TWI450714B - 抑制乳癌細胞增生的化合物(i)之用途 - Google Patents

抑制乳癌細胞增生的化合物(i)之用途 Download PDF

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Description

抑制乳癌細胞增生的化合物(I)之用途
本發明是有關於一種化合物，特別是有關於一種抑制乳癌細胞增生的化合物。
根據統計每年全世界有25萬人死於乳癌，國內乳癌的發生率為女性癌症的第二位。自1990年至1991年台灣地區癌症死亡人數增加為32993，在一年間增加了3.83%，佔死亡率百分比為26.05%。乳癌是台灣女性十大死亡癌症之一，有逐漸增加的趨勢，而好發年齡也較歐美年輕。每年有近一千兩百名婦女因乳癌而死亡，威脅婦女健康甚大。癌症的發生與基因及後天環境有強烈的相關性，尤其與飲食息息相關。
乳腺癌治療方法包括手術、放射治療、化療、內分泌治療、免疫治療、中醫藥治療。乳癌的治療必須根據疾病的階段，患者年齡，患者是否處於更年期、腫瘤大小及腫瘤表面是否具有某些荷爾蒙的接受器而決定。
在乳癌的最早期使用外科手術治療並配合放射療法(radiotherapy)以確定癌細胞被全部破壞。如果有少量癌細胞殘留或出現在其他位置會引起危險性，所以必須配合藥物療法(又稱輔助療法)，其中包括荷爾蒙療法，化學療法以及單株抗體療法。
目前的乳癌治療藥物有不同副作用，使用上須考量病人本身狀況及病史，以達到較佳的治療效果。
因此，本發明是一種具有如下所示結構之化合物(I)之用途： ，係應用於製備抑制乳癌細胞增生的藥物。
本發明之第一實施例是在提供一種化合物(I)的用途，係應用於抑制乳癌上皮-間葉細胞轉型或應用於製備抑制乳癌上皮-間葉細胞轉型之藥物。
本發明之第二實施例是在提供一種化合物(I)的用途，係應用於抑制乳癌細胞轉移或應用於製備抑制乳癌細胞轉移之藥物。
本發明之第三實施例是在提供一種化合物(I)的用途，係應用於抑制血管新生或應用於製備抑制血管新生之藥物。
本發明之第四實施例是在提供一種化合物(I)的用途，係應用於抑制Her2/neu表現或應用於製備抑制Her2/neu表現之藥物。
本發明之第五實施例是在提供一種化合物(I)的用途，係應用於調節乳癌細胞凋亡/自噬作用或應用於製備調節乳癌細胞凋亡/自噬作用之藥物。
依據本發明之第六實施例是在提供一種化合物(I)的用途，其中乳癌細胞為雌激素受體陽性的乳腺癌细胞株或雌性激素受體陰性的乳腺癌細胞株。
根據上述，本發明實施例之化合物(I)適用雌於激素接受體(ER+)或是非雌激素接受體(ER-)藥物，化合物(I)能預防乳癌的作用機轉包括抑制乳癌上皮-間葉細胞轉型、癌細胞轉移、血管新生、癌細胞自噬/凋亡的進行。
根據本發明之實施方式，可抑制癌細胞增生之化合物(I)，其來源可為化學合成，或來自於天然物、加工物或其萃取物；根據本發明之實施例，不論是合成的化合物(I)，或由樟芝之發酵液得到含化合物(I)的天然物或加工物萃取物，抑制乳癌細胞生長之效應均呈現一致。應理解的是由純的化合物(I)產生的功效同樣會出現在以化合物(I)為主要有效成份之混合物中。
以下實施例是用來闡明本揭示內容特定態樣並幫助習知技藝者了解並實施本揭示內容。但本揭示內容範疇並不限於這些實施例中。
實施例 一、化合物(I)抑制多種腫瘤細胞的存活率 試驗例1：化合物(I)能影響不同組織的癌細胞存活率
本發明實施例之化合物(I)具有殺死多種腫瘤細胞之能力。化合物(I)對不同細胞的半數致死劑量(IC50 )請參照下表1。
從表1的結果可得知，化合物(I)對乳癌細胞的發展具有最為顯著的抑制作用，其IC50 為7.51μM。因此後續將以乳癌細胞為例，分析化合物(I)對乳癌細胞的生長影響。
試驗例1-1：化合物(I)抑制乳癌細胞存活率
試驗使用的細胞為人類乳腺細胞MCF-10A、人類乳癌細胞MCF-7及MDA-MB-231。MCF-7為雌激素受體(estrogen receptor alpha；ERα)陽性(ERα(+))的乳腺癌细胞株；MDA-MB-231細胞株為雌性激素受體陰性(ERα(-))的乳腺癌細胞株。
乳癌細胞(MDA-MB-231、MCF-7)係購自食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center；BCRC)，培養於含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養液(Fetal bovine serum-DMEM)培養液中。人類乳腺細胞MCF-10A培養於含5%胎牛血清(FBS)的DMEM培養液(Fetal bovine serum-DMEM F12/insulin/hydrocortisol/epidermal growth factor)中。培養箱維持5% CO2 、37℃恆溫。細胞培養至一定數量時，以900轉數(rpm)離心10分鐘去除培養液，於實驗前24小時更換培養液，並以細胞計數器(hemocytometer)計算細胞數目。
