CN104363913B - Cdk8/cdk19选择性抑制剂及其在癌症的抗转移和化学预防方法中的用途 - Google Patents

Cdk8/cdk19选择性抑制剂及其在癌症的抗转移和化学预防方法中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抑制细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDKI)途径的化合物和方法。更具体地讲，本发明涉及抑制CDKI途径以研究并干预老年化相关疾病和其它CDKI相关疾病的化合物和方法。本发明提供溶解度和/或效力提高的新的化合物及其使用方法。在各个方面，本发明涉及癌症的治疗。本发明提供用于化学预防和预防肿瘤复发或转移的方法。本发明还提供用于治疗某些癌症类型的诊断技术。本发明使用CDK8/19的特异性抑制剂和/或患者中CDK8水平的测量。

Description

CDK8/CDK19选择性抑制剂及其在癌症的抗转移和化学预防方 法中的用途
发明背景。
发明领域
本发明涉及癌症的治疗和预防。
相关技术概要
CDK8，以及其密切相关的同种型CDK19，是一种致癌转录调节激酶(1-3)。与CDK家族更知名的成员(例如CDK1、CDK2和CDK4/6)不同，CDK8在细胞周期进程中不起作用。由于其在多能干细胞表型中的基本作用(6)所致，胚胎干细胞中的CDK8敲除妨碍胚胎发育(5)，但是CDK8耗尽不抑制正常细胞的生长(5,7)。CDK8在癌症中的作用是由于其作为参与致癌作用的数个转录程序的调节因子的独特功能所致(1)。在黑素瘤(8)和结肠癌(7)中，CDK8被鉴定为癌基因，CDK8基因在约50%的后一癌症中被扩增。较高CDK8的表达与较差的结肠癌预后有关(9)。CDK8的已知癌症相关活性包括Wnt/β-联蛋白途径的正调节(7,11)、生长因子诱导的转录(12)和TGFβ信号转导(13)。CDK8还显示维持胚胎干细胞的多能表型，并且与癌症干细胞表型有关(6)。DNA损伤化疗药物在内皮细胞和在其它癌症相关基质成分中诱导TNFα，一种转录因子NFκB的激活物(14)。基质衍生的TNFα作用于肿瘤细胞，其中它诱导相关的促肿瘤细胞因子CXCL1和CXCL2的NFκB介导的产生。CXCL1/2通过与髓样细胞表面的CXCR2受体结合，将髓样细胞吸引至肿瘤。髓样细胞然后分泌与慢性炎症和癌症有关的小的钙结合蛋白S100A8和A9。S100A8/9作用于肿瘤细胞，促进其转移和化学疗法的生存两者(15)。PCT/US12/55064教导了CDK8/19抑制剂抑制转录因子NFκB (其介导多种肿瘤支持性蛋白和炎性细胞因子的产生)的诱导，并且CDK8/19抑制剂特别抑制NFκB介导的CXCL1和CXCL2的诱导。美国专利公开20120071477教导了CDK8/19抑制剂还通过正常成纤维细胞中的DNA损伤防止旁分泌肿瘤促进活性的诱导，并且抑制HIV复制和β-联蛋白信号转导。
根据用靶向CDK8和某些其它基因的siRNA转染在肺癌细胞系中诱导毒性的研究结果，美国专利申请20040180844和20040180848要求保护“一种杀死癌细胞的方法，所述方法包括使癌细胞与选自CDK8、STK33、PRKCM、PRKACA、ACVR1B、CDK5R1、CDC42BPB、MPP6和CDC42BPA的基因的抑制剂接触”。然而，这个观察结果未表明所述基因的抑制对生物一般是无毒的，并且没有提供在癌症治疗中抑制CDK8的机制原理。
美国专利公开20120071477公开了CDK8及其同种型CDK19的选择性抑制剂。需要用于选择性抑制CDK8的更易溶解的和更有效的化合物和方法。还需要更好地理解CDK8在癌症中的作用以提供CDK8抑制剂的其它用途。
发明简述
本发明提供用于治疗中枢神经系统变性疾病(包括阿尔茨海默病(Alzheimer’sDisease)和其它痴呆)、癌症、病毒性疾病、动脉粥样硬化、关节炎和慢性肾病的化合物、药物制剂和方法。另外，本发明人出乎意料地发现，CDK8/19抑制剂预防癌症的发生(化学预防)，并且通过在手术、化学疗法或放射的肿瘤减积(tumor debulking)后给予这些作用剂预防癌症复发和转移。
本发明提供一个意料不到的发现，即在给动物注射肿瘤细胞前用CDK8/19抑制剂治疗动物降低随后开始用所述抑制剂治疗的肿瘤的生长速率。这种意料不到的作用可能是由于在支持肿瘤生长的正常组织中抑制CDK8调节基因的表达所致。本申请通过在乳腺癌患者中以及在其治疗包含DNA损伤性铂化合物的那些卵巢癌患者中CDK8及其结合配偶体细胞周期蛋白C (CCNC)的高表达与生存差的显著关联，进一步证实了CDK8表达对癌症治疗结果的重要性。这些研究结果表明，甚至在患者中不存在肿瘤块，例如在化学预防的情况下或在肿瘤减积后作为辅助或抗复发/抗转移疗法给予所述化合物时，给予特异性抑制CDK8/19的小分子化合物应有益于癌症患者延长生命。
这些研究结果还表明，测量癌症中的CDK8表达提供鉴定以下癌症患者的诊断方法：总体上有高风险、用DNA损伤性化疗剂治疗时有风险和最可能获益于用特异性抑制CDK8/19的小分子化合物治疗的那些患者。在一些实施方案中，癌症患者是乳腺癌或卵巢癌患者。
第一方面，本发明提供特异性抑制细胞周期蛋白依赖性激酶8和19 (CDK8/CDK19)的溶解度和/或效力提高的新的化合物。最初，本发明人使用高通量筛选系统(更详细地描述于申请号PCT/US06/01046中)，以针对防止被CDK结合蛋白p21的转录诱导的能力从市售可得的多种化合物集合中筛选超过100,000种药物样小分子。通过该筛选，本发明人鉴定了一组活性化合物。(参见美国专利申请公布号20080033000)。这些包括一系列结构上相关的化合物，所述化合物抑制被p21的转录诱导，在正常细胞中显示几乎没有或没有细胞毒性，且不干扰CDKI的细胞周期抑制功能。本发明人随后发现选择性抑制CDK8/CDK19的化合物的亚组。这些是最早的显示这种选择性的这类化合物。
