TWI504390B - 苯醌類化合物應用於抑制黑色素瘤細胞之Ｗｎｔ／β－ｃａｔｅｎｉｎ訊息途徑之用途 - Google Patents

Description

苯醌類化合物應用於抑制黑色素瘤細胞之Wnt/β-catenin訊息途徑之用途

本發明是有關於一種苯醌類化合物之用途，特別是有關於一種抑制黑色素瘤細胞增生的苯醌類化合物及其醫藥組合物。

黑色素瘤(melanoma)為皮膚惡性腫瘤的一種，惡性度最高，容易轉移，對西方人而言是皮膚疾病中發病率佔第一位的死亡原因。

目前對於治療黑色素瘤藥物的研究尚未完善。由於黑色素瘤對化學治療及放射線治療的效果不佳，又伴隨著高度的轉移性，因此若能尋找到輔助癌症治療的天然食材，是當前重要的課題。

Wnt/β-catenin訊息途徑可調控許多細胞的進程，包括增生(proliferation)、分化(differentiation)、存活(survival)、細胞凋亡(apoptosis)及細胞的轉移(motility)。約有30%的黑色素瘤可觀察到Wnt/β-catenin訊息途徑異常活化的現象，因此抑制Wnt/β-catenin訊息途徑也成為治療黑色素瘤的策略之一。

因此，本發明之一態樣是在提供一種苯醌類化合物之用途，係應用於抑制黑色素瘤細胞之Wnt/β-catenin訊息途徑。苯醌類化合物包含化合物(I)所示之結構或其還原態： 其中，R₁ 為氫基或[(C₄ H₄ )CH₃ ]_n ，n為1-5的整數；R₂ 為氫基或甲氧基。

依據本發明之實施方式，苯醌類化合物包含化合物(I)的組態異構物。

本發明實施方式之一實施例中，化合物(I)的組態異構物包含如下所示之結構： 其中，R₁ 為氫基或[(C₄ H₄ )CH₃ ]_n ，n為1-5的整數。

本發明實施方式之一實施例中，苯醌類化合物可為2,3-Dimethoxy-5-methyl-1,4-benzoquinone。

本發明實施方式之另一實施例中，苯醌類化合物可為2-methoxy-6-methyl-1,4-benzoquinone。

本發明實施方式之再一實施例中，苯醌類化合物可為5-methyl-1-benzo[1,3]dioxole-4,7-dione。

本發明之另一態樣是在提供一種苯醌類化合物(I) 的用途，係應用於製備抑制黑色素瘤細胞生長的藥物。

依據本發明之實施方式，製備抑制黑色素瘤細胞生長的藥物包含抑制黑色素瘤細胞增生之藥物、抑制黑色素瘤細胞分化之藥物、抑制黑色素瘤細胞存活之藥物、抑制黑色素瘤細胞轉移之藥物或促成黑色素瘤細胞凋亡之藥物。

本發明實施方式之實施例中，抑制黑色素瘤細胞生長的藥物為口服劑、注射劑或皮膚外用劑。

本發明之另一態樣是在提供一種用於抑制黑色素瘤細胞的Wnt/β-catenin訊息途徑而改善皮膚癌病況的醫藥組合物，包含以苯醌類化合物(I)、以苯醌類化合物(I)為有效成分之加工物或天然物的萃取物、苯醌類化合物(I)之藥學上可接受的鹽類、苯醌類化合物(I)之藥學上可接受的溶合物或上述之任意組合。

本發明實施方式之實施例中，以苯醌類化合物(I)為有效成分之加工物為樟芝發酵液或樟芝發酵液的乾燥粉末。

本發明之又一態樣是在提供一種補充劑，包含以苯醌類化合物(I)為有效成分，其中苯醌類化合物(I)之來源為人工合成、樟芝發酵液或樟芝發酵液萃取物。

本發明實施方式之實施例中，補充劑為液態、粉末、錠劑、膠囊或注射劑。

本發明之再一態樣是在提供一種泛醌-0(Ubiquinone-0)之用途，係應用於抑制黑色素瘤細胞之Wnt/β-catenin訊息途徑。

根據上述，本明實施例之苯醌類化合物(I)能抑制黑 色素瘤細胞之Wnt/β-catenin訊息途徑，適用於製備抑制黑色素瘤細胞增生、分化、存活、轉移或促成黑色素瘤細胞凋亡之藥物、醫藥組合物或補充劑。