細胞存活率(viability)之測定係以細胞存活率分析(Method of transcriptional and translational assay；MTT assay)進行。細胞存活檢測之試驗方法參照Parada-Turska等人提出的步驟。
乳癌細胞MDA-MB-231(2.5×105 cells/well)種於24孔盤，隔天細胞貼壁後，以PBS清洗。加入含1%胎牛血清(FBS)的DMEM培養液，讓細胞同步化後，隔天加入不同濃度的化合物 (I)，置於37℃、5% CO2 培養24小時，以PBS清洗一次，再各加入400μl的MTT試劑，反應4小時後再加入400μl的10% SDS，反應12小時，抽出200μl的上清液於96孔微量盤中，以570nm波長測吸光值。
請參照第1A圖，為施予不同劑量之化合物(I)對抑制人類正常乳腺細胞(MCF-10A)、非侵略性乳癌細胞(MCF-7)和侵略性乳癌細胞(MDA-MB-231)存活率的影響之量化圖，數據結果以mean±SD值表示，n=3，p<0.05。
第1A圖的結果顯示，試驗濃度為0-40μM之化合物(I)作用於MCF-10A、MCF-7及MDA-MB-231細胞24小時後，對正常乳腺細胞MCF-10A之IC50 濃度約在25μM；對MCF-7之IC50 濃度約在30μM；對MDA-MB-231之毒殺性最強IC50 濃度約在6.5μM。
根據上述結果可知化合物(I)具有強效抑制乳癌MDA-MB-231細胞株活性的效果。
試驗例1-2：化合物(I)抑制腫瘤細胞細胞群落形成
為了瞭解化合物(I)對乳癌細胞MDA-MB-231的群落形成的影響，以細胞群落形成分析法(Colony formation assay)觀察之。
第1B圖的(a)部分為將細胞貼附於細胞基質後，以不同濃度的化合物(I)反應24小時，再換成新鮮含10% FBS細胞培養液後，培養5天的菌落生長情形；第1B圖的(b)部分為將(a)部分所示的細胞群落掃描上電腦並用70%酒精將群落溶解，使用吸光值540nm測量後得到的數值。
第1B圖的(a)部分的結果顯示化合物(I)具有顯著的抑制乳癌細胞的群落形成；(b)部分的結果可以明顯看出，試驗的乳癌細胞群落數形成呈現與化合物(I)的劑量相關性。
二、化合物(I)抑制乳癌上皮-間葉細胞轉型(EMT) 試驗例2-1：化合物(I)抑制乳癌細胞上皮-間葉細胞轉型
腫瘤轉移是腫瘤細胞從原位處經由一連串步驟擴散到遠端的器官組織，形成另一新腫瘤塊的過程。癌細胞獲得侵入移行的能力，首先是上皮細胞型態轉變成間葉細胞的型態之間的相互轉換，同時也改變彼此原本的細胞特性，而上皮-間葉細胞轉型(Epithelial-mesenchymal transition；EMT)就是指上皮細胞型態轉變成間葉細胞型態的過程。
癌症轉移包括啟動侵入能力(invasion)、滲出(extravasation)與轉移(metastasis)的過程。在侵入過程，腫瘤細胞失去細胞與細胞間的粘著性，獲得移動性；接著滲出的細胞進入血液及淋巴系統，最後癌細胞轉移到目標位置成為新的腫瘤細胞。
啟動癌細胞進行EMT有許多訊息傳遞的途徑，牽涉到許多蛋白的活化，包括Transforming growth factor β(TGFβ)、Wnt/β-catenin、Phosphoinositide 3-kinases(PI3K)及Nuclear factor-κB(NF-κB)等。當細胞被TGF-β活化，轉錄因子例如Twist、Snail、slug、SIP1進而降低上皮細胞型態指標分子E-cadherin，增加間葉型態指標分子N-cadherin、Integrins、Vimentin和細胞外基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)的表現，促進細胞的移動和侵犯性。
此外，腫瘤細胞週遭環境的變化對於原位癌是否轉移是一個重要的因素。許多生長因子及細胞素包括hepatocyte growth factor(HGF)、epidermal growth factor(EGF)、vascular endothelial growth factor(VEGF)和transforming growth factor-β(TGF-β)，都極可能會促進癌轉移。大致而言，這些生長因子可透過訊息傳 導途徑像是PKC、PI3/AKT和HGFR-cMet活化N-cadherin、vimentin、fibronectin、snail、slug、twist、MMP-2、MMP-3或MMP-9等相關蛋白表現而促進腫瘤轉移，相對的會減少E-cadherin,desmoplakin、occludin及細胞黏附分子(Cell adhesion molecule，CAM)等相關蛋白表現。
因此，以下將就上述具有指標性的細胞蛋白質進行西方墨點分析，以觀察化合物(I)對抑制腫瘤細胞之作用機轉。