根据上述结果，本发明人开始开发保持所述之前鉴定的化合物的益处同时提供甚至更大的溶解度和/或效力的新的化合物。
第二方面，本发明提供抑制成纤维细胞产生促肿瘤分泌因子的方法，所述方法包括使成纤维细胞与特异性抑制CDK8/19的小分子化合物接触。
第三方面，本发明的化合物和方法可用于治疗CDKI介导的疾病，包括但不限于阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、淀粉样变、关节炎、慢性肾病、病毒性疾病和癌症。因此，本发明提供用于治疗或治疗性治疗患有CDKI介导的疾病的哺乳动物的方法，所述方法包括给予哺乳动物治疗有效量的特异性抑制CDK8/19的小分子化合物。
第四方面，本发明提供抑制CDK8至比其抑制某些其它CDK更大的程度的化合物。
第五方面，本发明提供用于治疗患有表达β-联蛋白的肿瘤的哺乳动物的方法，所述方法包括给予哺乳动物本发明第一方面的特异性抑制CDK8/19的新的小分子化合物。
第六方面，本发明提供用于化学保护有发生癌症的风险的患者的方法，所述方法包括给予患者特异性抑制CDK8/19的小分子化合物。
第七方面，本发明提供防止进行过肿瘤减积治疗的癌症患者的癌症复发或转移的方法，所述方法包括在减积后给予患者特异性抑制CDK8/19的小分子化合物。在一些实施方案中，患者是卵巢癌或乳腺癌患者。
第八方面，本发明提供用于治疗癌症患者的方法，所述方法包括给予患者与特异性抑制CDK8/CDK19的小分子化合物组合的有效量的DNA损伤作用剂。在一些实施方案中，癌症患者是乳腺癌或卵巢癌患者。
第九方面，本发明提供用于提高与手术组合给予的辅助疗法在患者中的功效的方法。所述方法包括给予与辅助疗法组合的特异性抑制CDK8/19的小分子化合物。
第十方面，本发明提供用于治疗患者的乳腺癌的方法，所述方法包括给予患者特异性抑制CDK8/19的小分子化合物。
第十一方面，本发明提供用于确定癌症患者是否适于用DNA损伤作用剂治疗的方法，所述方法包括测定患者中CDK8是否过量表达。在一些实施方案中，癌症患者是卵巢癌或乳腺癌患者。
第十二方面，本发明提供用于测定癌症患者中肿瘤复发或转移的可能性的方法，所述方法包括从患者肿瘤中获取样品并测定肿瘤样品中CDK8是否过量表达。在一些实施方案中，癌症患者是乳腺癌或卵巢癌患者。
第十三方面，本发明提供用于确定癌症患者是否将获益于辅助疗法的可能性的方法，所述方法包括测定患者的肿瘤样品中CDK8是否过量表达。
附图简述
图1显示表1中所列举的化合物的结构。
图2显示SNX2-1-165的合成流程。
图3显示SNX2-1-165 (Senexin B)的代表性体外CDK8激酶活性抑制测定。
图4显示在p21诱导性IPTG存在下抑制HT1080 p21-9细胞中的CMV-GFP表达的基于细胞的测定中Senexin B对CDK8的作用(上方曲线)。下方曲线显示未添加IPTG的测量。
图5显示针对CDK8、CDK19和对照CDK (CDK9)的SNX2-1-165的Kd测定，各测定以一式两份进行。
图6显示呈激酶家族进化树状图形式的SNX2-1-165激酶抑制选择性的KinomeScan分析结果，其中激酶抑制用红色圆圈表示，其大小表示抑制幅度。
图7A显示在以40 mg/kg i.p.注射后大鼠血浆中Senexin B的药代动力学(PK)特征。图7B显示当以100 mg/kg通过强饲给予小鼠时，小鼠血浆中Senexin B的PK特征。
图8绘制用5次每日i.p.注射SNX2-1-165 (40 mg/kg)或仅载体治疗、然后s.c.注射1 x 106个人A549肺癌细胞系的细胞的CB-17 SCID小鼠中肿瘤体积随时间推移的平均值和标准差。
图9A显示用25 mg/kg日剂量的Senexin B (i.p.) 5天预治疗对在最后一次Senexin B治疗后在6-8周龄雌性裸小鼠脂垫中同局部注射MDA-MB-468三联阴性乳腺癌(TNBC)细胞的植入的作用。图9B显示在MDA-MB-468注射(持续3天)前和在注射后治疗小鼠(每日i.p.注射40 mg/kg Senexin B)的结果。
图10显示不同浓度的Senexin B对HCT116结肠癌细胞中自β-联蛋白依赖性TOPFLASH启动子的萤光素酶表达的作用。
图11显示CDK8和CDK8相关基因表达和无复发生存(RFS)间的相关性的Kaplan-Meier (KM)图，采用基于万维网的基因表达荟萃分析程序产生。
图12显示KM图，表明卵巢癌患者、尤其用铂化合物治疗的那些(但用泰素治疗的那些除外)中CDK8、CDK19和CCNC的高表达与生存差显著相关。
图13A显示以10x物镜拍摄的侵入性管内乳腺癌切片代表性染色的实例。图13B显示相对于正常(NBT)或增生(H)乳腺组织或小叶内癌(ILC)，侵入性导管癌(IDC)中CDK8升高。
图14显示某些乳腺癌细胞系，例如MDA-MB-468和MDA-MB-157，显示由SNX2-1-165引起的剂量依赖性生长抑制，而其它乳腺癌细胞系则无。
图15A显示给雌性SCID小鼠同局部注射TNBC系MDA-MB-231，允许形成肿瘤，然后以7-10天间隔用以下治疗3轮的研究结果：溶媒、多柔比星、Senexin B或多柔比星+ Senexin。图15B显示使用MDA-MB-468 TNBC异种移植物模型的研究结果，其中给雌性裸小鼠接种MDA-MB-468细胞，使之形成可触摸到的肿瘤，然后每天用仅溶媒、Senexin B或与Senexin B组合的多柔比星i.p.治疗。
