CN112961081B - 一种联苯甲酰胺脲类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，尤其是肿瘤相关的疾病治疗领域，其中涉及一种联苯甲酰胺脲类化合物及其制备方法和应用。为了解决现有技术ROCK抑制剂效果仍有待提高的问题，本发明提出一种式(I)联苯甲酰胺脲类化合物：
Figure DDA0002936498090000011
通过优势片段杂合的设计策略制备了新型联苯甲酰胺脲类ROCKI抑制剂，使其能同时伸入靶标关键结合区域(A口袋和D口袋)来提高与的靶标亲合力，进而改善对ROCK的抑制效果和抗肿瘤效果。

Description

一种联苯甲酰胺脲类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，尤其是肿瘤相关的疾病治疗领域，其中涉及一种联苯甲酰胺脲类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
癌症是由多种复杂性因素引起的疾病，以恶性细胞的无限增殖为主要特征，也被称为恶性肿瘤。据WHO统计，每年全世界因癌症导致的死亡数就高达数百万，严重威胁了人类的健康。
ROCK即Rho相关蛋白激酶，属于AGC激酶家族，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，分为ROCKⅠ和ROCKⅡ两种亚型。大量研究表明，肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移和扩散都与ROCKⅠ的过度表达有关。近年来，以ROCKⅠ为靶标设计的抑制剂在抗肿瘤等方面的潜在应用价值已获得了广泛关注，使其成为研发肿瘤靶向治疗药物的重要靶标之一。
盐酸法舒地尔(Fasudil)作为最早上市的Rho激酶抑制剂，其主要用来扩张血管，缓解脑血管痉挛。近年来大量的研究表明：法舒地尔在多种肿瘤细胞系和荷瘤动物模型中也表现出良好的抗肿瘤效果。因此，开发具有高效抗肿瘤活性的新结构类型ROCKⅠ抑制剂具有重要意义。
发明人深入研究后发现，由法舒地尔与ROCKⅠ的共结晶复合物的结构可知(图1和图2)，其活性结合区域由两部分组成，分别为朝向里的A口袋和浅表面的D口袋(图1)。法舒地尔虽然能很好地伸入A口袋与并与其中的关键氨基酸Met156和Asp216形成有效氢键作用，但并未进入D口袋(图2)，提示法舒地尔作为ROCKI抑制剂，效果仍有待提高。
发明内容
为了解决现有技术ROCKI抑制剂抗肿瘤效果仍有待提高的问题，本发明提供了一种联苯甲酰胺脲类化合物及其制备方法和应用。通过优势片段杂合的策略，设计并制备了新型联苯甲酰胺脲类ROCKI抑制剂，使其能同时伸入靶标ROCKI的A口袋和D口袋来提高与靶标的亲合力，进而改善ROCK抑制剂的效果和抗肿瘤效果。
具体地，本发明是通过如下所述的技术方案实现的：
本发明第一方面，提供一种联苯甲酰胺脲类化合物，选自通式(I)及其药学上可接受的盐、其立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物、互变异构体、代谢产物或前药：
Figure BDA0002936498070000021
其中：R1和R2相同或不同，各自独立地选自取代或未取代的2～4碳原子的伯胺、仲胺、羟基，取代或未取代的烷氧基，卤素和氢。
本发明第二方面，提供一种联苯甲酰胺脲类化合物的制备方法，包括：
Figure BDA0002936498070000022
以3-溴苯基异氰酸酯(2)和含有R1取代基的苯甲醛(3)为起始原料，经氨基成异氰酸酯，亲核加成、消除、还原，成脲，铃木反应，氰基水解一系列反应得到联苯甲酰胺脲类化合物。
本发明第三方面，提供一种药物组合物，其包括联苯甲酰胺脲类化合物、其药学上可接受的盐、其立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物、互变异构体、代谢产物或前药以及药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明第四方面，提供一种联苯甲酰胺脲类化合物、其药学上可接受的盐、其立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物、互变异构体、代谢产物或前药在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明第五方面，提供一种联苯甲酰胺脲类化合物、其药学上可接受的盐、其立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物、互变异构体、代谢产物或前药在制备ROCK抑制剂药物中的应用。
本发明一个或多个实施例具有以下有益效果：
通过优势片段杂合的设计策略制备了新型联苯甲酰胺脲类ROCKⅠ抑制剂，使其能同时伸入靶标的两个活性结合区域(A口袋和D口袋)来提高与靶标的亲合力，进而改善对ROCK的抑制效果和进一步的抗肿瘤效果。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为本发明背景技术部分阳性对照药法舒地尔伸入ROCK I活性结合域模式图；
图2为本发明背景技术部分阳性对照药法舒地尔与ROCK I形成氢键作用的示意图；
图3为本发明实施例1化合物MJ-6-3伸入ROCKI活性结合域模式图；
图4为本发明实施例1化合物MJ-6-3与ROCKI的作用模式图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
发明人研究发现，由法舒地尔与ROCK I的共结晶复合物的晶体结构可知：其活性结合区域由两部分(A口袋和D口袋)组成，法舒地尔能很好地伸入A口袋并与其中的关键氨基酸Met156和Asp216形成有效氢键相互作用，但并没有伸入D口袋，而D口袋作为活性结合区域的一个重要疏水性空腔，如能引入适合该口袋的疏水性基团来与其形成疏水性相互作用提高与靶酶的亲合力，可有效提高抑制剂的活性。基于此，本发明基于靶标ROCKI的晶体结构特点，通过优势片段杂合的设计策略制备了新型联苯甲酰胺脲类ROCKI抑制剂，使其能同时伸入A口袋和D口袋来提高与靶标的亲合力，如下结构式所示：
Figure BDA0002936498070000041
具体地，本发明是通过如下所述的技术方案实现的：
本发明第一方面，提供一种联苯甲酰胺脲类化合物，选自通式(I)及其药学上可接受的盐、其立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物、互变异构体、代谢产物或前药：
Figure BDA0002936498070000042
其中：R1和R2相同或不同，各自独立地选自取代或未取代的2～4碳原子的伯胺、仲胺、羟基、取代或未取代的烷氧基、卤素和氢。
在本发明一个或多个实施例中，所述取代或未取代的2～4碳原子的伯胺、仲胺中碳原子数量为2；
优选地，所述取代的2～4碳原子的伯胺、仲胺中取代基为C1-C3直链或支链烷基或烷氧基，优选为甲基和甲氧基；
所述取代或未取代的2～4碳原子的羟基选自羟甲基、羟乙基和羟丙基；
优选地，所述取代或未取代的烷氧基中，烷氧基选自C1-C3直链或支链的烷氧基，优选为甲氧基；
