CN110563703B

CN110563703B - 基于crbn配体诱导parp-1降解的化合物及制备方法和应用

Info

Publication number: CN110563703B
Application number: CN201910881556.9A
Authority: CN
Inventors: 张智敏; 沈正荣; 黄文海; 曾申昕; 章迟啸; 马臻; 梁美好; 王尊元
Original assignee: Zhejiang Academy of Medical Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Medical Sciences
Priority date: 2019-09-18
Filing date: 2019-09-18
Publication date: 2021-04-09
Anticipated expiration: 2039-09-18
Also published as: CN110563703A

Abstract

本发明公开了一种基于CRBN配体诱导PARP‑1降解的化合物及制备方法和应用，通过使用连接链将PARP‑1小分子抑制剂和E3泛素连接酶复合体中cereblon蛋白配体连接获得双功能小分子。本发明还公开了所述化合物的制备方法和所述化合物的药物组合物，以及所述化合物和药物组合物在制备预防或/和治疗癌症的药物中的应用。所述化合物仅需较少用量即可诱导PARP‑1降解，能减轻对人体的毒副作用；还能表现出优异的PARP‑1降解作用和抗癌活性，其抗癌效果优于PARP‑1抑制剂，可用于预防或/和治疗多种癌症，在医药领域具有巨大的应用前景。

Description

基于CRBN配体诱导PARP-1降解的化合物及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及药物化合物合成领域，具体涉及一种基于CRBN配体诱导PARP-1降解的化合物及制备方法和应用。

背景技术

Cereblon是由人类CRBN基因编码的蛋白，CRBN同源基因是高度保守的，这表明它在生理学中的重要性。Cereblon与损伤DNA结合蛋白1(DDBl)、Cullin-4A(CUL4A)以及Cullin-1调节器(ROCI)组成E3泛素连接酶复合体，该复合体能泛素化一系列蛋白，但具体机制尚不清楚。Cereblon泛素化靶蛋白导致成纤维细胞生长因子8(FGFB)和成纤维细胞生长因子10(FGF10)增多，说明泛素化酶复合体对于胚胎肢体生长十分重要。

研究表明：来那度胺具有抗肿瘤、免疫调节和抗血管生成等多重作用，且来那度胺可以结合cereblon，从而引发转录因子lkaros(IKZFl)和Aiolos(IKZF3)的泛素化和降解，这些转录因子对于多发性骨髓瘤的生长极其重要。在目前的多发性骨髓瘤的治疗中，高表达的cereblon与泊马度胺或类似药物的疗效密切相关。

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerases，PARP]是一类广泛存在于真核细胞中的核酶，具有介导DNA修复以及维持基因组功能完整性等功能。迄今研究发现，PARP酶家族至少有18个成员，PARP-1在各亚型中含量最高，它在细胞内ADP-核糖基化过程中发挥着90％以上的作用，并且在真核生物中具有高度进化保守性，对其研究也最为深入。PARP-1通过介导腺苷二磷酸核糖(ADP-核糖)聚合，并将其从烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)转移到受体蛋白，参与单链损伤DNA的碱基切除修复通路。为维持正常生理功能，细胞必须有多种DNA损伤发现和修复机制，使受损的DNA得到及时精确的修复。现在很多抗癌药物都是通过损伤肿瘤细胞的DNA达到杀灭肿瘤的目的。但肿瘤细胞能够激活自身DNA损伤修复体系进行修复，从而对此类抗癌疗法产生耐性。因此，肿瘤治疗的一个重要途径是阻断DNA修复通路。PARP-1已成为有效的抗肿瘤靶点，多个PARP-1抑制剂已经上市用于多种癌症的治疗。但是，抑制PARP-1往往需要将药物长期维持在较高的浓度，有可能造成严重的副作用。因此，亟待开发一种在较少药物使用剂量条件下，仍具有较好的抗肿瘤效果的新型PARP-1蛋白降解靶向联合体。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种基于CRBN配体诱导PARP-1降解的化合物及制备方法和制备药物组合物中的应用，该化合物不仅具有优异的PARP-1降解作用和抗癌活性，还能减轻对人体的毒副作用，可用于制备抗肿瘤药物。

本发明的另一目的在于提供了上述化合物或其药学上可接受的盐和水合物在制备预防或/和治疗癌症的药物中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种基于CRBN配体诱导PARP-1降解的化合物，包括下式I所示的化合物及其药学上可接受的盐和水合物：