图16A显示用10 X和40 X物镜拍摄的4个肿瘤H&E染色的实例，并说明两例非侵袭性和两例侵袭性生长。图16B显示自图15B中的实验用仅溶媒、仅Senexin B、仅多柔比星或多柔比星和Senexin B治疗的小鼠组中侵袭性和非侵袭性生长情况的分布。
优选实施方案的详细描述
本发明涉及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDKI)途径的抑制。更具体地讲，本发明涉及抑制CDKI途径以研究及干预老年化相关疾病和癌症的方法。
本发明提供用于治疗中枢神经系统变性疾病(包括阿尔茨海默病和其它痴呆)以及癌症和病毒性疾病的新的化合物、药物制剂和方法。
本发明提供抑制CDKI途径的化合物和方法，所述化合物和方法在不同的年龄相关疾病的化学预防和治疗中可具有各种各样的临床应用。本发明的CDKI途径抑制剂在正常细胞中几乎没有或没有细胞毒性。这些分子不干扰CDKI的细胞周期抑制功能。它们还抑制通过CDKI阻滞细胞的抗凋亡因子的分泌。这些化合物以比之前描述的更大的溶解度和/或效力选择性地抑制CDK8和CDK19。
在各个方面，本发明涉及癌症的治疗。本发明人出乎意料地发现，通过在经手术、化学疗法或放射的肿瘤减积后给予CDK8/19抑制剂，所述抑制剂预防癌症的发生(化学预防)，并防止癌症复发或转移。本发明提供一个意料不到的发现，即在给动物注射肿瘤细胞前用CDK8/19抑制剂治疗动物降低随后开始用所述抑制剂治疗的肿瘤的生长速率。这种意料不到的作用可能是由于支持肿瘤生长的正常组织中这些CDK8/19调节基因的表达被抑制所致。本发明还提供一个意料不到的发现，即荷瘤动物用CDK8/19抑制剂治疗抑制肿瘤的侵袭性生长。通过在乳腺癌患者中和其治疗含有DNA损伤性铂化合物的卵巢癌患者中，CDK8、CDK19及其结合配偶体细胞周期蛋白C (CCNC)的高表达与防止肿瘤复发的辅助疗法失败显著关联，以及乳腺癌患者中不论辅助疗法如何，CDK8的高表达与无复发生存差的相关性，本申请进一步证实了CDK8表达对癌症治疗结果的重要性。这些研究结果表明，甚至当在患者中不存在肿瘤块(例如在化学预防的情况下或作为肿瘤减积后的辅助或抗复发/抗转移疗法)时给予该抑制剂时，给予CDK8/19抑制剂应有益于癌症患者延长生命。
这些研究结果还表明，测量癌症中的CDK8表达提供鉴定总体上有高风险的癌患者、用DNA损伤性化疗药物或放射治疗时有风险的癌患者、最可能获益于辅助疗法的那些患者以及最可能获益于包括CDK8抑制剂的治疗的那些患者的诊断方法。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌或卵巢癌。最后，这些研究结果提供用于测定癌症患者中肿瘤复发或转移的可能性的方法，所述方法包括从患者肿瘤中获取样品，并测定肿瘤样品中CDK8是否过量表达。
对于本发明的目的，“特异性抑制CDK8/19的小分子化合物”是抑制CDK8和CDK19的一种或多种至比其抑制某些其它CDK更大程度的小分子化合物。在一些实施方案中，所述化合物还抑制CDK8/19至比CDK9更大的程度。在优选的实施方案中，所述更大程度是CDK9的至少2倍。“小分子化合物”是分子量为约800道尔顿或以下的分子。除另有明确说明以外，包括在可用于本发明的化合物中的为同时待审的美国专利公开20120071477和本文中描述的化合物。术语“SNX-2-165”和“Senexin B”描述同一分子，在本文中可互换使用。术语“测定样品中CDK8是否过量表达”和类似术语意指测量患者组织(例如肿瘤样品)或体液中CDK8的表达，并将其与代表来自数名其它个人的正常和/或肿瘤组织样品和/或患者的无疾病(例如非癌)样品的CDK8 mRNA或蛋白质的平均水平的标准进行比较。“辅助疗法”是与手术组合给予的放射疗法和/或全身性疗法(化学疗法、免疫疗法、生物反应调节剂、激素疗法等及其组合)。(参见例如乳腺癌的非限制性实例，emedicine.medscape.com/article/1946040-overview)。
第一方面，本发明提供特异性抑制CDK8 /CDK19并具有改进的溶解度和/或效力的新的小分子化合物。在一些实施方案中，小分子化合物化合物具有以下结构式I或II：
其中每个B独立地为氢或
条件是至少一个B为氢且不超过一个B为氢；
D选自-NH、-N-低级烷基或O；
且n为0-2。
在一些实施方案中，低级烷基为甲基。在一些实施方案中，n为0或1。在一些实施方案中，n为1。
“低级烷基”意指可为直链或支链的1-6个碳原子的烷基。一些优选的低级烷基具有1-3个碳原子。在一些实施方案中，特异性抑制CDK8和CDK19的小分子化合物选自SNX2-1-162、SNX2-1-163、SNX2-1-164、SNX2-1-165、SNX2-1-166和SNX2-1-167。在一些实施方案中，特异性抑制CDK8和CDK19的小分子化合物为SNX2-1-165。在一些实施方案中，特异性抑制CDK8和CDK19的小分子化合物选自图1所示结构。
第二方面，本发明提供抑制成纤维细胞产生促肿瘤分泌因子的方法，所述方法包括使成纤维细胞与特异性抑制CDK8/19的小分子化合物接触。
在某些实施方案中，成纤维细胞是哺乳动物(包括人)的成纤维细胞。之前表明，特异性抑制CDK8的化合物抑制成纤维细胞产生促肿瘤分泌因子(参见美国专利公开号20120071477)。
本发明的第三方面，本发明提供用于治疗或治疗性治疗患有CDKI介导的疾病的哺乳动物的方法，所述方法包括给予哺乳动物有效量或治疗有效量的特异性抑制CDK8/19的小分子化合物。
