CN113582864B - Prmti型甲基转移酶抑制活性化合物及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有PRMT I型甲基转移酶抑制活性的化合物及其制备与应用，所述化合物具有式I所示的结构；本发明的式I化合物对PRMT I型甲基转移酶具有较好的抑制作用，对PRMT II型甲基转移酶抑制作用较弱，并且对正常细胞影响较小，具有更低的毒副作用，I。

Description

PRMTI型甲基转移酶抑制活性化合物及其制备与应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种具有PRMT I型甲基转移酶抑制活性的化合物及其制备与应用。
背景技术
PRMT s家族中包括的蛋白质在生物体之间进行进化保护，50多年前，Paik等在核胸腺提取物中发现了精氨酸甲基化修饰，并在1968年纯化出具有活性的精氨酸甲基转移酶。后来，从小牛大脑、大鼠肝脏和不同的细胞系中陆续发现并纯化了不同的家庭成员，但直到1990年代中期PRMT1的克隆才引起人们对这种翻译后修饰的兴趣。与其他PTM相比，进展相对缓慢，这主要是由于缺乏可靠的精氨酸甲基抗体和有效的小分子抑制剂，这些物质使基质的检测受阻，并无法分析甲基化对生物事件的影响。然而，多年的蛋白质组学研究方法与细胞生物学和鼠类组织特异性基因敲除分析相结合，继续揭示出精氨酸甲基化在mRNA剪接，DNA损伤反应，干细胞功能和免疫反应等方面的重要性，特别是对于癌症发病机理。在人类中，已经根据主要蛋白质序列的差异以及对不同底物的特异性，鉴定出11种PRMT蛋白。除了PRMT10和PRMT11，该家族的所有其余蛋白质均具有酶促和精氨酸的甲基化活性。
在多种肿瘤组织中，可以观察到PRMTs的过表达。如PRMT1是混合谱系白血病（mLL）转录复合体的重要组成部分，而且对急性髓细胞性白血病（AmL）有明显的调节作用。另外值得一提的是，在病灶组织中也会观察到PRMTs亚型的异常表达。Jocelyn课题组在2007年的报道证实了，PRMT1基因的前mRNA的5′端通过选择性剪接可产生七种不同的PRMTs亚型（PRMT1v1-v7）。研究证实了最广泛分布的PRMT1v1在结肠癌组织中明显过表达。而乳腺癌组织中，PRMT1v2含量最多，并且有促进乳腺癌细胞的存活和侵袭性的作用。
近些年来，越来越多的研究指出PRMTs在病理组织中的异常表达。已经发现的PRMTs异常表达的病灶包括病毒相关疾病，炎症反应，心血管疾病，肾脏疾病，糖尿病，肺部疾病和癌症。从病理学角度，精氨酸甲基化水平可以作为一些病症的生物标志物。例如，ADMA的数量与心血管疾病呈明显相关性；而对于前列腺癌患者，H4R3的甲基化程度可预测前列腺癌复发的可能性。
专利201710348647.7中公开了一种PRMT I型抑制剂及其制备方法和用途，其中提及PRMTⅠ型甲基转移酶异常相关疾病包括癌症、心血管疾病、神经退行性疾病、疟疾、艾滋病、痛风、糖尿病、肾功能衰竭、慢性肺部疾病、眼咽肌营养不良、可卡因成瘾、肺动脉高压疾病、肌萎缩侧索硬化症、酒精性肝硬化失代偿症等，但是专利201710348647.7中的化合物，由于两个环之间仅间隔了一个杂原子X，所述X为-O-、-S-等，环之间的距离较近，且刚性强，使得化合物虽然对PRMTⅠ型甲基转移酶具有一定的抑制活性，但具有毒副作用大的缺陷。
发明内容
本发明提供一种具有PRMT I型甲基转移酶抑制活性的化合物，对PRMT I型甲基转移酶具有较好的抑制活性，且对正常细胞影响较小，具有较低的毒副作用。
具体地，本发明提供一种式I化合物，其异构体、其外消旋体、或其药学上可接受的盐；
所述式I化合物为：
I
其中，
X1选自-O-或-S-，优选-O-；
R1为取代或非取代的C3-12环烷基、取代或非取代的非芳香性C3-6杂环基、取代或非取代的C6-12芳基或取代或非取代的5-10元杂芳基；C3-12环烷基优选为环己基、环戊基或环庚基、环辛基；C6-12芳基优选为苯基或萘；
L1为-[C(R6)2]a-、-CO-；
L2为-[C(R6)2]b-、-CO-；
L3为-[C(R6)2]c-、-CO-；
a、b、c为0、1、2、3、4或5；所述a优选为1，所述b优选为1，所述c优选为2；
R2、R3、R4、R5、R6分别独立的选自H、卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、C1-12烷基、卤代C1-12烷基、C1-12烷氧基、C1-12烷硫基、C1-12烷氧羰基、硫代C1-12烷基、C3-12环烷基、氧代基、C2-6酯基、C2-6酰基、C2-6酰胺基、羧基、C6-12芳基、5-10元杂芳基；
R2、R3、R4、R5或R6可以进一步被一个、二个或三个 R7取代；
