.66(d,J＝7.6Hz,1H),7.57–7.51(m,1H),7.42(d,J＝7.5Hz,1H),7.36–7.21(m,4H),6.94–6.83(m,1H),3.63(s,2H),2.92(t,J＝6.4Hz,2H),2.59(t,J＝6.3Hz,2H),2.11(s,3H)。Purity:98.7％。
实施例3 PT-1B酒石酸盐化合物的制备
Figure BDA0001297206520000172
将胺(100毫克，1当量)溶于1毫升乙酸乙酯，滴加酒石酸(74毫克，1.5当量)的乙酸乙酯(2毫升)和甲醇(1毫升)溶液，室温搅拌过夜。将产生的白色沉淀过滤，用乙酸乙酯洗涤，收集，干燥得到123毫克白色固体产品。表征数据：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.66(d,J＝7.6Hz,1H),7.57–7.51(m,1H),7.42(d,J＝7.5Hz,1H),7.36–7.21(m,4H),6.94–6.83(m,1H),3.96(s,3H),3.63(s,2H),2.92(t,J＝6.4Hz,2H),2.59(t,J＝6.3Hz,2H),2.11(s,3H)。Purity:98.4％。
实施例4-16
采用与实施例1-3相同或类似的方法或成盐方法制备获得实施例4-16化合物，具体化合物的结构如下。
Figure BDA0001297206520000173
Figure BDA0001297206520000181
Figure BDA0001297206520000191
实施例17 PT-14的制备
Figure BDA0001297206520000192
步骤i：将领氟苯甲醛(1.24克，1.0当量)，邻氯苯酚(1.29克，1.0当量)和碳酸钾(1.38克，1.0当量)分别加入到DMAC(20毫升)中，加热至170℃搅拌4小时，TLC显示原料消失，降至室温。倒入200毫升水中，用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，合并的有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩，粗品经柱层析得到1.12克油状物。
步骤ii-iv同PT-1，制备获得PT-14化合物，结构表征数据为：H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.49–7.42(m,2H),7.24–7.00(m,4H),6.83(dd,J＝8.2,1.4Hz,1H),6.79–6.74(m,1H),3.58(s,2H),2.73–2.62(m,2H),2.57(t,J＝5.7Hz,2H),2.33(s,3H),2.22(s,3H)。LRMS(ESI)m/z Calcd for C17H22ClN2O[M+H]+,305.1；Found,305.4；Purity 99.1％。
实施例18 PT-15的制备
Figure BDA0001297206520000201
氮气保护下，将邻氯苯胺(1克，1当量)，邻氯苯甲醛(1.55克，1.4当量)，醋酸钯(44毫克，2.5％当量)，碳酸铯(5.11克，2当量)和Xantphos(227毫克，5％当量)分别加入到23毫升二氧六环中，加热至油浴90度搅拌过夜。冷却，反应液用硅藻土过滤，乙酸乙酯洗涤，滤液浓缩，粗品经柱层析分离得到725毫克黄色液体产品。
Figure BDA0001297206520000202
将原料(462毫克，1当量)溶于10毫升无水四氢呋喃，氮气保护下分批加入四氢铝锂(228毫克，3当量)。反应随后在室温搅拌30分钟。冷却，滴加水淬灭反应，加乙酸乙酯萃取3次。干燥，浓缩，粗品经柱层析分离得到423毫克无色液体产品。
Figure BDA0001297206520000203
氮气保护下，将原料(233毫克，1当量)溶于10毫升无水二氯甲烷，降温至0度，依次加入三乙胺(2当量)和MsCl(1.3当量)。升至室温搅拌过夜。浓缩，加水稀释，用乙酸乙酯萃取，干燥，浓缩，粗品经柱层析分离得到298毫克产品。
Figure BDA0001297206520000204
将原料(6.65克，3.3当量)溶于90毫升无水二氯甲烷，降温至0度，滴加BOC酸酐(5克，1当量)的无水二氯甲烷(45毫升)溶液。反应随后在室温搅拌过夜。浓缩，粗品用乙酸乙酯和水分层，分出有机相，水相再用乙酸乙酯萃取2次。干燥，浓缩，粗品经柱层析分离得到2.96克黄色液体产品。
Figure BDA0001297206520000205
将原料(156毫克，1当量)，胺(141毫克，1.5当量)和碳酸铯(245毫克。1.5当量)分别加入到3毫升DMF中，升温至80度搅拌3小时,90度搅拌4小时。冷却，倒入30毫升水中，乙酸乙酯萃取。干燥，浓缩，粗品经柱层析分离得到189毫克产品。
Figure BDA0001297206520000211