請參照第2A圖及第2B圖，為利用西方墨點分析法(Western blotting)偵測施予不同劑量的化合物(I)對乳癌細胞中特定的蛋白質含量的影響。
其中，第2A圖為濃度0、0.5、1、2mM之化合物(I)對培養24小時後的乳癌細胞MDA-MB-231中與EMT相關的蛋白質表現情形；第2B圖為濃度0、10、15、20μM之化合物(I)對培養24小時後的乳癌細胞MCF-7中與EMT相關的蛋白質表現情形。
西方墨點分析之步驟為細胞以4℃的PBS洗滌二次，加入溶解緩衝溶液(lysis buffer)，以細胞刮片(rubbr policeman)刮碎並溶解細胞，將此細胞溶解液取至1.5ml的微量離心管中，震盪1分鐘，再於12000轉數離心10分鐘取上清液，以Bio-Rad protein assay kit來測定蛋白質的濃度，並將剩餘的蛋白質萃取液置於-70℃保存。取100μg的蛋白質溶液，加入等體積約二倍濃度之SDS/protein loading buffer於100℃煮沸10分鐘，冷卻後將蛋白質樣品放至每個中，將電壓調至100伏特，等到蛋白質樣品跑完並進行蛋白質電泳的轉印。取一張nitrocellulose paper，甲醇浸溼後，放入轉印槽於4℃冰櫃中以600微安培電流進行蛋白質的轉移，4小時後，將PVDF取出，放置於1% BSA的PBS blocking solution中，搖晃2小時，再放一次抗體的blocking solution中， 於室溫緩慢搖晃1小時，以PBST洗滌PVDF3次，每次3-5分鐘，轉數為100rpm。依不同的一級抗體，稀釋倍數，置於水平式旋轉器上於室溫振盪2小時，用PBST洗三次，接著使用冷光影像儀器，將PVDF膜以塑膠夾子置入黑色金屬盤上，蛋白面朝上，將以1：1混合的Chemiluminesent Substrate加入於膜上，再依不同抗體的螢光強弱決定曝光時間。
第2A圖中所示(a)部分為乳癌細胞MDA-MB-231中有助於抑制腫瘤發展的蛋白質，包括E-cadherin、occludin及ICAM的表現情形；(b)部分為乳癌細胞MDA-MB-231中促進腫瘤發展的蛋白質，包括Twist、Snail、vimentin、β -catenin及VEGF表現情形。β -actin為內控制組。
第2A圖(a)部分的結果顯示，隨著化合物(I)的劑量增加，MDA-MB-231細胞中有助於抑制腫瘤發展的蛋白質E-cadherin、occludin及ICAM的表現量均增加，呈現劑量相關性。相反地，第2A圖(b)部分的結果顯示隨著化合物(I)的劑量增加，MDA-MB-231細胞中有促進腫瘤發展的蛋白質的表現量均隨之減少。
再參照第2B圖，(a)部分為乳癌細胞MCF-7中有助於抑制腫瘤發展的蛋白質，包括E-cadherin、p-β -catenin及occludin的表現情形；(b)部分為乳癌細胞MCF-7中促進腫瘤發展的蛋白質，包括Twist、Snail、vimentin及β -catenin的表現情形。β -actin為內控制組。
第2B圖呈現與第2A圖相似的結果。第2B圖(a)部分的結果顯示，隨著化合物(I)的劑量增加，MCF-7細胞中有助於抑制腫瘤發展的蛋白質E-cadherin、p-β -catenin及occludin的表現量均增加，呈現劑量相關性。相反地，(b)部分的結果顯示隨著化合物 (I)的劑量增加，MCF-7細胞中有促進腫瘤發展的蛋白質的表現量均隨之減少。
因此，化合物(I)具有顯著抑制上皮-間葉細胞轉型的效果，而目前已有文獻指出，侵入性癌細胞重新過度表現E-cadherin時，就可以轉變為較不具侵入性，有助於抑制腫瘤的發展。
試驗例2-2：化合物(I)提升乳癌細胞質中E-cadherin表現
根據西方墨點分析的結果，化合物(I)具有提升乳癌細胞表現E-cadherin的效果，因此以MDA-MB-231細胞為例，實際觀察E-cadherin在細胞中的表現情形。
請配合參照第3圖，第3圖為E-cadherin螢光活性(Luciferase activity)的量化分析圖，其中以僅含有空載體(pC3.1)的轉形株為陰性對照組(negative control)、以及未添加化合物(I)的背景值對照組，其轉譯活性定為100%。
細胞免疫染色分析係將腫瘤組織以石蠟包埋組織，並將切片機切成5mm之厚度玻片，再經脫臘、回水、復性等，將玻片夾出放入一級抗體E-cadherin、反應1.5小時，以PBS沖洗三次，再以二級抗體反應30分鐘，PBS沖洗三次，且以3',3'-diaminobenzendine(DAB)以1：30比例染色，再以Entellanz封片。
第3圖的結果顯示，隨著化合物(I)的劑量增加，MDA-MB-231細胞質中的E-cadherin表現量亦隨之增加。
三、化合物(I)抑制乳癌細胞轉移(Metastasis) 試驗例3-1：化合物(I)降低乳癌細胞中的MMPs表現