优选地，所述卤素选自氟、氯、溴和碘；
优选地，所述R1位置选自苯环的邻、间、对位，优选为间位；
优选地，当R1和R2不同时，R1选自取代或未取代的烷氧基和卤素，R2选自取代或未取代的2～4碳原子的伯胺、仲胺、羟基；
进一步优选地，R1选自甲氧基、乙氧基、氟、氯和溴，R2选自2-(二甲基氨基)乙基、羟乙基和氢。
在本发明一个或多个实施例中，选自通式(II)及其药学上可接受的盐、其立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物、互变异构体、代谢产物或前药：
Figure BDA0002936498070000051
所述R1选自取代或未取代的烷氧基和卤素；
优选地，取代或未取代的烷氧基中，烷氧基选自C1-C3直链或支链的烷氧基；
所述R1优选为甲氧基、乙氧基、氟、氯和溴；
优选地，所述R1位置选自苯环的邻、间、对位，优选为间位。
在本发明一个或多个实施例中，所述联苯甲酰胺脲类化合物选自以下结构：
3'-(3-(2-(二甲基氨基)乙基)-3-(3-甲氧基苄基)脲基)-[1,1'-联苯]-4-羧酰胺，代号MJ-5-3；
3'-(3-(2-(二甲基氨基)乙基)-3-(3-氟苄基)脲基)-[1,1'-联苯]-4-羧酰胺，代号MJ-6-3；
3'-(3-(2-羟乙基)-3-(3-甲氧基苄基)脲基)-[1,1'-联苯]-4-羧酰胺，代号MJ-3-3；
3'-(3-(2-羟乙基)-3-(3-氟苄基)脲基)-[1,1'-联苯]-4-羧酰胺，代号MJ-4-3；
3'-(3-(3-甲氧基苄基)脲基)-[1,1'-联苯]-4-羧酰胺，代号MJ-1-3；
3'-(3-(3-氟苄基)脲基)-[1,1'-联苯]-4-羧酰胺，代号MJ-8-3。
本发明所述的具有抗肿瘤活性的联苯甲酰胺脲类化合物可以游离形式或以盐的形式存在，目的是为了提高水溶性，增加生物利用度。“药学上可接受的盐”是指常规的无毒性的盐，主要包括本申请含联苯甲酰胺脲生物碱与无机或有机酸形成的季铵盐。无机酸包括(但不限于)盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、二磷酸、氢溴酸、氢碘酸、六氟磷酸等；有机酸包括(但不限于)乙酸、马来酸、富马酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、乳酸、对甲苯磺酸、水杨酸、草酸等。此外，本领域熟练技术人员可以根据溶解度、稳定性、容易制剂等取某种盐而舍去另一种盐。这些盐的测定和最优化在本领域技术人员的经验范围内。
本发明第二方面，提供一种联苯甲酰胺脲类化合物的制备方法，包括：
Figure BDA0002936498070000061
以3-溴苯基异氰酸酯和含有R1取代基的苯甲醛为起始原料经氨基成异氰酸酯，亲核加成、消除、还原，成脲，铃木反应，氰基水解反应得到联苯甲酰胺脲类化合物。
本发明一个或多个实施例中，所述反应试剂及条件为：
b：二甲氨基乙胺，硼氢化钠，无水甲醇，0℃至室温；
c：三乙胺，无水四氢呋喃，0℃至室温；
d：碳酸钾，四(三苯基膦)钯；4-氰基苯硼酸，1,4-二氧六环和水；95℃；
e：碳酸钾，30％过氧化氢，二甲基亚砜，室温；
本发明一个或多个实施例中，所述制备方法包括以下步骤：
(1)向含有R1取代基的苯甲醛的无水甲醇溶液中加入二甲氨基乙胺，室温反应10-20分钟，降温至0℃再加入硼氢化钠，后升至室温反应1-3小时，得到中间体4；
(2)0℃下向中间体4和三乙胺的无水四氢呋喃溶液中缓慢滴加中间体2，即3-溴苯基异氰酸酯的四氢呋喃溶液，滴毕室温反应2-4小时，得到中间体5；
(3)将4-氰基苯硼酸与中间体5溶于1,4-二氧六环和水的混合溶剂中，加入催化剂四(三苯基膦)钯和碳酸钾，在氮气保护，80-100℃条件下反应10-18小时，制得中间体6；
(4)将中间体6和碳酸钾溶于二甲基亚砜溶液中，滴加过氧化氢溶液，滴毕室温反应1-3小时，即得联苯甲酰胺脲类化合物7；
优选地，所述步骤(1)中，室温反应15分钟；
优选地，加入硼氢化钠，后升至室温反应2小时；
优选地，含有R1取代基的苯甲醛、二甲氨基乙胺、硼氢化钠摩尔比为1.5-3：1.5-3：0.5-1.5，优选为2：2：1，所述的溶剂量为每毫摩尔含R1取代基的苯甲醛用无水甲醇为3-10mL，优选为5mL；
优选地，所述步骤(2)中，滴毕室温反应3小时；
优选地，所述中间体4，三乙胺，中间体2的摩尔比为0.5-1.5：1-3：1-2，优选为1：2：1.2，所述的溶剂量为每毫摩尔中间体4用无水四氢呋喃8-12mL，优选为10mL；
优选地，所述步骤(3)中，95℃条件下反应14小时；
优选地，所述中间体5、4-氰基苯硼酸、四(三苯基膦)钯、碳酸钾的摩尔比为0.5-1.2：1-2：0.02-0.1：2-4，优选为1：1.2：0.05：3，所述的溶剂量为每毫摩尔中间体5使用20-30mL的1，4-二氧六环，5-10mL的水，优选为24mL的1，4-二氧六环，6mL的水；
优选地，所述步骤(4)中，所述过氧化氢浓度为30％；
优选地，滴毕室温反应2小时；
优选地，所述中间体6，碳酸钾的摩尔比为0.5-2：4-8，优选为1：5，所述的溶剂量为每毫摩尔中间体6使用5-10mL的二甲基亚砜和3-6mL的30％过氧化氢，优选为6mL的二甲基亚砜和4mL的30％过氧化氢。
本发明一个或多个实施例中，所述制备方法还包括3-溴苯胺制备3-溴苯基异氰酸酯的过程，即：
Figure BDA0002936498070000071
3-溴苯胺制备3-溴苯基异氰酸酯的过程包括：0℃下将三光气溶于溶剂中，然后缓慢滴加3-溴苯胺溶液，滴加完毕在75℃下反应6小时，得到中间体2，即为3-溴苯基异氰酸酯；
优选地，所述反应试剂及条件为：a：三光气；无水乙酸乙酯，0℃至75℃；
优选地，所述三光气和3-溴苯胺的摩尔比为0.5-1.5：1-3，优选为1：2，三光气和3-溴苯胺的溶剂为无水乙酸乙酯；所述的溶剂的用量为每毫摩尔的三光气用15mL溶剂。
本发明第三方面，提供一种药物组合物，其包括联苯甲酰胺脲类化合物、其药学上可接受的盐、其立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物、互变异构体、代谢产物或前药以及药学上可接受的载体或赋形剂。
优选地，所述载体可以为固体或者液体；
优选地，所述药物组合物可制成口服制剂或肠胃外给药制剂；
优选地，药物组合物可以为片剂、丸剂、胶囊或注射剂；
优选地，所述药物组合物为抗肿瘤药物和/或ROCK抑制剂药物。
本发明第四方面，提供一种联苯甲酰胺脲类化合物、其药学上可接受的盐、其立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物、互变异构体、代谢产物或前药在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选地，所述抗肿瘤药物为抗肿瘤增殖和/或迁移活性的药物。
本发明第五方面，提供一种联苯甲酰胺脲类化合物、其药学上可接受的盐、其立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物、互变异构体、代谢产物或前药在制备ROCK抑制剂药物中的应用。
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