其中，n为1～15的整数。

本发明通过使用连接链将PARP-1小分子抑制剂和E3泛素连接酶复合体中cereblon蛋白配体进行连接制得一种蛋白降解靶向联合体(PROTACs)双功能小分子，能够选择性诱导PARP-1降解，具有较好的抗肿瘤活性。

优选地，n为3～12的整数，优选的化合物具有比较好的诱导PARP-1降解作用和抗肿瘤活性。

进一步优选，n为4～10的整数，优选的化合物具有更好的诱导PARP-1降解作用和抗肿瘤活性。

所述的式I所示的化合物为式1-1所示的化合物、式1-2所示的化合物或式1-3所示的化合物；

本发明还包括式(I)所示的化合物的立体异构体。本发明化合物的所有立体异构体，包括但不限于非对映异构体、对映异构体和阻转异构体以及他们的混合物(如外消旋物)，均包括在本发明的范围内。

还包括式(I)所示的化合物的互变异构体。属于“互变异构体”或“互变异构形式”是指经由低能垒相互转化的不同能量的结构异构体。

本发明还包括式(I)的衍生物的前药，式(I)的衍生物自身可能具有较弱的活性甚至没有活性，但是在给药后，在生理条件下(例如通过代谢、溶剂分解或另外的方式)被转化成相应的生物活性形式。

药学上可接受的盐包括：与下列酸形成的加成盐:盐酸、氢嗅酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、茶二磺酸、乙酸、丙酸、乳酸、三氟乙酸、马来酸、柠檬酸、富马酸、草酸、酒石酸或苯甲酸；以及盐酸、氢嗅酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、马来酸、苯磺酸或琉拍酸的酸成盐。

一种药物组合物，包括式(I)所述的化合物或其药学上可接受的盐和水合物，和药学上可接受的赋形剂。

其中，式(I)所述的化合物或其药学上可接受的盐和水合物作为活性成份，与药学上可接受的赋形剂混合制成药物组合物，所述的赋形剂为用于药学领域的稀释剂、辅助剂或载体。

一种在药物组合物中加入药学上可接受的辅料制成的临床上可接受的剂型。所述的剂型为注射剂、片剂或胶囊剂。

一种药物组合物，包括式(I)所述的化合物或其药学上可接受的盐和水合物，和不同的抗肿瘤药剂。本发明所述的化合物或其药学上可接受的盐、水合物和前药可作为抗肿瘤药剂单独使用，还可以与不同的抗肿瘤药剂联合使用，用于治疗预防肿瘤。

本发明还公开了式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐和水合物在制备预防或/和治疗癌症的药物中的应用。

所述的癌症为多发性骨髓瘤、胃癌、肺癌、乳腺癌、食管癌、结肠癌、髓母细胞瘤、急性粒细胞白血病、慢性白血病、前列腺癌、肝细胞瘤、肾细胞瘤、宫颈癌、皮肤癌、卵巢癌、结肠癌、神经胶质瘤、甲状腺癌或胰腺癌。

所述的式I所示的化合物的制备方法，由如下反应式制得:

其中，n的定义与式I中一致；

具体步骤包括：将式II所示的化合物与来那度胺混合溶于有机溶剂，反应得到式III所示的化合物，再将式III所示的化合物与式IV所示的化合物混合溶于有机溶剂，反应得到式I所示的化合物。

一种式I所示的化合物的制备方法，包括以下步骤：

1)在反应器中加入来那度胺和式II所示的化合物，加入N,N-二甲基甲酰胺溶解，随后加入HATU和三乙胺，氮气保护下15℃～35℃反应8～16小时。待反应完全后将反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取，合并有机相饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，降压蒸馏，得白色粗品；取白色粗品加入三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶剂，15℃～35℃反应1～3小时，反应结束后加入甲苯降压旋蒸得粗品，甲醇重结晶得式III所示的化合物；

2)在反应器中加入式III所示的化合物、式IV所示的化合物加入N,N-二甲基甲酰胺溶解，随后加入HATU和三乙胺，氮气保护下15℃～35℃反应8～16小时，待反应完全后将反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取，合并有机相饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，降压蒸馏，得为经纯化的白色粗品，硅胶层析分离得式I所示的化合物；

其中，式I中n与式III、式II中n具有相同含义，n为1～15的整数。

步骤1)中，所述的式II所示的化合物为8-((叔丁氧羰基)氨基)辛酸(式II所示的化合物，n为5)、11-((叔丁氧羰基)氨基)十一酸(式II所示的化合物，n为8)或12-((叔丁氧羰基)氨基)十二酸(式II所示的化合物，n为9)。