R7分别独立的选自H、卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、C1-12烷基、卤代C1-12烷基、C1-12烷氧基、C1-12烷硫基、C1-12烷氧羰基、硫代C1-12烷基、C3-12环烷基、氧代基、C2-6酯基、C2-6酰基、C2-6酰胺基、羧基、C6-12芳基、5-10元杂芳基；
任选地，任意两个R2、任意两个R6或R4与R5可连接形成环；
在一些具体实施方案中，所述R1为或/>；
所述R1为优选为、/>或/>；
R8、R9分别独立的选自H、卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、C1-12烷基、卤代C1-12烷基、C1-12烷氧基、C1-12烷硫基、C1-12烷氧羰基、硫代C1-12烷基、C3-12环烷基、氧代基、C2-6酯基、C2-6酰基、C2-6酰胺基、羧基、C6-12芳基、5-10元杂芳基；
R8或R9可以进一步被一个、二个或三个 R7取代；
在一些具体实施方案中，所述式I化合物为式(II)化合物或式(III)化合物：
/>
II III；
所述式I化合物优选为式(II-1)化合物或式(III-1)化合物：
II-1 III-1；
在一些具体实施方案中：
所述X1为O；
和/或，
所述R2为H；
和/或，
所述R6为H；
和/或，
所述R3为甲基；
和/或，
所述R4为H或甲基；
和/或，
所述R9为H；
和/或，
为/>、/>或/>；/>优选为/>、或/>；
具体地，本发明所述的式I化合物可为：
或 ；
本发明还提供一种上述式I化合物，其异构体、其外消旋体、或其药学上可接受的盐的制备方法，所述式I化合物为式(I-1)化合物，所述制备方法包括以下步骤：
a) 式1所示的化合物与2所示化合物反应得到式I-1所示的化合物；
其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、X1、L1、L3的定义如权利要求1-5任一项所述；
任选地，所述制备方法中还包括脱保护的步骤；
本发明还涉及一种制备式I-1化合物的中间体，如式1所示的化合物，所述式1所示的化合物结构式如下：
其中，R1、R2、R6、X1、L1的定义如上所述；
本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含：本发明式I化合物，其异构体、其外消旋体、或其药学上可接受的盐作为药物活性成分和药学上可接受的载体；
本发明还涉及一种式I化合物，其异构体、其外消旋体、或其药学上可接受的盐的应用，例如可用于制备治疗PRMTⅠ型甲基转移酶异常相关疾病的药物，所述PRMTⅠ型甲基转移酶优选为PRMT1、PRMT3、PRMT4、PRMT6、PRMT8中的一种或多种；
所述PRMTⅠ型甲基转移酶异常相关疾病选自：癌症、心血管疾病、神经退行性疾病、疟疾、艾滋病、痛风、糖尿病、肾功能衰竭、慢性肺部疾病、眼咽肌营养不良、可卡因成瘾、肺动脉高压疾病、肌萎缩侧索硬化症或酒精性肝硬化失代偿症；所述癌症优选为肾癌、乳腺癌、肺癌、白血病、黑色素瘤、前列腺癌、结肠癌或肝癌。
术语
在本文中，除特别说明之处，本发明所述“C3-12环烷基”指优选具有3～6个碳原子的环烷基，具体可为环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基或环辛基等；
本发明所述“非芳香性C3-6杂环基”指具有3-6个碳原子，优选1-3个选自O、S和/或N的杂原子的非芳香性环状基团；
本发明所述“C6-12芳基”可为苯基、萘基等；
本发明所述“5-10元杂芳基”可为吡啶基、嘧啶基、喹啉基、异喹啉、呋喃基、噻吩基、吡咯基等；
本发明所述“C1-12烷基”指具有1～12个碳原子的直链或支链烷基，优选为具有1-6个碳原子的直链或支链C1-C6的烷基，进一步优选为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基等；所述卤代C1-12烷基、C1-12烷氧基、C1-12烷硫基、C1-12烷氧羰基或硫代C1-12烷基中所涉及的C1-12烷基具有相同的定义或含义；
本发明所述“卤素”指F、Cl、Br或I；
本发明所述“取代”指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基R取代：H、卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、C1-12烷基、卤代C1-12烷基、C1-12烷氧基、C1-12烷硫基、C1-12烷氧羰基、硫代C1-12烷基、C3-12环烷基、氧代基、C2-6酯基、C2-6酰基、C2-6酰胺基、羧基、C6-12芳基、5-10元杂芳基；
本发明中，所述“药学上可接受的”成分是指适用于人和/或动物而无过度不良副反应，即有合理的效益/风险比的物质；
除非特别说明，本发明中所有出现的化合物均意在包括所有可能的光学异构体，如单一手性的化合物，或各种不同手性化合物的混合物(即外消旋体)。本发明的所有化合物之中，各手性碳原子可以任选地为R构型或S构型，或R构型和S构型的混合物；
