JP2021072865A - 非組み込みウイルス送達システムおよびその使用の方法 - Google Patents

Abstract

【課題】非組み込みウイルス送達システムおよびその使用の方法の提供。【解決手段】本発明は概して、非組み込みウイルス送達系およびその使用方法に関する。ウイルス送達系は、ウイルス担体、異種ウイルスエピソーム複製起点、異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列、および目的の少なくとも１つの遺伝子、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他の遺伝子サイレンシングＲＮＡを含む。ある特定の実施形態では、開示される系は遺伝子療法に使用され得る。【選択図】なし

Description

優先権および参照による援用
本出願は、２０１５年６月１０日に出願され、Ｎｏｎ−Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ Ｖｉ
ｒａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｕｓｅ Ｔ
ｈｅｒｅｏｆと題する米国仮出願番号第６２／１７３，７４８号に基づく優先権を主張し
ており、この仮出願は、その全体が参考として援用される。

分野
本発明は概して、ウイルスベクター、および遺伝子送達のための系、および他の治療、
診断、または調査使用のための分野に関する。

背景
ウイルスベクターは、特異的なウイルスエンベロープ−宿主細胞受容体の相互作用およ
び遺伝子発現のためのウイルスメカニズムのために、遺伝子を標的細胞に形質導入するた
めに使用され得る。その結果、ウイルスベクターは、全胚、受精卵、単離された組織試料
、ｉｎ ｓｉｔｕでの組織標的、および培養された細胞株を含む、多くの異なる細胞型へ
の遺伝子の移入のための媒体として使用されている。外来遺伝子を細胞内に導入し、発現
させる能力は、遺伝子発現の研究、ならびに細胞系統の解明、ならびに、遺伝子療法、誘
導された多能性幹細胞の体細胞リプログラミング、および様々なタイプの免疫療法などの
治療的介入の可能性の提供に有用である。

遺伝子療法に利用可能な多種多様な可能性のある遺伝子を考慮して、これらの遺伝子を
送達する効率的な手段が望まれている。マウスレトロウイルス、アデノウイルス、および
パルボウイルス（アデノ随伴ウイルス）を含むいくつかのウイルス系が、治療用遺伝子移
入ベクターとして開発されている。発現の安定性および制御、ゲノムパッケージング能力
、ならびに構築物依存性のベクター安定性を含む多くの因子が、ウイルスベクターを開発
する際に考慮されなければならない。さらに、ウイルスベクターのｉｎ ｖｉｖｏでの適
用は、ウイルス構造タンパク質および／または形質導入された遺伝子産物に対する宿主の
免疫応答によって制限されることが多い。

組換えポリペプチド、または小型ＲＮＡを含む遺伝子調節分子の生産のためのアプロー
チは、安定な発現系の使用である。これらの系は、形質導入されたレトロウイルスゲノム
（または少なくともその一部）の、宿主細胞ゲノムへの染色体組み込み、短期間のプラス
ミドトランスフェクション、または半減期も限定された非組み込みウイルスベクターに基
づく。遺伝子組み込みの部位は一般的にランダムであり、任意の特定の部位で組み込まれ
る遺伝子の数および比率は予測不可能であることが多い。同様に、非組み込みプラスミド
またはウイルスベクターは核ＤＮＡも生成するが、これらの種は通常、ＤＮＡの複製およ
び連続的な維持に必要な配列を欠いている。したがって、染色体組み込みに依存するベク
ターは、治療間隔を超え得る組換え遺伝子の永続的な維持をもたらし、そしてプラスミド
または他の非複製ＤＮＡの制御は不十分であり、所望の治療期間が完了する前に崩壊し得
る。

遺伝子発現のための安定な発現系の代替は、一過性発現系である。一過性遺伝子発現系
の発現は非組み込み型プラスミドに基づくものであり、したがって、典型的には細胞が分
割するにつれ発現が失われたり、またはプラスミドベクターが内因性ヌクレアーゼによっ
て破壊されたりする。したがって、一過性遺伝子発現系は、典型的には時間がたつにつれ
て発現が不十分になることから従来通り反復処置を要することとなり、これは一般的に望
ましくない。

要旨
一実施形態では、本発明は、新規な非組み込みウイルス送達系およびその使用方法に関
する。

一態様では、本発明は、ウイルス担体、異種ウイルスエピソーム複製起点、異種ウイル
スエピソーム複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードす
る配列、ならびに目的の少なくとも１つの遺伝子、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ
、および／または他の遺伝子調節ＲＮＡを含むウイルス送達系であって、ウイルス担体が
欠陥のあるインテグラーゼ遺伝子を有し、異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的な少
なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列の発現が誘導性プロモーター
の制御下にある、ウイルス送達系に関する。

一部の実施形態では、ウイルス担体はレンチウイルスであるが、他のウイルス担体もま
た適切であり得る。一部の実施形態では、異種ウイルスエピソーム複製起点は、ウシパピ
ローマウイルスまたはヒトパピローマウイルスなどのパピローマウイルスに由来し、異種
ウイルスエピソーム複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質は、
パピローマウイルスＥ１および／またはＥ２である。ある特定の実施形態では、Ｅ１およ
びＥ２の両方が、本明細書において記載される系に存在する。

あるいは、一部の実施形態では、異種ウイルスエピソーム複製起点は、エプスタイン・
バーウイルスまたは関連する哺乳動物ヘルペスウイルスのいずれかに由来し、異種ウイル
スエピソーム複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質は、ＥＢＮ
Ａ−１またはそれぞれ個々のヘルペスウイルスにおいて見られる特異的なイニシエーター
タンパク質である。

別の態様では、開示される発明は、開示されるウイルス送達系および薬学的に許容され
る担体を含む医薬組成物に関する。

別の態様では、開示される発明は、疾患の処置または予防を必要とする対象を識別する
ステップ、および治療有効量の本発明に従ったウイルス送達系を対象に投与するステップ
を含む、疾患を処置または予防する方法に関する。ウイルス送達系は、ウイルス担体、異
種ウイルスエピソーム複製起点、異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的な少なくとも
１つのイニシエータータンパク質をコードする配列、ならびに目的の少なくとも１つの遺
伝子、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／または他の遺伝子サイレンシング
ＲＮＡを含み、ここで、ウイルス担体は欠陥のあるインテグラーゼ遺伝子を有するか、ま
たは組み込みはウイルスインテグラーゼタンパク質の医薬阻害剤によってサイレンシング
され、異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータン
パク質をコードする配列の発現は、誘導性プロモーターの制御下にある。

一部の実施形態では、疾患は、エボラウイルス、ラッサ熱ウイルス、または特異的抗体
によって保護され得るあらゆるウイルス性因子などの感染性疾患であり得、また、これら
の実施形態では、目的の遺伝子、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／または
他の遺伝子サイレンシングＲＮＡは、エボラウイルスまたはラッサ熱ウイルスまたはあら
ゆる他の特異的ウイルス標的に特異的な抗体をコードし得る。

一部の実施形態では、疾患は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓもしくは
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、または他の細菌病原体、真菌病原体、もしくは原生
動物病原体などの感染性疾患であり得、ここで、目的の遺伝子、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ
、ｍｉＲＮＡ、および／または他の遺伝子サイレンシングＲＮＡは、病原体の複製を低減
させるかまたは外因性の病原体が生産する毒素の活性をブロックすることを標的にする抗
体をコードする。

一部の実施形態では、開示される方法を使用して処置または予防される疾患は、遺伝子
疾患または障害である。一部の実施形態では、遺伝子疾患はアルコール乱用であり、目的
の遺伝子、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／または他の遺伝子サイレンシ
ングＲＮＡは、脳由来の増殖因子をコードする。

別の態様では、開示される発明は、神経損傷を有する対象を識別するステップ、および
治療有効量の本発明に従ったウイルス送達系を対象に投与するステップを含む、神経損傷
を処置する方法に関する。ウイルス送達系は、ウイルス担体、異種ウイルスエピソーム複
製起点、異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータ
ンパク質をコードする配列、ならびに目的の少なくとも１つの遺伝子、ｓｈＲＮＡ、ｓｉ
ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／または他の遺伝子サイレンシングＲＮＡを含み、ここで、
ウイルス担体は欠陥のあるインテグラーゼ遺伝子を有し、異種ウイルスエピソーム複製起
点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列の発現は、誘
導性プロモーターの制御下にある。一部の実施形態では、目的の遺伝子、ｓｈＲＮＡ、ｓ
ｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／または他の遺伝子サイレンシングＲＮＡは、神経成長因
子である。

さらに別の実施形態では、開示される発明は、創傷を有する対象を識別するステップ、
および治療有効量の本発明に従ったウイルス送達系を対象に投与するステップを含む、創
傷治癒を増強する方法に関する。ウイルス送達系は、ウイルス担体、異種ウイルスエピソ
ーム複製起点、異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエー
タータンパク質をコードする配列、ならびに目的の少なくとも１つの遺伝子、ｓｈＲＮＡ
、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／または他の遺伝子サイレンシングＲＮＡを含み、こ
こで、ウイルス担体は欠陥のあるインテグラーゼ遺伝子を有し、異種ウイルスエピソーム
複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列の発現
は、誘導性プロモーターの制御下にある。創傷は、例えば、事故、損傷、または外科手術
によるものであり得る。一部の実施形態では、目的の遺伝子、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、
ｍｉＲＮＡ、および／または他の遺伝子サイレンシングＲＮＡは、血小板由来増殖因子ま
たは血管内皮増殖因子である。