所述的来那度胺、式II所示的化合物、HATU、三乙胺的摩尔比为10mmol：10mmol：10.5mmol：10.5mmol，

三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶剂中，三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1:5；

步骤2)中，所述的式III所示的化合物、式IV所示的化合物、HATU、三乙胺的摩尔比为1mmol：1mmol：10.5mmol：10.5mmol。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明式(I)所述的双功能小分子可以对PARP-1进行泛素化标记，仅需较少用量即可诱导蛋白降解，这个过程类似于催化反应，并不需要等摩尔量的药物，能减轻对人体的毒副作用；

(2)本发明体外抗肿瘤活性测试及体外PARP-1蛋白降解活性测试表明，式(I)所述的双功能小分子表现出了优异的PARP-1蛋白降解作用和抗癌活性，其抗癌效果优于PARP-1抑制剂，可用于预防或/和治疗多种癌症，在医药领域具有巨大的应用前景。

(3)式(I)化合物仅需较少用量即可诱导PARP-1降解，能减轻对人体的毒副作用；还能表现出优异的PARP-1降解作用和抗癌活性，其抗癌效果优于PARP-1抑制剂，可用于预防或/和治疗多种癌症，在医药领域具有巨大的应用前景。

附图说明

图1为实施例1～3制得的化合物对PARP-1的降解效果图，其中，横坐标为化合物，1为化合物1-1，2为化合物1-2，3为化合物1-3；

图2为化合物1-2对SW620细胞的增殖抑制图，其中，横坐标为lg[浓度(μM)]，纵坐标为抑制率；

图3为化合物1-1的核磁图谱。

具体实施方式

下文中提供的实施例和制备例进一步阐明和举例说明本发明化合物及其制备方法。应当理解，下述实例和制备例的范围并不以任何方式限制本发明的范围。本发明的原料可以从商业途径获得或通过本领域已知的方法制备。

化合物的结构通过核磁共振(¹H-NMR)和高分辨质谱(HRMS)来确定，NMR测定是用ACF-400BRUK型核磁共振仪，测定溶剂为氘代氯仿(CDC1₃)或氘代二甲亚砜(DMSO-D₆)，TMS为内标。柱层析采用200-300目硅胶。

实施例1：

(1)制备8-氨基-N-(2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1-氧代异偶姻-4-基)八酰胺(2-1)：

在50mL的圆底烧瓶中加入来那度胺(10mmol)和8-((叔丁氧羰基)氨基)辛酸(10mmol)，加入10mL无水DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶解，随后加入HATU(10.5mmol，2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐)和TEA(10.5mmol，三乙胺)，氮气保护下室温25℃反应12小时。待反应完全后将反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取，合并有机相饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，降压蒸馏，得未经纯化的白色粗品；取上述粗品1.0mmol加入3mLTFA(三氟乙酸)和DCM(二氯甲烷)的混合溶剂TFA/DCM(1:5,v/v)，室温25℃反应2小时，反应结束后加入甲苯(10mL×3)降压旋蒸得粗品，甲醇重结晶得黄色固体，收率77％。黄色固体的表征数据如下：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ11.02(s,1H),9.83(s,1H),7.83(d,J＝6.9Hz,2H),7.78(s,1H),7.49(q,J＝7.3Hz,2H),5.15(dd,J＝13.3,5.1Hz,1H),4.37(q,J＝17.5Hz,2H),2.98–2.87(m,1H),2.78(dd,J＝13.4,6.7Hz,2H),2.62(d,J＝16.7Hz,1H),2.37(t,J＝7.4Hz,3H),2.09–2.00(m,1H),1.57(d,J＝31.9Hz,4H),1.31(s,6H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ173.34,171.86,171.55,168.31,134.32,134.09,133.13,129.08,125.64,119.41,60.22,52.00,46.94,36.20,31.67,28.92,28.77,27.44,26.16,25.43,23.11.HRMSm/z:calcd.for C₂₁H₂₉N₄O₄[M+H]⁺401.2229,found 401.2198.表明黄色固体为2-1结构。

(2)制备N-(8-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1-氧代异丁醇-4-基)氨基)-8-氧代辛基)-2-氟-5-((4-氧代-3,4-二氢邻苯二嗪-1-基)甲基)苯甲酰胺(1-1)：

