CN113456818B

CN113456818B - Prmt3蛋白的用途和调控hiv转录的方法

Info

Publication number: CN113456818B
Application number: CN202110750730.3A
Authority: CN
Inventors: 于丹; 何玉先; 姚开虎
Original assignee: Beijing Childrens Hospital
Current assignee: Beijing Childrens Hospital
Priority date: 2021-07-01
Filing date: 2021-07-01
Publication date: 2022-02-22
Anticipated expiration: 2041-07-01
Also published as: CN113456818A

Abstract

本发明的第一个目的在于提供一种具有调控HIV‑1转录的宿主蛋白信息。本发明的另一个目的在于提供一种调控HIV‑1转录的方法。本发明采用shRNA和抑制剂分别检测抑制PRMT3对于HIV‑1转录的调控作用,并证明两种方式均可有效抑制HIV‑1转录,并且发现PRMT3可与HIV‑1LTR互作,影响H4R3Me2a水平调控HIV‑1转录,为研发干扰HIV‑1繁殖的药物提供了多种思路和手段。

Description

PRMT3蛋白的用途和调控HIV转录的方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及PRMT3蛋白的用途和调控HIV转录的方法。

背景技术

艾滋病是全球重大传染性疾病,艾滋病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)具有潜伏特性,一旦感染可以通过整合HIV基因组入人体而终身潜伏。深入认识和理解 HIV转录调控机制,发现新型抗艾滋药物靶标有助于突破此瓶颈问题,为发现治愈HIV 感染探索潜在途径。虽然多年来科学家们揭示了HIV侵染宿主及宿主免疫防御的信号通路,发现了多个潜在抗艾滋病靶标。然而现有药物仅能杀伤活跃繁殖中的HIV,目前临床尚无方案可控制潜伏HIV,是治愈患者的主要障碍。新型药物靶标的发现是研发抗艾滋病新药的重要前提,我们亟需从基础科研角度发现新型潜在的抗艾滋药物靶标, 为艾滋病临床治疗提供潜在创新思路。

蛋白精氨酸甲基转移酶(protein arginine methyltransferases,PRMTs)介导一系列含精氨酸残基蛋白质底物的甲基化,在癌症的发生、发展和侵袭等过程中起关键作用。PRMT3与肿瘤的关系:PRMT3虽属Ⅰ型PRMT家族,但PRMT3的大部分生物学功能及其与肿瘤发生的关系尚未明确。吉西他滨是中晚期胰腺癌的主要化疗药物。PRMT3在对吉西他滨耐药的胰腺癌细胞中异常表达,抑制PRMT3可能是提高胰腺癌细胞对吉西他滨敏感性的治疗策略之一(精氨酸甲基转移酶与肿瘤关系的研究进展中国临床医学2021年4月第28卷第2期)

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种复合体，所述复合体为PRMT3与HIV-LTR结合形成。

所述HIV-LTR为HIV-1的LTR区域。

本发明的另一个方面，提供一种的调控HIV转录的方法。

所述调控包括正调控和/或负调控。进一步的包括，促进和/或抑制调控HIV转录。所述调控通过调节PRMT3和/或调节PRMT3与HIV-LTR(Long terminal repeats,LTR)复合体实现。所述调节包括正调节和/或负调节。

所述正调节为促进PRMT3的表达或提高PRMT3活性。负调节为抑制PRMT3的表达或抑制PRMT3的活性。

前述HIV可以是HIV-1。

本发明还提供一种抑制HIV转录或治疗艾滋病的药物，其包含PRMT3抑制剂。进一步的，前述HIV是HIV-1。

进一步的，前述PRMT3抑制剂包括但不限于任何能够抑制PRMT3的表达或抑制PRMT3活性的制剂，进一步的，包括但不限于SGC707和/或shRNA。进一步的，前述药物通过破坏PRMT3与HIV-LTR复合体实现。

进一步的，前述药物可以包含PRMT3与HIV-LTR复合体的破坏和/或阻碍剂。

进一步的，可以包括抑制PRMT3表达或PRMT3活性的制剂。

进一步的，可以通过破坏HIV-LTR的结构实现，具体的包括破坏分子结构，或核酸序列。

进一步的，所述破坏和/或阻碍包括破坏一级或二级结构，或蛋白构象，或核酸序列，以及任一能破坏二者相互作用的方式和实现所述方式的试剂。

进一步的，所述HIV-LTR为HIV-1的LTR区域，所述LTR区域为HIV-1启动子区 LTR。

进一步的，所述复合体被破坏后用于抑制HIV的转录或治疗艾滋病。

本发明还提供一种PRMT3调节剂用于制备调节HIV转录的制剂的用途。

进一步的，前述HIV是HIV-1。

进一步的，前述调控包括正调控和/或负调控。进一步的包括，促进和/或抑制调控HIV转录。所述调控通过调节PRMT3和/或调节PRMT3与HIV-LTR复合体实现。所述调节包括正调节和/或负调节。