优选的CDKI介导的疾病包括而不限于阿尔茨海默病、其它痴呆、淀粉样变、动脉粥样硬化、肾病、病毒性疾病和癌症。在某些实施方案中，病毒性疾病是人免疫缺陷病毒(HIV)感染。之前表明，特异性抑制CDK8的化合物抑制HIV-1复制(参见美国专利公开号20120071477)。优选的哺乳动物包括人。
第四方面，本发明提供抑制CDK8和CDK19至比其抑制某些其它CDK更大程度的小分子化合物。在一些实施方案中，所述化合物抑制CDK8和CDK19至比CDK9更大的程度。在优选的实施方案中，所述更大程度是CDK9的至少2倍。通过本说明书实施例中教导的测定法，包括本文所用服务提供商所采用的测定条件，测量抑制程度。这些测定的结果在本文一般以对照的百分比(POC)表示，其中对照为不存在化合物。或者，结果可表示为IC50。
第五方面，本发明提供用于治疗或治疗性治疗患有表达β-联蛋白的肿瘤的哺乳动物的方法，所述方法包括给予哺乳动物有效量或治疗有效量的特异性抑制CDK8/19的新的小分子化合物。在一些实施方案中，新的小分子化合物具有以下结构式I或II：
其中每个B独立地为氢或
条件是至少一个B为氢且不超过一个B为氢；
D选自-NH、-N-低级烷基或O；
且n为0-2。
在一些实施方案中，低级烷基为甲基。在一些实施方案中，n为0或1。在一些实施方案中，n为1。
在一些实施方案中，新的小分子化合物选自SNX2-1-162、SNX2-1-163、SNX2-1-164、SNX2-1-165、SNX2-1-166和SNX2-1-167。在一些实施方案中，小分子化合物是SNX2-1-165。在一些实施方案中，小分子化合物选自图1所示结构。
之前表明，特异性抑制CDK8/19的化合物抑制表达β-联蛋白的肿瘤细胞的生长(参见美国专利公开号20120071477)。优选的哺乳动物包括人。
第六方面，本发明提供用于化学保护有发生癌症的风险的患者的方法，所述方法包括给予患者特异性抑制CDK8/19的小分子化合物。有癌症风险的患者包括具有表明可能发生癌症的家族性遗传特征的个体。还包括暴露于致癌物(例如致癌化学物或病毒或放射)的个体。
第七方面，本发明提供用于预防进行过肿瘤减积治疗的癌症患者的癌症转移或复发的方法，所述方法包括在肿瘤减积后给予患者特异性抑制CDK8/19的小分子化合物。在一些实施方案中，癌症患者是乳腺癌或卵巢癌患者。
减积包括用于治疗原发性肿瘤的任何方法，例如手术、化学疗法和放射。尽管减积，但总有原发性肿瘤转移或不完全清除的风险，导致癌症复发。因此，给予特异性抑制CDK8/19的小分子化合物是可用于任何类型的癌症减积的辅助疗法。
第八方面，本发明提供用与特异性抑制CDK8/19的小分子化合物组合的DNA损伤作用剂治疗癌症患者的方法。在一些实施方案中，癌症患者是乳腺癌或卵巢癌患者。对于本发明的目的，DNA损伤作用剂包括放射和诱导DNA损伤的任何化疗剂，例如多柔比星或基于铂的药物。“与……组合”一般意指在治疗患者的过程中给予本发明的特异性CDK8/19抑制剂和DNA损伤作用剂。这种给予可以任何顺序进行，包括同时给予以及从相隔数秒直到数天的时间间隔顺序。这种组合治疗还可包括超于一次单一给予本发明的化合物和/或单独的DNA损伤作用剂。本发明的化合物和其它作用剂的给予可通过相同或不同的途径。
第九方面，本发明提供用于提高与手术组合给予的辅助疗法在患者中的功效的方法。所述方法包括给予与辅助疗法组合的特异性抑制CDK8/19的小分子化合物。“与……组合”一般意指在治疗患者的过程中给予本发明的特异性CDK8/19抑制剂和DNA损伤作用剂。这种给予可以任何顺序进行，包括同时给予以及从相隔数秒直到数天的时间间隔顺序。这种组合治疗还可包括超于一次单一给予本发明的化合物和/或单独的DNA损伤作用剂。本发明的化合物和其它作用剂的给予可通过相同或不同的途径。
第十方面，本发明提供用于治疗患者的乳腺癌的方法，所述方法包括给予患者CDK8/19的特异性抑制剂。
在本发明的第二至第十方面的各种方法的一些实施方案中，小分子化合物具有以下结构式I或II：
其中每个B独立地为氢或
条件是至少一个B为氢且不超过一个B为氢；
D选自-NH、-N-低级烷基或O；
且n为0-2。
在一些实施方案中，低级烷基为甲基。在一些实施方案中，n为0或1。在一些实施方案中，n为1。
“低级烷基”意指可为直链或支链的1-6个碳原子的烷基。一些优选的低级烷基具有1-3个碳原子。在一些实施方案中，特异性抑制CDK8和CDK19的小分子化合物选自SNX2-1-162、SNX2-1-163、SNX2-1-164、SNX2-1-165、SNX2-1-166和SNX2-1-167。在一些实施方案中，特异性抑制CDK8和CDK19的小分子化合物是SNX2-1-165。在一些实施方案中，特异性抑制CDK8和CDK19的小分子化合物选自图1所示结构。
在本发明的治疗或预防的每种方法的一些实施方案中，口服给予小分子化合物。
第十一方面，本发明提供用于确定癌症患者是否适于用DNA损伤作用剂治疗的方法，所述方法包括测定患者的肿瘤样品中CDK8是否过量表达。在治疗前测定CDK8水平应提供有关这些作用剂的任一种的使用是否适当或是否应采用替代治疗方法的有价值的信息。如果确定患者不适于用DNA损伤作用剂治疗，则患者可用与特异性抑制CDK8/19的小分子化合物组合的DNA损伤作用剂治疗。
本发明的第十二方面提供用于测定癌症患者中肿瘤复发或转移的可能性的方法，所述方法包括测定患者的肿瘤样品中CDK8是否过量表达。在一些实施方案中，癌症患者是乳腺癌或卵巢癌患者。在发现从患者手术切除的肿瘤样品具有高的CDK8表达水平时，有必要对患者进行针对癌症复发的更频繁的跟踪试验和/或患者需要本发明第七方面的后续治疗。