根據本發明之實施方式，可抑制黑色素瘤細胞Wnt/β-catenin訊息途徑之苯醌類化合物(I)、其還原態或其異構物的來源可為化學合成，或來自於天然物、加工物或加工物之萃取物。

其中，R₁ 為氫基或[(C₄ H₄ )CH₃ ]_n ，n為1-5的整數；R₂ 為氫基或甲氧基。

應說明的是，來自於天然物、加工物或加工物萃取之苯醌類化合物(I)，其自然狀態下可產生氧化還原態的互換、不同的結構異構物(constitutional isomers)或組態異構物(configurational isomers)。而根據本發明之實施例，不論是合成的化合物(I)，或由樟芝之發酵液得到含化合物(I)的天然物或加工物萃取物，其抑制黑色素瘤細胞Wnt/β-catenin訊息途徑之效應均呈現一致。因此以下試驗例所述之試驗的標化合物(I)的具體結構為R₁ 為氫基、 R₂ 為甲氧基。可理解的是，由純的化合物(I)產生的功效同樣會出現在以化合物(I)為主要有效成份之混合物中。

以下實施例是用來闡明本揭示內容特定態樣並幫助習知技藝者了解並實施本揭示內容。但本揭示內容範疇並不限於這些實施例中。

實施例 一、化合物(I)抑制黑色素瘤細胞增生(Proliferation) 試驗例1-1：化合物(I)抑制黑色素瘤細胞存活率

試驗使用的細胞為人類正常皮膚細胞(HaCaT)、黑色素腫瘤細胞(A2058)、小鼠黑色素瘤细胞(B16F1)和小鼠黑色素瘤高轉移细胞(B16F10)。各受試細胞培養於適當培養基中，培養箱維持5% CO2、37℃恆溫。細胞培養至一定數量時，以900轉數(rpm)離心10分鐘去除培養液，於實驗前24小時更換培養液，並以細胞計數器(hemocytometer)計算細胞數目。

細胞存活率(viability)之測定係以細胞存活率分析(Method of transcriptional and translational assay；MTT assay)進行。細胞存活檢測之試驗方法參照Parada-Turska等人提出的步驟。

受試細胞種於24孔盤(2.5×10⁵ cells/well)，隔天細胞貼壁後，以PBS清洗。加入含1%胎牛血清(FBS)的DMEM培養液，讓細胞同步化後，隔天加入不同濃度的化合物(I)，置於37℃、5% CO₂ 培養24小時，以PBS清洗一次，再各加入400 μl的MTT試劑，反應4小時後再加入400 μl的10% SDS，反應12小時，抽出200 μl的上 清液於96孔微量盤中，以570 nm波長測吸光值。

請參照第1圖，為施予不同劑量之化合物(I)對抑制人類正常皮膚細胞(HaCaT)、黑色素腫瘤細胞(A2058)、小鼠黑色素瘤细胞(B16F1)和小鼠黑色素瘤高轉移细胞(B16F10)存活率的影響之量化圖，數據結果以mean±SD值表示，n=3，p<0.05。

第1圖的結果顯示，試驗濃度為0-20 μM之化合物(I)作用於受試細胞24小時後，對正常皮膚細胞HaCaT不產生影響，A2058之存活率有70%；對B16F1之IC₅₀ 濃度約在15-20 μM之間；對高轉移细胞B16F10則具有明顯之毒殺性，IC₅₀ 濃度約在10 μM。

根據上述結果可知化合物(I)具有強效抑制小鼠黑色素瘤高轉移细胞株活性的效果。以下試驗例中，使用之「腫瘤細胞」、「黑色素瘤細胞」用語，如未特別指明的情況下，均指小鼠黑色素瘤高轉移细胞株B16F10。

試驗例1-2：化合物(I)抑制腫瘤細胞群落形成

為了瞭解化合物(I)對黑色素瘤高轉移細胞B16F10的群落形成的影響，以細胞群落形成分析法(Colony formation assay)觀察之。

第2圖的(a)部分為將細胞貼附於細胞基質後，以不同濃度的化合物(I)反應24小時，再換成新鮮含10% FBS細胞培養液後，培養5天的菌落生長情形；結果顯示化合物(I)具有顯著的抑制黑色素瘤細胞的群落形成的作用。