实施例1化合物的制备
Figure BDA0002936498070000081
上述制备流程中所用的试剂分别为：(a)三光气；无水乙酸乙酯，0℃至75℃；(b)二甲氨基乙胺/2-氨基乙醇，硼氢化钠，无水甲醇，0℃至室温；(c)三乙胺，无水四氢呋喃，0℃至室温；(d)碳酸钾；四(三苯基膦)钯；4-氰基苯硼酸，1,4-二氧六环和水；95℃；(e)碳酸钾，30％过氧化氢，二甲基亚砜，室温。
(1)中间体3-溴苯基异氰酸酯(2)的制备
0℃下，向0.59g(2mmol)三光气溶于15mL的无水乙酸乙酯溶液中缓慢滴加0.69g(4mmol)3-溴苯胺的乙酸乙酯溶液15mL，滴加完毕0℃下继续反应半小时，后升至室温反应1小时，75℃下反应6小时。将反应液过滤，滤液浓缩得到浅黄色油状液体，无需纯化直接用于下一步。
(2)N1-(3-甲氧基苄基)-N2，N2-二甲基乙烷-1,2-二胺(4a)的制备
将0.54g(4mmol)3-甲氧基苯甲醛溶于10mL的无水甲醇溶液中然后加入0.35g(4mmol)二甲氨基乙胺，室温下反应15分钟，将反应液降温至0℃，再分批次加入76mg(2mmol)硼氢化钠，室温下反应2小时，向反应液中加入3mL的水，旋蒸除去甲醇，乙酸乙酯萃取(3×15mL)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到浅黄色油状液体，无需纯化直接用于下一步。
(3)N1-(3-氟苄基)-N2，N2-二甲基乙烷-1,2-二胺(4b)的制备
将0.50g(4mmol)3-氟苯甲醛溶于10mL的无水甲醇溶液中然后加入0.35g(4mmol)二甲氨基乙胺，室温下反应15分钟，将反应液降温至0℃，再分批次加入76mg(2mmol)硼氢化钠，室温下反应2小时，向反应液中加入3mL的水，旋蒸除去甲醇，乙酸乙酯萃取(3×15mL)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到浅黄色油状液体，无需纯化直接用于下一步。
(4)2-((3-甲氧基苯基)氨基)乙烷-1-醇(4c)的制备
将0.54g(4mmol)3-甲氧基苯甲醛溶于10mL的无水甲醇溶液中然后加入0.24g(4mmol)2-氨基乙醇，室温下反应15分钟，将反应液降温至0℃，再分批次加入76mg(2mmol)硼氢化钠，室温下反应2小时，向反应液中加入3mL的水，旋蒸除去甲醇，乙酸乙酯萃取(3×15mL)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到浅黄色油状液体，无需纯化直接用于下一步。
(5)2-((3-氟苯基)氨基)乙烷-1-醇(4d)的制备
将0.49g(4mmol)3-氟苯甲醛溶于10mL的无水甲醇溶液中然后加入0.24g(4mmol)2-氨基乙醇，室温下反应15分钟，将反应液降温至0℃，再分批次加入76mg(2mmol)硼氢化钠，室温下反应2小时，向反应液中加入3mL的水，旋蒸除去甲醇，乙酸乙酯萃取(3×15mL)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到浅黄色油状液体，无需纯化直接用于下一步。
(6)3-(3-溴苯基)-1-(2-(二甲基氨基)乙基)-1-(3-甲氧基苄基)脲(5a)的制备
0℃，向0.47g(2.3mmol)中间体4a和0.47g(4.6mmol)三乙胺的10mL无水四氢呋喃溶液中，缓慢滴加0.57g(2.8mmol)中间体2的无水四氢呋喃溶液2mL，滴毕室温反应3小时，旋蒸除去溶剂，残留物用10mL二氯甲烷溶解，加水(3×10mL)洗涤，收集有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯3:1)，得到白色固体0.82g,产率64％。1HNMR(400MHz,CDCl3-d6):δ11.19(s,1H,NH),7.63(s,1H,ArH),7.30(m,1H,ArH),7.22(d,J＝7.5Hz,1H,ArH),7.11(dd,J＝16.1,7.7Hz,3H,ArH),7.03(d,J＝9.6Hz,1H,ArH),6.96(t,J＝8.4Hz,1H,ArH),4.56(s,2H,CH2),3.76(s,3H,OCH3),3.31(t,J＝2.6Hz,2H,CH2),2.48(t,J＝2.6Hz,2H,CH2),2.38(s,6H,(CH3)2)；ESI-MS(m/z):406.16[M+H]+；理论计算值:C19H24BrN3O2 406.11[M+H]+.
(7)3-(3-溴苯基)-1-(2-(二甲基氨基)乙基)-1-(3-氟苄基)脲(5b)的制备
0℃，向0.45g(2.3mmol)中间体4a和0.47g(4.6mmol)三乙胺的10mL无水四氢呋喃溶液中，缓慢滴加0.57g(2.8mmol)中间体2的无水四氢呋喃溶液2mL，滴毕室温反应3小时，旋蒸除去溶剂，残留物用10mL二氯甲烷溶解，加水(3×10mL)洗涤，收集有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇50:1)，得到黄色固体0.63g,产率70％。1H NMR(400MHz,CDCl3-d6):δ11.23(s,1H,NH),7.64(s,1H,ArH),7.31(m,1H,ArH),7.24(d,J＝7.5Hz,1H,ArH),7.15(dd,J＝16.3,7.7Hz,3H,ArH),7.05(d,J＝9.6Hz,1H,ArH),6.98(t,J＝8.4Hz,1H,ArH),4.54(s,2H,CH2),3.31(t,J＝2.5Hz,2H,CH2),2.48(t,J＝2.5Hz,2H,CH2),2.39(s,6H,(CH3)2)；ESI-MS(m/z):395.30[M+H]+；理论计算值：C18H21BrFN3O395.29[M+H]+。
(8)3-(3-溴苯基)-1-(2-羟乙基)-1-(3-甲氧基苄基)脲(5c)的制备
0℃下，向0.42g(2.3mmol)中间体4c和0.47g(4.6mmol)三乙胺的10mL无水四氢呋喃溶液中，缓慢滴加0.57g(2.8mmol)中间体2的无水四氢呋喃溶液2mL，滴毕室温反应3小时，旋蒸除去溶剂，残留物用10mL二氯甲烷溶解，加水(3×10mL)洗涤，收集有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯3:1)，得到白色固体0.60g,产率67％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.84(s,1H,NH),7.77(s,1H,ArH),7.38(d,J＝8.1Hz,1H,ArH),7.23(dt,J＝25.2,8.1Hz,2H,ArH),7.11(d,J＝7.8Hz,1H,ArH),6.84(d,J＝7.8Hz,3H,ArH),5.23(s,1H,OH),4.57(s,2H,CH2),3.74(s,3H,OCH3),3.56(d,J＝4.0Hz,2H,CH2),3.38(d,J＝4.8Hz,2H,CH2).ESI-MS(m/z):380.26[M+H]+；理论计算值:C17H19BrN2O2380.11[M+H]+.