第十三方面，本发明提供用于确定癌症患者是否将获益于辅助疗法的可能性的方法，所述方法包括测定患者的肿瘤样品中CDK8是否过量表达。如果确定患者不可能获益于标准辅助疗法，则该患者可用与特异性抑制CDK8/19的小分子化合物组合的辅助疗法治疗。
本发明的前述第十一、十二和十三方面的备选实施方案中，并非测定肿瘤样品中CDK8是否过量表达，或除测定肿瘤样品中CDK8是否过量表达以外，可测定肿瘤中CCNC、CDK19、CXCL1和CXCL2的一种或多种是否过量表达。
药物制剂和给药
在本发明的方法中，可将上述化合物掺入药物制剂中。这种制剂包含在药学上可接受的稀释剂(包括而不限于水)、载体或赋形剂中的可呈游离酸、盐或前药的形式的化合物。这种制剂是本领域众所周知的，描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，编辑A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990。载体的特性可取决于给药途径。本文所用术语“药学上可接受的”意指与生物系统(例如细胞、细胞培养物、组织或生物体)相容且不干扰一种或多种活性成分的生物活性的有效性的无毒材料。因此，除所述抑制剂以外，本发明的组合物还可含有稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂和本领域众所周知的其它材料。本文所用术语药学上可接受的盐是指保留上述化合物的所需生物活性并显示最低毒理作用或没有非期望的毒理作用的盐。这类盐的实例包括但不限于与无机酸(例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等)形成的盐和与以下有机酸形成的盐：例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、单宁酸、棕榈酸(palmoic acid)、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、萘二磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸和聚半乳糖醛酸。化合物还可作为本领域技术人员已知的药学上可接受的季盐给予，所述季盐特别包括式-NR+Z-的季铵盐，其中R为氢、烷基或苄基，Z为反荷离子，包括氯离子、溴离子、碘离子、-O-烷基、甲苯磺酸根、甲基磺酸根、磺酸根、磷酸根或羧酸根(例如苯甲酸根、琥珀酸根、乙酸根、羟乙酸根、马来酸根、苹果酸根、柠檬酸根、酒石酸根、抗坏血酸根、苯甲酸根、肉桂酸根、扁桃酸根、benzyloate和二苯基乙酸根)。活性化合物包括在药学上可接受的载体或稀释剂中，其量足以向患者递送治疗有效量而不会在所治疗的患者中引起严重的毒性作用。“治疗有效量”是足以减轻或消除疾病的体征或症状的量。可根据待递送的母体化合物的重量计算药学上可接受的衍生物的有效剂量范围。如果衍生物本身显示活性，则可如上使用衍生物的重量，或通过本领域技术人员已知的其它方法，估算有效剂量。在包括而不限于老年性痴呆例如阿尔茨海默病的某些应用中，70 kg患者的有效剂量范围是约50 mg/患者/天直到约10克/患者/天，或最大耐受剂量。在某些优选的实施方案中，剂量范围为约200 mg/患者/天-约10g/患者/天。在某些优选的实施方案中，剂量范围为约200 mg/患者/天-约5 g/患者/天。可根据对给予的具体药物的临床反应，调整每个患者的剂量。在本发明的方法中药物制剂的给予可通过任何医学上可接受的途径，包括而不限于胃肠外、口服、舌下、经皮、局部、鼻内、气管内或直肠内。在某些优选的实施方案中，胃肠外给予本发明的组合物，例如在医院的情况下静脉内给予。在某些其它优选的实施方案中，优选可通过口服途径给予。
下列实施例欲进一步说明本发明的某些优选的实施方案，并且无意限制本发明的范围。
实施例1
CDK8/CDK19抑制剂的合成
按照图2所示流程合成SNX-2-1-165。所有其它的化合物采用类似方法合成。
实施例2
CDKI途径抑制的测试
下述化合物见表1，本发明一些新的化合物的结构见图1。化合物SNX2-1-102、SNX2-1-108和SNX2-1-145公开于美国专利申请号12/956,420，其它化合物是新近合成的。在描述于我们之前的专利申请PCT/US06/01046的细胞测定法中，测试了所有化合物抑制CDKI途径的能力。该测定法基于在自异丙基-β-硫代-半乳糖苷(IPTG)诱导型启动子表达CDKI p21的人HT1080纤维肉瘤细胞中自巨细胞病毒(CMV)启动子表达绿色荧光蛋白(GFP)的诱导。作为CDKI途径抑制剂的化合物活性通过其阻止在加入p21诱导性IPTG时CMV启动子被刺激的能力来测量。CMV启动子活性通过GFP荧光与相对细胞数(通过用Hoechst 33342染色细胞DNA测定)的比率来测量。表1和图1中仅包括在该测定中IC50 < 10 µM的化合物。
实施例3
溶解度和活性测试
如下测定了化合物在20%丙二醇和在水中的溶解度。在40℃的温度下，在不时涡旋的同时，将化合物(干粉)以1 mM的浓度溶于20%丙二醇中。30分钟后，将溶液以10,000 x g离心5分钟。制备澄清上清液的系列稀释液，并通过OD读数，用来测量化合物相对于相同化合物的1 µM标准溶液的浓度。测量结果表示为在20%丙二醇中1 mM化合物的%溶解度。为了测定水溶解度，在40℃的温度下，在不时涡旋的同时，最初将化合物(干粉)以100 mM的浓度溶于水。30分钟后，将溶液以10,000 x g离心5分钟，并监测不溶解沉淀物的形成。在随后的步骤中，尝试以较低的浓度溶解化合物，直到离心后观察不到沉淀，这表明化合物的完全溶解。不同化合物的20%丙二醇和水溶解度测量的结果列于表1中。