进一步的，前述所述转录包括但不限于Tat激活的HIV-1转录和/或JQ激活的HIV-1的转录。

进一步的，前述所述转录不包括Prostratin激活的HIV-1。

进一步的，前述PRMT3调节剂包括PRMT3抑制剂和PRMT3促进剂。

进一步的，前述PRMT3抑制剂可以是任何能够抑制PRMT3表达或活性的药物或制剂，可以但是不限于SGC707或shRNA。

进一步的，前述调控在任意细胞中，具体可以是NH1细胞或Jurkat 2D10细胞中。

进一步的，前述调控是通过调节PRMT3和HIV-1的LTR区域的结合发挥作用。

所述调节具体为抑制或破坏和/或阻碍。

进一步的，可以包括任何抑制PRMT3表达或PRMT3活性的制剂。

进一步的，所述破坏剂可以通过破坏HIV-LTR的结构实现，具体包括破坏分子结构，或核酸序列。

进一步的，所述破坏和/或阻碍包括破坏一级或二级结构，或蛋白构象，或核酸序列，或任意能破坏二者相互作用的方式。

本发明还涉及H4R3Me2a甲基化水平调节剂用于制备调控HIV转录的制剂的用途。

进一步的，所述HIV转录为HIV-1的转录。

进一步的，H4R3Me2a甲基化水平调节剂包括PRMT3调节剂。进一步包括PRMT3 抑制剂和PRMT3促进剂。前述PRMT3抑制剂可以但是任何能够抑制PRMT3表达或活性的药物或制剂，可以但是不限于SGC707或shRNA。

本发明还包括PRMT3的shRNA对于HIV-1转录的调控作用,PRMT3与HIV-1启动子区LTR组合物对于控制HIV-1转录的作用,H4R3Me2a水平在调控HIV-1转录中的作用。

本发明采用shRNA和抑制剂分别检测抑制PRMT3对于HIV-1转录的调控作用,并证明两种方式均可有效抑制HIV-1转录,并且发现PRMT3可与HIV-1LTR互作,影响 H4R3Me2a水平调控HIV-1转录,因此为未来我们研发干扰HIV-1繁殖的药物提供了多种思路和手段。

附图说明

图1.ChIP-q-PCR检测PRMT3在HIV-1LTR结合情况。

图2.NH1细胞中通过shRNA下调PRMT3水平,检测Tat激活的HIV-1转录水平。

图3.NH1细胞中通过抑制剂SGC707抑制PRMT3活性，检测Tat激活的HIV-1转录水平。

图4.NH1细胞中通过抑制剂SGC707抑制PRMT3活性，检测JQ1激活的HIV-1转录水平。

图5.用PRMT3抑制剂SGC707处理细胞,同时使用Prostratin处理细胞，检测Prostratin 激活的HIV-1转录水平。

图6.在种细胞系中检测PRMT3的表达水平。

图7.Jurkat 2D10细胞中，PRMT3抑制剂SGC707处理，检测内源性H4R3Me2a水平。

图8.Jurkat 2D10细胞中,PRMT3抑制剂SGC707处理，通过FACS检测JQ-1激活的HIV-1转录。

图9.对图8的FACS结果进行统计学分析。

具体实施方式

下面结合附图和实施方式对本发明做进一步的详细说明。以下实施例仅是范例性的,仅用以对本发明的技术方案做更进一步的详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,在不偏离本发明技术方案的精神和范围内,对技术方案进行的修改或者替换均应涵盖在本发明的权利要求保护范围内。

实施例1：PRMT3与LTR互作。

一、材料

染色体免疫共沉淀所需要的beads购买自Invitrogen公司,IgG抗体、PRMT3抗体购买自Cell Signaling Technology公司。

二、方法结果

1)染色体免疫共沉淀

在NH1细胞中转染HIV-1LTR质粒并转入Tat或空载体作为阴性对照组,固定细胞后超声打断DNA获得大小在500bp到1000bp之间的DNA；分别取600μl上清加入PRMT3抗体孵育过夜,取600μl上清加入IgG抗体孵育过夜，作为对照组；第二天加入Protein A Dynabeads孵育3小时；将带有DNA产物的beads用Wash buffer洗后,用 Elution buffer洗脱；过夜解交联后进行RNA酶和蛋白酶处理,并用PCR片段回收试剂盒纯化DNA；设计扩增LTR区域的两对引物(序列如下),通过q-PCR检测PRMT3在 HIV-1LTR区域的结合情况。