第2圖的(b)部分為將(a)部分所示的細胞群落掃描上電腦並用70%酒精將群落溶解，使用吸光值540 nm測 量後得到的數值。結果可以明顯看出，試驗的黑色素瘤細胞群落數形成呈現與化合物(I)的劑量相關性。

二、化合物(I)抑制黑色素瘤細胞Wnt/β-catenin調控路徑

啟動癌細胞生長有許多訊息傳遞的途徑，牽涉到多種蛋白的活化。有30%的黑色素瘤可觀察到Wnt/β-catenin訊息途徑異常活化的現象，因此抑制Wnt/β-catenin訊息途徑也成為治療黑色素瘤的策略之一。Wnt/β-catenin訊息途徑中相關的蛋白表現或活化可調控腫瘤細胞的進程，包括增生(proliferation)、分化(differentiation)、存活(survival)、細胞凋亡(apoptosis)及細胞的轉移(motility)。

試驗例2-1：化合物(I)促進β-Catenin磷酸化

肝醣合成激酶-3β(Glycogen synthase kinase-3 beta；GSK3β)為一個多功能的酵素激酶，在細胞中不僅參與肝醣合成路徑也調控許多訊息傳遞、基因表現、細胞生存或走向死亡等重要機轉。β-catenin是一種可調控降解的腫瘤相關蛋白質，目前的研究顯示β-catenin可被GSK3β磷酸化，而β-catenin的磷酸化與癌變密切相關。

以下以西方墨點分析(Western blotting)觀察不同濃度的化合物(I)對黑色素瘤細胞中之β-catenin及GSK3β的蛋白含量及其磷酸化反應的影響。

第3圖為將培養24小時的黑色素瘤細胞B16F10於濃度0、5、10、15及20 μM之化合物(I)處理後，以西方墨點分析偵測黑色素瘤細胞中β-catenin及磷酸化的 β-catenin(p-β-catenin)、GSK3β及磷酸化的GSK3β(p-GSK3β)的蛋白含量結果。β-actin為內控制組。

西方墨點分析之步驟為細胞以4℃的PBS洗滌二次，加入溶解緩衝溶液(lysis buffer)，以細胞刮片(rubbr policeman)刮碎並溶解細胞，將此細胞溶解液取至1.5 ml的微量離心管中，震盪1分鐘，再於12000轉數離心10分鐘取上清液，以Bio-Rad protein assay kit來測定蛋白質的濃度，並將剩餘的蛋白質萃取液置於-70℃保存。取100 μg的蛋白質溶液，加入等體積約二倍濃度之SDS/protein loading buffer於100℃煮沸10分鐘，冷卻後將蛋白質樣品放至每個中，將電壓調至100伏特，等到蛋白質樣品跑完並進行蛋白質電泳的轉印。取一張聚偏氟乙烯膜(poly(vinylidene fluoride)；PVDF)，甲醇浸溼後，放入轉印槽於4℃冰櫃中，以600微安培電流進行蛋白質的轉移，4小時後，將PVDF取出，放置於1% BSA的PBS blocking solution中，搖晃2小時，再放一次抗體的blocking solution中，於室溫緩慢搖晃1小時，以PBST洗滌PVDF膜3次，每次3-5分鐘，轉數為100 rpm。依不同的一級抗體，稀釋倍數，置於水平式旋轉器上於室溫振盪2小時，用PBST洗三次，接著使用冷光影像儀器，將PVDF膜以塑膠夾子置入黑色金屬盤上，蛋白面朝上，將以1：1混合的Chemiluminesent Substrate加入於膜上，再依不同抗體的螢光強弱決定曝光時間。

第3圖的結果顯示隨著化合物(I)處理濃度增加，β-catenin的蛋白表現會受到濃度增加而減少，但其磷酸化蛋白(p-β-catenin)的表現量隨濃度增加而增加，呈現劑量 相關性；反之，GSK3β的量則有被化合物(I)抑制的情形，其磷酸化蛋白(p-GSK3β)亦隨化合物(I)濃度增加而減少。根據上述，證實化合物(I)會促進有助於抑制腫瘤發展的蛋白質p-β-Catenin磷酸化，並調控非磷酸化β-Catenin及GSK3β的降解。