表1. SNX2类化合物的活性和溶解度
第一组的新的化合物衍生自SNX2-1-145。活性测试表明对于这些化合物的任一种，相对于SNX2-1-145，功效无显著增加，但溶解度测试表明，数种新的化合物比SNX2-1-145更溶于水，同时保持类似活性，这就表明了这些化合物的侧链可能使SNX2类化合物更易溶解。在下一阶段，我们合成了两种最有效的早期化合物SNX2-1-102和SNX2-1-108的一组衍生物，将其药效团与两种新的可溶性衍生物SNX2-1-151和SNX2-1-153的侧基组合。
在测试这些新的衍生物后，我们鉴定出显示高活性和溶解度两者的数种衍生物(SNX2-1-162至SNX2-1-167) (表1)。与之前开发的SNX2类化合物相比，这些化合物中最有效的SNX2-1-165更有活性。
实施例4
SNX2-1-165的活性测定
图3显示CDK8激酶活性被SNX2-1-165 (Senexin B)抑制，如使用ProQinase测定试剂盒测定，在不同测定中得到24-50 nM范围的IC50值。SNX2-1-165在1 mM下完全溶于20%丙二醇，在50 mM浓度下完全溶于水。接下来，在基于细胞的测定(在HT1080细胞中抑制通过IPTG诱导型p21的CMV-GFP表达诱导)中，测试了Senexin B对CDK8的作用。结果见图4。在两个测定中Senexin B有效地抑制CDK8。
实施例5
SNX2-1-165对CDK8/CDK19的选择性
图5显示SNX2-1-165对于CDK8、CDK19和对照CDK (CDK9)的Kd测定，各测定以一式两份进行。Kd值对于CDK8为140 nM和对于CDK19为80 nM，而CDK9不被显著抑制。采用KinomeScan，加拿大圣地亚哥Ambit Biosciences的一个部门的服务，测定了SNX2-1-165对CDK8和CDK19的选择性，所述服务测量单一浓度的化合物(2,000 nM，高于Kd的数量级)抑制>450种激酶的ATP袋结合的活性(16)。该分析的结果以激酶家族进化树状图形式呈现于图6中，其中激酶抑制用红色圆圈表示，其大小表示抑制的幅度。观察到对CDK19 (98.6%抑制)和CDK8 (97.8%抑制)的最强抑制；图6中显示的唯一的其它受抑制的激酶是MAP4K2 (69%抑制)。除YSK4 (59%抑制)以外，整个图中无其它激酶被2,000 nM SNX2-1-165抑制>50%。因此，SNX2-1-165是CDK8/19的高效和高选择性两者的抑制剂。
实施例6
Senexin B在小鼠和大鼠中是无毒的和生物可利用的
图7A显示在以40 mg/kg i.p.注射后大鼠血浆中Senexin B的药代动力学(PK)特征；14.1 mg*hr/ml的曲线下面积(AUC)与其它抗癌药物(例如最新核准的Vemurafenib)的值类似。当以100 mg/kg通过强饲给予小鼠时，Senexin B产生高达约50 µM的峰值血浆浓度，表明了这种化合物是口服可用的(图7B)。
SNX2-1-165的动物毒性研究按通过Taconic Farms，Inc. (Hudson，NY)的服务进行。在12天研究中，两组8只Balb/c小鼠各接受i.p.注射40 mg/kg SNX2-1-165/水性载体(10 mM柠檬酸，pH 6，150 mM NaCl)或仅载体的5个日剂量，接着2天休息和另一5个日剂量。在研究结束时，难以区分Senexin B治疗小鼠与载体治疗小鼠的体重增加。在器官(脑、肾、胸腺、脾、肺和肝)中，仅脾显示作用，重量下降约20%。相对于对照小鼠，血细胞计数显示仅淋巴细胞降低约25%，任何其它细胞类型无变化。这种超治疗剂量的耐受性特征表明Senexin B具有比典型抗癌药物宽泛得多的治疗指数。
实施例7
动物的SNX2-1-165治疗抑制随后的肿瘤生长
在该研究中，CB-17 SCID小鼠(8周龄)接受5次每日i.p.注射SNX2-1-165 (40 mg/kg)或仅载体，每组10只小鼠。然后给小鼠s.c.注射人A549肺癌细胞系的1 x 106个细胞；在早晨给予最后剂量的治疗的同一天的下午注射肿瘤细胞。从肿瘤注射后第7天开始，以3-4天的间隔，一周两次监测小鼠的肿瘤形成直到肿瘤注射后第24天；通过测径器测量，计算肿瘤体积。到研究结束时，两组中的全部小鼠都出现可测量的肿瘤。图8绘制两组中随时间推移肿瘤体积的平均值和标准差；图8内的表格显示两组间肿瘤体积的差异的p值(Student t检验)。图8显示小鼠中用CDK8/19抑制剂NX2-1-165预治疗对A549人肺异种移植物肿瘤随后生长的作用。每个点表示一组10只小鼠中肿瘤体积的平均值和标准差。引人注目的是，用SNX2-1-165预治疗的小鼠显示比对照组显著更慢的肿瘤生长，在第21和24天达到p<0.007。因此，用CDK8/19抑制剂对无肿瘤动物预治疗抑制肿瘤随后的生长。
接下来，我们测试了用25 mg/kg日剂量的Senexin B (i.p.) 5天预治疗对MDA-MB-468三联阴性乳腺癌(TNBC)细胞植入的影响，所述乳腺癌细胞在6-8周龄雌性裸小鼠(4只/组)脂垫中同局部注射，接着最后的Senexin B治疗。每天对可触摸到的肿瘤的出现进行评分。如图9A所示，相对于对照，Senexin B预治疗的小鼠显示在注射部位可触摸的肿瘤显著较慢地出现。在图9B所示实验中，在MDA-MB-468注射前(持续3天)和在注射后两者，对小鼠进行治疗(每日i.p.注射40 mg/kg Senexin B)。肿瘤体积的测径器测量显示每日给予Senexin B对肿瘤生长产生强且持续的抑制(图9B)。