将原料(114毫克，1当量)溶于6毫升无水二氯甲烷，降温下滴加甲磺酸(133毫克，5当量)。室温搅拌30分钟。浓缩，粗品用水和乙酸乙酯分层，分出有机相，丢弃。水相用氢氧化钠溶液调节pH＝13，乙酸乙酯萃取3次，合并的有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩得到103毫克黄色液体产品。表征数据：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.94(s,1H),7.43(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),7.34(dd,J＝8.2,1.4Hz,1H),7.30–7.17(m,4H),6.92–6.81(m,2H),3.52(s,2H),2.61(t,J＝6.8Hz,2H),2.42(t,J＝6.8Hz,2H),2.21(s,3H),2.19(s,3H)。LRMS(ESI)m/z Calcdfor C17H23ClN3[M+H]+,304.8；Found,304.6；Purity 96.6％。
实施例19 PT-16的制备
Figure BDA0001297206520000212
将原料邻氯硫酚(2eq)，K2CO3(3eq)溶于干燥的DMF中，室温搅拌20min，滴加邻氯苯甲醛1g(1eq)的DMF溶液，加毕室温反应2h。TLC检测原料反应完全。反应液倒入水中，EA萃取，有机层盐水洗涤，干燥浓缩后过柱纯化得黄色油状物1.6g。
Figure BDA0001297206520000213
将原料1.6g(1eq)溶于干燥的DCM中，冰浴条件下加入m-CPBA的DCM溶液(3eq)，加毕室温反应1h。TLC检测原料反应完全。反应液用饱和NaS2O3溶液淬灭，有机层盐水洗，干燥浓缩后过柱纯化得白色固体430mg。
Figure BDA0001297206520000214
将原料430mg(1eq)溶于干燥的MeOH中，冰浴冷却加入NaBH4(1.5eq)，加毕低温反应0.5h。TLC检测原料反应完全。加水淬灭反应，反应液浓缩后溶于EA，水洗，盐水洗，干燥浓缩后得到白色固体376mg。
Figure BDA0001297206520000215
将原料352mg(1eq)，催化量的吡啶溶于干燥的DCM中，冰浴冷却下滴加SOCl2(2eq)，加毕升至室温反应2h。TLC检测原料反应完全。反应液倒入水中，分出有机层，盐水洗，干燥浓缩后得到油状物。
Figure BDA0001297206520000221
将N，N-二甲基乙二胺(7eq)，K2CO3(3eq)溶于干燥的DMF中，滴加原料(1eq)的DMF溶液，加毕室温反应2h。TLC检测原料反应完全。反应液倒入水中，EA萃取，有机层盐水洗，干燥浓缩后过柱纯化得到271毫克白色固体产品。数据表征：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.37(dd,J＝7.5,2.0Hz,1H),8.18(d,J＝7.9Hz,1H),7.75(d,J＝7.6Hz,1H),7.63–7.48(m,3H),7.48–7.37(m,2H),3.66(s,2H),2.53(t,J＝6.0Hz,2H),2.36(s,3H),2.33(t,J＝6.0Hz,2H),1.96(s,3H)。LRMS(ESI)m/z Calcd for C17H22ClN2O2S[M+H]+,353.1；Found,353.5；Purity94.3％。
实施例20 PT-25的制备
Figure BDA0001297206520000222
将原料(380毫克，1当量)溶于8毫升无水甲醇，冰浴加NaBH4(209毫克，2当量)，冰浴搅拌0.5小时。加10毫升水淬灭，浓缩，乙酸乙酯萃取一次，水相调pH＝3，乙酸乙酯萃取，干燥，浓缩，得油状物167毫克。
Figure BDA0001297206520000223
将NCS(1.34克，1.0当量)加入到10毫升四氯化碳中，冰浴冷却下滴加5毫升四氯化碳稀释的邻氯苯硫酚(1.45克，1.0当量)，室温搅拌3小时，TLC显示原料反应完全，抽滤，石油醚洗涤，浓缩滤液得到1.77克油状物粗品，纯化后HNMR正确。
Figure BDA0001297206520000224
将原料(214毫克，1当量)加入到THF/MeOH(2ml/4ml)中，滴加TEA(265毫克，2.2当量)和硫酚(167毫克，1当量)，室温搅拌过夜。浓缩，乙酸乙酯萃取，干燥，浓缩，粗品经柱层析得到105毫克白色固粉，HNMR确证。
Figure BDA0001297206520000231
将原料(105毫克，1当量)溶于4毫升无水二氯甲烷，滴加一滴吡啶，冰浴加SOCl2(55毫克，1.3当量)，室温搅拌过夜，TLC显示原料转化完全，加水淬灭，分液。水相再用二氯甲烷萃取，干燥，浓缩得到110毫克油状物。
Figure BDA0001297206520000232
将原料(110毫克，1当量)，K2CO3(101毫克，2当量)和胺(225毫克，7当量)分别加入到4毫升DMF中，室温搅拌过夜，TLC显示原料反应完全。倒入30毫升水中，乙酸乙酯萃取，干燥，浓缩，粗品经柱层析分离得到80毫克油状物。
Figure BDA0001297206520000233