如本文所用，本发明中，所述“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸所形成的适合用作药物的盐，药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐，本发明中所述药学上可接受的盐具体可为盐酸盐，更具体为式（I）化合物的二盐酸盐。
本发明在现有技术的基础上，增加连接基团L1，所述L1优选为亚甲基等亚烷基，通过增加连接基团L1增大两个环之间的距离，有效的降低了化合物对正常细胞的影响，减少了毒副作用，同时对PRMTⅠ型仍具有较高的抑制活性；此外，研究发现在两个环之间增加连接基团L1后的本发明化合物，其药物化学构效关系不同于两环之间仅有杂原子（例如-O-、-S-等）连接的情况，形成了新的构效关系。综上所述，本发明的化合物具有高的活性和低毒性，具有潜在的药学应用前景。
附图说明
图1为化合物1-1与PRMT4蛋白的热稳定性迁移图。
图2为化合物1-1对PRMT4的胞内抑制能力图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
使用Bruker400MHz核磁共振仪测定化合物核磁共振谱图，其中1H NMR和13C NMR频率分别为400MHz和100MHz，以四甲基硅烷（TMS）为δ=0ppm 处的内标物。使用WatersMicromass Q-TOF micro Synapt高分辨质谱仪测定化合物的高分辨质谱（HRMS）。所有溶剂均为分析纯试剂。采用碘、紫外荧光等方法显色。本发明中用到的起始反应物未经特别说明，均为商业购买。
实施例1 化合物1-1的制备
在50 mL茄形瓶中加入2,3-二氯苄醇（1.76 g，10 mmol），加入15 mL40%的氢溴酸水溶液，加热至120oC，反应两小时。反应完毕后，冷却至室温，用乙酸乙酯（2 × 20 mL）萃取，再用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠固体干燥，减压蒸馏除去有机溶剂，得到黄色油状物1-1a，产率91%；
1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.43 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.36 (d, J= 7.5 Hz, 1H), 7.19 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 4.60 (s, 2H).
在50 mL茄形瓶中加入1-1a（239 mg，1 mmol），水杨醛（110 mg，0.9 mmol），碳酸钾（276.4 mg，2 mmol），加入15mLN,N-二甲基甲酰胺溶解，室温下反应过夜。反应完毕，加水淬灭，乙酸乙酯萃取（2 × 20 mL），有机相再用水洗涤（2 × 20 mL），饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去有机溶剂，硅胶色谱柱纯化得到目标产物1-1b，白色固体，产率83%；1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 10.58 (s, 1H), 7.88 (d, J=7.7 Hz,1H), 7.65-7.44 (m, 3H), 7.31-7.29 (m,1H), 7.15-6.99 (m, 2H), 5.30 (s, 2H).
将化合物1-1b（280 mg，1mmol）和N-甲基-N- [2-（甲基氨基）乙基]氨基甲酸叔丁酯（206 mg，1.1 mmol）溶于20 mL二氯甲烷中，滴入两滴冰醋酸。在室温下搅拌30min，加入三乙酰基硼氢化钠（632 mg，3 mmol），室温搅拌过夜。反应完毕，水洗（2 × 20 mL），再用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥。硅胶色谱柱纯化得到目标化合物1-1c，无色油状物，产率47%;1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.44 (t, J=5.5 Hz, 1H), 7.38-7.29(m, 2H), 7.21-7.13 (m, 2H), 6.91 (td, J=7.4, 1.1 Hz, 1H), 6.85-6.79 (m, 1H),5.11 (s, 2H), 3.62 (d, J=32.6 Hz, 2H), 3.36-3.20 (m, 2H), 2.75 (s, 3H), 2.50-2.46 (m, 2H), 2.28-2.23 (m, 3H), 1.34 (s, 9H).