实施例8
Senexin B对致癌性β-联蛋白活性的作用
如美国专利公开20120071477对于Senexin A (SNX2-1-53)中的描述，在HCT116结肠癌细胞中测量了不同浓度的Senexin B对自β-联蛋白依赖性TOPFLASH启动子的萤光素酶表达的作用。Senexin B显示致癌性β-联蛋白活性的浓度依赖性抑制(图10)。
实施例9
CDK8表达对无复发乳腺癌生存的作用
为了测试CDK8表达在乳腺癌中的影响，使用在线生存分析工具(http://kmplot.com/analysis/)，该分析工具使用对乳腺癌的多项研究的微阵列基因表达数据(10)，评价基因对预后的作用。图11显示CDK8和CDK8相关基因的表达与无复发生存(RFS)之间的关系的Kaplan-Meier (KM)曲线图，其利用基于万维网的基因表达荟萃分析程序(10)生成。Affymetrix微阵列数据来自2,896名乳腺癌患者；选择各测试基因的JetSet最佳探针组。在这些患者中，已知995人在样品采集后不接受辅助性全身性疗法(未治疗)，1,465人接受全身性疗法(治疗)。CDK8的高表达(由2,896名患者的中位值限定)显示在所有乳腺癌患者中与差的无复发生存显著相关(p=2.6x10-15)。这种相关性在未治疗患者中弱得多(p=0.0055)，但在治疗患者中强得多(p=0)，表明了与不依赖于治疗的肿瘤进展相比，CDK8表达的负预后作用(negative prognostic impact)与治疗反应更大程度地相关。同样，CCNC(细胞周期蛋白C，即CDK8的结合配偶体)、CDK19 (又名CDC2L6，CDK8的同种型)和MED13 (在介质复合体(Mediator complex)的CDK模件中与CDK8/CCNC相互作用的蛋白质(2))的高于中位值的表达还显示在所有患者中的显著相关性、在未治疗患者中无相关性和在治疗患者中的极强相关性(图11)，表明了这些基因表达的正预后作用与治疗反应而非肿瘤进展有关。相比之下，MED12，介质的CDK模件的另一个亚单位，显示相反的相关性，其中低于MED12表达中位值与较短的RFS强相关。此外与CDK8和该分析的其它基因大不相同，MED12显示在治疗和未治疗患者中有类似相关性(图11)，表明了MED12表达的正预后作用与肿瘤进展而非治疗反应有关。可根据最新研究(17)来解释MED12表达的这种正作用，该研究报告了MED12起TGFβ信号转导的负调节因子的作用，一种独立于其在介质中的作用的活性。
这些相关性表明，CDK8、CCNC、CDK18和MED13的高表达与乳腺癌中辅助疗法失效有关，且其肿瘤显示这些基因低表达的患者尤其可能获益于辅助疗法。另外，CDK8的高表达和MED12的低表达与乳腺癌中不依赖于治疗的不良预后有关。对于CDK8表达所观察到的显著临床相关性还表明，与标准疗法组合的CDK8的药理学抑制可产生患者无疾病生命期限的显著增加。
实施例10
高CDK8、CDK19和CCNC表达与肿瘤对DNA损伤化疗药物的耐药性有关
如美国专利申请公布号20080033000中所述，DNA损伤抗癌药(例如多柔比星或电离放射)诱导促肿瘤旁分泌活性的产生。这种对抗性损伤反应被选择性CDK8/19抑制剂抑制。这些研究结果表明，表达高水平CDK8的肿瘤由于CDK8介导的这种旁分泌活性的诱导所致，可耐受DNA损伤作用剂。上述在线生存分析工具(http://kmplot.com/analysis/)包括不仅来自乳腺癌而且还来自1,107个卵巢癌病例的微阵列基因表达数据，在后一种情况下，根据患者接受的治疗的类型(铂化合物或紫杉烷类)对肿瘤样品分级。CDK8、CDK19和CCNC的高表达与卵巢癌患者中生存差显著相关，而且这种相关性在1,000名用DNA损伤性铂化合物治疗的患者中变得甚至更强。引人注目的是，在529名用抗微管药物泰素治疗的患者中失去基因表达与生存差的相关性(图12)。因此，CDK8、CDK19和CCNC的表达与临床癌症中DNA损伤化学疗法的失效强相关。其肿瘤表达高水平CDK8、CDK19或CCNC的患者不太可能获益于用DNA损伤化疗药物的治疗。在所有全身性治疗的患者中，低的CDK8表达与大约10年以上无复发生存有关。因此，CDK8在DNA损伤诱导的旁分泌活性中的作用表明，CDK8抑制剂可有利地与DNA损伤药物组合。
实施例11
乳腺癌样品的免疫组织化学染色
还使用来自US Biomax的市售可得的乳腺癌组织阵列，分析了乳腺癌临床样品中的CDK8蛋白质表达，其包括在显微镜载玻片上的乳腺活检样品经福尔马林固定、石蜡包埋的系列切片。在洗涤、表位暴露和过氧化物酶封闭步骤后，使用Antibody Amplifier(ProHisto，LLC)，将载玻片与抗CDK 8抗体(山羊多克隆，1:250稀释液；Santa CruzSC1521)一起在4℃下温育过夜。通过在1:2000稀释的基于聚合物的第二驴抗山羊抗体(SC-2020，Santa Cruz)中温育1.5小时，来检测抗体结合区。使用DAB，并用甲基绿对比染色，来实现显色检测。图13A显示侵入性管内乳腺癌切片的代表性染色的实例(US BiomaxBR1003)，以10x物镜拍摄。该分析表明最强的CDK8染色与肿瘤而非间质细胞有关。在乳腺癌发生的不同阶段CDK8蛋白质表达的免疫组织化学(IHC)分析表明，相对于正常或增生乳腺组织或小叶内癌，CDK8在侵入性导管癌中升高(图13B)。
实施例12
仅CDK8抑制剂对乳腺癌细胞的作用