将原料(80毫克，1当量)溶于6毫升乙酸乙酯，加入草酸(41毫克，2当量)室温搅拌1小时，抽滤，乙酸乙酯洗，干燥，得到淡黄色固体粉末58毫克。数据表征：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.55(s,1H),7.73–7.46(m,2H),7.45–7.15(m,5H),3.66(d,J＝23.6Hz,2H),3.07(d,J＝5.8Hz,2H),2.68(s,2H),2.55(s,3H),2.15(d,J＝10.5Hz,3H)。LRMS(ESI)m/z Calcdfor C17H22ClN2S2[M+H]+,353.1；Found,353.4。
实施例21 PT-76的制备
Figure BDA0001297206520000234
将原料(510毫克，1当量)和邻氯苯胺(383毫克，1当量)分别加入到3毫升无水乙醇中，然后加入CAN(82毫克，5％当量)。室温搅拌1.5小时。加水30毫升稀释，用乙酸乙酯萃取3次。合并的有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩得到870毫克红褐色液体粗品。
将硼氢化钠(342毫克，3当量)分批加入到10毫升醋酸中，保持温度15-20度。完毕后，继续搅拌30分钟。降温至0度，滴加前一步的粗产品。完毕后，在10度搅拌过夜。于50度浓缩除去乙酸，残渣用水稀释，用碳酸钠调节PH至碱性，乙酸乙酯萃取3次。干燥，浓缩，粗品经柱层析分离得到636毫克黄色液体产品。
Figure BDA0001297206520000241
将原料(995毫克，1当量)溶于10毫升无水四氢呋喃，氮气保护下分批加入四氢铝锂(403毫克，3当量)。反应随后在室温搅拌30分钟。冷却，滴加水淬灭反应，加乙酸乙酯萃取3次。干燥，浓缩，粗品经柱层析分离得到598毫克无色液体产品。
Figure BDA0001297206520000242
氮气保护下，将原料(358毫克，1当量)溶于10毫升无水二氯甲烷，降温至0度，依次加入三乙胺(2当量)和MsCl(1.3当量)。升至室温搅拌过夜。浓缩，加水稀释，用乙酸乙酯萃取，干燥，浓缩，粗品经柱层析分离得到406毫克产品。
Figure BDA0001297206520000243
将原料(300毫克，1当量)，胺(267毫克，1.5当量)和碳酸铯(462毫克。1.5当量)分别加入到3毫升DMF中，升温至80度搅拌3小时,90度搅拌4小时。冷却，倒入30毫升水中，乙酸乙酯萃取。干燥，浓缩，粗品经柱层析分离得到126毫克产品。
Figure BDA0001297206520000244
将原料(126毫克，1当量)溶于2毫升无水二氯甲烷，滴加甲磺酸(89毫克，3当量)。室温搅拌1小时。浓缩，粗品用水稀释，加氢氧化钠调节pH至13。用甲基叔丁基醚萃取，干燥，浓缩，粗品经制备板分离得到70毫克淡黄色半固体产品。表征数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.23(dd,J＝7.9,1.4Hz,1H),7.10(s,1H),6.69(d,J＝8.1Hz,1H),6.58(t,J＝7.0Hz,1H),4.45(s,1H),4.08(d,J＝7.2Hz,2H),3.83(s,1H),3.67–3.48(m,2H),3.05(s,2H),2.92(s,3H),2.67(s,3H),2.00(s,2H),1.84(s,1H),1.69(d,J＝35.8Hz,2H),1.51(s,2H),1.45–1.36(m,2H),0.88(d,J＝6.1Hz,1H)。LRMS(ESI)m/z Calcd for C17H29ClN3[M+H]+,310.2；Found,310.6；Purity 98.2％。
实施例22-87
采用实施例17-21中相同或类似的方法制备实施例22-87化合物，具体化合物的结构如下：
Figure BDA0001297206520000251
Figure BDA0001297206520000261
Figure BDA0001297206520000271
Figure BDA0001297206520000281
Figure BDA0001297206520000291
Figure BDA0001297206520000301
Figure BDA0001297206520000311
Figure BDA0001297206520000321
Figure BDA0001297206520000331
Figure BDA0001297206520000341
实施例88
同位素实验是通过[3H]标记PRMTⅠ型甲基供体SAM中的甲基，在正常反应体系中PRMT酶将催化SAM上[3H]同位素标记的甲基转移到精氨酸底物上，若PRMT的甲基转移酶活性被抑制则在底物多肽中无法检测到同位素信号，以此评价化合物对PRMT I型的甲基转移酶活性的抑制程度。同理检测化合物对PRMT II型(PRMT 5、PRMT 7、PRMT 9)的甲基转移酶活性的抑制程度。