将化合物1-1c（227 mg，0.5 mmol）在冰浴下溶于盐酸饱和乙酸乙酯，室温下搅拌过夜，反应完毕后，有白色固体析出。过滤，用乙酸乙酯和正己烷洗涤，得到目标产物1-1，白色固体，产率88%，纯度97.3%;1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.87 (s, 1H), 9.47 (s,2H), 7.71-7.64 (m, 3H), 7.50-7.44 (m, 2H), 7.20 (d, J=7.6 Hz, 1H), 7.08 (t, J=7.5 Hz, 1H), 5.33 (s, 2H), 4.51-4.33 (m, 2H), 3.56 (s, 2H), 3.38-3.34 (m,2H),2.73 (s, 3H), 2.53 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, Deuterium Oxide) δ 156.65,135.80, 132.89, 132.83, 132.57, 131.55, 130.76, 128.94, 128.05, 121.81,116.98, 113.02, 68.51, 55.68, 50.54, 42.79, 40.68, 33.21.HRMS (ESI) m/z：Calcdfor C18H23Cl2N2O(M+H)+, 353.1182, found 353.1197.
实施例2化合物1-2的制备
将化合物1-1b（280 mg，1 mmol）和2-(甲基氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯（193 mg，1.1 mmol）溶于20 mL二氯甲烷中，滴入两滴冰醋酸。在室温下搅拌30min，加入三乙酰基硼氢化钠（632 mg，3 mmol），室温搅拌过夜。反应完毕，水洗（2×20 mL），再用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥。硅胶色谱柱纯化得到目标化合物1-2c，无色油状物，产率53%；1HNMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.48 (dd, J = 7.8, 1.6 Hz, 1H), 7.43 (dd, J =8.0, 1.6 Hz, 1H), 7.33-7.29 (m, 1H), 7.28-7.18 (m, 2H), 6.97 (td, J = 7.4,1.1 Hz, 1H), 6.85 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 5.24 (s, 2H), 3.61 (s, 2H), 3.29-3.19(m, 2H), 2.60-2.52 (m, 2H), 2.23 (s, 3H), 1.37 (s, 9H).
将化合物1-2c（220 mg，0.5 mmol）在冰浴下溶于盐酸饱和乙酸乙酯，室温下搅拌过夜，反应完毕后，有白色固体析出。过滤，用乙酸乙酯和正己烷洗涤，得到目标产物1-2，白色固体，产率86%，纯度99.9%；1H NMR (400 MHz, Deuterium Oxide) δ 7.57 (dd, J =8.1, 1.6 Hz, 1H), 7.50 (td, J = 7.9, 1.8 Hz, 1H), 7.45 (td, J = 7.4, 1.7 Hz,2H), 7.31 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.18 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.10 (t, J = 7.5 Hz,1H), 5.34 (s, 2H), 4.40 (s, 2H), 3.51-3.46 (m, 2H), 3.38-3.30 (m, 2H), 2.84(s, 3H).HRMS (ESI) m/z：Calcd for C17H21Cl2N2O(M+H)+, 339.1025, found 339.1042.
实施例3化合物1-3的制备
化合物1-3a以2-氯卞醇为原料，合成方法和化合物1-1a相同，产物为黄色油状物，产率92%;1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.47-7.42 (m, 1H), 7.41-7.36 (m,1H), 7.27-7.24 (m, 2H), 4.60 (s, 2H).
化合物1-3b以1-3a为原料，合成方法和化合物1-1b相同，产物为白色固体，产率79%;
1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 10.59 (s, 1H), 7.88 (dd, J = 8.1,1.8 Hz, 1H), 7.60-7.55 (m, 2H), 7.46-7.41 (m, 1H), 7.34-7.30 (m, 2H), 7.07(d, J = 7.9 Hz, 2H), 5.30 (s, 2H).
化合物1-3c以1-3b为原料，合成方法和化合物1-1c相同，产物为无色油状物，产率47%;
1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.57 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.31-7.27 (m, 2H), 7.23 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.97 (t, J = 7.4Hz, 1H), 6.94 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 5.18 (s, 2H), 3.78-3.64 (m, 2H), 3.43-3.27(m, 2H), 2.82 (s, 3H) , 2.67-2.50 (m, 2H),2.31 (s, 3H), 1.41 (s, 9H).
化合物1-3以1-3c为原料，合成方法和化合物1-1相同，产物为白色固体，产率86%，纯度99.9%;1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.86 (s, 1H), 9.44 (s, 2H), 7.71-7.70(m, 1H), 7.65 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 7.55-7.53 (m, 1H), 7.47 (t, J = 7.9 Hz,1H), 7.43-7.40 (m, 2H), 7.15 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.01 (t, J = 7.4 Hz, 1H),5.29 (s, 2H), 4.43-4.33 (m, 2H), 3.53 (s, 2H),3.33-3.32(m, 2H), 2.72 (s, 3H),2.51 (s, 3H).HRMS (ESI) m/z：Calcd for C18H24ClN2O(M+H)+ , 319.1572, found319.1595.