(9)3-(3-溴苯基)-1-(2-羟乙基)-1-(3-氟苄基)脲(5d)的制备
0℃下，向0.39g(2.3mmol)中间体5d和0.47g(4.6mmol)三乙胺的10mL无水四氢呋喃溶液中，缓慢滴加0.57g(2.8mmol)中间体2的无水四氢呋喃溶液2mL，滴毕室温反应3小时，旋蒸除去溶剂，残留物用10mL二氯甲烷溶解，加水(3×10mL)洗涤，收集有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯3:1)，得到白色固体0.60g,产率71％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.96(s,1H,NH),7.79(s,1H,ArH),7.33(d,J＝8.2Hz,1H,ArH),7.24(dt,J＝25.2,8.2Hz,2H,ArH),7.11(d,J＝7.8Hz,1H,ArH),6.84(d,J＝7.8Hz,3H,ArH),5.23(s,1H,OH),4.57(s,2H,CH2),3.59(d,J＝4.0Hz,2H,CH2),3.29(d,J＝4.8Hz,2H,CH2).ESI-MS(m/z):367.04[M+H]+；理论计算值:C16H16BrFN2O2366.07[M+H]+.
(10)1-(3-溴苯基)-3-(3-甲氧基苄基)脲(5e)的制备
0℃下，向0.32g(2.3mmol)3-甲氧基卞胺和0.47g(4.6mmol)三乙胺的10mL无水四氢呋喃溶液中，缓慢滴加0.57g(2.8mmol)中间体2的无水四氢呋喃溶液2mL，滴毕室温反应3小时，旋蒸除去溶剂，残留物用10mL二氯甲烷溶解，加水(3×10mL)洗涤，收集有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝3:1,v:v)，得到白色固体0.41g,产率53％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.77(s,1H,NH),7.83(s,1H,NH),7.23(m,3H,ArH),7.09(s,1H,ArH),6.86(m,3H,ArH),6.70(s,1H,ArH),4.27(s,2H,CH2),3.75(s,3H,OCH3).ESI-MS(m/z):336.20[M+H]+；理论计算值:C15H15BrN2O2336.17[M+H]+.
(11)1-(3-溴苯基)-3-(3-氟苄基)脲(5f)的制备
0℃，向0.29g(2.3mmol)3-氟卞胺和0.47g(4.6mmol)三乙胺的10mL无水四氢呋喃溶液中，缓慢滴加0.57g(2.8mmol)中间体2的无水四氢呋喃溶液2mL，滴毕室温反应3小时，旋蒸除去溶剂，残留物用10mL二氯甲烷溶解，加水(3×10mL)洗涤，收集有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯3:1)，得到白色固体0.58g,产率78％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.77(s,1H,NH),7.83(s,1H,NH),7.23(m,3H,ArH),7.09(s,1H,ArH),6.86(m,3H,ArH),6.70(s,1H,ArH),4.27(s,2H,CH2).ESI-MS(m/z):324.01[M+H]+；理论计算值:C14H12BrFN2O324.11[M+H]+.
(12)3-(4'-氰基-[1,1'-联苯]-3-基)-1-(2-(二甲基氨基)乙基)-1-(3-甲氧基苄基)脲(6a)的制备
将0.41g(1mmol)中间体5a，0.17g(1.2mmol)4-氰基苯硼酸，57mg(0.05mmol)四(三苯基膦)钯,0.41g(3mmol)碳酸钾溶于24mL 1,4-二氧六环和6mL水的混合溶液中，于95℃，氮气保护下反应14小时。旋干混合液，得到粗产物。粗产物用硅胶柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝1：1)，得白色固体141mg，收率34％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.16(s,1H,NH),8.02(s,1H,ArH),7.78(s,1H,ArH),7.68(d,J＝7.6Hz,2H,ArH),7.37(d,J＝8.8Hz,3H,ArH),7.28(d,J＝7.4Hz,2H,ArH),6.86(dd,J＝15.7,8.7Hz,3H,ArH),4.54(s,2H,CH2),3.34(t,J＝2.2Hz,2H,CH2),2.48(t,J＝2.2Hz,2H,CH2),2.26(s,6H,(CH3)2)。ESI-MS(m/z):427.48[M-H]-；理论计算值：C26H28N4O2427.54[M-H]-。
(13)3-(4'-氰基-[1,1'-联苯]-3-基)-1-(2-(二甲基氨基)乙基)-1-(3-氟苄基)脲(6b)的制备
将0.40g(1mmol)中间体5b，0.17g(1.2mmol)4-氰基苯硼酸，57mg(0.05mmol)四(三苯基膦)钯,0.41g(3mmol)碳酸钾溶于24mL 1,4-二氧六环和6mL水的混合溶液中，于95℃，氮气保护下反应14小时。旋干混合液，得到粗产物。粗产物用硅胶柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝1：1)，得白色固体150mg，收率35％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.36(s,1H,NH),8.12(s,1H,ArH),7.74(s,1H,ArH),7.67(d,J＝7.8Hz,2H,ArH),7.47(d,J＝8.7Hz,3H,ArH),7.26(d,J＝7.3Hz,2H,ArH),6.86(dd,J＝15.8,8.4Hz,3H,ArH),4.64(s,2H,CH2),3.34(t,J＝2.3Hz,2H,CH2),2.48(t,J＝2.3Hz,2H,CH2),2.26(s,6H,(CH3)2)。ESI-MS(m/z):417.03[M+H]+；理论计算值：C25H25FN4O417.20[M+H]+。
(14)3-(4'-氰基-[1,1'-联苯]-3-基)-1-(2-羟乙基)-1-(3-甲氧基苄基)脲(6c)的制备
将0.38g(1mmol)中间体5c，0.17g(1.2mmol)4-氰基苯硼酸，57mg(0.05mmol)四(三苯基膦)钯,0.41g(3mmol)碳酸钾溶于24mL 1,4-二氧六环和6mL水的混合溶液中，于95℃，氮气保护下反应14小时。旋干混合液，得到粗产物。粗产物用硅胶柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝3：1)，得白色固体89mg，收率30％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.90(s,1H,NH),7.88(s,1H,ArH),7.78(s,1H,ArH),7.68(d,J＝7.6Hz,2H,ArH),7.37(d,J＝8.8Hz,3H,ArH),7.28(d,J＝7.4Hz,2H,ArH),6.86(dd,J＝15.7,8.7Hz,3H,ArH),4.54(s,2H,CH2),3.77(s,3H,OCH3),3.34(t,J＝2.2Hz,2H,CH2),2.48(t,J＝2.2Hz,2H,CH2).ESI-MS(m/z):400.47[M-H]-；理论计算值：C24H23N3O3 400.43[M-H]-。
(15)3-(4'-氰基-[1,1'-联苯]-3-基)-1-(2-羟乙基)-1-(3-氟苄基)脲(6d)的制备
将0.37g(1mmol)中间体5d，0.17g(1.2mmol)4-氰基苯硼酸，57mg(0.05mmol)四(三苯基膦)钯,0.41g(3mmol)碳酸钾溶于24mL 1,4-二氧六环和6mL水的混合溶液中，于95℃，氮气保护下反应14小时。旋干混合液，得到粗产物。粗产物用硅胶柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝3：1)，得白色固体168mg，收率38％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.94(s,1H,NH),7.86(s,1H,ArH),7.78(s,1H,ArH),7.68(d,J＝7.6Hz,2H,ArH),7.37(d,J＝8.8Hz,3H,ArH),7.28(d,J＝7.4Hz,2H,ArH),6.86(dd,J＝15.7,8.7Hz,3H,ArH),4.54(s,2H,CH2),3.34(t,J＝2.2Hz,2H,CH2),2.48(t,J＝2.2Hz,2H,CH2).ESI-MS(m/z):388.15[M-H]-；理论计算值：C23H20FN3O2388.13[M-H]-。
(16)1-(4'-氰基-[1,1'-联苯]-3-基)-3-(3-甲氧基苄基)脲(6e)的制备