Nascent:

F:GTTAGACCAGATCTGAGCCT；(SEQ ID NO：1)

R:GTGGGTTCCCTAGTTAGCCA(SEQ ID NO：2)

Interior:

F:CTCTTTCGAAAGAAGTCGGGG；(SEQ ID NO：3)

R:GAACAACTTTACCGACCGCG(SEQ ID NO：4)

结果如图1所示,在Tat加入后即HIV-1转录激活时,PRMT3可有效结合在HIV-1 LTR区域。结果表明：可通过破坏PRMT3与LTR互作来干扰HIV-1转录。

实施例2：下调PRMT3表达的shRNA构建。

一、材料

引物由北京天一辉远公司合成；退火使用buffer为NEB buffer2；连接酶使用NEB公司T4 ligase产品；测序由天一辉远公司完成；其他相关试剂均为市购。

二、方法结果

1、shRNA序列设计如下:

shRNA-1F:

CCGGCCTTGTGGTATTAAGCATATACTCGAGTATATGCTTAATACCACAAGG TTTTTG(SEQ IDNO：5)

shRNA-1R:

AATTCAAAAACCTTGTGGTATTAAGCATATACTCGAGTATATGCTTAATACCAC AAGG(SEQ IDNO：6)

shRNA-2F:

CCGGGCAGTGAGTGATGTGAATAAACTCGAGTTTATTCACATCACTCACTGCTT TTTG(SEQ IDNO：7)

shRNA-2R:

AATTCAAAAAGCAGTGAGTGATGTGAATAAACTCGAGTTTATTCACATCACTCA CTGC(SEQ IDNO：8)

2、引物退火

1)引物稀释:

引物管12000rpm离心2mins,配置为100μM液体,-20℃保存。

2)分别取正向和反向引物各4.5μl,加入1μl NEB buffer2后混匀,煮开水至100℃, 将以上混合物放入100℃开水直至降至室温。

3、酶切

酶切体系如下:

质粒1.5μg加入2ml酶切buffer,1μl限制性内切酶,补充无菌水至总计20μl,放至37℃水浴锅酶切2hrs。

4、DNA凝胶电泳纯化片段

1)配置1％琼脂糖DNA胶。

2)将上述酶切产物加入6×loading buffer后上样至DNA胶孔中,120V,1h跑胶。

3)使用Omega胶回收试剂盒进行DNA片段胶回收。

5、连接

16℃连接仪过夜连接将含有shRNA序列的DNA连接至PLKO.1质粒上。连接体系如下:质粒1μg；加入1μl buffer和0.5μl连接酶,补充无菌水至10μl。

6、转化

取上述连接产物5μl加入至50μl大肠杆菌感受态细胞,冰上静置30mins,42℃热激45s,冰上静置2mins后加入LB培养基,37℃复苏1h,涂布含氨苄霉素的LB平板。过夜生长后挑单克隆送测序,验证shRNA序列已正确连接至质粒。

实施例3：通过shRNA下调PRMT3水平可抑制HIV-1转录。

一、材料

转染试剂使用Polysciences公司的PEI；细胞培养使用Corning公司的12孔培养板；培养基使用公司的DMEM,血清购自四季青公司；Luciferase检测试剂盒购自Promega 公司。

二、方法结果

1)转染

取2个1.5ml EP管,分别加入50μl无血清的DMEM,1个管中加入1μl质粒混匀, 另外一个管中加入2.5μl PEI混匀,两个EP管种液体合并混匀后室温静置30mins,逐滴加入至细胞培养板中。

2)Luciferase检测

转染48小时后收集细胞,每孔使用100μl裂解液重悬细胞放至-80℃冰箱至少2hrs,取出细胞室温融化后,震荡重悬后取出10μl放入检测白板中,加入20μl Luciferase底物,使用酶标仪检测Luciferase信号,并统计数据。

NH1细胞在Hela细胞系整合有HIV-1LTR作为Luciferase的启动子,因此通过检测Luciferase表达可用来评价HIV-1转录活性。将两个靶向PRMT3不同区域的 shRNAs连接至PLKO.1质粒，得到shPRMT3_1和shPRMT3_2。后瞬时转染 shPRMT3_1和shPRMT3_2至NH1细胞，下调PRMT3水平,采用Luciferase检测HIV-1 转录水平。实验重复三次,标准差使用误差线显示,并使用双尾检验进行统计学分析,*:p <0.05；**:p<0.05；***:p<0.001。