实施例4化合物1-4的制备
化合物1-4c以1-3b为原料，合成方法和化合物1-4c相同，产物为无色油状物，产率47%;
1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.56-7.53 (m, 1H), 7.42-7.38 (m,1H), 7.34-7.25 (m, 3H), 7.22 (dd, J = 7.8, 1.8 Hz, 1H), 7.00-6.92 (m, 1H),6.90 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 5.24 (s, 2H), 3.63 (s, 2H), 3.30-3.20 (m, 2H), 2.58(t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.25 (s, 3H), 1.38 (s, 9H).
化合物1-4以1-4c为原料，合成方法和化合物1-2相同，产物为白色固体，产率84%，纯度99.9%；1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 11.01 (s, 1H), 8.50 (s, 3H), 7.69 (t, J= 4.4Hz, 1H), 7.65 (d, J = 5.76 Hz, 1H), 7.54-7.52 (m, 1H), 7.48-7.43 (t, J =8.52 Hz 1H), 7.42-7.40 (m, 2H), 7.19 (d, J =7.96 Hz 1H), 7.06 (t, J =6.6 Hz,1H), 5.29 (s, 2H), 4.42-4.34 (m, 2H), 3.34-3.30 (m, 4H), 2.72 (s, 3H).
HRMS (ESI) m/z：Calcd for C17H22ClN2O(M+H)+, 305.1415, found 305.1438.
实施例5化合物1-5的制备
化合物1-5a以2,4 -二氯卞醇为原料，合成方法和化合物1-1a相同，产物为黄色油状物，产率91%;1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.41 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.37(d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.23 (dd, J = 8.3, 2.1 Hz, 1H), 4.54 (s, 2H).
化合物1-5b以21-5a为原料，合成方法和化合物1-1b相同，产物为白色固体，产率74%;
1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 10.55 (d, J = 0.8 Hz, 1H), 7.88 (dd,J = 7.7, 1.8 Hz, 1H), 7.59-7.56 (m, 1H), 7.54-7.50 (m, 1H), 7.46 (d, J = 2.1Hz, 1H), 7.31 (dd, J = 8.3, 2.1 Hz, 1H), 7.09 (tt, J = 7.5, 0.9 Hz, 1H), 7.04(dd, J = 8.5, 0.9 Hz, 1H), 5.25 (s, 2H).
化合物1-5c以1-5b为原料，合成方法和化合物1-1c相同，产物为无色油状物，产率47%;
1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.52 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.43 (d, J= 2.1 Hz, 1H), 7.41-7.36 (m, 1H), 7.29 (dd, J = 8.5, 2.1 Hz, 1H), 7.23 (t, J= 7.8 Hz, 1H), 6.98 (td, J = 7.4, 1.0 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 5.14(s, 2H), 3.73 - 3.63 (m, 2H), 3.39-3.30 (m, 2H), 2.82 (s, 3H), 2.33-2.28 (m,2H), 1.78 (s, 3H), 1.42 (s, 9H).
化合物1-5以1-5c为原料，合成方法和化合物1-1相同，产物为白色固体，产率85%，纯度96.7%;1H NMR (600 MHz, DMSO-d 6) δ 10.82 (s, 1H), 9.38 (s, 2H), 7.75 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.73 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.65 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.52 (dd,J = 8.3, 2.2 Hz, 1H), 7.48 (t, J = 8.1 Hz, 1H), 7.22 (d, J = 8.4 Hz, 1H),7.08 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 5.27 (d, J = 3.1 Hz, 2H), 4.45-4.32 (m, 2H), 3.53 (s,2H), 3.39 (s, 2H), 2.73 (s, 3H), 2.54 (s, 3H).HRMS (ESI) m/z：Calcd forC18H23Cl2N2O(M+H)+, 353.1182, found 353.1199.
实施例6化合物1-6的制备
化合物1-6c以1-5b为原料，合成方法和化合物1-2c相同，产物为无色油状物，产率47%;
1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.51-7.41 (m, 2H), 7.36-7.27 (m,3H), 7.01 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 6.92 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 5.21 (s, 2H), 3.89(s, 2H), 3.32-3.27 (m, 2H), 2.89-2.87 (m, 2H), 2.48 (s, 3H), 1.38 (s, 9H).