首先将精氨酸甲基转移酶(PRMTs)、多肽底物和[3H]标记的甲基供体S-腺苷基甲硫氨酸([3H]-SAM)溶于Tris的缓冲溶液中，并把化合物溶解或稀释至待测浓度加入反应板中。接着向已加入化合物的反应板中加入15μL蛋白酶溶液室温孵育15分钟，再加入5μL多肽底物溶液和[3H]-SAM溶液开始反应，室温孵育60分钟，最后通过加入5μL冷的终止试剂终止反应。将最终的反应体系混合液吸25μL加入到Flashplate中室温孵育60分钟，并用含有0.1％的Tween-20的蒸馏水洗去非特异性结合的同位素标记物，放入检测仪(Microbeta)中读取信号值，按照公式计算抑制率，通过GraphPad Prism 5.0软件拟合得到IC50值。
抑制率(％)＝(1-(化合物信号值-最低信号值)/(最高信号值-最低信号值))×100
表1 PRMT I型酶活抑制活性数据结果
Figure BDA0001297206520000351
Figure BDA0001297206520000361
Figure BDA0001297206520000371
Figure BDA0001297206520000381
Figure BDA0001297206520000391
Figure BDA0001297206520000401
Figure BDA0001297206520000411
Figure BDA0001297206520000421
表中，++++表示IC50<10nM；+++表示10nM≤IC50<100nM；++表示100nM≤IC50<1μM；+表示1μM≤IC50<50μM；-表示100μM≤IC50<200μM；--表示200μM≤IC50<500μM
表1结果表明本发明的化合物是目前已知的靶向PRMT I型活性最强的化合物，分子水平抑制活性IC50能够达到皮摩尔级别，对PRMTⅡ型酶无活性，类药性好，有望成为全新机制的1.1类抗肿瘤药物。同时，对于PRMT I型相关的其他疾病如心血管疾病、神经退行性疾病、可卡因成瘾等疾病也有一定治疗潜力。
为了证明筛选到的活性化合物与PRMT1蛋白结合并且作用于底物组蛋白H4精氨酸结合口袋，进行了核磁共振实验。在STD核磁实验方法中，未加入化合物时检测不到信号值，加入化合物后化合物与PRMT1蛋白结合则可检测到信号值；在CPMG核磁实验中，仅存在小分子时可检测到信号值，当加入蛋白后蛋白与化合物有结合，则与蛋白大分子结合的小分子的信号将检测不到，因此随着加入的蛋白浓度的升高，小分子与蛋白结合导致游离的小分子逐渐减少，因此检测到的信号值逐渐降低，小分子信号呈现出与蛋白的浓度依赖。实验结果表明本发明化合物与PRMT1蛋白有结合，如图1中A、B、C、D所示。
当验证的本发明的化合物与PRMT1蛋白存在结合后，为更进一步研究小分子作用口袋位点是否是底物组蛋白H4结合位点，采用CPMG核磁共振竞争实验验证。在竞争实验中，若小分子结合口袋与底物结合口袋一致，即小分子通过占据底物口袋抑制PRMT1的甲基转移酶活性，则随着底物浓度的上升竞争掉的小分子将变多，即溶液中游离的小分子将变多，核磁共振检测到的信号值将升高；若小分子结合位点为甲基转移供体SAM的结合口袋，即小分子通过占据SAM口袋抑制PRMT1的甲基转移酶活性，则随着SAM浓度的上升竞争掉的小分子将变多，即溶液中游离的小分子将变多，核磁共振检测到的信号值将升高。最终实验结果表明底物多肽可浓度依赖地竞争结合小分子，SAM并不能竞争小分子，表明小分子结合在底物多肽口袋，如图1中E、F所示。
实施例89
本实施例以膀胱癌细胞株SW780、前列腺癌细胞株LNCap、乳腺癌细胞株MCF7、肺癌细胞株A549、混合谱系白血病(MLL)细胞株MV4-11、肾癌细胞株786-O、结肠癌细胞株HCT116为细胞模型，考查化合物对上述细胞增殖抑制的IC50。
采用相应培养基(MV4-11，786-O细胞用RPMI-1640培养基培养；其它用DMEM培养基培养)加入10％胎牛血清。细胞计数后，以每孔1000-3000个/100μl接种于96孔板中，同时给予化合物处理，浓度梯度以100μM为起始浓度，两倍梯度稀释。通过CellTiter-Glo法检测给药72小时后细胞增殖的变化。以细胞存活率为纵坐标，药物浓度为橫坐标做图，并计算化合物对各细胞株的增殖抑制的IC50，结果如表2所示。
细胞存活率(％)计算方法为：
存活率(％)＝(给药孔OD-空白孔OD)/(对照孔OD-空白孔OD)×100。结果表明，化合物有效抑制上述细胞增殖。
表2抑制PRMT I型酶细胞活性测定结果
(+++表示0.1-1μM；++表示1-10μM；+表示10-100μM)
Figure BDA0001297206520000431
Figure BDA0001297206520000441
Figure BDA0001297206520000451
Figure BDA0001297206520000461
Figure BDA0001297206520000471
Figure BDA0001297206520000481
Figure BDA0001297206520000491
Figure BDA0001297206520000501
Figure BDA0001297206520000511
实施例90
PT-1及PT-2对白血病细胞增殖的抑制及对正常细胞的影响