癌細胞轉移的過程中通常伴隨著細胞外基質(Extracellular matrix；ECM)的分解，而主要扮演分解ECM的角色為基質金屬蛋 白酶(Matrix metalloproteinase；MMPs)，以及促進MMPs活化的尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator；uPA)。乳癌腫瘤細胞會大量分泌MMPs，許多研究指出MMP-2及MMP-9在血管新生作用及腫瘤轉移過程中扮演著特別重要角色。此外基質金屬蛋白酶抑制劑TIMP-1、TIMP-2的表現則能抑制MMPs的活性，血漿纖溶酶原激活物抑制物(plasminogen activator inhibtion；PAI)PAI-1能抑制uPA的活性，達到抑制腫瘤細胞入侵與轉移的作用。
因此，以下就上述與血管新生與原位癌轉移相關的細胞蛋白質進行西方墨點分析，以說明化合物(I)對抑制腫瘤細胞轉移之作用機制。
請參照第4A圖，為利用西方墨點分析法偵測施予不同劑量的化合物(I)對乳癌細胞中特定的蛋白質含量的影響。分別以濃度0、0.5、1、2μM之化合物(I)培養24小時後的乳癌細胞中與細胞轉移相關的蛋白質表現情形，西方墨點分析之步驟同試驗例2-2中所示，在此不再贅述。
第4A圖中所示(a)部分為乳癌細胞中MMP-2、MMP-9、uPA及uPAR的表現情形；(b)部分為乳癌細中TIMP-1、TIMP-2及PAI-1的表現情形。β -actin為內控制組。
第4A圖(a)部分的結果顯示，隨著化合物(I)的劑量增加，乳癌細胞中有MMP-2、MMP-9、uPA及uPAR的表現被抑制，呈現劑量相關性。相反地，第4A圖(b)部分的結果顯示隨著化合物(I)的劑量增加，乳癌細胞中TIMP-1、TIMP-2及PAI-1的表現量均隨之增加。
根據上述結果可知化合物(I)能藉由促進MMP抑制劑表現，以及抑制MMP之活化物uPA的功效，使基質金屬蛋白酶不活化， 從而達到抑制MMPs的活性，抑制腫瘤細胞入侵與轉移的作用。
請參照第4B圖，為利用Zymography酵素活性分析法偵測施予不同劑量的化合物(I)對乳癌細胞中MMP-9、MMP2及uPA的酵素活性影響。
Zymography酵素活性分析方法係將細胞(1×106 )種於6孔盤中，隔天細胞貼壁後，以無血清的的DMEM培養液置於37℃、5% CO2 培養箱中24小時。加入不同濃度劑量的化合物(I)的DMEM培養液，培養2小時後，以PBS清洗，將細胞培養液抽出放進微量離心管中，已轉數1500離心10分鐘，取上清液進行蛋白質凝膠電泳(SDS-PAGE)分離。之後分別以明膠(Gelatin)或酪蛋白(Casein)為受質，分析其酵素活性。
第4B圖的結果顯示，隨著化合物(I)的劑量增加，於乳癌細胞能使促進血管新生作用及腫瘤轉移的MMP-2、MMP-9、uPA酵素的活性降低。
試驗例3-2：化合物(I)抑制腫瘤訊息傳導的蛋白之磷酸化反應
癌細胞中MMPs及uPA活化的訊息傳導路徑以及細胞凋亡的信號轉導過程，係由一種serine/threonine kinases的激酶家族-活化絲裂原活化蛋白激酶家族(mitogen activated protein kinases；MAPKs)參與。MAPKs包括ERK 1/2(extracellar signal-regluated kinase)，JNK/SAPK(c-Jun NH2-terminal kinase)以及p38。MAPK家族有多個成員及多條反應途徑，利用一連串的蛋白質磷酸化反應來進行訊息的傳導。
磷酸化的MAPK相關蛋白在細胞中可以傳遞許多訊息，MAPKs對細胞的生理功能的影響包括發炎反應(inflammination)、細胞凋亡(apoptosis)、致癌基因轉形、腫瘤 細胞轉移，進而向下調控核內的轉錄因子，影響各種蛋白的表現，包括轉移相關蛋白。過去在不同細胞研究顯示經由ERK1/2、P38與JNK路徑會調控MMPs與uPA的表現，例如，抑制了p38的磷酸化，則能增加TIMP-2的表現量，降低癌細胞的轉移能力，而JNK在抑制癌細胞轉移上也占非常重要的角色。因此抑制MAPKs路徑與抑制血管新生、細胞增生與癌細胞轉移有關。
因此，以下就上述與血管新生、細胞增生與癌細胞轉移相關的細胞蛋白質進行西方墨點分析，以說明化合物(I)對抑制腫瘤細胞轉移之作用機制。
請參照第5圖，為利用西方墨點分析法偵測隨著化合物(I)的處理時間增加對於乳癌細胞中ERK1/2、p38與JNK1/2的蛋白含量及其磷酸化反應的影響。將乳癌細胞以2μM的化合物(I)處理0-120分鐘後進行西方墨點分析，分析步驟同試驗例2-2中所示，在此不再贅述。
第5圖的結果顯示隨著化合物(I)處理時間增加，ERK1/2、p38、JNK1/2的蛋白表現不受影響，但其磷酸化則似乎有被抑制的情形，因此阻擋了訊傳遞息進入核內調控轉錄因子，而影響能促使血管新生作用及腫瘤轉移的之酵素表現。
試驗例3-3：化合物(I)對腫瘤細胞的訊息傳遞之影響