化合物1-6以1-6c为原料，合成方法和化合物1-2相同，产物为白色固体，产率86%，纯度98.7%;1H NMR (600 MHz, DMSO-d 6) δ 11.06 (s, 1H), 8.52 (s, 3H), 7.75 (d, J= 8.3 Hz, 1H), 7.71 (s, 1H), 7.65 (dd, J = 7.6, 1.7 Hz, 1H), 7.51 (dd, J =8.3, 2.2 Hz, 1H), 7.46 (td, J = 7.9, 1.7 Hz, 1H), 7.19 (d, J = 8.4 Hz, 1H),7.07 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 5.27 (d, J = 3.1 Hz, 2H), 4.44-4.30 (m, 2H), 3.32-3.25 (m, 4H), 2.72 (s, 3H).HRMS (ESI) m/z：Calcd for C17H21Cl2N2O(M+H)+,339.1025, found 339.1044.
实施例7化合物2-14的制备
化合物2-14a以环己基甲醇为原料，氮气保护下，在50 mL二口烧瓶中依次加入10mL无水四氢呋喃溶解的水杨酸乙酯（166.2 mg，1 mmol），偶氮二甲酸二异丙酯（DIAD）（303mg，1.5 mmol），15 mL无水四氢呋喃溶解的三苯基膦（393 mg，1.5 mmol）和环己甲醇（114.2mg，1 mmol），室温搅拌下过夜。反应完毕，加水（15 mL × 2）洗涤，用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，得到化合物2-14a的粗品直接进行下一步反应；
在50 mL茄形瓶中将2-14a的粗品溶于无水四氢呋喃，冰浴下分批加入氢化铝锂（114 mg，3 mmol），撤去冰浴，室温下反应两小时。反应完毕后，冰浴下用水淬灭。用硅藻土抽滤除去固体杂质，减压除去溶剂，粗品通过硅胶色谱柱纯化得到化合物2-14b为无色油状物，产率61%；1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.25-7.20 (m, 3H), 6.90 (t, J =7.4 Hz, 1H), 6.84 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 4.67 (d, J = 4.1 Hz, 2H), 3.79 (d, J =5.9 Hz, 2H), 1.78-1.66 (m, 4H), 1.25-1.16 (m, 4H), 1.10-0.99 (m, 2H).
将化合物2-14b（220 mg，1 mmol）溶于20 mL1,2-二氯乙烷，加入活性二氧化锰（435 mg，5 mmol），加热至80℃，反应4h。反应完毕，硅藻土抽滤除去二氧化锰，水洗（15 mL× 2）有机相，用饱和氯化钠溶液洗，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏除去溶剂，产物2-14c为无色油状物，产率93%；
将化合物2-14c（218 mg，1 mmol）和2- (甲基氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯（193 mg，1.1 mmol）溶于20 mL二氯甲烷中，滴入两滴冰醋酸。在室温下搅拌三十分钟，加入三乙酰基硼氢化钠（630 mg，3 mmol），室温搅拌过夜。反应完毕，水洗（2 × 20 mL），用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥。得到化合物2-14d的粗品；
将化合物2-14d粗品在冰浴下溶于盐酸饱和乙酸乙酯，室温下搅拌过夜，反应完毕后，有白色固体析出。过滤，用乙酸乙酯和正己烷洗涤，得到化合物2-14，白色固体，两步产率43%，纯度100.0%；1H NMR (400 MHz, Deuterium Oxide) δ 7.38 (t, J = 9.4 Hz,1H), 7.32 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.02 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.95 (t, J = 7.4 Hz,1H), 4.36-4.26 (m, 2H), 3.85-3.80 (m, 2H), 3.49 – 3.35 (m, 4H), 2.79 (s, 3H),1.78-1.54 (m, 6H), 1.21-1.06 (m, 3H), 0.99-0.89 (m, 2H)；
HRMS (ESI) m/z: Calcd for C17H29N2O (M+H)+, 277.2274, found 277.2288.
实施例8化合物2-15的制备
化合物2- 15d以2- 14c为原料，将化合物2-14c（218 mg，1 mmol）和N-甲基-N-[2-（甲基氨基）乙基]氨基甲酸叔丁酯（206 mg，1.1 mmol）溶于20 mL二氯甲烷中，滴入两滴冰醋酸。在室温下搅拌30min，加入三乙酰基硼氢化钠（632 mg，3 mmol），室温搅拌过夜。反应完毕，水洗（2 × 20 mL），用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥。得到目标化合物2-15d的粗品直接投入下步反应。
将化合物2-15d的粗品在冰浴下溶于盐酸饱和乙酸乙酯，室温下搅拌过夜，反应完毕后，有白色固体析出。过滤，用乙酸乙酯和正己烷洗涤，得到目标产物2-15，白色固体，两步产率48%，纯度100.0%;1H NMR (400 MHz, Deuterium Oxide) δ 7.41 (t, J = 8.0 Hz,1H), 7.32 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.04 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.96 (t, J = 7.5 Hz,1H), 4.32 (s, 2H), 3.86 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 3.50-3.41 (m, 4H), 2.79 (s, 3H),2.68 (s, 3H), 1.79-1.55 (m, 6H), 1.22-1.07 (m, 3H), 1.03-0.92 (m, 2H).13C NMR(100 MHz, Deuterium Oxide) δ 157.49, 132.60, 132.45, 120.84, 116.78, 112.63,73.83, 56.03, 50.42, 42.83, 40.49, 36.78, 33.21, 29.34, 25.99, 25.22.HRMS(ESI) m/z: Calcd for C18H31N2O (M+H)+, 291.2431, found 291.2446.