关于表明CDK8在乳腺癌中的关键作用的临床相关性，测试了选择性CDK8/19抑制剂NX2-1-165在细胞培养物中是否会抑制不同乳腺癌细胞系的生长。将细胞以1,500个细胞/孔铺板于96孔板中，并暴露于载体或递增浓度的SNX2-1-165 (一式四份)达5天；通过MTT测定法测量细胞存活。如图14所示，某些乳腺癌细胞系例如MDA-MB-468和MDA-MB-157显示由SNX2-1-165引起的剂量依赖性生长抑制，而某些其它乳腺癌细胞系(例如4T1)，除最高浓度的CDK8/19抑制剂以外不被抑制。这些结果，连同CDK8、CDK19和CCNC的表达与乳腺癌的生存差的相关性，表明CDK8/19抑制剂对乳腺癌的疗法的效用。
实施例13
Senexin B抑制三联阴性乳腺癌(TNBC)异种移植物肿瘤生长并
使TNBC异种移植物对多柔比星敏感
图15A显示给雌性SCID小鼠同局部注射TNBC系MDA-MB-231的研究结果。一旦形成肿瘤，便将小鼠随机分成4组群(n=10)，并且以7-10天间隔用以下治疗3轮：溶媒(5个日剂量)、1 mg/kg多柔比星(单剂量)、40 mg/kg Senexin B (5个日剂量)或多柔比星(单剂量)+Senexin B (5个日剂量)。虽然在此处在36天治疗期仅15天给予Senexin B，但用仅SenexinB治疗的组显示肿瘤生长与仅用多柔比星治疗的组类似的降低，如在实验结束时肿瘤重量的分布所证实(图15A)。值得注意的是，多柔比星治疗小鼠的体重比对照小鼠的低约15%，而Senexin B治疗小鼠显示与对照无显著的重量差异，其表明没有毒性，尽管两种药物有类似的肿瘤抑制作用。用Senexin B和多柔比星的组合治疗显示相加效应(图15A)。
图15B显示使用MDA-MB-468 TNBC异种移植物模型的研究结果。给雌性裸小鼠接种MDA-MB-468细胞，且一旦形成可触摸到的肿瘤，则将小鼠随机分成4组，每日用仅溶媒(n=12)、40 mg/kg Senexin B、间隔两周两次注射4 mg/kg多柔比星或与Senexin B组合的多柔比星i.p.治疗(后组中各组n=8)。图15B显示在30天治疗后各组中肿瘤体积(测径器测量)的分布。Senexin B和多柔比星两者显著减慢肿瘤生长，并且相对于各个单独的方案，两种治疗的组合产生显著改善(图15B)。
实施例14
Senexin B治疗抑制MDA-MB-468 TNBC肿瘤侵袭
图15B所示在实验结束时，处死小鼠，取出肿瘤，福尔马林固定，切片并加工用于H&E染色后的组织学分析。该分析表明，一些肿瘤显示侵袭性生长进入肌肉层，而其它不侵入，在肿瘤与正常组织区域之间留下显著的分离。图16A显示4个肿瘤的H&E染色的实例，用10 X和40 X物镜拍摄，说明两例非侵袭性和两例侵袭性生长。图16B显示在用仅溶媒、仅SenexinB、仅多柔比星或多柔比星和Senexin B治疗的小鼠组中侵袭性和非侵袭性生长情况的分布。用仅溶媒或仅多柔比星治疗的大多数肿瘤显示侵袭性生长，但用单独或与多柔比星组合的Senexin B治疗的几乎所有肿瘤为非侵袭性的。Senexin B的这种作用是极显著的，说明CDK8抑制剂具有抗侵袭性，并且因此具有抗转移性。
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Claims (22)

1.一种特异性抑制CDK8和CDK19的小分子化合物，其具有以下结构式I或II：
其中每个B独立地为氢或
条件是至少一个B为氢且不超过一个B为氢；
D选自-NH、-N-低级烷基或O；
且n为0-2。
2.权利要求1的小分子化合物，其中低级烷基为甲基。
3.权利要求1的小分子化合物，其中n为0或1。
4.权利要求1的小分子化合物，其中n为1。
5.权利要求1的小分子化合物，其选自下述化合物：
和。
6.小分子化合物SNX2-1-165：
。
7.权利要求1的小分子化合物，其选自如下所示结构：
和。
8.一种药物制剂，其包含权利要求1-7中任一项的化合物和生理上可接受的载体或稀释剂。
9.一种药物制剂，其包含小分子化合物SNX2-1-165和生理上可接受的载体或稀释剂：
。
10.权利要求1-7中任一项的小分子在制备用于治疗CDKI介导的疾病的药物中的用途。
11.权利要求10的用途，其中所述CDKI介导的疾病选自阿尔茨海默病、其它痴呆、淀粉样变、动脉粥样硬化、肾病、病毒性疾病和癌症。
12.权利要求11的用途，其中所述疾病是癌症或HIV感染。
13.权利要求1-7中任一项的小分子在制备用于治疗表达β-联蛋白的肿瘤的药物中的用途。
14.权利要求1-7中任一项的小分子在制备用于化学保护有发生癌症的风险的患者的药物中的用途。
15.权利要求1-7中任一项的小分子在制备用于防止肿瘤减积治疗后的癌症复发或转移的药物中的用途。
16.权利要求1-7中任一项的小分子在制备用于防止卵巢或乳腺肿瘤减积治疗后的癌症复发或转移的药物中的用途。
17.权利要求1-7中任一项的小分子在制备用于预防肿瘤侵袭的药物中的用途。
18.权利要求1-7中任一项的小分子在制备含有DNA损伤作用剂的药物中的用途。
19.权利要求1-7中任一项的小分子在制备用于治疗卵巢癌或乳腺癌的药物中的用途，其中，所述药物进一步含有DNA损伤作用剂。
20.权利要求1-7中任一项的小分子在制备用于抑制通过一种或多种成纤维细胞和间质细胞的促肿瘤因子分泌的药物中的用途。
21.权利要求1-7中任一项的小分子在制备用于改进手术后的辅助疗法的效力的药物中的用途。
22.权利要求10-21中任一项的用途，其中，所述药物是可口服生物利用的。
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