試驗例2-2：化合物(I)抑制Wnt/β-catenin調控相關蛋白表現

以下再就Wnt/β-catenin調控路徑中具有指標性的蛋白質進行西方墨點分析，以說明化合物(I)對抑制黑色素腫瘤高轉移細胞之作用機轉。

請參照第4圖，為黑色素腫瘤細胞中會促進腫瘤發展的蛋白質表現情形，包括Wnt-5a、Low-density lipoprotein receptor-related protein 6(LPR6)、Axin、Dvl。β-actin為內控制組，西方墨點分析之步驟同試驗例2-1所示。

第4圖的結果顯示，隨著化合物(I)的劑量增加，黑色素腫瘤高轉移細胞中Wnt/β-catenin調控路徑的Wnt-5a、LPR6、Axin、Dvl蛋白表現均被抑制，且呈現劑量相關性。

試驗例2-3：化合物(I)抑制β-Catenin入核表現

根據上述，化合物(I)會促進有助於抑制腫瘤發展的蛋白質p-β-Catenin磷酸化，並調控非磷酸化β-Catenin及GSK3β的降解。目前研究已知大部分非磷酸化的β-catenin都定位於核中，以下針對在化合物(I)存在下，細胞中的β-catenin位置進行分析。

第5圖為利用細胞免疫螢光染色(Immunofluenrence staining)方法，使用β-Catenin之一級抗體並以螢光顯微鏡在200倍視野下的照片。

細胞免疫螢光染色分析係將不同濃度的化合物(I)刺激細胞後，加入β-Catenin之一級抗體(1：250稀釋)，置於37℃、5% CO₂ 中培養2小時。再加入螢光二級抗體(1：200稀釋)，最後加入DAPI(1：1000稀釋)避光置於室溫5分鐘，在螢光顯微鏡下觀察拍照(200x)再使用mounting gel封片。

第5圖的結果顯示，化合物(I)可抑制β-catenin入核，並且降低核質β-catenin的蛋白表現，佐證化合物(I)能促進p-β-Catenin磷酸化以抑制腫瘤發展。

試驗例2-4：化合物(I)促進核內及細胞質β-catenin降解

由於未受到磷酸化的β-catenin會在細胞質中累積並轉位至細胞核，再進一步分析當化合物(I)存在下，是否具有促進β-catenin降解的效果。

第6圖為利用以西方墨點法分析以不同濃度的化合物(I)處理，對細胞質及核內的β-catenin在核內及細胞質中表現量的影響。Histone及β-actin分別核內及細胞質的內控制組。

第6圖的結果顯示，隨著化合物(I)的處理濃度提高，細胞質及核內的β-catenin量均顯著減少。

試驗例3-1：化合物(I)促進β-catenin的降解

根據前述已知，化合物(I)可抑制β-catenin入核表現，並且降低核質β-catenin的蛋白表現。為確定化合物(I)在Wnt/β-catenin調控路徑中對β-catenin蛋白量的影響機轉，以給予受試樣品蛋白酶體抑制劑(proteasome inhibitor)、GSK3β抑制劑或蛋白合成抑制劑(protein synthesis inhibitor)的方式，以西方墨點法分析觀察黑色素腫瘤高轉移細胞中蛋白質量的變化。

請參照第7圖，為偵測同時給予化合物(I)及蛋白酶體抑制劑MG132後，β-catenin蛋白的表現情形。β-actin為內控制組。西方墨點分析之步驟同試驗例2-2中所示。

由第7圖可看出，當化合物(I)單獨存在下，β-catenin蛋白在細胞中的量明顯減少，而在蛋白酶體抑制劑MG132單獨存在時，β-catenin蛋白在細胞中的量很高；然而當同時給予化合物(I)及蛋白酶體抑制劑MG132時，則能使β-catenin的蛋白量回復為較少量。