別の実施形態では、開示される発明は、外傷性熱傷を有する対象を識別するステップ、
および治療有効量の本発明に従ったウイルス送達系を対象に投与するステップを含む、外
傷性皮膚熱傷からの回復を増強する方法に関する。ウイルス送達系は、ウイルス担体、異
種ウイルスエピソーム複製起点、異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的な少なくとも
１つのイニシエータータンパク質をコードする配列、ならびに目的の少なくとも１つの遺
伝子、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／または他の遺伝子サイレンシング
ＲＮＡを含み得、ここで、ウイルス担体は欠陥のあるインテグラーゼ遺伝子を有し、異種
ウイルスエピソーム複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコ
ードする配列の発現は、誘導性プロモーターの制御下にある。皮膚外傷は、化学的または
物理的（熱または紫外線または放射線照射）損傷によるものであり得る。一部の実施形態
では、目的の遺伝子、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／または他の遺伝子
サイレンシングＲＮＡは、表皮もしくはケラチン生成細胞増殖因子または表皮細胞の成長
および分化の他のプロモーターをコードする。

別の実施形態では、開示される発明は、がんまたは新生物疾患を有する対象を識別する
ステップ、および治療有効量の本発明に従ったウイルス送達系を対象に投与するステップ
を含む、がんまたは新生物疾患を処置する方法に関する。ウイルス送達系は、ウイルス担
体、異種ウイルスエピソーム複製起点、異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的な少な
くとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列、ならびに目的の少なくとも１
つの遺伝子、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／または他の遺伝子サイレン
シングＲＮＡを含み得、ここで、目的の遺伝子、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、
および／または他の遺伝子サイレンシングＲＮＡは、腫瘍抗原を標的とする抗体、または
、免疫療法、外科手術、放射線照射、もしくは化学療法に対する腫瘍の感受性を改変する
ことを意図したポリペプチドおよび／もしくは調節ＲＮＡをコードする。

別の実施形態では、開示される発明は、遺伝子の欠失、改変、または再シーケンシング
のための系を含む、タンパク質および／または核酸を送達するための系である。染色体遺
伝子を改変するための現在の技術は、オフターゲット効果を予防するための適切な安全因
子を欠く。提案される発明では、本発明のＤＮＡ改変系をコードする遺伝子は、所要の治
療期間後に確実に枯渇される。

別の実施形態では、開示される発明は、創傷を有する対象を識別するステップ、および
治療有効量の本発明に従ったウイルス送達系を対象に投与するステップを含む、骨の治癒
を増強する方法に関する。ウイルス送達系は、ウイルス担体、異種ウイルスエピソーム複
製起点、異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータ
ンパク質をコードする配列、ならびに目的の少なくとも１つの遺伝子、ｓｈＲＮＡ、ｓｉ
ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／または他の遺伝子サイレンシングＲＮＡを含み、ここで、
ウイルス担体は欠陥のあるインテグラーゼ遺伝子を有し、異種ウイルスエピソーム複製起
点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列の発現は、誘
導性プロモーターの制御下にある。骨折は、例えば、事故、損傷、外傷、または外科手術
によるものであり得、また、骨の癒合不全または急性骨折または所要の脊椎固定術であり
得る。一部の実施形態では、目的の遺伝子、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およ
び／または他の遺伝子サイレンシングＲＮＡは、骨形成タンパク質１〜４またはシクロオ
キシゲナーゼ−２または血管内皮増殖因子をコードする。

先の一般的記載および以下の詳細な説明は、例示的で説明的なものであり、特許請求の
範囲に記載の本発明をさらに説明することを意図したものである。他の目的、利点、およ
び新規な特長は、以下の図面の簡単な説明および本発明の詳細な説明から当業者に容易に
明らかである。

図１は、本発明の実施形態に従ったウイルスベクター内の例示的なウイルスを示す図である。 図２は、Ｅ１イニシエータータンパク質も含有する例示的なベクター・イン・ベクター（ＶＩＶ）の実施形態（ベクター１）を示す図である。 図３は、ベクター１を使用する２９３Ｔ細胞における形質導入の結果を示す図である。 図４は、Ｅ１およびＥ２イニシエータータンパク質の両方をまた含有する例示的なベクター・イン・ベクターの実施形態を示す図である。

詳細な説明
本明細書において開示されるのは、非組み込み性の、エピソーム複製するウイルスベク
ター（例えば、レンチウイルスベクター）およびその使用方法である。本発明のようなエ
ピソームで複製するベクターは、ウイルス様Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ウシ
パピローマウイルスまたはＢＰＶ）またはＨｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ（例えば、エプス
タイン・バーウイルスまたはＥＢＶ）またはＨｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、Ｂ
型肝炎ウイルスまたはＨＢＶ）のウイルス成分を含有し得る。これらのウイルスに由来す
るエピソームで複製するベクターは、複製起点および少なくとも１つのウイルストランス
作用因子、例えば、ＢＰＶポリメラーゼのためのＥ１およびＥＢＶもしくはＨＢＶポリメ
ラーゼのためのＥＢＮＡ−１などのイニシエータータンパク質、またはアデノウイルスの
末端結合タンパク質を含有し得る。エピソーム複製のプロセスは、典型的には、宿主細胞
の複製機構およびウイルストランス作用因子の両方を組み入れる。

異種ウイルスの複製起点を使用することによって、新規なベクターは、複製起点を認識
するために必要なウイルスタンパク質の発現の「オフ」スイッチで操作され得る。ベクタ
ーのＤＮＡ複製のスイッチオフは、形質導入された遺伝子のさらなる発現を防ぎ、ウイル
スベクターは時間とともに消えて、その結果、形質導入された遺伝子はもはや宿主細胞内
に存在しなくなる。開示される系および方法は、形質導入された遺伝子の過剰発現または
発現の延長から生じるあらゆる毒性効果を予防する能力を含む、先行技術に対する多くの
改善を提供する。一旦ＤＮＡ複製が停止した遺伝子を排除することで、その後の望ましく
ない遺伝子発現またはノックダウンが予防される。同様に、エピソーム複製の有益な点を
異種ウイルス系に組み合わせることによって、目的の遺伝子を様々な細胞型に安全かつ効
率的に形質導入し得るプラットフォームが提供される。

パピローマウイルス
パピローマウイルスは、哺乳動物細胞において主にエピソームとして複製する。ＤＮＡ
ヘリカーゼとして機能するウイルスＥ１タンパク質の、ウイルス複製起点（ｏｒｉ）に対
する作用が、感染した上皮細胞の分化状態に応じて細胞当たり数百から数千のコピーの生
産を駆動する。この特性を認識して、いくつかの研究所は、「シャトルプラスミド」とし
て公知になったものを使用する、パピローマウイルスに基づく遺伝子送達系の開発を試み
た。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＤＮＡの生産を可能にするための細菌複製起点および哺乳動物
細胞におけるエピソーム複製を可能にするパピローマウイルスｏｒｉを用いて、多くの研
究が遺伝子発現の安全性および耐久性を実証するために行われた。ほとんどのケースにお
いて、ｏｒｉはウシパピローマウイルスに由来するものであった。

パピローマウイルスは、表皮細胞および上皮細胞に感染するように進化している。感染
細胞が基底面から管腔表面に分化するにつれ、パピローマウイルスはＤＮＡ複製を増大さ
せ、コピー数は、大量のウイルスが内腔表面で放出されるまで非常に増える。これによっ
て、ヒトパピローマウイルスから明らかであるように、パピローマウイルスは非常に伝染
性となる。コピー数の急増は、主に宿主因子に起因する。しかし、パピローマウイルスの
この特長は、一時的な遺伝子療法が表皮表面および上皮表面を標的にするために利用する
ことができる。

したがって、パピローマウイルスのある特定の特長は、エピソームベクターの発現およ
び複製を駆動するため、ならびにベクターの発現が特定の細胞型を標的にするために使用
することができる。

エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）
ヒトヘルペスウイルス４としても公知であるエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）は
、ヘルペスウイルスファミリーのメンバーである。これは最も一般的なヒトウイルスの１
つであり、ほとんどの人は人生で何度かＥＢＶに感染する。

ＥＢＶは、およそ８５の遺伝子を含有し、Ｂ細胞および上皮細胞に感染することが公知
である、二本鎖ＤＮＡウイルスである。ＥＢＶは、溶解性複製および潜伏複製の両方が可
能であり、潜伏複製によって、環状化型のＥＢＶゲノムの宿主細胞核への転座が生じ、核
において、ＥＢＶは宿主細胞ＤＮＡポリメラーゼによって複製され得る。

ＥＢＶは、少なくとも３つの異なる経路を介して潜伏複製し得るが、各経路は、エピソ
ーム複製起点を結合し宿主細胞の分割の間のエピソームの区分化を媒介するタンパク質で
ある、エプスタイン・バーウイルス核抗原１（ＥＢＮＡ−１）の発現を伴う。ＥＢＮＡ−
１は、ＥＢＶ遺伝子の調節、複製、およびエピソームの維持における不可欠な役割を有す
る。

染色体外で複製するその天然の向性および能力に起因して、ＥＢＶは、ウイルスベクタ
ーとして興味深い。このようなベクターは、ＥＢＶのウイルス発がん遺伝子および／また
は極めて重要な溶解性遺伝子が欠失するように突然変異することが多い。しかし、ウイル
スベクターとしてのＥＢＶの利用性は、これまでのところ、ｅｘ ｖｉｖｏおよび調査目
的にかなり限定されている。

Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、ヘパドナウイルスファミリーのメンバーである。これ
は、進行性肝臓線維症、肝炎、および肝細胞癌に関連する、一般的なヒトウイルスである
。

ＨＢＶは、ＲＮＡ中間体を介しウイルスポリメラーゼに依存して複製する、二本鎖ＤＮ
Ａウイルスである。肝細胞におけるＨＢＶの安定な維持は、根絶が困難な、共有結合によ
り閉環したウイルスＤＮＡ環状形態の存在に起因する。

染色体外で複製するその天然の向性および能力に起因して、ベクターとしてのＨＢＶは
、肝細胞の標的化および治療遺伝子の送達のための重要な可能性のある利点を提供する。
ＨＢＶの固有のライフサイクルは、ＲＮＡ中間体をウイルスＤＮＡに変換するために必要
なウイルスポリメラーゼの制御された発現を介してエピソームＤＮＡレベルを調節するた
めの固有の方法を提供する。

レトロウイルス
レトロウイルスは、ＲＮＡ鋳型からＤＮＡコピーを生成することが可能な逆転写酵素を
コードすること、および宿主細胞染色体へのプロウイルスの組み込みを特徴とするウイル
スファミリーである。レンチウイルスは、顕著な量のウイルス核酸を宿主細胞内に送達し
得るレトロウイルスの属である。レンチウイルスは、分裂していない細胞に感染する／形
質導入する固有の能力を有することを特徴とし、形質導入の後、レンチウイルスは自らの
核酸を宿主細胞の染色体に組み込む。

感染性レンチウイルスは、病原性タンパク質ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖをコードす
る３つの主要な遺伝子、ならびにｔａｔおよびｒｅｖを含む２つの調節遺伝子を有する。
特異的な血清型およびウイルスに応じて、ウイルス核酸の調節、合成、および／またはプ
ロセシング、ならびに他の複製機能に関与するタンパク質をコードするさらなるアクセサ
リー遺伝子が存在し得る。

さらに、レンチウイルスは、およそ６００ｎｔ長であり得る長い末端反復（ＬＴＲ）領
域を含有する。ＬＴＲは、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５領域にセグメント化され得る。ＬＴＲは
、インテグラーゼの作用を介して宿主染色体へのレトロウイルスＤＮＡの組み込みを媒介
し得る。あるいは、インテグラーゼを機能化せずに、ＬＴＲは、ウイルス核酸を環状化す
るために使用され得る。

レンチウイルス複製の初期段階に関与するウイルスタンパク質には、逆転写酵素および
インテグラーゼが含まれる。逆転写酵素は、ウイルスによってコードされる、ＲＮＡ依存
性のＤＮＡポリメラーゼである。この酵素は、ウイルスＲＮＡゲノムを相補的ＤＮＡコピ
ーの合成のための鋳型として使用する。逆転写酵素はまた、ＲＮＡ鋳型の破壊のためのＲ
ＮａｓｅＨ活性を有する。インテグラーゼは、逆転写酵素によって生成されるウイルスｃ
ＤＮＡおよび宿主ＤＮＡの両方を結合する。インテグラーゼは、ウイルスゲノムを宿主Ｄ
ＮＡ内に挿入する前にＬＴＲをプロセシングする。ｔａｔは、転写の間にトランス活性化
因子として作用して、ウイルスＤＮＡから作製されるＲＮＡコピーの開始および伸長を増
強する。ｒｅｖ応答性エレメントは転写後に作用し、ｍＲＮＡのスプライシングおよび細
胞質への輸送を調節する。

ベクター・イン・ベクター技術
本明細書において開示されるのは、様々なウイルス種の所望の特長を組み合わせること
によって遺伝子の送達および発現を正確に調節し得る、新規なベクター・イン・ベクター
（ＶＩＶ）系である。レンチウイルス（ＬＶ）プラットフォームを含む多くのウイルスベ
クターが、当技術分野において公知である。ＬＶは、製造の容易性および柔軟な標的化特
徴という有益な点を有するが、レンチウイルスの形質導入は、安定な形質導入のほとんど
の他の形態と同様に、ＬＶペイロードの染色体組み込みを生じさせる。染色体組み込みの
特性は、ウイルスインテグラーゼ遺伝子を不活化する突然変異を介して無効にされ得る。

染色体組み込みを避けることによって、ｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子送達に対する障壁が
低減する。組み込みに欠陥のあるＬＶでさえ、組み込みのバックグラウンド頻度を有し、
いかなるＤＮＡ分子も宿主配列と再び組み合わさるための相同性をわずかに有し得る。し
かし、これらの組み込み率は非常にわずかであり、通常は臨床的に有意ではない。

例として、パピローマウイルスｏｒｉプラスＥ１タンパク質、またはＥＢＶ ｏｒｉプ
ラスＥＢＮＡ−１、またはヘパドナウイルス末端プラスウイルスポリメラーゼが、通常は
エピソームで維持され得ない異種ウイルスの遺伝子カーゴの一部として付加され得る。こ
の異種ウイルス複製機構をレンチウイルスベクターに組み入れることで、目的の治療遺伝
子を収容し得るおよそ５ｋｂのさらなるカーゴ空間が残る。

さらに、他の制御エレメントを、開示されるＶＩＶ系内に組み入れることができる。例
えば、Ｅ１またはＥＢＮＡ−１またはＨＢＶポリメラーゼの発現は、誘導性プロモーター
によって駆動され得る。多くのタイプの誘導性プロモーターが当技術分野において公知で
あり、本発明の目的では、誘導性プロモーターには、限定はしないが、抗生物質（すなわ
ち、テトラサイクリン、アミノグリコシド、ペニシリン、セファロスポリン、ポリミキシ
ンなど）もしくは他の薬物、銅および他の金属、アルコール、ステロイド、光、酸素、熱
、冷気、または他の物理的もしくは化学的刺激に応答するプロモーターが含まれ得る。例
えば、開示されるウイルス系を使用する方法は、カーゴ遺伝子の発現のための薬物のコン
スタントな供給に依存するテトラサイクリン誘導性の遺伝子発現を採用し得る。誘導性プ
ロモーターを誘導するために使用される化合物は、エピソーム複製の期間および所望のカ
ーゴ送達のタイミングに応じて１回または繰り返して添加され得る。ＤＮＡ複製およびエ
ピソームの維持は、Ｅ１および場合によってはＥ２またはＥＢＮＡ−１の誘導に依存し、
次いで、この誘導は、遺伝子発現の誘導因子（すなわち、テトラサイクリン）に依存する
。ＶＩＶ系の例示的な図解を図１に示す。ＶＩＶ系の別の例示的な図解を図２に示す。図
２に示すように、Ｅ１イニシエータータンパク質が存在し、カーゴはＥＦ１−ＨＴＬＶプ
ロモーター下のＧＦＰである。ＶＩＶ系の別の例示的な図解を図４に示し、この図におい
て、遺伝子カーゴはＣＭＶ／ＧＦＰ発現カセットとして表される。カーゴ遺伝子配列は、
カーゴ遺伝子の５’末端に同一である合成オリゴヌクレオチドプライマー、およびカーゴ
遺伝子の３’末端に相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅され得る。５’プライマーは、エンドヌクレアーゼの
ための認識部位を有するその５’末端から伸長され得る。３’プライマーもまた、エンド
ヌクレアーゼ認識のための相補体を有するその３’末端で伸長され得る。得られた増幅さ
れたカーゴ遺伝子配列は、レンチウイルスベクターなどの適切なベクターにアニーリング
され得る。遺伝子カーゴの非限定的な例には、ＣＭＶ／ＶＥＧＦ、ＣＭＶ／抗上皮増殖因
子受容体（ＥＧＦＲ）、またはｍｉＲＮＡ抑制性Ｃ−Ｃケモカイン受容体５型（ＣＣＲ５
）が含まれる。

カーゴの適切な発現は、適切なアッセイによって判定され得る。例えば、ＤＮＡのコピ
ー数は、定量ＰＣＲによって測定され得る。ベクター１またはベクター１９（本明細書に
おいて記載される）のいずれかから翻訳されたタンパク質産物は、例えば分析用フローサ
イトメトリーによって測定され得る。ＥＬＩＳＡアッセイは、ＶＥＧＦなどの分泌型タン
パク質などのある特定のカーゴの存在を検出するために使用され得る。ウェスタンブロッ
ト技術もまた、抗ＥＧＦＲなどの抗体などのある特定のカーゴを検出するために使用され
得る。さらに、ＣＣＲ５などのケモカイン受容体などのカーゴタンパク質の細胞表面発現
の低減のモニタリングもまた採用され得る。