經由磷酸化活化的腫瘤相關蛋白PI3K及Akt可調節細胞許多的反應，如生長、生存、發炎以及移動(migration)。當生長因子受體(growth factor receptor)受到活化後，經由PI3K/Akt活化，而起始下游蛋白的活化，促進腫瘤細胞的存活。
因此，以下就細胞中PI3K及Akt進行西方墨點分析，以說明化合物(I)對抑制腫瘤細胞轉移之作用機制。
請參照第6圖，為利用西方墨點分析法偵測隨著化合物(I)的處理時間增加對於乳癌細胞中PI3K及Akt的蛋白含量及其磷酸化反應的影響。將乳癌細胞以2μM的化合物(I)處理0-120分鐘後進行西方墨點分析，分析步驟同試驗例2-2中所示，在此不再贅述。
第6圖的結果顯示隨著化合物(I)處理時間增加，PI3K及Akt的蛋白表現不受影響，但其磷酸化則似乎有被抑制的情形，尤其是PI3K，因此阻擋了訊傳遞息進入核內調控轉錄因子，而影響腫瘤細胞的生長、生存、發炎以及移動。
試驗例3-4：化合物(I)經由產生活性氧影響腫瘤細胞發展
活性氧物質(reactive oxygen species；ROS)是生物體在細胞內的代謝和環境刺激下所產生的分子，如O-2 、˙OH和H2 O2 。細胞內自由基造成細胞凋亡的可能機制有自由基改變DNA以誘發細胞凋亡、蛋白質-自由基作用使蛋白質變性。近年來亦有很多研究指出ROS在正常細胞是重要的訊息傳導角色。
請配合參照第7圖，第7圖為以化合物(I)處理後培養乳癌細胞後進行細胞存活率分析(MTT assay)的結果。
第7圖為分別比較單獨以不同劑量的化合物(I)處理後的細胞存活率及以化合物(I)加入抗氧化劑NAC處理，是否能使細胞存活率恢復正常，藉以釐清化合物(I)所導致的活性氧增加對腫瘤細胞生長的效應。細胞存活檢測之試驗方法參照試驗例2-1的步驟，以0、2、5、7.5、10及15mM的化合物(I)處理MDA-MD-231乳癌細胞24小時後，觀察對MDA-MD-231乳癌細胞存活率之影響。第7圖為量化圖，數據結果以mean±SD值表示，n=3。
第7圖的結果顯示，當濃度為2-15μM之化合物(I)作用於 MDA-MB-231細胞後，細胞存活率隨著化合物(I)處理濃度增加而明顯降低；相反地，在添加化合物(I)及抗氧化劑NAC的試驗組中，細胞存活率不受影響。
根據上述結果可知化合物(I)以產生活性氧的方式促使腫瘤細胞死亡。
試驗例3-5：化合物(I)抑制腫瘤細胞遷移(migration)
癌細胞轉移時，若為高轉移細胞株，當細胞間受到破壞，加上細胞本身釋放大量的蛋白分解酵素促進細胞外基質降解，會增加癌細胞的遷移情形，造成癌細胞的轉移。
請參照第8圖，為以細胞刮傷試驗(Wound scratching assay)分析不同劑量的化合物(I)對於癌細胞遷移的影響效應。
觀察細胞遷移(Wound migration)的方法係將MDA-MB-231 cell(3×105 )種於12孔盤，隔天以PBS清洗2次，換成含1% FBS細胞培養液，隔天以在孔盤底部刮一條空間後，移除細胞培養液並以PBS洗2次，加入含1% FBS的細胞培養液與不同濃度的化合物(I)，在0、12、24、36小時分別拍照觀察細胞遷移的情形，反應結束後，以75%冰酒精固定30分鐘，待酒精完全揮發後，以Giemsa Stain染色，於顯微鏡底下(200X)隨機選三個視野計數遷移的細胞量(Lin et al.,2008)。細胞刮傷試驗以未添加化合物(I)為對照組、添加0.5、1、2μM的化合物(I)為試驗組處理乳癌細胞0、12、24、36小時後，觀察化合物(I)對MDA-MD-231乳癌細胞遷移的影響。第8圖為細胞遷移的量化圖，數據結果以mean±SD值表示，n=3。
如第8圖中所示，計數遷移的細胞量在較低濃度(0.5μM)的化合物(I)存在下，在12-24小時間尚有約60-70%的乳癌細胞 遷移，而當化合物(I)的濃度在1μM以上時，即能顯著抑制乳癌細胞的遷移能力。
試驗例3-6：化合物(I)抑制腫瘤細胞侵入(invasion)
當惡性腫瘤準備進行轉移的時候，腫瘤細胞藉由破壞extracellular matrix(ECM)進而侵入組織的基膜(basement membrane)，稱為侵入(invasion)，是藉由金屬蛋白質酶群MMPs的參與，促進癌症細胞侵犯的能力。
請參照第9圖，為以細胞移行試驗(Transwell invasion assay)觀察化合物(I)對乳癌細胞移行的影響。第9圖為細胞移行試驗之量化圖，數據結果以mean±SD值表示，n=3。
細胞移行試驗係利用Matrigel為細胞外基質的成分，可以模擬細胞間環境，當BD MatrigelTM Invasion Chamber中的細胞受到Matrigel matrix中的生長因子刺激，則細胞會分泌一些基質分解酵素，將Matrigel分解，會吸引細胞的移行，若細胞移行能力強，染色後可以在濾膜上觀察到細胞。
細胞移行試驗方法為於轉移盤(Transwell)加入800μl含有10% FBS的DMEM當趨化劑，再將500μl的細胞(1×105 )種入轉移盤，分別加入無FBS的DMEM培養液以及0.5、1、2μM的化合物(I)移入37℃、5% CO2 的培養箱培養20小時，以Giemsa染色15分鐘後，以光學顯微鏡在200倍視野下觀察並拍照。每次實驗中之各組皆以3個重覆之轉移盤的平均值為代表。