将0.37g(1mmol)中间体5e，0.17g(1.2mmol)4-氰基苯硼酸，57mg(0.05mmol)四(三苯基膦)钯,0.41g(3mmol)碳酸钾溶于24mL 1,4-二氧六环和6mL水的混合溶液中，于95℃，氮气保护下反应14小时。旋干混合液，得到粗产物。粗产物用硅胶柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝3：1)，得白色固体78mg，收率31％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.90(s,1H,NH),7.88(s,4H,ArH),7.78(s,1H,ArH),7.68(d,J＝7.6Hz,2H,ArH),7.37(d,J＝8.8Hz,3H,ArH),7.28(d,J＝7.4Hz,2H,ArH),6.86(s,1H,NH),4.54(s,2H,CH2),3.77(s,3H,OCH3).ESI-MS(m/z):356.15[M-H]-；理论计算值：C22H19N3O2356.03[M-H]-。
(17)1-(4'-氰基-[1,1'-联苯]-3-基)-3-(3-氟苄基)脲(6f)的制备
将0.32g(1mmol)中间体5f，0.17g(1.2mmol)4-氰基苯硼酸，57mg(0.05mmol)四(三苯基膦)钯,0.41g(3mmol)碳酸钾溶于24mL 1,4-二氧六环和6mL水的混合溶液中，于95℃，氮气保护下反应14小时。旋干混合液，得到粗产物。粗产物用硅胶柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝3：1)，得白色固体120mg，收率37％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.90(s,1H,NH),7.88(s,4H,ArH),7.78(s,1H,ArH),7.68(d,J＝7.6Hz,2H,ArH),7.37(d,J＝8.8Hz,3H,ArH),7.28(d,J＝7.4Hz,2H,ArH),6.86(s,1H,NH),4.56(s,2H,CH2).ESI-MS(m/z):346.13[M+H]-；理论计算值：C21H16FN3O 346.22[M+H]-.
(18)3'-(3-(2-(二甲基氨基)乙基)-3-(3-甲氧基苄基)脲基)-[1,1'-联苯]-4-羧酰胺(7a,代号MJ-5-3)的制备
将0.22g(0.5mmol)中间体6a，0.35g(2.5mmol)碳酸钾溶于3mL的二甲基亚砜中，缓慢滴加30％过氧化氢2mL，室温反应2小时，将反应液用乙酸乙酯(3×15mL)萃取，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，滤液旋蒸，用硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝50：1)，得白色固体150mg，收率80％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.16(s,1H),8.02(s,1H,CONH),7.97(d,J＝7.6Hz,2H,ArH),7.78(s,1H,CONH),7.68(d,J＝7.6Hz,2H,ArH),7.33(m,5H,ArH),6.86(dd,J＝15.7,8.7Hz,3H,ArH),4.54(s,2H,CH2),3.74(s,3H,OCH3),3.37(s,2H,CH2),2.44(s,2H,CH2),2.26(s,6H,(CH3)2).13C NMR(151MHz,DMSO-d6):δ168.10,159.86,156.66,143.54,142.03,141.00,140.09,133.56,130.01,129.74,128.66(2C),126.80(2C),120.49,120.06,118.95,117.71,113.70,112.65,59.40,55.44(2C),50.63,45.66(2C).ESI-MS(m/z):892.78[2M+H]+；理论计算值：C26H30N4O3 892.46[2M+H]+。
(19)3'-(3-(2-(二甲基氨基)乙基)-3-(3-氟苄基)脲基)-[1,1'-联苯]-4-羧酰胺(7b,代号MJ-6-3)的制备
将0.20g(0.5mmol)中间体6b，0.35g(2.5mmol)碳酸钾溶于3mL的二甲基亚砜中，缓慢滴加30％过氧化氢2mL，室温反应2小时，将反应液用乙酸乙酯(3×15mL)萃取，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，滤液旋蒸，用硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝50：1)，得白色固体155mg，收率71％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.25(s,1H,NH),8.02(s,1H,CONH),7.97(d,J＝7.6Hz,2H,ArH),7.78(s,1H,CONH),7.68(d,J＝7.6Hz,2H,ArH),7.39(m,4H,ArH),7.29(d,J＝6.8Hz,1H,ArH),7.12(m,3H,ArH),4.58(s,2H,CH2),3.40(s,2H,CH2),2.46(s,2H,CH2),2.27(s,6H,(CH3)2).13C NMR(151MHz,DMSO-d6):δ168.09,162.77(d,JC-F＝243.1HZ),156.69,143.53,142.59(d,JC-F＝6.1HZ),141.95,140.12,133.56,130.85(d,JC-F＝7.5HZ),129.76,128.66(2C),126.81(2C),123.89(d,JC-F＝3.1HZ),120.57,118.97,117.73,114.53(d,JC-F＝22.7HZ),114.18(d,JC-F＝21.1HZ),59.48,50.36,45.89,45.63(2C).ESI-MS(m/z):433.34[M-H]-；理论计算值:C25H27FN4O2433.21[M-H]-。
(20)3'-(3-(2-羟乙基)-3-(3-甲氧基苄基)脲基)-[1,1'-联苯]-4-羧酰胺(7c,代号MJ-3-3)的制备
将0.20g(0.5mmol)中间体6c，0.35g(2.5mmol)碳酸钾溶于3mL的二甲基亚砜中，缓慢滴加30％过氧化氢2mL，室温反应2小时，将反应液用乙酸乙酯(3×15mL)萃取，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，滤液旋蒸，用硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝25：1)，得白色固体150mg，收率72％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.81(s,1H,NH),8.01(s,1H,CONH),7.97(d,J＝7.6Hz,2H,ArH),7.79(s,1H,CONH),7.68(d,J＝7.5Hz,2H,ArH),7.49(d,J＝7.9Hz,1H,ArH),7.31(m,4H,ArH),6.85(t,J＝10.9Hz,3H,ArH),5.26(s,1H,OH),4.59(s,2H,CH2),3.74(s,3H,OCH3),3.59(t,J＝6.9Hz,2H,CH2),3.41(t,J＝6.3Hz,2H,CH2).13C NMR(151MHz,DMSO-d6):δ168.07,159.85,156.29,143.44,141.64,140.97,139.96,133.55,130.01,129.61,128.63(2C),126.79(2C),120.70,119.89,119.34,118.14,113.57,112.57,60.33,55.43,50.44,49.49.ESI-MS(m/z):876.94[2M+K]+；理论计算值：C24H25N3O4 877.13[2M+K]+。
(21)3'-(3-(2-羟乙基)-3-(3-氟苄基)脲基)-[1,1'-联苯]-4-羧酰胺(7d,代号MJ-4-3)的制备
将0.19g(0.5mmol)中间体6d，0.35g(2.5mmol)碳酸钾溶于3mL的二甲基亚砜中，缓慢滴加30％过氧化氢2mL，室温反应2小时，将反应液用乙酸乙酯(3×15mL)萃取，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，滤液旋蒸，用硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝80：1)，得白色固体126mg，收率71％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.84(s,1H,NH),8.02(s,1H,CONH),7.97(d,J＝7.8Hz,2H,ArH),7.80(s,1H,CONH),7.69(d,J＝7.8Hz,2H,ArH),7.49(d,J＝7.8Hz,1H,ArH),7.36(m,4H,ArH),7.12(m,3H,ArH),5.31(s,1H,OH),4.63(s,2H,CH2),3.60(t,J＝6.9Hz,2H,CH2),3.44(t,J＝6.4Hz,2H,CH2).13C NMR(151MHz,DMSO-d6):δ168.08,165.84(d,JC-F＝244.6HZ),156.30,143.43,142.56(d,JC-F＝6.1HZ),141.55,139.99,133.57,130.85(d,JC-F＝7.5HZ),129.62,128.63(2C),126.80(2C),123.72(d,JC-F＝3.1HZ),120.79,119.38,118.17,114.39(d,JC-F＝21.1HZ),114.14(d,JC-F＝21.1HZ),60.38,50.15,49.68.ESI-MS(m/z):408.50[M+H]+；理论计算值：C23H22FN3O3408.16[M+H]+.