図１に示すように、開示されるＶＩＶは、目的の少なくとも１つの遺伝子または配列を
含み得る。ＶＩＶに組み入れられる遺伝子または配列は、ＶＩＶの目的に依存する。図１
を参照すると、レンチウイルスがインテグラーゼ欠陥系でパッケージングされるか、また
は形質導入が、インテグラーゼ活性をブロックするために使用される臨床的薬物（例えば
、ドルテグラビルまたはラルテグラビル）の存在下で行われる。組み込みが失敗すると、
直鎖状の二本鎖ベクターＤＮＡは一般的に、宿主の酵素機構を使用して環状化する。薬物
誘導性プロモーターは、必要に応じてＥ１および／またはＥ２タンパク質を発現させるよ
うに活性化され得、これによって次いでＤＮＡ複製を駆動する。治療カーゴはカセットか
ら発現される。様々な実施形態では、誘導性プロモーターを誘導する化合物（本明細書で
は「誘導因子」とも呼ばれる）は、中止されるかまたは停止される。誘導因子の停止は、
Ｅ１および／またはＥ２の合成を下方調節する。さらなる実施形態では、Ｅ１および／ま
たはＥ２の生産は効果的に停止する。いずれの事象においても、これによってエピソーム
ＤＮＡのレベルが低下し、最終的にベクター構築物が排除される。図１および２は、Ｅ１
を含有するＶＩＶ系を示す。図４は、単一のウイルスベクター上にＥ１およびＥ２の両方
を含有するＶＩＶ系を示す。好ましい実施形態では、同一のｍＲＮＡからＥ１およびＥ２
の両方を発現するために、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を付加して、タンパク質
翻訳の再開を可能にする。

例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）をコードする遺伝子が、目的のｓｈＲＮＡ、
ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／または他の遺伝子サイレンシングＲＮＡと共に、遺伝
子として、創傷治癒を促進するために使用されるＶＩＶに組み入れられ得る。開示される
ＶＩＶ系は、発現され得る遺伝子または配列のタイプに限定されない。したがって、開示
されるＶＩＶは、多くの治療的または予防的遺伝子または配列、例えば、感染性疾患また
はがんに関連する抗原（複製している病原体上の抗原、および外因性毒素である抗原、お
よび腫瘍細胞上の抗原を含む）に対する抗体、血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子、
脳由来の増殖因子、神経成長因子、ヒト増殖因子、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、嚢胞性線
維症の膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）、ジストロフィンまたはジストロフィ
ン関連複合体、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、リポタンパク質リパーゼ、α−およ
び／またはβ−サラセミア、因子ＶＩＩＩ、骨形成タンパク質１〜４、シクロオキシゲナ
ーゼ２、血管内皮増殖因子、ケモカイン受容体ＣＣＲ５、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４、
ケモカイン受容体ＣＸＣＲ５、大腸炎、炎症性腸疾患、またはクローン病に関与する自己
免疫抗原に対するアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ、アヘン剤またはアルコールに対する
神経衰弱を調節するｍｉＲＮＡを含む常用癖に関与する低分子干渉ＲＮＡ、腫瘍サプレッ
サー遺伝子、プロアポトーシスまたは抗アポトーシス遺伝子およびプロ自食作用または抗
自食作用遺伝子を含む細胞生存を調節する遺伝子、放射線照射耐性因子をコードする遺伝
子、腫瘍細胞の転移または他の細胞輸送現象の追跡に使用される発光タンパク質をコード
する遺伝子、あるいは、放射線照射、外科手術、もしくは化学療法の最大効果を得るため
に身体を調整して、または放射線照射、外科手術、もしくは化学療法から組織を保護して
、器官の移植を改善するかまたは特に気道における過剰反応性を抑制するべく宿主組織ま
たはグラフト組織を改変するために使用され得る様々な他の治療上有用な配列をコードす
る配列を組み入れ得る。

ＶＩＶ系において遺伝子をエピソーム形態に維持することによって、安全性スイッチが
組み込まれる。遺伝子産物が毒性であれば、誘導因子分子の中止によってＤＮＡ複製が停
止し、エピソーム数はその後減少し、遺伝子およびベクターは消失する。従来の調節型遺
伝子発現と異なり、安全性スイッチとして開示される発現構築物は内因性ヌクレアーゼに
よって分解され、それが効果的に消失するまで細胞分裂によって希釈され、これによって
、あらゆる短期または長期のブレークスルー発現が予防される。

目的の遺伝子、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／または他の遺伝子サイ
レンシングＲＮＡをエピソーム形態に維持することによって、広範囲にわたり、かつ従来
のレンチウイルス形質導入によって達成されるよりもはるかに高いレベルでコピー数を調
節することも可能になる。

開示されるＶＩＶ系は、多くの有益な点を示す。例えば、エピソームＤＮＡは、染色体
改変に対する感受性が低く、これによって、従来の形質導入ベクターの遺伝子サイレンシ
ングが生じ得る。同様に、ＶＩＶエピソームＤＮＡベクターは、少なくとも、約１から約
４ヶ月、および場合によってはそれ以上の短期間から中期間にわたって、活性な遺伝子送
達をサポートする。本発明の他の実施形態では、エピソームＤＮＡベクターは、約１、約
２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、または約１２週間の
期間にわたって、活性な遺伝子送達をサポートする。他の実施形態では、エピソームＤＮ
Ａベクターは、約１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、
９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、またはそれ以上の期間にわたって、活性な遺伝
子送達をサポートする。これらの期間のあらゆる組合せ、例えば、１ヶ月および１週間、
または３ヶ月および２週間もまた、本発明の方法において使用することができる。

開示されるＶＩＶ系の組み込みのためのレンチウイルス担体の使用に特異的に関連する
有益な点があるが、開示される系は、単一のタイプのウイルスベクターに限定されない。
限定はしないが、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、ワ
クシニア、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、ヘパドナウイルス、パルボウイルス、およ
びマウスウイルスを含む、あらゆるＤＮＡウイルスまたはＤＮＡ中間体を使用するウイル
スを、ＶＩＶ複製戦略を組み入れるための担体として使用することができる。

方法
一部の実施形態では、本発明は、それを必要とする患者にＶＩＶベクターを投与する方
法であって、ＶＩＶベクターが少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの
、少なくとも４つの、または少なくとも５つの目的の遺伝子をコードする方法に関する。
多用途性および治療可能性および開示されるＶＩＶ系を考慮すると、本発明のＶＩＶ系は
、限定はしないが、感染性疾患または感染性病原体によって生産される毒素に関連する抗
原に対する抗体、血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子、脳由来の増殖因子、神経成長
因子、ヒト増殖因子、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、嚢胞性線維症の膜貫通コンダクタンス
調節因子（ＣＦＴＲ）、ジストロフィンまたはジストロフィン関連複合体、リポタンパク
質リパーゼ、α−および／またはβ−サラセミア、因子ＶＩＩＩ、骨形成タンパク質１〜
４、シクロオキシゲナーゼ２、血管内皮増殖因子、ケモカイン受容体ＣＣＲ５、ケモカイ
ン受容体ＣＸＣＲ４、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ５、大腸炎、炎症性腸疾患、またはクロ
ーン病に関与する自己免疫抗原に対するアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ、アヘン剤また
はアルコールに対する神経衰弱を調節するｍｉＲＮＡを含む常用癖に関与する低分子干渉
ＲＮＡ、腫瘍サプレッサー遺伝子、プロアポトーシスまたは抗アポトーシス遺伝子および
プロ自食作用または抗自食作用遺伝子を含む細胞生存を調節する遺伝子、放射線照射耐性
因子をコードする遺伝子、腫瘍細胞の転移または他の細胞輸送現象の追跡に使用される発
光タンパク質をコードする遺伝子、あるいは、放射線照射、外科手術、もしくは化学療法
の最大効果を得るために身体を調整して、または放射線照射、外科手術、もしくは化学療
法から組織を保護して、器官の移植を改善するかまたは特に気道における過剰反応性を抑
制するべく宿主組織またはグラフト組織を改変するために使用され得る様々な他の治療上
有用な配列を含む遺伝子または核酸配列をコードし得る。

感染性疾患
開示される組成物および方法は、特に、高リスク地域に一時的に居住している個体に対
する、疾患からの保護を提供し得る。遺伝子療法のための鍵となる標的は、遺伝子産物が
慢性的に発現している場合に、大きなリスクを伴う。１つの例示的な適用は、風土病地域
内を移動する個体（例えば、エボラ感染地域に入る衛生兵および救援隊員）を保護するた
めに必要な、致命的なウイルス性因子に対する防御抗体を含むモノクローナル抗体の予防
的送達である。ワクチンは、エボラもしくはラッサ熱ウイルス、またはデング熱、または
チクングニヤウイルス、またはマラリアの原因であるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｓｐｐ．な
どの疾患についてはほとんど試験されておらず、組み込みベクターの使用を介する予防的
抗体遺伝子の慢性的発現は、未知の健康上のリスクを有する。したがって、高いが一過性
でなくてはならない効果的な抗体発現が医学的に非常に要求されている。開示されるＶＩ
Ｖ系ならびに高いコピー数の目的の遺伝子、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およ
び／または他の遺伝子サイレンシングＲＮＡを限られた期間にわたり送達する方法は、こ
の医学的要求を満たす。

一実施形態では、本発明は、感染性疾患に関連する状態、症候、または副作用を処置、
予防、または最小になる方法に関する。一部の実施形態では、感染性疾患は、ヒト免疫不
全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エボラウイルス、ラッサ熱ウイルス
、デング熱、ジカウイルス、マラリア、結核、狂犬病、ワクシニアウイルス、または他の
感染性疾患であり得る。一部の実施形態では、ＶＩＶベクターは、予防的にまたは感染性
疾患に感染した後に投与され得る。