以8种白血病细胞株(KOPN-8，KMS18，MV4-11，THP1，RCH-ACV，REH，RS4；11，U937)为细胞模型，考查化合物PT-1及PT-2对白血病细胞株增殖的抑制。采用RPMI1640培养基加入10％胎牛血清。细胞计数后，以每孔3000～10000个/100ul接种于96孔板中，同时给予化合物处理，浓度点设置为12.5μM，6.25μM两组。通过Cell Titer-Glo法检测给药72小时后细胞增殖的变化。以细胞存活率为纵坐标，药物浓度为橫坐标做图，并计算化合物对各细胞株的增殖抑制情况。细胞存活率(％)计算方法为：存活率(％)＝(给药孔OD-空白孔OD)/(对照孔OD-空白孔OD)×100。结果表明，化合物PT-1及PT-2有效抑制白血病细胞增殖，具体抑制率参见图2中A、C。
另外，还考察了PT-1及PT-2对正常细胞的影响。采用美国模式培养物集存中心(ATCC)指定的相应培养基加入10％胎牛血清。细胞计数后，以每孔3000个/100ul接种于96孔板中，同时给予化合物处理，浓度点设置为25μM，12.5μM，6.25μM三组。通过Cell Titer-Glo法检测给药72小时后细胞增殖的变化。以细胞存活率为纵坐标，药物浓度为橫坐标做图，并计算化合物对各细胞株的增殖抑制情况。细胞存活率(％)计算方法为：存活率(％)＝(给药孔OD-空白孔OD)/(对照孔OD-空白孔OD)×100。结果表明，化合物PT-1及PT-2对正常细胞增殖影响甚微，如图2中B、D。
实施例91
敲减PRMT1对MV4-11白血病细胞增殖的影响
首先，用蛋白免疫印迹法检测PRMT1敲减片段的敲减效率。
样品经4％-16％SDS-聚丙烯酰胺梯度胶分离，经转膜，封闭，一抗孵育过夜，洗膜3次，最后经二抗孵育1小时后显影曝光。
实验结果表明，敲减片段shPRMT1#1及shPRMT1#2均可以显著降低MV4-11细胞中的PRMT1表达水平及其泛性不对称二甲基化修饰水平，如图3中A所示。
敲减片段的序列如下：
shPrmt1#1:TGTGTTCCAGTATCTCTGATTATTCTAGAGATAATCAGAGATACTGGAACACTTTTTTC；
shPrmt1#2:TCCGGCAGTACAAAGACTACAATTCTAGAGATTGTAGTCTTTGTACTGCCGGTTTTTTC。
接着，使用敲减片段shPRMT1#1及shPRMT1#2在MV4-11细胞敲减PRMT1。MV4-11细胞以1×105/ml密度接种至六孔板，2ml每孔，种板当天使用慢病毒感染的方法对PRMT1基因进行敲减。敲减48小时后，将细胞按shPRMT1#1，shPRMT1#2，对照组分板至96孔板中，检测敲减PRMT1基因在48，96，144，192小时对白血病细胞MV4-11增殖的影响。实验结果表明，敲减PRMT1可以显著抑制白血病细胞MV4-11增殖，如图3中B所示。
实施例92
PT-1对MLL型白血病MV4-11细胞增殖的抑制，对细胞内不对称二甲基化修饰水平的调控，对周期阻滞和凋亡的诱导作用，及对致白血病基因HOXA9、HOXA10、MEIS1转录的抑制
首先，以MLL白血病细胞株MV4-11为细胞模型，考查化合物PT-1对MV4-11增殖抑制的IC50。采用RPMI1640培养基加入10％胎牛血清。细胞计数后，MV4-11细胞以1×105/ml密度接种至十二孔板中，同时给予化合物处理，浓度梯度以100μM为起始浓度，两倍梯度稀释。给药4天后将细胞分板至96孔板中，通过Cell Titer-Glo法检测细胞增殖的变化，剩余细胞传至新的12孔中并重新给予化合物处理，浓度梯度以100μM为起始浓度，两倍梯度稀释，其余时间点以此类推。以细胞存活率为纵坐标，药物浓度为橫坐标做图，并计算化合物对MV4-11细胞株增殖抑制的IC50。细胞存活率(％)计算方法为：存活率(％)＝(给药孔OD-空白孔OD)/(对照孔OD-空白孔OD)×100。结果表明，化合物PT-1及PT-2有效抑制白血病细胞MV4-11增殖，并且随着处理时间延长，化合物的作用效果提高，具有时间依赖性，参见图4中A。
其次，考察PT-1对MV4-11细胞精氨酸甲基化修饰水平的调控。MV4-11细胞以3×105/ml密度接种至六孔板，2ml每孔，种板当天给药。于48小时检测化合物对细胞内二甲基化修饰的影响。细胞经离心收集、PBS洗涤后，用SDS sample buffer煮样裂解10min，使蛋白变性。样品经4％-16％SDS-聚丙烯酰胺梯度胶分离，经转膜，封闭，一抗孵育过夜，洗膜3次，最后经二抗孵育1小时并洗膜3次后显影曝光。实验结果表明，化合物PT-1可以浓度依赖的下调MV4-11细胞中泛性不对称二甲基化修饰(ADMA)和组蛋白H4R3的不对称二甲基化修饰(H4R3me2a)并且可以相应的上调细胞内对称二甲基化修饰水平(SDMA)，如图4中B。
然后，考查化合物PT-1对细胞增殖的抑制作用是否通过影响白血病细胞周期和凋亡所导致的。MV4-11细胞以3×105/ml密度接种至六孔板，2ml每孔，种板当天给药。于72、96小时分别检测化合物对细胞周期和凋亡的影响。细胞周期检测中，细胞经离心收集、PBS洗涤后，以-20度预冷的乙醇固定过夜。固定好的细胞经离心收集、PBS洗涤后用PI染色，染色后的细胞用流式细胞仪检测，分析处于细胞周期不同时相(G1、G2/M，S期)的细胞比例。细胞凋亡检测中，细胞经离心收集、PBS洗涤后，用Annexin V和PI室温下避光染色，用流式细胞仪测定并计算样品中正常细胞、早期凋亡及晚期凋亡细胞的比例。实验结果表明，化合物PT-1促使MV4-11白血病细胞周期G1期阻滞(图4中C)并有效诱导细胞凋亡(图4中D)，且化合物PT-1对周期阻滞和凋亡的诱导作用具有浓度依赖梯度。