实施例9AlphaLISA体外活性检测实验
化合物梯度稀释后取100 nL与DMSO 组，阳性对照组（SAH）一起转移至反应板；测定板中加入5 μL CARM1酶溶液，室温下孵育15分钟；每个孔中加入5 μL由底物多肽和SAM组成的混合溶液以开始反应，室温下孵育60分钟；加入15 μL受体和供体珠溶液，室温下于弱光孵育60分钟；将所有反应液转移到Flashplate板中继续孵育60分钟；使用带有Alpha模式的酶标仪Enspire读取信号值。
注：NT表示未测试活性
实施例10同位素体外活性检测实验
同位素实验是通过[3H]标记PRMTⅠ型甲基供体SAM中的甲基，在正常反应体系中PRMT酶将催化SAM上[3H]同位素标记的甲基转移到精氨酸底物上，若PRMT的甲基转移酶活性被抑制则在底物多肽中无法检测到同位素信号，以此评价化合物对PRMT I型的甲基转移酶活性的抑制程度。同理检测化合物对PRMT II型（PRMT 5、PRMT 7、PRMT 9）的甲基转移酶活性的抑制程度。
首先将精氨酸甲基转移酶(PRMTs)、多肽底物和[3H]标记的甲基供体S-腺苷基甲硫氨酸([3H]-SAM)溶于Tris的缓冲溶液中，并把化合物溶解或稀释至待测浓度加入反应板中。接着向已加入化合物的反应板中加入15μL蛋白酶溶液室温孵育15分钟，再加入5μL多肽底物溶液和[3H]-SAM溶液开始反应，室温孵育60分钟，最后通过加入5μL冷的终止试剂终止反应。将最终的反应体系混合液吸25μL加入到Flashplate中室温孵育60分钟，并用含有0.1%的Tween-20的蒸馏水洗去非特异性结合的同位素标记物，放入检测仪(Microbeta)中读取信号值，按照公式计算抑制率，通过GraphPadPrism8.0软件拟合得到IC50值。
抑制率(%)=(1-(化合物信号值-最低信号值)/(最高信号值-最低信号值))×100
注：NT表示未测试活性
实施例11肿瘤细胞株增殖抑制实验
本实施例以肾癌Caki-1、乳腺癌细胞株MCF7、肺癌细胞株A549、混合谱系白血病（MLL）细胞株MV4-11、黑色素瘤A2058、前列腺癌细胞株LNCAP结肠癌细胞株HCT116、肝癌细胞株SKHep1为细胞模型，考查化合物对上述细胞增殖抑制的IC50。
采用相应培养基加入10%胎牛血清。细胞计数后，接种于96孔板中，同时给予化合物处理，浓度梯度以100μM为起始浓度，两倍梯度稀释。通过CellTiter-Glo法检测给药120小时后细胞增殖的变化。以细胞存活率为纵坐标，药物浓度为橫坐标做图，并计算化合物对各细胞株的增殖抑制的IC50，结果如表2所示。
细胞存活率(%)计算方法为：
存活率(%)=(给药孔OD-空白孔OD)/(对照孔OD-空白孔OD)×100。结果表明，化合物有效抑制上述细胞增殖。
表2 细胞增殖抑制活性测定结果
IC50 (+++表示1-10μM；++表示10-25μM；+表示25-100μM)
注：NT表示未测试活性
实施例12正常细胞株增殖抑制实验
以大鼠成肌纤维细胞（L6）、猪肾细胞（SK-6）、小鼠下皮细胞（L929）为细胞模型，考查化合物对上述细胞增殖抑制的IC50。
采用相应培养基加入10%胎牛血清。细胞计数后，接种于96孔板中，同时给予化合物处理，浓度梯度以100μM为起始浓度，两倍梯度稀释。通过CellTiter-Glo法检测给药96小时后细胞增殖的变化。以细胞存活率为纵坐标，药物浓度为橫坐标做图，并计算化合物对各细胞株的增殖抑制的IC50，结果如表3所示。本发明中化合物具有更好的细胞安全性。
细胞存活率(%)计算方法为：
存活率(%)=(给药孔OD-空白孔OD)/(对照孔OD-空白孔OD)×100。结果表明，化合物有效抑制上述细胞增殖。
表3 细胞增殖抑制活性测定结果
IC50 (+++表示1-10 μM；++表示10-25 μM；+表示25-100 μM)
注：NT表示未测试活性
实施例13SKHep1细胞中蛋白热稳定性实验
首先，将SKHep1细胞在培养皿中培养，然后离心收集细胞。用PBS洗涤细胞两次，用200 μl PBS重悬（加入1×cocktail）。细胞裂解液经4轮液氮冻融后，在4℃下离心40分钟得到上清。将上清用PBS稀释7倍后加入1×cocktail的每400 μl作为Input。样品组400 μl上清液经40 μmol的化合物1-1室温处理1小时。对照组400 μl上清液经control溶剂(未加化合物)处理。