創傷治癒
別の実施形態では、本発明は、創傷治癒に関連する状態、症候、または副作用を処置、
予防、または最小にする方法に関する。開示される組成物は、全身に、または事故、損傷
、もしくは外科手術後の創傷に直接投与され得る。外科手術のケースでは、ＶＩＶベクタ
ーは、治癒を促進するために予防的に投与され得る。事故、損傷、または外科手術による
創傷のケースでは、ＶＩＶベクターは、創傷形成のある程度後に投与され得る。例えば、
ＶＩＶベクターは、創傷形成の約１、約２、約３、約４、約５、約１０、約１２、約２４
、約３６、約４８、約６０、約７２、約８４、約９６、約１０８、約１２０、または約１
６８時間以内に投与され得る。

本発明の方法および組成物の別の適用は、創傷治癒を加速させる血小板増殖因子を発現
し得るＶＩＶ構築物の一時的送達である。高用量の血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は、
非常に迅速であるが一時的である必要がある。開示される系および方法は、このタイプの
適用に理想的である。

さらなる短期間の適用には、アルコール乱用の断続的処置のための脳由来の増殖因子の
発現、脊髄再生のための神経成長因子、および皮膚状態のための局部適用が含まれる。

骨の疾患または損傷
一実施形態では、開示される発明は、骨損傷を有する対象を識別するステップ、および
治療有効量の本発明に従ったウイルス送達系を対象に投与するステップを含む、骨の治癒
を増強する方法に関する。ウイルス送達系は、ウイルス担体、異種ウイルスエピソーム複
製起点、異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的なイニシエータータンパク質をコード
する配列、ならびに目的の少なくとも１つの遺伝子、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮ
Ａ、および／または他の遺伝子サイレンシングＲＮＡを含み、ここで、ウイルス担体は欠
陥のあるインテグラーゼ遺伝子を有し、異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的なイニ
シエータータンパク質をコードする配列の発現は、誘導性プロモーターの制御下にある。
骨損傷は、事故、損傷、または外科手術によるものであり得、骨の癒合不全または急性骨
折または所要の脊椎固定術であり得る。一部の実施形態では、目的の遺伝子、ｓｈＲＮＡ
、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／または他の遺伝子サイレンシングＲＮＡは、骨形成
タンパク質１〜４またはシクロオキシゲナーゼ−２または血管内皮増殖因子をコードする
。

一実施形態では、開示される発明は、骨疾患を有する対象を識別するステップ、および
治療有効量の本発明に従ったウイルス送達系を対象に投与するステップを含む、骨の治癒
を増強する方法に関する。ウイルス送達系は、ウイルス担体、異種ウイルスエピソーム複
製起点、異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的なイニシエータータンパク質をコード
する配列、ならびに目的の少なくとも１つの遺伝子、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮ
Ａ、および／または他の遺伝子サイレンシングＲＮＡを含み、ここで、ウイルス担体は欠
陥のあるインテグラーゼ遺伝子を有し、異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的なイニ
シエータータンパク質をコードする配列の発現は、誘導性プロモーターの制御下にある。
骨疾患は、例えば、事故、損傷、または外科手術によるものであり得、骨の癒合不全また
は急性骨折または所要の脊椎固定術であり得る。さらに、骨疾患は、低い骨密度、骨への
低い血流量、加齢、遺伝性の状態などであり得る。一部の実施形態では、目的の遺伝子、
ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／または他の遺伝子サイレンシングＲＮＡ
は、骨形成タンパク質１〜４またはシクロオキシゲナーゼ−２または血管内皮増殖因子を
コードする。
遺伝性遺伝子疾患

別の実施形態では、本発明は、遺伝性遺伝子疾患に関連する状態、症候、または副作用
を処置、予防、または最小にする方法に関する。このような遺伝性遺伝子疾患のいくつか
の例を、以下の命名を用いて、突然変異の原因型および関与する染色体と共に、表１に示
す。
Ｐ−点突然変異、または全体が１つの遺伝子内にあるあらゆる挿入／欠失
Ｄ−１つまたは複数の遺伝子の欠失
Ｃ−全染色体の過剰、喪失、またはその両方（染色体異常を参照されたい）
Ｔ−トリヌクレオチド反復障害：遺伝子はその長さを伸長している

現在の遺伝子療法には、遺伝子の欠失、置換、または再シーケンシングを介してゲノム
ＤＮＡを編集する試みが含まれる。当技術分野において公知の様々な遺伝子療法系には、
レンチウイルス形質導入による遺伝物質の送達に依存する、Ｔａｌｅｎ、ＣＲＩＳＰＲ−
Ｃａｓ９、ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼなどが含まれる。しかし、開示される発
明とは異なり、これらの系は、活性な染色体改変系が予想外の部位を改変し得るので、延
長された期間の間細胞内で活性であり続け、がんを含む新たな遺伝子疾患に至る予想外の
結果を有し得る。宿主ＤＮＡの改変に真に実用的な系には、本明細書において開示されて
いる方法などの方法を介する、一過性で良く調節された発現が必要である。

したがって、一実施形態では、開示される発明は、遺伝性遺伝子疾患を有する対象を識
別するステップ、および治療有効量の本発明に従ったウイルス送達系を対象に投与するス
テップを含む、遺伝性遺伝子疾患を処置する方法に関する。ウイルス送達系は、ウイルス
担体、異種ウイルスエピソーム複製起点、異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的なイ
ニシエータータンパク質をコードする配列、ならびに少目的のなくとも１つの遺伝子、ｓ
ｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／または他の遺伝子サイレンシングＲＮＡを
含み、ここで、ウイルス担体は欠陥のあるインテグラーゼ遺伝子を有し、異種ウイルスエ
ピソーム複製起点に特異的なイニシエータータンパク質をコードする配列の発現は、誘導
性プロモーターの制御下にある。遺伝性遺伝子疾患は、例えば、表１に列挙する疾患であ
り得、一部の実施形態では、目的の遺伝子、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およ
び／または他の遺伝子サイレンシングＲＮＡは、表１に列挙する遺伝子の非突然変異型を
コードする。

ガイドＲＮＡ標的配列を開示されるＶＩＶベクターに組み入れることも可能である。ガ
イドＲＮＡは、変異したか、または他の方法で修正を要する宿主ゲノム内の特定部位に遺
伝子編集機構を向けるために使用される配列である。ＶＩＶベクターのカーゴ内にガイド
ＲＮＡを含めることによって、修正を要する染色体セクションの改変が可能になり、同一
の改変がＶＩＶ内で生じて、宿主による分解および／または希釈が加速する。したがって
、本発明のある特定の実施形態では、開示されるウイルス送達系は、ウイルス担体、異種
ウイルスエピソーム複製起点、異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的なイニシエータ
ータンパク質をコードする配列、目的の少なくとも１つの遺伝子、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮ
Ａ、ｍｉＲＮＡ、および／または他の遺伝子サイレンシングＲＮＡ、ならびに少なくとも
１つのガイドＲＮＡを含み、ここで、ウイルス担体は欠陥のあるインテグラーゼ遺伝子を
有し、異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的なイニシエータータンパク質をコードす
る配列の発現は、誘導性プロモーターの制御下にある。

細胞または組織のｅｘ ｖｉｖｏでの改変
別の実施形態では、ＶＩＶベクターは、疾患の治療に使用される細胞または組織を改変
するために使用され得る。細胞には、限定はしないが、リンパ球、幹細胞、上皮細胞、神
経細胞などの一次細胞が含まれ得る。例えば、ＶＩＶベクターは、がん、感染性疾患、ま
たは自己免疫を含む特定疾患に再び向けられるリンパ球を改変するために、かつ遺伝子改
変された細胞の長期的存在が健康上のリスクを有する場合に、使用され得る。例えば、Ｖ
ＩＶベクターは、高レベルの転写産物因子を要する多能性幹細胞を規定された間隔にわた
りプログラムするために、そして組み込まれたウイルスベクターの長期的存在が望ましく
ない場合に、使用され得る。合成皮膚または他の適用に使用され得る上皮細胞は、処置後
の正常組織の機能に有害となりＶＩＶベクターによって最良に送達される栄養因子または
増殖因子の、最初の処置の間の発現を要し得る。

用量および剤形
開示されるＶＩＶベクターは、目的の遺伝子または配列の短期、中期、または長期の発
現、および開示されるベクターのエピソームでの維持を可能にする。したがって、投薬レ
ジメンは、処置される状態および投与方法に基づいて変化し得る。

一実施形態では、ＶＩＶは、必要とする対象に様々な用量で投与され得る。具体的には
、対象は、≧１０^６感染用量（１標的細胞を形質導入するために平均して１用量が必要と
される）で投与され得る。さらに具体的には、対象は、≧１０^７、≧１０^８、≧１０^９、
または≧１０^１０感染用量で投与され得る。ＶＩＶ投薬の上限は疾患適応症ごとに決定さ
れ、個々の製品または製品ロットについての毒性／安全性プロファイルに基づく。

さらに、本発明のＶＩＶは、１日に１回または２回投与され得る。あるいは、ＶＩＶは
、必要とする対象に１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、１ヶ月に１回、１ヶ月
おき、３ヶ月おき、６ヶ月おき、９ヶ月おき、１年に１回、１８ヶ月おき、２年おき、３
６ヶ月おき、または３年おきに投与され得る。