細胞移行試驗量化的方法為隨機選取位於轉移盤膜下表面中的9個視野，並計算每一視野中的總細胞數；9個視野細胞數的平均值為每個轉移盤之乳癌細胞趨化性移動的指標，每次實驗中之各組皆以3個重覆之轉移盤的平均值為代表(Rose et al.,2005)。
如第9圖中所示，計數移行的細胞量隨著化合物(I)的濃度增加而減少移行的能力。
四、化合物(I)抑制血管新生(angiogenesis)
根據上述試驗例，可得知化合物(I)影響MAPK路徑中的ERK1/2、p38、JNK1/2磷酸化反應目前已知MAPKs路徑可能與抑制血管新生、細胞增生與癌細胞轉移有關，MDA-MB-231乳癌細胞可以經由TNF-α誘導MMP-9與AP-1的表現，而加入ERK抑制劑或P38抑制劑後，能降低TNF-α所誘導的MMP-9活性表現(Kimet al. ,2008)。
因此，以下將就化合物(I)對於TNF-α是否有影響，並且降低誘導的MMP-9活性表現作進一步分析。
試驗例4-1：化合物(I)抑制TNF-α誘導MMP表現
第10圖為針對使用不同劑量的化合物(I)對人類內皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells；HUVECs)的細胞存活率分析。
細胞存活率之測定係將內皮細胞(EAhy926細胞株)種至約8分滿，培養於含有15%FBS-DMEM的1XHAT(篩選具有融合特性的細胞)、1% glutamine、1% PSN的培養基中。細胞培養至一定數量時，以900rmp，10分鐘離心去除培養液，於實驗前24小時更換培養液，以血球計數器計算細胞數目。再將細胞(5×104 )種於24孔盤中，隔天細胞貼壁後，分別加入濃度為5、10、20μM的化合物(I)處理1小時，未添加化合物(I)者為對照組，用PBS洗兩次後，以10ng/mL的TNF-α/TGF-刺激，以PBS清洗。將每個孔中加入400μL的MTT試劑反應2小時，上清液於96孔 微量盤中，以570nm波長測吸光值。
第10圖的結果顯示，化合物(I)添加的濃度達10μM以上時，細胞存活率明顯下降。
觀察細胞遷移的方法請參照試驗例3-5所述。細胞刮傷試驗以未添加化合物(I)及TNF-α刺激的細胞為對照組，對照組的細胞不具有遷移的能力。其餘試驗組為受10ng/mL TNF-α刺激的細胞，以未添加化合物(I)、添加10、20μM的化合物(I)處理24小時後，觀察化合物(I)對MDA-MD-231乳癌細胞遷移的影響。
請參照第11圖，為利用Zymography酵素活性分析法偵測化合物(I)對於受10ng/mL TNF-α刺激的細胞誘導產生MMP-9、MMP2的酵素活性。Zymography酵素活性分析方法如試驗例4-1所述。
以未添加化合物(I)及TNF-α刺激的細胞為對照組，對照組的細胞不具有酵素活性。其餘試驗組為未添加化合物(I)、以5、10、20μM的化合物(I)處理，觀察化合物(I)是否對TNF-α 誘導MMPs的效應之影響。
由第11圖的酵素活性分析結果，可以明顯看到未添加化合物(I)的試驗組，可表現出MMP-9、MMP2的酵素活性；而以20μM的化合物(I)處理的試驗組，其完全未表現出MMP2的酵素活性。因此化合物(I)具有抑制TNF-α 誘導MMPs的效應。
根據第10圖及第11圖之結果，化合物(I)可抑制由TNF-α 誘導的MMPs蛋白活性，特別是抑制能促進血管新生作用及腫瘤轉移的MMP-2、MMP-9酵素的活性。
五、化合物(I)抑制Her2/neu表現
原癌基因HER-2位於染色體17q21，與抗細胞凋亡、Akt路 徑、MAPK有關，HER-2具有內在酪氨酸激酶活性，參與調控細胞的生長、增殖及分化，Her-2/neu mRNA的大量表現，會促使癌細胞的繁殖能力增強，導致細胞週期紊亂，無法及時修復受損的DNA，導致不正常細胞之增生。
以下利用乳癌細胞MDA-MB-453為標的，說明化合物(I)對Her-2/neu表現的影響。
試驗例5-1：化合物(I)抑制Her2/neu及其下游基因表現
第12圖為針對使用不同劑量的化合物(I)對乳癌細胞MDA-MB-453的細胞存活率分析。
細胞存活率之測定係將MDA-MB-453細胞培養於5% Fetal bovine serum-DMEM F12/insulin/hydrocortisol/epidermal growth factor的培養液中。培養箱維持5% CO2 、37℃恆溫。細胞培養至一定數量時，以900rmp離心10分鐘去除培養液，於實驗前24小時更換培養液，以血球計數器計算細胞數目。
第12圖的結果顯示，隨著化合物(I)添加的濃度越高，乳癌細胞存活率呈現顯著下降。