(22)3'-(3-(3-甲氧基苄基)脲基)-[1,1'-联苯]-4-羧酰胺(7e,代号MJ-1-3)的制备
将0.18g(0.5mmol)中间体6e，0.35g(2.5mmol)碳酸钾溶于3mL的二甲基亚砜中，缓慢滴加30％过氧化氢2mL，室温反应2小时，将反应液用乙酸乙酯(3时，将反应)萃取，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，滤液旋蒸，用硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝50：1)，得白色固体150mg，收率80％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.75(s,1H,NH),8.01(s,1H,CONH),7.96(d,J＝7.8Hz,2H,ArH),7.82(s,1H,CONH),7.67(d,J＝7.8Hz,2H,ArH),7.37(m,5H,ArH),6.89(d,J＝7.5Hz,2H,ArH),6.81(d,J＝8.1Hz,1H,ArH),6.73(s,1H,NH),4.30(s,2H,CH2),3.74(s,3H,OCH3).13C NMR(151MHz,DMSO-d6):δ168.08,159.81,155.74,143.53,142.44,141.57,140.24,133.56,129.87,128.63(2C),127.97,126.83(2C),120.25,119.73,117.88,116.59,113.28,112.49,55.45,43.18.ESI-MS(m/z):772.96[2M+Na]+；理论计算值：C22H21N3O3 772.99[2M+Na]+。
(23)3'-(3-(3-氟苄基)脲基)-[1,1'-联苯]-4-羧酰胺(7f,代号MJ-8-3)的制备
将0.17g(0.5mmol)中间体6f，0.35g(2.5mmol)碳酸钾溶于3mL的二甲基亚砜中，缓慢滴加30％过氧化氢2mL，室温反应2小时，将反应液用乙酸乙酯(3时，将反应)萃取，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，滤液旋蒸，用硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝50：1)，得白色固体155mg，收率89％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.82(s,1H,NH),8.02(s,1H,CONH),7.96(d,J＝7.5Hz,2H,ArH),7.82(s,1H,CONH),7.67(d,J＝7.5Hz,2H,ArH),7.37(m,4H,ArH),7.25(d,J＝7.5Hz,1H,ArH),7.11(m,3H,ArH),6.83(s,1H,NH),4.34(s,2H,CH2).13C NMR(151MHz,DMSO-d6):δ168.11,161.73(d,JC-F＝244.6HZ),155.79,144.07(d,JC-F＝7.6HZ),143.52,141.51,140.23,133.55,130.70(d,JC-F＝7.6HZ),129.84,128.63(2C),126.83(2C),123.49(d,JC-F＝3.1HZ),120.32,117.95,116.65,114.12(d,JC-F＝22.1HZ)113.87(d,JC-F＝21.1HZ),42.74.ESI-MS(m/z):362.06[M-H]-,理论计算值:C21H18FN3O2 362.14[M-H]-。
实施例2化合物对ROCK I的抑制活性检测
通过迀移率检测技术(Mobility shift assay)测试化合物在针对ROCK1的抑制活性。具体方法如下：
实验原理：用迀移率实验测酶活时，反应的底物是带有荧光标记的多肽，在反应体系酶的作用下，底物转变为产物，同时其所带的电荷也发生了相应的变化，在分离管路电压的作用下，带不同电荷的底物和产物被分离并检测。
(1)化合物的准备：使用100％DMSO对化合物进行稀释。
(2)实验分组：阴性对照组：不加化合物的空白组；阳性对照组：法舒地尔；小分子待测化合物组。
(3)激酶反应：配置2.5倍激酶溶液：在1倍激酶缓冲液中加入激酶，形成2.5倍激酶溶液；配置2.5倍底物溶液：将FAM标记的底物肽和ATP加入1倍激酶缓冲液，形成2.5倍底物溶液；向含有5μL的化合物溶液的384孔反应板中加入10μL的2.5倍激酶溶液，并在室温下孵育10分钟；向384孔反应板中加入10μL的2.5倍底物溶液，在28℃下反应1h后加入25μL终止液终止反应。
(4)从Caliper上复制转化率数据
(5)计算抑制率：把转化率换算成抑制率。对ROCKI的抑制率＝(Max-conversion)/(Max-Min)*100“conversion”代表化合物组的转化率；“max”代表未加化合物的DMSO对照；“min”代表低对照。
实验结果如表1所示：
表1.化合物对ROCK1的抑制活性检测
Figure BDA0002936498070000171
Figure BDA0002936498070000181
实施例3：化合物体外抑制肿瘤细胞增殖实验
(1)实验材料：人肺癌细胞A549，人肝癌细胞HepG2，人胃癌细胞AGS，96-孔板，细胞计数板，DMEM培养基，F12K培养基，胎牛血清，青霉素－链霉素混合溶液，胰酶，PBS缓冲液，CCK8、二甲基亚砜(DMSO),多功能酶标仪(BioTek)，待测化合物，阳性对照药：法舒地尔
(2)实验方法：取对数生长期的肿瘤细胞，用胰酶消化制成单细胞悬液，细胞计数，按每孔5000个细胞稀释，均匀接种于96孔板上，每孔100μL。另设空白对照：仅有相同体积培养基；阴性对照：只加细胞悬液、不加药。24小时后，吸掉96孔板中的培养基，向实验孔中加入100μL不同浓度的待测化合物，每个浓度设定4个复孔，阴性对照孔和空白对照孔分别加入100μL培养基。在37℃、5％CO2的培养箱中孵育24h后，每孔弃去100μL后，加入含有10％CCK8的培养基100μL，再在37℃，5％CO2培养箱中孵育1.5h后，用多功能酶标仪(BioTek)测定在450nm时的OD值，然后再进行数据处理。
(3)计算抑制率：抑制率％＝(阴性对照组OD值－实验组OD值)/(阴性对照组OD值一空白组OD值)，用Graphpadprism 8软件计算IC50值。
实验结果如表2所示。
表2.化合物体外抑制肿瘤细胞增殖实验结果
Figure BDA0002936498070000182
由结果可知，本发明化合物对A549，HepG2和AGS三株肿瘤细胞的抗增殖作用均优于法舒地尔，对A549的增殖抑制作用尤其显著，明显优于阳性对照。