一実施形態では、ＶＩＶは医薬組成物として投与される。一実施形態では、ＶＩＶを含
む医薬組成物は、臨床適用のために、広範な、経鼻、肺、経口、局所的、または非経口剤
形で製剤化され得る。剤形のそれぞれは、様々な崩壊剤、界面活性剤、充填剤、増粘剤、
結合剤、湿潤剤などの希釈剤、または他の薬学的に許容される賦形剤を含有し得る。ＶＩ
Ｖを含む医薬組成物はまた、注射のために処方され得る。

ＶＩＶ組成物は、鼻腔内投与、バッカル投与、舌下投与、経口投与、直腸投与、眼投与
、非経口（静脈内、皮内、筋肉内、皮下、大槽内、腹腔内）投与、肺投与、膣内投与、局
所的投与、局所的投与、瘢痕化後の局部所的投与、エアロゾルを介するまたはバッカルも
しくは経鼻スプレー製剤を介する粘膜投与などの、あらゆる薬学的に許容される方法を使
用して投与され得る。

さらに、ＶＩＶ組成物は、固体剤形、錠剤、丸剤、トローチ剤、カプセル剤、液体分散
剤、ゲル剤、エアロゾル剤、肺エアロゾル剤、鼻エアロゾル剤、軟膏剤、クリーム剤、半
固体剤形、および懸濁剤などの、あらゆる薬学的に許容される剤形に製剤化され得る。さ
らに、組成物は、制御放出製剤、持続放出製剤、即時放出製剤、またはそのあらゆる組合
せであり得る。さらに、組成物は経皮送達系であり得る。

別の実施形態では、ＶＩＶを含む医薬組成物は、経口投与のための固体剤形に製剤化さ
れ得、固体剤形は、粉末剤、顆粒剤、カプセ剤ル、錠剤剤、またはピル剤であり得る。さ
らに別の実施形態では、固体剤形は、炭酸カルシウム、デンプン、ショ糖、乳糖、微晶質
セルロース、またはゼラチンなどの１つまたは複数の賦形剤を含み得る。さらに、固体剤
形は、賦形剤に加えて、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤を含み得る
。一部の実施形態では、経口剤形は、即時放出または改変された放出形態であり得る。改
変された放出剤形には、制御または延長放出、腸溶性放出などが含まれる。改変された放
出剤形で使用される賦形剤は、当業者に一般に公知である。

さらなる実施形態では、ＶＩＶを含む医薬組成物は、舌下またはバッカル剤形として製
剤化され得る。このような剤形は、舌下錠剤または舌の下に投与される溶液組成物、およ
び頬と歯茎との間に置かれるバッカル錠剤を含む。

なおさらなる実施形態では、ＶＩＶを含む医薬組成物は、経鼻剤形として製剤化され得
る。本発明のこのような剤形は、鼻送達のための溶液剤、懸濁剤、およびゲル組成物を含
む。

一実施形態では、医薬組成物は、経口投与のための液体剤形、例えば、懸濁剤、エマル
ジョン剤、またはシロップ剤に製剤化され得る。他の実施形態では、液体剤形は、水およ
び液体パラフィンなどの一般に使用される単純な希釈剤に加えて、湿潤剤、甘味料、香料
、または防腐剤などの様々な賦形剤を含み得る。特定の実施形態では、ＶＩＶを含む組成
物またはその薬学的に許容される塩は、小児患者への投与に適するように製剤化され得る
。

一実施形態では、医薬組成物は、無菌水溶液剤、懸濁剤、エマルジョン剤、非水性溶液
剤、または坐剤などの、非経口投与のための剤形に製剤化され得る。他の実施形態では、
非水性溶液剤または懸濁剤には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリ
ーブオイルなどの植物油、またはオレイン酸エチルなどの注射可能なエステルが含まれ得
る。坐剤の基材として、ウイテプゾール、マクロゴール、ｔｗｅｅｎ ６１、カカオ油、
ラウリン油、またはグリセリン化されたゼラチンを使用することができる。

医薬組成物の投薬は、患者の体重、年齢、性別、投与の時間および態様、排出速度、な
らびに疾患の重症度に応じて変化し得る。

定義
本明細書で具体的に定義されない語は、当業者によって理解される意味と同じ意味を有
すると理解される。

本明細書において使用する場合、用語「約」は当業者によって理解され、それが使用さ
れる文脈に応じてある程度変化する。その用語が使用される文脈を考慮しても当業者に自
明でない用語が使用される場合には、「約」は、具体的な用語のプラスまたはマイナス１
０％までを意味する。

「処置」は、病状を標的化しそれと戦う、すなわち病状を改善または予防することを意
味する。特定の処置はこうして、標的化される病状、ならびに薬物療法および治療的アプ
ローチの現在または将来の状態に応じる。処置は毒性を伴い得る。

活性物質「の投与」または活性物質「を投与する」という用語は、本発明の活性物質を
、治療上有用な形態および治療有効量で個体の体内に導入し得る形態で、処置を必要とす
る対象に提供することを意味する。

用語「治療有効量」は、および所与の病気、損傷、疾患、または状態を患っている患者
において見られる合併症の症候、進行、または発病を処置または予防するために適切な組
成物内の、かつ適切な剤形の、十分な量の本発明の活性物質を差す。治療有効量は、患者
の状態またはその重症度、および処置される対象の年齢、体重などに応じて変化する。治
療有効量は、例えば、投与経路、対象の状態、および当業者によって理解されている他の
因子を含む、多くの因子のいずれかに応じて変化し得る。

用語「処置」または「処置すること」は、概して、処置されている対象の自然経過を改
変するための試みへの介入を指し、予防のためまたは臨床病理学の経過の間に行われ得る
。所望の効果には、限定はしないが、疾患の発生または再発を予防すること、症候を軽減
すること、疾患のあらゆる直接的なまたは間接的な病理学的結果を抑制すること、弱める
こと、または阻害すること、病状を改善または緩和すること、および寛解または予後の改
善を生じさせることが含まれる。

用語「個体」、「宿主」、「対象」、および「患者」は、本明細書では区別せずに使用
される。

本明細書において使用する場合、「発現」、「発現した」、または「コードする」は、
ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡ
がその後、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。
発現には、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシング、または他の形態の転写後改変も
しくは翻訳後改変が含まれ得る。

以下の実施例は、本発明を説明するために提供される。しかし、本発明はこれらの実施
例において記載されている具体的な条件または詳細に限定されない。本明細書で参照され
る全ての発行された刊行物は、参照によって具体的に組み入れられる。

（実施例１）
感染性疾患の処置におけるＶＩＶの使用
この実施例は、図１に例示される非限定的な例によって実証されるように、エボラウイ
ルスまたは他の感染性疾患の処置における開示されるＶＩＶの使用を実証する。この実施
例において、図１に示す「カーゴ」領域の少なくとも１つは、エボラウイルスを特異的に
標的とする抗体をコードする。

エボラを有する疑いがあるかまたはエボラを有すると診断された対象に、エボラウイル
スを特異的に標的とする抗体をコードする治療有効量のＶＩＶを、単独で、またはエボラ
を処置もしくは予防するための１つもしくは複数のさらなる作用物質と組み合わせて投与
する。エボラウイルスを特異的に標的とする抗体をコードするＶＩＶおよび／またはさら
なる作用物質を、当技術分野において公知のまたは本明細書において記載される方法に従
って、経口により、鼻腔内に、髄腔内に、眼内に、皮内に、経粘膜的に、イオン泳動的に
、局所的に、全身に、静脈内に、皮下に、腹腔内に、または筋肉内に投与する。対象を、
限定はしないが、例えば、発熱、疲労、倦怠感、衰弱、目の赤み、関節および筋肉痛、頭
痛、吐き気、嘔吐、出血、ならびに死亡を含むエボラに関連する徴候および症候の存在お
よび／または重症度について毎日評価する。処置は、エボラの１つまたは複数の徴候また
は症候が改善または排除されるような時間まで維持する。

エボラを有する疑いがあるかまたはエボラを有すると診断され、エボラウイルスを特異
的に標的とする抗体をコードする治療有効量のＶＩＶを投与されている対象が、重症度の
低減またはエボラに関連する１つもしくは複数の症候の排除を示すことは、合理的に予測
される。さらに、エボラウイルスを特異的に標的とする抗体をコードするＶＩＶを１つま
たは複数のさらなる作用物質と組み合わせて投与することが付加的または相乗的な効果を
有することが予想される。

これらの結果は、エボラウイルスを特異的に標的とする抗体をコードするＶＩＶがエボ
ラまたは他の感染性疾患の処置において有用であることを示す。したがって、感染性抗原
を特異的に標的とする抗体をコードするＶＩＶは、感染性疾患の処置のためにそれを必要
とする対象にＶＩＶを投与することを含む方法において有用である。

（実施例２）
感染性疾患の予防におけるＶＩＶの使用
この実施例は、図１に例示される非限定的な例によって実証されるように、エボラウイ
ルスまたは他の感染性疾患の予防における開示されるＶＩＶの使用を実証する。この実施
例において、図１に示す「カーゴ」領域の少なくとも１つは、エボラウイルスを特異的に
標的とする抗体をコードする。