在25mL的三颈中加入2-1结构的化合物(1mmol)、IV结构的化合物(1mmol)加入10mL无水DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶解，随后加入HATU(10.5mmol，2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐)和TEA(10.5mmol，三乙胺)，氮气保护下室温25℃反应12小时。待反应完全后将反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取，合并有机相饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，降压蒸馏，得为经纯化的白色粗品，硅胶层析分离得下式(1-1)所示淡黄色固体收率52.7％。淡黄色固体的表征如下：¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.65(s,1H),11.06(s,1H),9.96(s,1H),8.29(d,J＝7.9Hz,2H),7.98(d,J＝4.3Hz,1H),7.90(d,J＝7.1Hz,1H),7.83(dd,J＝13.5,6.4Hz,2H),7.57(d,J＝6.7Hz,1H),7.52(dd,J＝13.0,7.5Hz,2H),7.23–7.18(m,1H),5.18(dd,J＝13.3,5.1Hz,1H),4.34(s,2H),3.24(dd,J＝12.9,6.6Hz,2H),2.90(s,1H),2.70(s,3H),2.40(t,J＝7.4Hz,2H),1.94(s,2H),1.65–1.48(m,4H),1.33(s,6H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ173.35,172.52,171.97,171.54,168.36,163.94,159.89,157.28,145.44,134.74,134.34,133.97,133.11,132.71,132.00,130.40,129.51,129.03,128.33,126.52,125.97,125.72,124.81,119.38,116.66,52.04,38.68,36.93,36.25,31.67,30.87,29.34,29.10,26.73,25.54,23.12,21.56.HRMS m/z:calcd.forC₃₇H₃₈FN₆O₆[M+H]⁺681.2837,found 681.2838.表明黄色固体为2-1结构。

得到的淡黄色固体，即N-(8-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1-氧代异丁醇-4-基)氨基)-8-氧代辛基)-2-氟-5-((4-氧代-3,4-二氢邻苯二嗪-1-基)甲基)苯甲酰胺(1-1)，其结构如下：

实施例2：

制备N-(11-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1-氧代异偶姻-4-基)氨基)-11-氧代异戊烯基)-2-氟-5-((4-氧代-3,4-二氢邻苯二嗪-1-基)甲基)苯甲酰胺(1-2)。具体制备方法参照实施例1，只需将实施例1中的8-((叔丁氧羰基)氨基)辛酸用11-((叔丁氧羰基)氨基)十一酸替代。1-2其结构如下：

表征结果如下：¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.62(s,1H),11.05(s,1H),9.78(s,1H),8.28(d,J＝7.8Hz,1H),8.25(s,1H),7.97(d,J＝7.9Hz,1H),7.89(t,J＝8.3Hz,1H),7.83(t,J＝8.2Hz,2H),7.55(d,J＝6.8Hz,1H),7.51(d,J＝5.3Hz,1H),7.47–7.42(m,1H),7.23–7.17(m,1H),5.18(dd,J＝13.3,5.1Hz,1H),4.33(s,2H),3.40(s,3H),3.22(dd,J＝13.0,6.7Hz,2H),2.99–2.90(m,1H),2.63(d,J＝17.0Hz,1H),2.36(d,J＝7.6Hz,2H),2.00(s,1H),1.63–1.46(m,4H),1.28(d,J＝15.4Hz,12H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ173.33,171.88,171.55,168.33,163.89,159.87,157.29,145.40,134.77,134.29,134.12,133.95,133.13,132.72,131.99,130.43,129.53,129.07,128.36,126.53,125.96,125.68,124.81,119.43,116.66,60.22,55.36,52.01,46.95,36.94,36.30,31.69,29.44,29.37,29.16,26.83,25.57,23.13,21.21,14.54.HRMS m/z:calcd.for C₄₀H₄₄FN₆O₆[M+H]⁺723.3306,found 723.3298.

实施例3：

制备N-(12-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1-氧代异偶姻-4-基)氨基)-12-氧代癸基)-2-氟-5-((4-氧代-3,4-二氢邻苯二嗪-1-基)甲基)苯甲酰胺(1-3)。具体制备方法参照实施例1，只需将实施例1中的8-((叔丁氧羰基)氨基)辛酸用12-((叔丁氧羰基)氨基)十二酸替代。其结构如下：