最后，考查化合物对致白血病基因HOXA9、HOXA10、MEIS1转录的影响。MV4-11细胞以3×105/ml密度接种至六孔板，2ml每孔。药物处理72小时后，使用Trizol提取细胞内RNA，经反转录试剂盒反转，变为cDNA后，采用荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法分别检测化合物对HOXA9、HOXA10、MEIS1基因转录的影响。结果表明，化合物PT-1可以抑制白血病致病基因HOXA9、HOXA10、MEIS1的表达并上调髓系细胞分化相关基因MNDA的转录水平(图4中E)。
实施例93
PT-1对肾癌细胞株786-O、Caki-1、769-P、A498细胞增殖的抑制及细胞内不对称二甲基化修饰水平的调控。
首先，以肾癌细胞株786-O、Caki-1、769-P、A498为细胞模型，考查化合物PT-1对肾癌细胞株增殖抑制的IC50。采用RPMI1640培养基(对786-O，Caki-1，769-P)和MEM培养基(对A498)加入10％胎牛血清。细胞计数后，以每孔700-2000个/100ul接种于96孔板中，待细胞贴壁后给予化合物处理，浓度梯度以100μM为起始浓度，两倍梯度稀释。通过CellTiter-Glo法检测给药7天后细胞增殖的变化。以细胞存活率为纵坐标，药物浓度为橫坐标做图，并计算化合物对各细胞株的增殖抑制的IC50。细胞存活率(％)计算方法为：存活率(％)＝(给药孔OD-空白孔OD)/(对照孔OD-空白孔OD)×100。结果表明，化合物PT-1有效抑制肾癌细胞786-O、Caki-1、769-P、A498增殖，具体抑制率及IC50值，参见图5。
其次，考察PT-1对肾癌细胞786-O、Caki-1、769-P、A498细胞修饰水平的调控。786-O、Caki-1、769-P、A498细胞以1×105/ml密度接种至六孔板，2ml每孔，待细胞贴壁后给予化合物处理，浓度梯度以20μM为起始浓度，三倍梯度稀释。于48小时检测化合物对细胞内二甲基化修饰的影响。细胞经离心收集、PBS洗涤后，用SDS sample buffer煮样裂解10min，使蛋白变性。样品经4％-16％SDS-聚丙烯酰胺梯度胶分离，经转膜，封闭，一抗孵育过夜，洗膜3次，最后经二抗孵育1小时并洗膜3次后显影曝光。实验结果表明，化合物PT-1可以浓度依赖的下调肾癌细胞786-O、Caki-1、769-P、A498细胞中泛性不对称二甲基化修饰(ADMA)和组蛋白H4R3、H3R2的不对称二甲基化修饰(H4R3me2、H3R2me2)并且可以相应的上调细胞内对称二甲基化修饰水平(SDMA)，如图6。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海药物研究所
<120> PRMT I型抑制剂及其制备方法和用途
<130> P2017-0895
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgtgttccag tatctctgat tattctagag ataatcagag atactggaac acttttttc 59
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tccggcagta caaagactac aattctagag attgtagtct ttgtactgcc ggttttttc 59

Claims (31)

1.一种式(I)化合物，其外消旋体、或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0003578712920000011
其中，X选自：NH、O、S、C＝O、C＝S、-S(O)-、O＝S＝O、S-S、-C＝NH-、-(C＝O)-NH-、-(C＝O)-O-、-(C＝O)-S-、-(C＝S)-NH-、-(C＝S)-O-或-(C＝S)-S-；
Y选自C＝O或CH2；
R1为卤素；
R2为H或甲基；
R3、R4各自独立地为H、C1-12烷基、部分或全部卤代的C1-12烷基或C3-10环烷基，且R3和R4不同时为甲基；
虚线为化学键或无，任意相邻两虚线不同时为化学键；
A1、A2、A3和A4各自独立地为O、S、N、NH或CH；且A1、A2、A3或A4独立地任选地被R5取代，其中各R5独立地为卤素、C1-6烷基、C3-10环烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基、C1-6烷氨基、部分或全部卤代的C1-6烷基、或含N和/或O的取代或未取代的六元芳环或六元杂环；或A1、A2、A3、A4其中任意两个与R5形成包含3-16个碳原子的芳环、芳杂环或非芳香环；
Figure FDA0003578712920000012
为
Figure FDA0003578712920000013
R7为H、F、Cl、Br或I。
2.如权利要求1所述的式(I)化合物，其外消旋体、或其药学上可接受的盐，其特征在于：X为NH，O，S，C＝O，C＝S，-S(O)-，O＝S＝O或-S-S-。