实施例4：化合物体外抑制肿瘤细胞迁移实验
(1)实验材料：人肺癌细胞A549，人肝癌细胞HepG2，人胃癌细胞AGS，6孔板，细胞计数板，DMEM培养基，F12K培养基，胎牛血清，青霉素－链霉素混合溶液，胰酶，PBS缓冲液，二甲基亚砜(DMSO)，倒置生物显微镜，直尺，待测化合物，阳性对照药：法舒地尔
(2)实验方法：取对数生长期的肿瘤细胞，用胰酶消化制成单细胞悬液，细胞计数，按每孔50000个细胞稀释，均匀接种于6孔板上，每孔2ml。另设阴性对照：只加细胞悬液、不加药。12小时后，借助直尺用20μL的灭菌枪头在每孔划2条竖直的线，用PBS洗去划下的细胞，向实验孔中加入2ml不同浓度的待测化合物，每个浓度设定2个复孔，阴性对照孔加入2ml培养基。在37℃，5％CO2的培养箱中孵育，按照0h、48h在倒置生物显微镜下观察、拍照，然后ImageJ进行数据处理。
(3)计算迁移抑制率：迁移抑制率＝(阴性对照组0h距离值—实验组48距离值)/(阴性对照组0h距离值—阴性对照组48h距离值)。
化合物在7.8μM下对三株肿瘤细胞的抑制率如表3所示。
表3.化合物在7.8μM下对三株肿瘤细胞的抑制率
Figure BDA0002936498070000191
化合物在15.6μM下对三株肿瘤细胞的抑制率如表4所示。
表4.化合物在15.6μM下对三株肿瘤细胞的抑制率
Figure BDA0002936498070000192
由结果可知，本发明化合物对A549,HepG2和AGS三株肿瘤细胞的抑制迁移的作用均优于法舒地尔，且具有浓度依赖性，随着浓度的升高迁移抑制率增大。
实施例5：化合物与ROCKI的对接研究
实验原理：SYBYL是美国Tripos公司开发的计算机分子模拟软件，其中Surflex-Dock分子对接模块采用独特的经验打分函数和拥有专利的搜索引擎(基于分子相似性的搜索引擎)将配体分子对接到蛋白的结合位点，属于柔性对接技术，同时支持考虑生物大分子蛋白残基柔性的对接，是化合物虚拟活性筛选的主要考量因素，可为发现新型ROCK靶点先导化合物及其结构改造和修饰提供理论支撑和技术指导。
实验步骤：
1)从蛋白质数据库中下载ROCKⅠ复合物晶体结构2ESM；
2)配体优化：在对接软件中画出配体分子，进一步优化处理在SYBYL配体准备模块(ligand structure preparation)进行。首先，对配体分子进行加氢处理；然后，进行能量优化，参数设置如下：力场设定为Tripos力场，能量优化计算方法为Powell，梯度为
Figure BDA0002936498070000201
最大迭代次数为10,000次。
3)受体优化：在SYBYL Surflex-Dock蛋白准备模块(prepare proteinstructure)对2ESM进行优化处理。首先将复合物晶体结构中的配体抽提出来，对蛋白进行加氢处理。然后，以复合物晶体结构中配体分子的坐标为中心生成原型分子即对接口袋，保存当前生成的文件用于下一步分子对接操作。
4)配体分子与ROCKI蛋白分子对接：为了检验分子对接软件的对接效果，并进一步确定ROCK I抑制剂与蛋白对接的合适参数，在SYBYL Surflex-Dock模块，将配体分子对接回蛋白活性口袋。选择Surflex-Dock对接模式，导入处理后的受体分子和配体分子，对接参数设置如下：每个片段的最大生成构象(Max conformations per Fragment)为20，每个配体分子最大输出构象(Maximum Number of Poses per Ligand)为20，最终保留对接构象间的RMSD值(Minimum RMSD Between FinalPoses)为
Figure BDA0002936498070000202
为了比较对接构象与结晶构象之间的差异，设定2ESM中。
结果分析：如图3所示，MJ-6-3的空间伸展方向与阳性对照法舒地尔基本相似，但MJ-6-3能同时伸入ROCK I的活性结合域(A口袋和D口袋)。图4是MJ-6-3与靶标ROCK I对接情况，显示MJ-6-3不仅能通过柔性取代基的伸展而伸入关键结合腔A口袋并与其中关键氨基酸Met156，Asp216形成氢键相互作用，同时与Glu154形成额外的氢键从而增强与靶点的亲合力，这些均是法舒地尔所不能比拟的，这从一定程度上也可以解释，MJ-6-3比法舒地尔具有更好的肿瘤细胞增殖以及迁移抑制活性这一结果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (31)

1.一种联苯甲酰胺脲类化合物，其特征在于，选自通式(I)及其药学上可接受的盐、同位素标记物；
Figure FDA0003770699770000011
所述联苯甲酰胺脲类化合物选自以下结构：
3'-(3-(2-(二甲基氨基)乙基)-3-(3-甲氧基苄基)脲基)-[1,1'-联苯]-4-羧酰胺，代号MJ-5-3，其结构式为：
Figure FDA0003770699770000012
3'-(3-(2-(二甲基氨基)乙基)-3-(3-氟苄基)脲基)-[1,1'-联苯]-4-羧酰胺，代号MJ-6-3，其结构式为：
Figure FDA0003770699770000013
3'-(3-(2-羟乙基)-3-(3-甲氧基苄基)脲基)-[1,1'-联苯]-4-羧酰胺，代号MJ-3-3其结构式为：
Figure FDA0003770699770000014
3'-(3-(2-羟乙基)-3-(3-氟苄基)脲基)-[1,1'-联苯]-4-羧酰胺，代号MJ-4-3，其结构式为：
Figure FDA0003770699770000015
3'-(3-(3-甲氧基苄基)脲基)-[1,1'-联苯]-4-羧酰胺，代号MJ-1-3，其结构式为：
Figure FDA0003770699770000021
3'-(3-(3-氟苄基)脲基)-[1,1'-联苯]-4-羧酰胺，代号MJ-8-3，其结构式为：
Figure FDA0003770699770000022
2.权利要求1所述的联苯甲酰胺脲类化合物的制备方法，其特征在于，反应路线如下：
Figure FDA0003770699770000023
以3-溴苯基异氰酸酯和含有R1取代基的苯甲醛为起始原料，经亲核加成、消除、还原，成脲，铃木反应，氰基水解反应得到联苯甲酰胺脲类化合物，所述R1和R2与权利要求1限定相同。
3.根据权利要求2所述的联苯甲酰胺脲类化合物的制备方法，其特征在于，所述反应试剂及条件为：
b：二甲氨基乙胺/2-氨基乙醇，硼氢化钠，无水甲醇，0℃至室温；
c：三乙胺，无水四氢呋喃，0℃至室温；
d：碳酸钾，四(三苯基膦)钯，4-氰基苯硼酸，1,4-二氧六环和水，95℃；
e：碳酸钾，30％过氧化氢，二甲基亚砜，室温。