エボラに罹患するリスクが増大している疑いがある対象に、エボラウイルスを特異的に
標的とする抗体をコードする予防有効量のＶＩＶを、単独で、またはエボラを処置もしく
は予防するための１つもしくは複数のさらなる作用物質と組み合わせて、エボラに罹患す
るリスクが増大している区域に入る前に投与する。エボラウイルスを特異的に標的とする
抗体をコードするＶＩＶおよび／またはさらなる作用物質を、当技術分野において公知の
または本明細書において記載される方法に従って、経口的に、鼻腔内に、髄腔内に、眼内
に、皮内に、経粘膜的に、イオン泳動的に、局所的に、全身に、静脈内に、皮下に、腹腔
内に、または筋肉内に投与する。対象を、限定はしないが、例えば、発熱、疲労、倦怠感
、衰弱、目の赤み、関節および筋肉痛、頭痛、吐き気、嘔吐、出血、ならびに死亡を含む
エボラに関連する徴候および症候の存在および／または重症度について毎日評価する。処
置は、エボラの１つまたは複数の徴候または症候が予防されるような時間まで維持する。

エボラを有する疑いがあるかまたはエボラを有すると診断され、エボラウイルスを特異
的に標的とする抗体をコードする予防有効量のＶＩＶを投与されている対象の、エボラに
罹患するリスクが低減することは、合理的に予測される。さらに、エボラウイルスを特異
的に標的とする抗体をコードするＶＩＶを１つまたは複数のさらなる作用物質と組み合わ
せて投与することがこの点に関して付加的または相乗的な効果を有することが予想される
。

これらの結果は、エボラウイルスを特異的に標的とする抗体をコードするＶＩＶがエボ
ラまたは他の感染性疾患の予防において有用であることを示す。したがって、感染性抗原
を特異的に標的とする抗体をコードするＶＩＶは、感染性疾患の予防のためにそれを必要
とする対象にＶＩＶを投与することを含む方法において有用である。

（実施例３）
創傷治癒の増強のためのＶＩＶの使用
この実施例は、図１に例示される非限定的な例によって実証されるように、創傷治癒の
増強のための開示されるＶＩＶの使用を実証する。この実施例において、図１に示す「カ
ーゴ」領域の少なくとも１つは、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）をコードする。

創傷（例えば、事故、損傷、または外科手術による）を有する対象に、血小板由来増殖
因子（ＰＤＧＦ）をコードする治療有効量のＶＩＶを、単独で、または創傷を処置もしく
は滅菌するための１つもしくは複数のさらなる作用物質と組み合わせて投与する。ＶＩＶ
ＰＤＧＦおよび／またはさらなる作用物質を、当技術分野において公知のまたは本明細
書において記載される方法に従って、経口的に、鼻腔内に、髄腔内に、眼内に、皮内に、
経粘膜的に、イオン泳動的に、局所的に、全身に、静脈内に、皮下に、腹腔内に、または
筋肉内に投与する。対象を、創傷の状態を判定するために毎日評価する。処置は、創傷が
治癒し、瘢痕化が最小になるような時間まで維持する。

創傷を有し、治療有効量のＶＩＶ ＰＤＧＦを投与されている対象が、創傷治癒の増強
を示すことは、合理的に予測される。さらに、ＰＤＧＦをコードするＶＩＶを１つまたは
複数のさらなる作用物質と組み合わせて投与することが付加的または相乗的な効果を有す
ることが予想される。

これらの結果は、ＰＤＧＦをコードするＶＩＶが創傷治癒の増強に有用であることを示
す。したがって、ＰＤＧＦをコードするＶＩＶまたは類似の遺伝子は、創傷の処置のため
にそれを必要とする対象にＶＩＶを投与することを含む方法において有用である。

（実施例４）
骨損傷の処置におけるＶＩＶの使用
この実施例は、図１に例示される非限定的な例によって実証されるように、骨損傷の処
置における開示されるＶＩＶの使用を実証する。この実施例において、図１に示す「カー
ゴ」領域の少なくとも１つは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）をコードする。

骨損傷を有する疑いがあるかまたは骨損傷を有すると診断された対象に、血管内皮増殖
因子（ＶＥＧＦ）をコードする治療有効量のＶＩＶを、単独で、または骨損傷を処置する
ための１つもしくは複数のさらなる作用物質と組み合わせて投与する。ＶＥＧＦをコード
するＶＩＶおよび／またはさらなる作用物質を、当技術分野において公知のまたは本明細
書において記載される方法に従って、経口的に、鼻腔内に、髄腔内に、眼内に、皮内に、
経粘膜的に、イオン泳動的に、局所的に、全身に、静脈内に、皮下に、腹腔内に、または
筋肉内に投与する。対象を、骨損傷に関連する徴候および症候の存在および／または重症
度について毎週評価して、治癒の速度および強さを判定する。処置は、骨が治癒するよう
な時間まで維持する。

骨損傷を有する疑いがあるかまたは骨損傷を有すると診断され、ＶＥＧＦをコードする
治療有効量のＶＩＶを投与されている対象が、損傷の重症度の低減および治癒の増強を示
すことは、合理的に予測される。さらに、ＶＥＧＦをコードするＶＩＶを１つまたは複数
のさらなる作用物質と組み合わせて投与することが付加的または相乗的な効果を有するこ
とが予想される。

これらの結果は、ＶＥＧＦをコードするＶＩＶが骨の損傷または疾患の処置において有
用であることを示す。したがって、ＶＥＧＦをコードするＶＩＶまたは類似の遺伝子は、
骨の損傷または疾患の処置のためにそれを必要とする対象にＶＩＶを投与することを含む
方法において有用である。

（実施例５）
遺伝性疾患の処置におけるＶＩＶの使用
この実施例は、図１に例示される非限定的な例によって実証されるように、嚢胞性線維
症（ＣＦ）または他の遺伝性遺伝子疾患の処置における開示されるＶＩＶの使用を実証す
る。この実施例において、図１に示す「カーゴ」領域の少なくとも１つは、嚢胞性線維症
の膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）をコードする。

（ＣＦ）を有する疑いがあるかまたは（ＣＦ）を有すると診断された対象に、嚢胞性線
維症の膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）をコードする治療有効量のＶＩＶを、
単独で、またはＣＦを処置するための１つもしくは複数のさらなる作用物質と組み合わせ
て投与する。ＣＦＴＲをコードするＶＩＶおよび／またはさらなる作用物質を、当技術分
野において公知のまたは本明細書において記載される方法に従って、経口的に、鼻腔内に
、髄腔内に、眼内に、皮内に、経粘膜的に、イオン泳動的に、局所的に、全身に、静脈内
に、皮下に、腹腔内に、または筋肉内に投与する。対象を、限定はしないが、例えば、成
長不良、持続性の咳、濃い喀痰および粘液、喘鳴、息切れ、運動能力の低下、肺感染の反
復、鼻孔の炎症、油っぽい便、腸閉塞、ならびに体重増加不良を含むＣＦに関連する徴候
および症候の存在および／または重症度について毎週評価する。処置は、ＣＦの１つまた
は複数の徴候または症候が改善または排除されるような時間まで維持する。

ＣＦを有する疑いがあるかまたはＣＦを有すると診断され、ＣＦＴＲをコードする治療
有効量のＶＩＶを投与されている対象が、重症度の低減またはＣＦに関連する１つもしく
は複数の症候の排除を示すことは、合理的に予測される。さらに、ＣＦＴＲをコードする
ＶＩＶを１つまたは複数のさらなる作用物質と組み合わせて投与することが付加的または
相乗的な効果を有することが予想される。

これらの結果は、ＣＦＴＲをコードするＶＩＶがＣＦまたは他の遺伝性遺伝子疾患の処
置において有用であることを示す。したがって、遺伝子疾患に関連する突然変異したまた
は他の方法で欠陥のある遺伝子をコードするＶＩＶは、遺伝子疾患の処置のためにそれを
必要とする対象にＶＩＶを投与することを含む方法において有用である。

（実施例６）
カーゴを発現させるためのＥ１を含有するＶＩＶの使用
緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）をカーゴとして含有する図２に従ったベクターを
作製した。ヒトパピローマウイルス１６型（ＮＣＢＩ受託番号Ｕ８９３４８）の完全な遺
伝子座制御領域およびＥ１タンパク質を含有するＤＮＡを化学的に合成した。個々のセグ
メントおよび／またはコード配列を最初に合成した。これらを、緑色蛍光タンパク質遺伝
子の５’末端に同一であ合成オリゴヌクレオチドプライマー、そして緑色蛍光タンパク質
の３’末端に相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）によって増幅した。５’プライマーは、ＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩエン
ドヌクレアーゼのための認識部位を有するその５’末端から伸長した。３’プライマーは
、ＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼ認識部位の相補体を有するその３’末
端で伸長した。次いで、得られた増幅された緑色蛍光タンパク質遺伝子配列をＢａｍＨＩ
およびＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。

レンチウイルスベクターは、Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃから入手
した。プラスミドをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ酵素で切断し、過剰に増幅した緑色蛍光
タンパク質遺伝子配列と、インサート対ベクターが１：３の比率で混合した。

次いで、酵素活性を摂氏７０度で２０分の熱不活化によって停止させた。上記の混合物
を室温まで冷却し、アニーリングを可能にした。

アニーリング反応は、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて、３０分、室
温で行った。２．５マイクロリットルの得られたライゲーション混合物を、２５マイクロ
リットルのＳＴＢＬ３コンピテント細菌細胞に添加した。