第13圖為以西方墨點分析在不同濃度的化合物(I)存在下，與Her-2/neu相關的促進腫瘤細胞存活的蛋白質表現情形。將乳癌細胞分別以10-60μM的化合物(I)處理後進行西方墨點分析，分析步驟同試驗例2-2中所示，在此不再贅述。
第13圖的結果顯示隨著化合物(I)處理濃度提高，受Her-2/neu活化的p-Tyrosine的表現量顯著降低，與Her-2/neu的表現量呈現一致的趨勢。而PI3K及Akt的蛋白表現亦受到較高濃度的化合物(I)抑制，從而抑制了下游的訊息傳遞，使乳癌細胞的生長、生存、發炎以及移動受到影響。
根據第13圖的結果，可知當乳癌細胞以40μM的化合物(I)處理後，即能完全抑制Her-2/neu及p-Tyrosine的表現，因此以下使用40μM的化合物(I)處理細胞，觀察細胞中ROS含量。細胞內活性氧物質產量測定法係如試驗例3-4所示。
請配合參照第14圖，第14圖為利用活性氧物質產量測定法偵測以40μM的化合物(I)處理之乳癌細胞，隨著處理時間的增加對於乳癌細胞中ROS含量的影響結果的量化圖，實驗結果數據以平均值±標準差(MEAN±SD)表示(n=3)。以SPSS系統進行變異性分析(ANOVA)，並以Duncan’s multiple range test做組間差異比較。P<0.05代表有顯著性差異。
第14圖的量化結果顯示，與未添加化合物(I)的對照組相較，以化合物(I)處理的試驗組的細胞中活性氧增加量均具有顯著性差異。
第15圖為以40μM的化合物(I)處理之乳癌細胞在2.5mM抗氧化劑NAC存在下的細胞活率分析。結果顯示，在以化合物(I)單獨處理細胞時，細胞存活率相較於對照組減少了一半，然而當抗氧化劑NAC與化合物(I)同時存在時，則可回復細胞的存活率，化合物(I)使細胞死亡的效應被大幅減弱，因此可以得知化合物(I)是透過產生ROS的方式促使乳癌細胞死亡。
六、化合物(I)誘導乳癌細胞自噬(autophage)
細胞自噬(autophagy)是一種利用自我消化提供的回收作為一種臨時替代能源的生理機制，如果細胞持續或過度誘導的自噬，細胞死亡可能隨之而來。有研究指出，細胞自噬與細胞凋亡是相互調節的，當細胞抵抗誘導凋亡等療法下，自噬性細胞死亡可作為替代細胞死亡的機制。因此，誘導自噬性細胞死亡可作為 治療癌症的治療策略是合理的。
以下將以西方墨點分析驗證化合物(I)對於乳癌細胞的自噬機制之效應。其結果顯示於第16圖及第17圖。
試驗例6-1：化合物(I)誘導乳癌細胞自噬相關蛋白表現
第16圖為在不同濃度的化合物(I)存在下，乳癌細胞MCF-7在培養72小時後，與細胞自噬相關之LC3B蛋白的表現情形。結果顯示，在當化合物(I)的濃度為10μM以上時，LC3B蛋白表現量即與對照組具有顯著的差異，化合物(I)可能與乳癌細胞MCF-7的細胞自噬作用有關。
第17圖為在不同濃度的化合物(I)存在下，乳癌細胞MDA-MB-231在培養24、48或72小時後，與細胞自噬相關之LC3-II蛋白的表現情形。結果顯示，在當化合物(I)的濃度為7.5μM時，LC3-II蛋白表現量即與對照組具有顯著的差異，化合物(I)可能與乳癌細胞MDA-MB-231的細胞自噬作用有關。
七、化合物(I)之動物實驗抑制裸鼠乳癌腫瘤
根據上述細胞實驗，可知化合物(I)具有抑制乳癌細胞生長的效果，以下將以體內試驗(in vivo )方式進一步驗證其功效。
試驗例7-1：化合物(I)於體內試驗中抑制裸鼠乳癌腫瘤生長
體內試驗以裸鼠異位移植腫瘤模式(nude mice xenograft tumor model)進行。實驗動物係購自中華民國國家動物中心的BALB/c-nu種系裸鼠，飼養在無菌箱中，光照時間為7：00-19：00，提供過濾過的空氣及滅菌過的水及飼料，讓其自行食用。採用8-10週成熟的母性裸鼠來進行實驗。
將乳癌細胞(2x106 /100μl)以皮下注射的方式植入60隻裸鼠 背部一側，約10天裸鼠背部長出1-3mm的腫瘤後任意分成4組，再將3組給與不同劑量之樟芝活性成分，每天觀察其腫瘤生成的情形並照相保存，每三天量一次腫瘤體積，而體積的計算方式根據1987年Osborne等人提出的公式。
試驗動物分為對照組(無任何處理)、溶劑組(只施打生理食鹽水)及注射化合物(I)組(劑量為0.75mg/Kg)，每天注射，將動物於正常情形下養育、照相記錄，以比較各組實驗動物腫瘤生長的情形。
請配合參照第18圖，第18圖為對照組與注射化合物(I)組的MDA-MB-231移植裸鼠之生長周數與腫瘤體積的大小比較圖。
第18圖的比較圖中可明顯看出注射化合物(I)的移植裸鼠，其腫瘤體積較對照組為小，且對照組與注射組的腫瘤重量分別為對照組0.455±0.328，注射組為0.039±0.028，注射組與對照組之間具有顯著性差異。
試驗例7-2：腫瘤移植裸鼠之細胞內E-cadherin及Vimentin的表現
腫瘤移植裸鼠之細胞內的訊息傳遞相關蛋白的表現量以免疫組織化學染色(Immunochemistry Staining)方法進行。本實驗特別針對E-cadherin及Vimentin的表現進行偵測。免疫組織化學染色方法及其量化方法如試驗例2-2所述，在此不再贅述。