表征结果如下：¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.61(s,1H),11.04(s,1H),9.77(s,1H),8.27(d,J＝7.8Hz,1H),8.24(t,J＝4.7Hz,1H),7.97(d,J＝7.9Hz,1H),7.88(t,J＝7.6Hz,1H),7.86–7.78(m,2H),7.54(dd,J＝6.8,2.3Hz,1H),7.51–7.50(m,1H),7.47–7.41(m,1H),7.25–7.14(m,1H),5.16(dd,J＝13.3,5.1Hz,1H),4.33(s,2H),3.37(s,4H),3.20(dd,J＝13.0,6.7Hz,2H),2.98–2.88(m,1H),2.62(d,J＝16.9Hz,1H),2.37–2.34(m,2H),1.63–1.45(m,4H),1.31–1.23(m,14H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ173.33,171.87,171.55,168.32,163.88,159.86,157.27,145.41,134.77,134.29,134.13,133.97,133.13,132.72,132.01,130.42,129.53,129.08,128.36,126.53,125.98,125.69,124.82,119.43,116.66,60.23,55.38,54.07,52.00,46.94,36.93,36.29,31.68,29.45,29.42,29.37,29.26,29.18,26.82,25.56,23.13.HRMS m/z:calcd.for C₄₁H₄₆FN₆O₆[M+H]⁺737.3463,found 737.3452.；

性能测试：

(1)抗肿瘤活性测试

CCK-8试验法：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μL，加相应浓度的药物，培养3-5天，每孔加CCK-8溶液20μL。继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150μL DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。选择450nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。

并根据细胞抑制率计算出实施例2制得的化合物1-2对SW620肿瘤细胞株的半抑制浓度(IC₅₀值)，具体结果附图2。

由图2所知，本发明所提供化合物对SW620肿瘤有良好的抑制作用，化合物1-2显示出了较强的抗肿瘤增值活性，其IC₅₀值均为2.9μM。

(2)PARP-1蛋白降解活性测试

将药物干预过的相应细胞收集，用预冷的PBS洗涤2次，PMSF与PIPA裂解液以1:100的比例混合，冰上裂解细胞20min，4℃，12000r/min*20min离心，取上清，即细胞总蛋白，用BCA法定量检测蛋白量，用5*蛋白上样缓冲液稀释蛋白后100℃变性5分钟。蛋白在SDS-PAGE电泳分离，砖模，封闭2小时，一抗4℃孵育过夜。TBST洗膜，二抗1:1000孵育2小时，化学发光后X胶片显影，结果如图1所示。

图1为实施例1～3制得的化合物对PARP-1的降解效果图，其中，1为化合物1-1，2为化合物1-2，3为化合物1-3。图2为化合物1-2对SW620细胞的增殖抑制图。由图所知，本发明提供的化合物具有较好的PARP-1降解效果和抗肿瘤效果。图3为化合物1-1的核磁图谱。

Claims

1.一种基于CRBN配体诱导PARP-1降解的化合物，其特征在于，包括下式I所示的化合物及其药学上可接受的盐和水合物：

其中，n为3～12的整数。

2.根据权利要求1所述的基于CRBN配体诱导PARP-1降解的化合物，其特征在于，n为4～10的整数。

3.根据权利要求1所述的基于CRBN配体诱导PARP-1降解的化合物，其特征在于，所述的式I所示的化合物为式1-1所示的化合物、式1-2所示的化合物或式1-3所示的化合物；

4.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述的基于CRBN配体诱导PARP-1降解的化合物和药学上可接受的赋形剂。

5.根据权利要求1～3任一项所述的基于CRBN配体诱导PARP-1降解的化合物在制备预防或/和治疗癌症的药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的癌症为多发性骨髓瘤、胃癌、肺癌、乳腺癌、食管癌、结肠癌、髓母细胞瘤、急性粒细胞白血病、慢性白血病、前列腺癌、肝细胞瘤、肾细胞瘤、宫颈癌、皮肤癌、卵巢癌、结肠癌、神经胶质瘤、甲状腺癌或胰腺癌。

7.一种式I所示的化合物的制备方法，包括以下步骤：

将式II所示的化合物与来那度胺混合溶于有机溶剂，反应得到式III所示的化合物，再将式III所示的化合物与式IV所示的化合物混合溶于有机溶剂，反应得到式I所示的化合物；

8.一种式I所示的化合物的制备方法，包括以下步骤：

1)在反应器中加入来那度胺和式II所示的化合物，加入N,N-二甲基甲酰胺溶解，随后加入HATU和三乙胺，氮气保护下15℃～35℃反应8～16小时，待反应完全后将反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取，合并有机相饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，降压蒸馏，得白色粗品；取白色粗品加入三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶剂，15℃～35℃反应1～3小时，反应结束后加入甲苯降压旋蒸得粗品，甲醇重结晶得式III所示的化合物；

9.根据权利要求8所述的式I所示的化合物的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述的式II所示的化合物为8-((叔丁氧羰基)氨基)辛酸、11-((叔丁氧羰基)氨基)十一酸或12-((叔丁氧羰基)氨基)十二酸。