3.如权利要求1所述的式(I)化合物，其外消旋体、或其药学上可接受的盐，其特征在于：Y为CH2；
R2为甲基；
R3为H、C1-6烷基、部分或全部卤代的C1-6烷基或C3-6环烷基；
R4为H、C1-6烷基、部分或全部卤代的C1-6烷基或C3-6环烷基。
4.如权利要求1所述的式(I)化合物，其外消旋体、或其药学上可接受的盐，其特征在于：R1为卤素。
5.如权利要求1所述的式(I)化合物，其外消旋体、或其药学上可接受的盐，其特征在于：R2为甲基。
6.如权利要求1所述的式(I)化合物，其外消旋体、或其药学上可接受的盐，其特征在于：-NR3R4为-NH2或-NHCH3。
7.如权利要求1所述的式(I)化合物，其外消旋体、或其药学上可接受的盐，其特征在于：Y为-CH2-。
8.如权利要求1所述的式(I)化合物，其外消旋体、或其药学上可接受的盐，其特征在于，
Figure FDA0003578712920000021
为苯环、吡啶环、嘧啶环、苯并四氢吡咯基、苯并吡啶环或苯并嘧啶环，其中苯环、吡啶环、嘧啶环、苯并四氢吡咯基、苯并吡啶环或苯并嘧啶环上任选地具有一个或两个取代基，各取代基独立地为卤素、C1-C3卤代烷基、吗啉基、C1-C3烷基、四氢呋喃基、六氢吡啶基。
9.如权利要求8所述的式(I)化合物，其外消旋体、或其药学上可接受的盐，其特征在于，C1-C3卤代烷基为三氟甲基。
10.如权利要求1或4所述的式(I)化合物，其外消旋体、或其药学上可接受的盐，其特征在于，R1为Cl。
11.一种式(I)化合物，其外消旋体、或其药学上可接受的盐，
Figure FDA0003578712920000022
所述的式(I)化合物为：
Figure FDA0003578712920000023
Figure FDA0003578712920000031
Figure FDA0003578712920000041
Figure FDA0003578712920000051
12.一种如权利要求1所述的式(I)化合物，其外消旋体、或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
Figure FDA0003578712920000052
a)式IV所示的化合物与甲基磺酰氯或SOCl2反应的得到式V所示的化合物；
b)式V所示的化合物与式VI所示的化合物反应得到式(I)化合物，
其中，R1、R2、A1、A2、A3、A4、
Figure FDA0003578712920000053
X、Y的定义如权利要求1所述；
R3、R4各自独立地为H、C1-12烷基、部分或全部卤代的C1-12烷基或C3-10环烷基，且R3和R4不同时为甲基；
R8为氯或甲基磺酸酯基。
13.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，式IV所示的化合物加至二氯甲烷中，加入三乙胺，降温，滴加甲基磺酰氯，加完撤去水浴，室温反应1h，TLC检测无新点，MS检测反应体系，有产物生成，升温至30℃反应过夜，停止反应，加入饱和碳酸氢钠溶液，分液，萃取，合并有机相，饱和食盐水洗，干燥，浓缩得式V所示的化合物，为淡黄色油状物。
14.如权利要求13所述的制备方法，其特征在于，三乙胺加入量为式IV所示的化合物的摩尔量的1.2～2.5倍；所述甲基磺酰氯的加入量为式IV所示的化合物的摩尔量的1～4倍。
15.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，当X选自：NH，O，S，C＝O，C＝S，S＝O，O＝S＝O，-C＝NH-，-(C＝O)-NH-，-(C＝O)-O-，-(C＝O)-S-，-(C＝S)-NH-，-(C＝S)-O-或-(C＝S)-S-，Y为CH2时，所述的式IV化合物采用如下的反应步骤制备得到：
Figure FDA0003578712920000061
1eq的式VII化合物与1.5～3eq的NaBH4反应获得式IV化合物，其中R1、
Figure FDA0003578712920000062
A1、A2、A3、A4的定义如上所述。
16.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，当X选自：NH，O，S，C＝O，C＝S，S＝O，O＝S＝O，-S-S-，-C＝NH-，-(C＝O)-NH-，-(C＝O)-O-，-(C＝O)-S-，-(C＝S)-NH-，-(C＝S)-O-或-(C＝S)-S-，Y为C＝O时，所述的式IV化合物采用如下的反应步骤制备得到：
Figure FDA0003578712920000063
所示式VIII化合物，其中R1、A1、A2、A3或A4的定义如上所述，Z为F或Cl，与所示式IX化合物，其中
Figure FDA0003578712920000064
的定义如上所述，在Cu，K2CO3条件下缩合得到相应式IV结构化合物。
17.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，当X选自：-S-S-，Y为C＝O或CH2时，所述的式IV化合物采用如下的反应步骤制备得到：
Figure FDA0003578712920000071