4.根据权利要求2所述的联苯甲酰胺脲类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)向含有R1取代基的苯甲醛的无水甲醇溶液中加入二甲氨基乙胺，室温反应10-20分钟，降温至0℃再加入硼氢化钠，后升至室温反应1-3小时，得到中间体4；
(2)0℃下向中间体4和三乙胺的无水四氢呋喃溶液中缓慢滴加中间体2，即3-溴苯基异氰酸酯的四氢呋喃溶液，滴毕室温反应2-4小时，得到中间体5；
(3)将4-氰基苯硼酸与中间体5溶于1,4-二氧六环和水的混合溶剂中，加入催化剂四(三苯基膦)钯和碳酸钾，在氮气保护，80-100℃条件下反应10-18小时，制得中间体6；
(4)将中间体6和碳酸钾溶于二甲基亚砜溶液中，滴加过氧化氢溶液，滴毕室温反应1-3小时，即得联苯甲酰胺脲类化合物。
5.根据权利要求4所述的联苯甲酰胺脲类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，室温反应15分钟。
6.根据权利要求4所述的联苯甲酰胺脲类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，加入硼氢化钠，后升至室温反应2小时。
7.根据权利要求4所述的联苯甲酰胺脲类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，含有R1取代基的苯甲醛、二甲氨基乙胺、硼氢化钠摩尔比为1.5-3：1.5-3：0.5-1.5，所用溶剂量为每毫摩尔含R1取代基的苯甲醛用无水甲醇3-10mL。
8.根据权利要求7所述的联苯甲酰胺脲类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，含有R1取代基的苯甲醛、二甲氨基乙胺、硼氢化钠摩尔比为2：2：1，所用溶剂量为每毫摩尔含R1取代基的苯甲醛用无水甲醇5mL。
9.根据权利要求4所述的联苯甲酰胺脲类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，滴毕室温反应3小时。
10.根据权利要求4所述的联苯甲酰胺脲类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，中间体4，三乙胺，中间体2的摩尔比为0.5-1.5：1-3：1-2，所用溶剂量为每毫摩尔中间体4用无水四氢呋喃8-12mL。
11.根据权利要求10所述的联苯甲酰胺脲类化合物的制备方法，其特征在于，所述中间体4，三乙胺，中间体2的摩尔比为1：2：1.2，所用溶剂量为每毫摩尔中间体4用无水四氢呋喃10mL。
12.根据权利要求4所述的联苯甲酰胺脲类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，95℃条件下反应14小时。
13.根据权利要求4所述的联苯甲酰胺脲类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述中间体5、4-氰基苯硼酸、四(三苯基膦)钯、碳酸钾的摩尔比为0.5-1.2：1-2：0.02-0.1：2-4，所用溶剂量为每毫摩尔中间体5使用20-30mL的1，4-二氧六环和5-10mL的水。
14.根据权利要求13所述的联苯甲酰胺脲类化合物的制备方法，其特征在于，所述中间体5、4-氰基苯硼酸、四(三苯基膦)钯、碳酸钾的摩尔比为1：1.2：0.05：3，所用溶剂量为每毫摩尔中间体5使用24mL的1，4-二氧六环和6mL的水。
15.根据权利要求4所述的联苯甲酰胺脲类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述过氧化氢浓度为30％。
16.根据权利要求4所述的联苯甲酰胺脲类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，滴毕室温反应2小时。
17.根据权利要求4所述的联苯甲酰胺脲类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述中间体6，碳酸钾的摩尔比为0.5-2：4-8，所用溶剂量为每毫摩尔中间体6使用5-10mL的二甲基亚砜和3-6mL的30％过氧化氢。
18.根据权利要求17所述的联苯甲酰胺脲类化合物的制备方法，其特征在于，所述中间体6，碳酸钾的摩尔比为1：5，所用溶剂量为每毫摩尔中间体6使用6mL的二甲基亚砜和4mL的30％过氧化氢。
19.根据权利要求2所述的联苯甲酰胺脲类化合物的制备方法，其特征在于，还包括3-溴苯胺制备3-溴苯基异氰酸酯的过程，即：
Figure FDA0003770699770000041
3-溴苯胺制备3-溴苯基异氰酸酯的过程包括：0℃下将三光气溶于溶剂中，然后缓慢滴加3-溴苯胺溶液，滴加完毕在75℃下反应6小时，得到中间体2，即为3-溴苯基异氰酸酯。
20.根据权利要求19所述的联苯甲酰胺脲类化合物的制备方法，其特征在于，所述反应试剂及条件为：a：三光气，无水乙酸乙酯。
21.根据权利要求19所述的联苯甲酰胺脲类化合物的制备方法，其特征在于，所述三光气和3-溴苯胺的摩尔比为0.5-1.5：1-3，三光气和3-溴苯胺的溶剂为无水乙酸乙酯；所用溶剂的用量为每毫摩尔的三光气用15mL溶剂。
22.根据权利要求21所述的联苯甲酰胺脲类化合物的制备方法，其特征在于，所述三光气和3-溴苯胺的摩尔比为1：2。
23.一种药物组合物，其包括权利要求1所述的联苯甲酰胺脲类化合物、其药学上可接受的盐或同位素标记物以及药学上可接受的载体或赋形剂。
24.根据权利要求23所述的一种药物组合物，其特征在于，所述载体为固体或者液体。
25.根据权利要求23所述的一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物制成口服制剂或肠胃外给药制剂。
26.根据权利要求23所述的一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为片剂、丸剂、胶囊或注射剂。
27.根据权利要求23所述的一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为抗肿瘤药物。
28.权利要求1所述的联苯甲酰胺脲类化合物、其药学上可接受的盐或同位素标记物在制备抗肿瘤药物中的应用。
29.根据权利要求28所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为抗肿瘤增殖和/或迁移活性的药物。
30.权利要求1所述的联苯甲酰胺脲类化合物MJ-6-3、MJ-3-3、MJ-4-3，其药学上可接受的盐或同位素标记物在制备预防和/或治疗与ROCK相关疾病的药物中的应用。
31.根据权利要求30所述的应用，其特征在于，所述药物为ROCK抑制剂。
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