结果如图2所示，shscramble为阴性对照；左侧3列为本底基因转录，右侧3列为Tat激活的HIV-1转录。结果表明：通过shRNA下调PRMT3可显著抑制Tat激活的HIV-1转录,但并不显著影响宿主本底基因转录。

实施例4：抑制PRMT3活性可抑制Tat激活的HIV-1转录。

一、材料

PRMT3抑制剂SGC707购买自TargetMOI公司。

二、方法结果

1)抑制剂处理

使用PRMT3抑制剂SGC707按浓度0.0625mM、0.125mM、0.25mM和0.5mM 处理细胞16h后收集细胞,每孔使用100μl裂解液重悬细胞放至-80℃冰箱至少2hrs, 取出细胞室温融化后,震荡重悬后取出10μl放入检测白板中,加入20μl Luciferase底物,使用酶标仪检测Luciferase信号,并统计数据。实验重复三次,标准差使用误差线显示,并使用双尾检验进行统计学分析,*:p<0.05；**:p<0.05；***:p<0.001。

结果如图3所示，在NH1细胞中,使用PRMT3抑制剂处理,在Tat激活前后,采用Luciferase检测HIV-1转录水平。DMSO为阴性对照。

结果表明：发现通过抑制剂SGC707抑制PRMT3活性可显著抑制Tat激活的 HIV-1转录。

实施例5：抑制PRMT3活性可抑制JQ-1激活的HIV-1转录。

一、材料

JQ-1购自Sigma公司。

二、方法结果

1)抑制剂处理

JQ-1是BRD4抑制剂,其也为HIV-1激活剂,是通过Tat依赖信号通路激活HIV-1。转录使用PRMT3抑制剂SGC707处理细胞,同时使用JQ-1处理细胞16h后收集细胞, 每孔使用100μl裂解液重悬细胞放至-80℃冰箱至少2hrs,取出细胞室温融化后,震荡重悬后取出10μl放入检测白板中,加入20μl Luciferase底物,使用酶标仪检测 Luciferase信号,并统计数据。实验重复三次,标准差使用误差线显示,并使用双尾检验进行统计学分析,*:p<0.05；**:p<0.05；***:p<0.001。

结果如图4所示，在NH1细胞中,使用PRMT3抑制剂处理,在JQ-1激活前后,采用Luciferase检测HIV-1转录水平。DMSO为阴性对照。

结果表明：使用PRMT3抑制剂SGC707处理细胞16h抑制PRMT3活性可有效抑制JQ-1激活的HIV-1转录。

实施例6：抑制PRMT3活性不能抑制Prostratin激活的HIV-1转录。

一、材料

Prostratin购自Sigma公司。

二、方法结果

1)抑制剂处理

Prostratin通过蛋白激酶C通路激活HIV-1转录。使用PRMT3抑制剂SGC707 处理细胞,同时使用Prostratin处理细胞16h后收集细胞,每孔使用100μl裂解液重悬细胞放至-80℃冰箱至少2hrs,取出细胞室温融化后,震荡重悬后取出10μl放入检测白板中,加入20μlLuciferase底物,使用酶标仪检测Luciferase信号,并统计数据。实验重复三次,标准差使用误差线显示,并使用双尾检验进行统计学分析,*:p<0.05；**:p< 0.05；***:p<0.001。

结果如图5所示，在NH1细胞中,使用PRMT3抑制剂处理,在Prostratin激活前后,采用Luciferase检测HIV-1转录水平。

结果表明：发现PRMT3抑制剂并不能抑制Prostratin激活的HIV-1转录。以上结果提示PRMT3特异性抑制Tat激活的HIV-1转录。说明SGC707特异性抑制Tat激活的HIV-1转录激活,并不影响宿主基本功能通路。

实施例7：PRMT3在多种细胞系中表达量相当。

一、材料

Western-blot相关实验耗材购自兰博利德公司；PRMT3抗体购自Cell SignalingTechnology公司；H4R3Me2a抗体购自Invitrogen公司。