由第19圖及第20圖的結果顯示，以0.75mg/Kg/天注射化合物(I)的注射組移植裸鼠，其腫瘤組織內有助於抑制腫瘤發展的蛋白質E-cadherin的量較高，而促進腫瘤發展的蛋白質Vimentin的量較低。因此，化合物(I)具有直接抑制腫瘤組織生長的功效。
根據上述，化合物(I)或以化合物(I)為有效成份的混合 物能抑制腫瘤細胞增生，因此化合物(I)或以化合物(I)為有效成份的混合物能以醫藥組合物形式提供作為治療的藥物。
含有化合物(I)的醫藥組合物中，化合物(I)係以自由態形式或以藥學上可接受之鹽形式存在。此外，含有化合物(I)的醫藥組合物，可更包含一或多種藥學上可接受之載劑，例如賦形劑、溶劑、乳化劑、懸浮劑、分解劑、黏結劑、安定劑、防腐劑、潤滑劑、吸收延遲劑及脂質體。含有化合物(I)的醫藥組合物，可依照實際需要被製成一適用的投藥形式，例如口服投藥的形式或外用塗敷劑的形式，用以抑制腫瘤細胞增生。
根據上述，本發明實施例之化合物(I)及其醫藥組合物，可用以係應用於抑制乳癌上皮-間葉細胞轉型、抑制乳癌細胞轉移、抑制血管新生、抑制Her2/neu表現、調節乳癌細胞凋亡/自噬作用或應用於製備與上述功能有關之藥物。
雖然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下： 第1A圖為施予不同劑量之化合物(I)對抑制人類正常乳腺細胞(MCF-10A)、非侵略性乳癌細胞(MCF-7)和侵略性乳癌細胞(MDA-MB-231)存活率的影響之量化圖。
第1B圖為細胞群落形成分析法分析化合物(I)對乳癌細胞 MDA-MB-231的群落形成的影響結果。
第2A圖為濃度0、0.5、1、2mM之化合物(I)對培養24小時後的乳癌細胞MDA-MB-231中與EMT相關的蛋白質之西方墨點分析結果。
第2B圖為濃度0、10、15、20μM之化合物(I)對培養24小時後的乳癌細胞MCF-7中與EMT相關的蛋白質西方墨點分析結果。
第3圖為E-cadherin螢光活性(Luciferase activity)的量化分析圖。
第4A圖為利用西方墨點分析法偵測施予不同劑量的化合物(I)對乳癌細胞中特定的蛋白質含量的影響結果。
第4B圖為利用Zymography酵素活性分析法偵測施予不同劑量的化合物(I)對乳癌細胞中MMP-9、MMP2及uPA的酵素活性影響結果。
第5圖為利用西方墨點分析法偵測隨著化合物(I)的處理時間增加對於乳癌細胞中ERK1/2、p38與JNK1/2的蛋白含量及其磷酸化反應的影響結果。
第6圖為利用西方墨點分析法偵測隨著化合物(I)的處理時間增加對於乳癌細胞中PI3K及Akt的蛋白含量及其磷酸化反應的影響結果。
第7圖為以化合物(I)處理培養乳癌細胞後進行細胞存活率分析(MTT assay)的量化圖。
第8圖為為以細胞刮傷試驗分析不同劑量的化合物(I)造成癌細胞遷移的量化圖。
第9圖為細胞移行試驗結果的量化圖。
第10圖為針對使用不同劑量的化合物(I)對人類內皮細胞 的細胞存活率分析。
第11圖為利用Zymography酵素活性分析法偵測化合物(I)對於受10ng/mL TNF-α刺激的細胞誘導產生MMP-9、MMP2的酵素活性分析結果。
第12圖為針對使用不同劑量的化合物(I)對乳癌細胞MDA-MB-453的細胞存活率分析。
第13圖為以西方墨點分析在不同濃度的化合物(I)存在下，與Her-2/neu相關的促進腫瘤細胞存活的蛋白質表現情形。
第14圖為利用活性氧物質產量測定法偵測以化合物(I)處理之乳癌細胞中ROS含量的量化圖。
第15圖為以40μM的化合物(I)處理之乳癌細胞在2.5mM抗氧化劑NAC存在下的細胞活率分析。
第16圖為在不同濃度的化合物(I)存在下，乳癌細胞MCF-7在培養72小時後與細胞自噬相關之LC3B蛋白的表現情形。
第17圖為在不同濃度的化合物(I)存在下，乳癌細胞MDA-MB-231在培養24、48或72小時後，與細胞自噬相關之LC3-II蛋白的表現情形。
第18圖為對照組與注射化合物(I)組的MDA-MB-231移植裸鼠之生長周數與腫瘤體積的大小比較圖。
第19圖為E-cadherin之一級抗體反應的量化結果。
第20圖為Vimentin之一級抗體反應的量化結果。

Claims (3)

  1. 一種化合物(I)之用途，該化合物(I)具有如下所示之結構： ，係應用於製備抑制乳癌細胞增生的藥物。
  2. 如請求項1所述之化合物(I)之用途，其中該製備抑制乳癌細胞增生的藥物包含抑制乳癌上皮-間葉細胞轉型之藥物、抑制乳癌細胞轉移之藥物、抑制血管新生之藥物、抑制Her2/neu表現之藥物或調節乳癌細胞自噬作用之藥物。
  3. 如請求項1所述之化合物(I)之用途，其中該乳癌細胞為雌激素受體陽性的乳腺癌细胞株或雌性激素受體陰性的乳腺癌細胞株。
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