设置从46.4℃到60.4℃8个温度梯度，每40 μl一份，样品均分为8份后对应温度梯度加热3分钟，然后再在25℃冷却3分钟，离心50分钟取上清。可溶性组分转移至微型管，SDS-PAGE分析，Westernblot分析确定化合物与蛋白的结合能力。如附图1所示，化合物1-1在40 μM浓度的条件下可以引起PRMT4蛋白的热稳定性迁移，表明化合物1-1与PRMT4蛋白有很强的直接相互作用。
实施例14蛋白印迹法在SKHep1细胞中检测精氨酸甲基化修饰变化
首先，通过离心收集SKHep1细胞样品；然后，使用1x SDS上样缓冲液裂解细胞获得蛋白质。经8分钟煮样后，将准备好的蛋白上样到4%-16%的SDS-PAGE梯度胶加样孔中，用伯乐（Bio-Rad）电泳仪进行恒流电泳，当溴酚蓝到达胶底部时停止电泳。胶片经分离、浸泡、转膜等工序后加入一抗在4℃孵育过夜，再加入与辣根过氧化物酶结合的二抗进行孵育。最后，漂洗三次后用辣根过氧化物酶法（ECL）曝光，通过显影仪分析化合物1-1对PRMT4的胞内抑制能力。如附图2所示，化合物1-1可以浓度依赖的抑制PRMT4，从而影响其底物H3R17的不对称二甲基化修饰，明确了其细胞内的在靶效应。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种式I化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述式I化合物为：
其中，
X1为-O-；
R1为
L1为-[C(R6)2]a-；
L2为-[C(R6)2]b-；
L3为-[C(R6)2]c-；
a为1；
b为1；
c为2；
R2、R6分别独立的选自H、卤素、C1-6烷基、卤代C1-6烷基或C1-6烷氧基；
R3选自C1-6烷基或卤代C1-6烷基；
R4、R5分别独立的选自H、C1-6烷基或卤代C1-6烷基；
R8、R9分别独立的选自H、卤素、C1-6烷基、卤代C1-6烷基或C1-6烷氧基。
2.一种如权利要求1所述的式I化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：
所述R2为H；
和/或，
所述R6为H；
和/或，
所述R3为甲基；
和/或，
所述R4为H或甲基；
和/或，
所述R9为H；
和/或，
所述R8为H；
和/或，
所述R5为H。
3.一种如权利要求2所述的式I化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：所述的式I化合物为：
4.一种如权利要求1-3任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，所述式I化合物为式I-1化合物，所述制备方法包括以下步骤：
a)式1所示的化合物与式2所示化合物反应得到式I-1所示的化合物；其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、X1、L1、L3的定义如权利要求1-3任一项所述。
5.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含：如权利要求1-3中任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐作为药物活性成分和药学上可接受的载体。
6.一种如权利要求1-3中任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐的应用，其特征在于，用于制备治疗PRMTⅠ型甲基转移酶异常相关疾病的药物，所述PRMTⅠ型甲基转移酶为PRMT1、PRMT3、PRMT4、PRMT6、PRMT8中的一种或多种。
7.一种如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述PRMTⅠ型甲基转移酶异常相关疾病选自：癌症、心血管疾病、神经退行性疾病、疟疾、艾滋病、痛风、糖尿病、肾功能衰竭、慢性肺部疾病、眼咽肌营养不良、可卡因成瘾、肺动脉高压疾病、肌萎缩侧索硬化症或酒精性肝硬化失代偿症。
8.一种如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述癌症为肾癌、乳腺癌、肺癌、白血病、黑色素瘤、前列腺癌、结肠癌或肝癌。
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