二、方法结果

1)细胞培养

接种10⁵细胞于6孔板中,使用DMEM培养基加入10％FBS,于37℃含有5％CO₂的培养箱静置培养。

2)Western-blot

a)配置10％SDS聚丙烯酰胺蛋白胶；

b)将细胞收集后使用1×SDS loading buffer重悬后,于100℃煮10mins；12000rpm 离心取上清上样；

c)80V跑胶30mins后,140V跑胶1h。

d)按照300mA电流冰上转膜2h。

e)5％脱脂牛奶室温封闭1h。

f)加入一抗4℃过夜孵育。

g)用TBST wash 3次,每次15mins,加入二抗。

h)用TBST wash 3次,加入显影增强液,X胶片暗室显影。

结果如图6所示，通过WB在多种细胞系中检测PRMT3的表达情况。

结果表明：发现PRMT3在包括HIV-1天然感染Jurkat CD4+T细胞在内的如图多种细胞中均有较高表达。

实施例8：抑制PRMT3活性可有效下调内源的H4R3Me2a的甲基化水平。

H4R3Me2a水平是开放染色质,基因转录激活的标志。根据文献提示,抑制PRMT3 可下调内源性H4R3Me2a甲基化水平。HIV-1潜伏模型Jurkat 2D10细胞是整合有HIV-1Nef蛋白缺失的假病毒融合表达d2EGFP,并表达有与P-TEFb减弱互作Tat蛋白的细胞系。因此,我们使用PRMT3抑制剂SGC707处理Jurkat 2D10细胞抑制PRMT3 活性。

结果如图7所示，发现Jurkat 2D10细胞内源性H4R3Me2a甲基化水平确实有所下降。

结果表明：PRMT3可能是通过下调内源性H4R3Me2a甲基化水平抑制HIV-1转录。

实施例9：Jurkat 2D10细胞模型中抑制PRMT3活性可抑制HIV-1转录。

一、材料

流式细胞仪使用所需管购自Invitrogen公司。

二、方法结果

1)使用24孔板培养细胞,接种10⁴Jurkat2D10细胞(Jurkat T细胞系中整合有HIV-1 LTR作为GFP启动子,因此通过检测GFP表达量具有评价HIV-1转录活性的作用)每孔,RMPI16410加入10％FBS培养过夜。

2)流式细胞仪检测GFP信号

使用PRMT3抑制剂SGC707处理细胞16h后800g离心5mins收集细胞,用PBS 洗一遍,上机流式细胞仪,使用软件分析数据。

HIV-1潜伏模型Jurkat 2D10细胞是整合有HIV-1Nef蛋白缺失的假病毒融合表达不稳定增强型绿色荧光蛋白,并表达有与P-TEFb减弱互作Tat蛋白的细胞系。因此,我们使用JQ-1激活潜伏HIV-1转录后,按照可以降低H4R3Me2a水平的抑制剂浓度处理 Jurkat2D10细胞,在Jurkat 2D10细胞中,使用PRMT3抑制剂处理,在JQ-1激活前后,FACS检测HIV-1转录水平,发现抑制PRMT3活性可抑制JQ-1激活的HIV-1转录 (图8)。图8三次独立的重复实验进行统计学分析(图9)。实验重复三次,标准差使用误差线显示,并使用双尾检验进行统计学分析,*:p<0.05。

结果如图9所示,在Jurkat 2D10细胞中,JQ-1激活后，使用PRMT3抑制剂SGC707 处理，HIV-1转录水平下降。

结果表明：在Jurkat 2D10细胞中,使用PRMT3抑制剂处理,发现抑制PRMT3活性可抑制JQ-1激活的HIV-1转录。

SEQUENCE LISTING

<110> 首都医科大学附属北京儿童医院

<120> PRMT3蛋白的用途和调控HIV转录的方法

<130> P210079

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Synthetic sequences）

<400> 1

gttagaccag atctgagcct 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Synthetic sequences）

<400> 2

gtgggttccc tagttagcca 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Synthetic sequences）

<400> 3

ctctttcgaa agaagtcggg g 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Synthetic sequences）

<400> 4

gaacaacttt accgaccgcg 20

<210> 5

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列（Synthetic sequences）

<400> 5

ccggccttgt ggtattaagc atatactcga gtatatgctt aataccacaa ggtttttg 58

<210> 6

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列（Synthetic sequences）

<400> 6

aattcaaaaa ccttgtggta ttaagcatat actcgagtat atgcttaata ccacaagg 58

<210> 7

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列（Synthetic sequences）

<400> 7

ccgggcagtg agtgatgtga ataaactcga gtttattcac atcactcact gctttttg 58

<210> 8

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列（Synthetic sequences）

<400> 8

aattcaaaaa gcagtgagtg atgtgaataa actcgagttt attcacatca ctcactgc 58

Claims

1.PRMT3抑制剂用于制备抑制HIV-1转录的药物中的用途，其特征在于，所述HIV-1转录是Tat激活或JQ-1激活的HIV-1转录。

2.权利要求1所述用途，所述PRMT3抑制剂通过抑制PRMT3和HIV-LTR结合抑制HIV-1转录。

3.权利要求1所述用途，所述PRMT3抑制剂通过抑制H4R3Me2a甲基化水平抑制HIV-1转录。