次いで、トランスフェクションを摂氏４２度での簡単な（１分）熱ショックによって行
った。

細菌細胞を、アンピシリンを含有する寒天プレート上にストリークして、細菌培養物を
得た。これらの培養物をＬｕｒｉａ培養液内で増殖させた。

増幅した緑色蛍光タンパク質遺伝子配列の、レンチウイルスベクターパッケージングプ
ラスミド内への挿入を確認するために、ＤＮＡを上記の細菌培養物から抽出し、標準的な
方法によって精製した。精製したＤＮＡを、構築物を作製するために使用した同一のエン
ドヌクレアーゼで消化した。断片の長さをアガロースゲル電気泳動によって分析し、増幅
した緑色蛍光タンパク質遺伝子配列を、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ ＬＬ
Ｃから入手した特異的プライマーを使用してＤＮＡシーケシングによって検証した。

レンチウイルスベクターストックを以下のように作製した。少なくとも２つのレンチウ
イルスパッケージングプラスミドプラスカーゴプラスミドを、ウイルス遺伝子およびゲノ
ムＲＮＡを発現させるＨＥＫ細胞にコトランスフェクトし、インテグラーゼ欠損レンチウ
イルス粒子内にアセンブルし、そして培養培地内に放出させた。無細胞上清を、トランス
フェクション後３〜１０日の間隔をあけて生成および回収した。レンチウイルス粒子を、
遠心分離、一時的なフロー濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、サイズ排除濾過、また
はイオン交換クロマトグラフィーを含み得る方法の組合せを含む標準的手順によって精製
した。各ストックについての濃度および生物学的活性（ｍｌ当たりの形質導入単位数）を
判定した。

２９３Ｔ細胞を含む哺乳動物細胞を、レンチウイルス由来エピソームの形成、コピー数
、および発現を試験するために使用した。２９３Ｔ細胞に、インテグラーゼ欠損レンチウ
イルス粒子を、ポリブレンの存在下で、１から１０の範囲の感染多重度で形質導入した。
吸収されなかったウイルスを、適用の３時間後に細胞を洗浄することによって除去し、細
胞を３日間培養した。細胞を蛍光顕微鏡で観察し、ＧＦＰを発現している細胞を計数する
。形質導入されなかった２９３Ｔ細胞を陰性対照として使用した。データを、培養物中の
生存細胞１００個当たりのＧＦＰ陽性細胞として報告した。最少３００個の細胞を顕微鏡
視野当たりで計数し、５〜１０の視野を各複製実験で計数する。１つの陰性対照および３
つの複製実験を含む４つの独立した形質導入実験を行って、形質導入された細胞の頻度を
判定した。データは図３に示され、３つの複製実験にわたるＧＦＰの発現を示す。

（実施例７）
カーゴを発現するためのＥ１およびＥ２を含有するＶＩＶの使用
図４に示すように、ベクター１９を、Ｅ１およびＥ２イニシエータータンパク質の両方
を含有するように構築する。この実施例において、遺伝子カーゴはＣＭＶ／ＧＦＰ発現カ
セットによって表され、適切な誘導性プロモーターをまた、誘導性プロモーターを誘導し
得る化合物を外部から添加できるように選択する。

２９３Ｔ細胞に、ベクター１９を、細胞当たり１から２０の間の範囲の形質導入単位の
感染多重度で形質導入する。３時間後、細胞を、吸着されなかったビリオンを除去するた
めに培地で洗浄し、培養物に戻す。形質導入の１２〜２４時間後、細胞を、誘導性プロモ
ーターを誘導し得る少なくとも１投薬量の化合物で処理する。誘導性プロモーターを誘導
し得る化合物を添加すると、Ｅ１およびＥ２のｍＲＮＡがエピソームから転写され、遺伝
子座制御領域断片２（ＬＣＲ／Ｆ２）に組み合わされ、そしてアセンブリされて、ＤＮＡ
複製が引き起こされる。レンチウイルス由来のエピソームは、プロモーター誘導の停止の
およそ２４〜３６時間後に崩壊し始める。ベクター１９内のカーゴからのタンパク質生成
物を、分析用フローサイトメトリーによって測定する。

本発明のある特定の好ましい実施形態を本明細書において記載し、具体的に例示してき
たが、本発明がこのような実施形態に限定されることを意図してはいない。これに対する
様々な修正が、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく行われ得る。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
（ａ）欠陥のあるインテグラーゼ遺伝子を有するウイルス担体、
（ｂ）異種ウイルスエピソーム複製起点、
（ｃ）異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータ
ンパク質をコードする配列であって、前記異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的な少
なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列の発現が誘導性プロモーター
の制御下にある、配列、および
（ｄ）目的の少なくとも１つの遺伝子、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または
他の遺伝子サイレンシングＲＮＡ
を含むウイルス送達系。
（項目２）
前記ウイルス担体がレンチウイルスである、項目１に記載のウイルス送達系。
（項目３）
前記異種ウイルスエピソーム複製起点がパピローマウイルスに由来する、項目１に記載
のウイルス送達系。
（項目４）
前記異種ウイルスエピソーム複製起点がウシパピローマウイルスに由来する、項目３に
記載のウイルス送達系。
（項目５）
前記異種ウイルスエピソーム複製起点がヒトパピローマウイルスに由来する、項目３に
記載のウイルス送達系。
（項目６）
前記異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータン
パク質がＥ１である、項目１に記載のウイルス送達系。
（項目７）
前記異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータン
パク質がＥ２である、項目１に記載のウイルス送達系。
（項目８）
前記異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的な２つのイニシエータータンパク質を含
む、項目１に記載のウイルス送達系。
（項目９）
前記異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的な前記２つのイニシエータータンパク質
がＥ１およびＥ２である、項目８に記載のウイルス送達系。
（項目１０）
前記異種ウイルスエピソーム複製起点がエプスタイン・バーウイルスに由来する、項目
１に記載のウイルス送達系。
（項目１１）
前記異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的なイニシエータータンパク質がＥＢＮＡ
−１である、項目１０に記載のウイルス送達系。
（項目１２）
項目１に記載の前記ウイルス送達系および少なくとも１つの薬学的に許容される担体を
含む医薬組成物。
（項目１３）
（ａ）疾患の処置または予防を必要とする対象を識別するステップ、および
（ｂ）治療有効量のウイルス送達系を対象に投与するステップ
を含む、疾患を処置または予防する方法であって、前記ウイルス送達系が、
（ｉ）欠陥のあるインテグラーゼ遺伝子を有するウイルス担体、
（ｉｉ）異種ウイルスエピソーム複製起点、
（ｉｉｉ）異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエー
タータンパク質をコードする配列であって、前記少なくとも１つのイニシエータータンパ
ク質をコードする配列の発現が誘導性プロモーターの制御下にある、配列、および
（ｉｖ）目的の少なくとも１つの遺伝子、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ま
たは他の遺伝子サイレンシングＲＮＡ
を含む、方法。
（項目１４）
前記疾患が感染性疾患である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記感染性疾患がエボラウイルスまたはラッサ熱ウイルスである、項目１４に記載の方
法。
（項目１６）
前記目的の遺伝子、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他の遺伝子サイレン
シングＲＮＡが、エボラウイルスまたはラッサ熱ウイルスに特異的な抗体をコードする、
項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記疾患が遺伝子疾患または障害である、項目１３に記載の方法。
（項目１８）
前記遺伝子疾患がアルコール乱用である、項目１３に記載の方法。
（項目１９）
前記目的の遺伝子、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他の遺伝子サイレン
シングＲＮＡが、脳由来の増殖因子をコードする、項目１３に記載の方法。
（項目２０）
（ａ）神経損傷を有する対象を識別するステップ、および
（ｂ）治療有効量のウイルス送達系を対象に投与するステップ
を含む、神経損傷を処置する方法であって、前記ウイルス送達系が、
（ｉ）欠陥のあるインテグラーゼ遺伝子を有するウイルス担体、
（ｉｉ）異種ウイルスエピソーム複製起点、
（ｉｉｉ）異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエー
タータンパク質をコードする配列であって、前記少なくとも１つのイニシエータータンパ
ク質をコードする配列の発現が誘導性プロモーターの制御下にある、配列、および
（ｉｖ）目的の少なくとも１つの遺伝子、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ま
たは他の遺伝子サイレンシングＲＮＡ
を含む、方法。
（項目２１）
前記目的の遺伝子、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他の遺伝子サイレン
シングＲＮＡが神経成長因子である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
（ａ）創傷を有する対象を識別するステップ、および
（ｂ）治療有効量のウイルス送達系を対象に投与するステップ
を含む、創傷治癒を増強する方法であって、前記ウイルス送達系が、
（ｉ）欠陥のあるインテグラーゼ遺伝子を有するウイルス担体、
（ｉｉ）異種ウイルスエピソーム複製起点、
（ｉｉｉ）異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエー
タータンパク質をコードする配列であって、前記少なくとも１つのイニシエータータンパ
ク質をコードする配列の発現が誘導性プロモーターの制御下にある、配列、および
（ｉｖ）少なくとも１つの目的の遺伝子、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ま
たは他の遺伝子サイレンシングＲＮＡ
を含む、方法。
（項目２３）
前記目的の遺伝子、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他の遺伝子サイレン
シングＲＮＡが血小板由来増殖因子または血管内皮増殖因子である、項目２２に記載の方
法。
（項目２４）
前記創傷が事故または損傷によるものである、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記創傷が外科手術によるものである、項目２２に記載の方法。
（項目２６）
前記創傷が火傷である、項目２２に記載の方法。
（項目２７）
前記創傷が骨の癒合不全である、項目２２に記載の方法。

Claims (1)

1. 明細書に記載の発明。

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