所示式XI化合物，其中R1、A1、A2、A3或A4的定义如上所述，与所示式XII化合物，其中
Figure FDA0003578712920000072
Y的定义如上所述，在三乙胺作为缚酸剂条件下缩合得到相应式IV结构化合物。
18.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含：
如权利要求1-11中任一项所述的式(I)化合物，其外消旋体、或其药学上可接受的盐作为药物活性成分；和
药学上可接受的载体。
19.一种如权利要求1-11中任一项所述的式(I)化合物，其外消旋体、或其药学上可接受的盐的用途，其特征在于，用于制备：
(1)制备抑制PRMTI型酶活性的药物或制备PRMTI型抑制剂；
(2)制备治疗或预防与PRMTI型蛋白调节异常有关的哺乳动物疾病的药物；
(3)体外抑制肿瘤细胞的增殖；
(4)制备降低精氨酸甲基化水平的药物；
(5)制备诱导肿瘤细胞凋亡的药物；
(6)制备下调泛性不对称二甲基化修饰ADMA以及组蛋白H4R3和/或H3R2的不对称二甲基化修饰H4R3me2、H3R2me2的药物；
(7)制备上调细胞内对称二甲基化修饰水平SDMA的药物；
(8)制备抑制白血病致病基因HOXA9、HOXA10、MEIS1的表达的药物；或
(9)制备上调髓系细胞分化相关基因MNDA的转录水平的药物。
20.如权利要求19所述的用途，其特征在于，所述疾病选自：癌症、心血管疾病、神经退行性疾病、疟疾、艾滋病、痛风、糖尿病、肾功能衰竭、慢性肺部疾病、眼咽肌营养不良、可卡因成瘾、肺动脉高压疾病、肌萎缩侧索硬化症、酒精性肝硬化失代偿症。
21.如权利要求19所述的用途，其特征在于，所述PRMT I型抑制剂为PRMT1抑制剂、PRMT3抑制剂、PRMT4抑制剂、PRMT6抑制剂或PRMT8抑制剂。
22.如权利要求19所述的用途，其特征在于，所述肿瘤选自下组：淋巴瘤、脑癌、结肠癌、宫颈癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、肾癌、肺癌、纤维肉瘤、表皮鳞状细胞癌、前列腺癌、白血病、胰腺癌、口腔癌、胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、混合谱系白血病、恶性胶质瘤。
23.如权利要求19所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤细胞为选自下组的肿瘤细胞：结肠癌细胞，宫颈癌细胞，乳腺癌细胞，肝癌细胞，胃癌细胞，肾癌细胞，肺癌细胞，纤维肉瘤细胞，表皮鳞状细胞癌细胞，前列腺癌细胞，白血病细胞，胰腺癌细胞，口腔癌细胞，胶质细胞瘤细胞，神经母细胞瘤细胞，耐紫杉醇肺癌细胞，耐长春新碱口腔癌细胞，耐阿霉素慢性粒细胞白血病细胞。
24.如权利要求19所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤细胞选自下组：HCT116、Hela、MCF-7、LM3、NCI-N87、Caki-1、A549、HT1080、A431、PC3、HL60、Panc-1、KB、U87-MG、K562、Kasumi-1、THP-1、Jurkat、REH、Raji、RNK-16、KMS-1、P39、U118-MG、H4、SK-N-SH、SH-SY5Y、A549/Taxol、KB/VCR、K562/Adr。
25.如权利要求19所述的用途，其特征在于，泛性不对称二甲基化修饰ADMA、组蛋白H4R3和/或H3R2的不对称二甲基化修饰H4R3me2、H3R2me2、对称二甲基化修饰是指在白血病细胞MV4-11、肾癌细胞786-O、Caki-1、769-P、A498细胞内的泛性不对称二甲基化修饰ADMA、组蛋白H4R3和/或H3R2的不对称二甲基化修饰H4R3me2、H3R2me2、对称二甲基化修饰。
26.一种体外抑制肿瘤细胞增殖的方法，包括在细胞培养基中加入如权利要求1-11中任一项所述的式(I)化合物，其外消旋体、或其药学上可接受的盐的步骤。
27.一种体外上调髓系细胞分化相关基因MNDA的转录水平的方法，包括在细胞培养基中加入如权利要求1-11中任一项所述的式(I)化合物，其外消旋体、或其药学上可接受的盐的步骤。
28.一种体外诱导肿瘤细胞凋亡的方法，包括在细胞培养基中加入如权利要求1-11中任一项所述的式(I)化合物，其外消旋体、或其药学上可接受的盐的步骤。
29.一种体外下调细胞内泛性不对称二甲基化修饰ADMA以及组蛋白H4R3和/或H3R2的不对称二甲基化修饰H4R3me2、H3R2me2的方法，包括在细胞培养基中加入如权利要求1-11中任一项所述的式(I)化合物，其外消旋体、或其药学上可接受的盐的步骤。
30.一种体外上调细胞内对称二甲基化修饰水平SDMA的方法，包括在细胞培养基中加入如权利要求1-11中任一项所述的式(I)化合物，其外消旋体、或其药学上可接受的盐的步骤。
31.一种体外抑制白血病致病基因HOXA9、HOXA10、MEIS1的表达的方法，包括在细胞培养基中加入如权利要求1-11中任一项所述的式(I)化合物，其外消旋体、或其药学上可接受的盐的步骤。
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