第8圖為偵測同時給予化合物(I)及GSK3β抑制劑SB216763後，β-catenin蛋白的表現情形。

由第8圖可看出，當化合物(I)單獨存在下，β-catenin蛋白在細胞中的量明顯減少，而在GSK3β抑制劑SB216763單獨存在時，β-catenin蛋白在細胞中的量維持不變；然而當同時給予化合物(I)及GSK3β抑制劑SB216763時，仍能降低β-catenin的蛋白量。

第9圖為偵測於不同時間點給予化合物(I)或蛋白合成抑制劑(Cycloheximide；CHX)後，β-catenin的表現情形。

第9圖的結果顯示，以蛋白合成抑制劑CHX處理細胞0、6、12、24小時，β-catenin在細胞中的量隨著處理間增加而減少；而以15 μM之化合物(I)處理細胞的試驗組亦呈現類似的趨勢，推測化合物(I)與促進β-catenin的降解有關。

試驗例3-2：化合物(I)促進β-catenin降解為非GSK3β依賴型

第10圖為利用免疫沉澱法(Immunoprecipitation；IP)分析在化合物(I)存在下，β-catenin與其降解複合物中的GSK3β、Axin之交互作用。

由第10圖可得知，在化合物(I)存在下，β-catenin與Axin結合，而與GSK3β的結合並不明顯，表示在化合物(I)存在下，β-catenin的降解為非GSK3β依賴型。

試驗例4-1：化合物(I)抑制β-catenin轉錄活性

由於化合物(I)具有促進β-catenin降解的效果，進行β-catenin啟動子分析(TCF/β-catenin reporter assay)，可得知β-catenin下游的基因表現情形。

第11圖的(a)部分為以螢光報導基因分析β-catenin啟動子之表現的量化圖。結果顯示，隨著化合物(I)的劑量增加，B16F10細胞中的β-catenin啟動子表現隨之降低，即化合物(I)可抑制β-catenin轉錄活性。

第11圖的(b)部分為添加GSK3β抑制劑LiCL(Lithim Chroride)作為對照組，以螢光報導基因分析β-catenin啟動子之表現的量化圖。結果顯示，僅加入GSK3β抑制劑LiCl能增加β-catenin啟動子強度，然而隨著化合物(I)處理的劑量增加，而同時加入LiCl與化合物(I)，化合物(I)仍表現出能抑制β-catenin轉錄活性的作用。

試驗例4-2：化合物(I)抑制β-catenin下游基因表現

根據上述，化合物(I)能降低β-catenin啟動子的表現，可推知其下游標的基因如促進腫瘤增殖的c-myc蛋白、細胞 週期蛋白cyclin D1、抑制細胞凋亡之蛋白如生存素(survivin)的表現應受到影響而減少。

第12圖為以西方墨點法分析在化合物(I)存在下，β-catenin下游標的基因產物的表現情形。結果顯示，隨著化合物(I)處理的濃度增加，c-myc、cyclin D1及survivin的表現量均隨之減少。

二、化合物(I)促進黑色素瘤細胞凋亡(Apoptosis) 試驗例5-1：化合物(I)促進黑色素瘤細胞凋亡

從試驗例1-1及試驗例1-2已知，化合物(I)具有降低黑色素瘤細胞存活率的效果，以下將以DNA特異性螢光染色法以及細胞型態分析了解化合物(I)是否促進細胞凋亡。

第13圖為利用去氧核糖核酸末端轉移酶的缺口末端標記法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling；TUNEL)分析偵測細胞中染色體斷裂情形，以偵測細胞凋亡的結果量化圖。由第13圖的結果顯示，隨著化合物(I)的處理濃度提高，細胞凋亡的程度越高。

再參照第14圖，為利用流式細胞儀(flow cytometry)分析不同劑量的化合物(I)存在下細胞型態的變化，以觀察是否有細胞死亡的情形產生。由第14圖的結果顯示，隨著化合物(I)的處理濃度提高，細胞呈現死亡的比率越高。

試驗例5-2：化合物(I)提升細胞中促進黑色素瘤細胞凋亡蛋白質的含量

細胞凋亡途徑牽涉到一連串的相關蛋白質進行調節。例如，Procaspase-9、Procaspase-3為誘導細胞凋亡的蛋白質caspase-9及caspase-3之前身，腫瘤細胞中Procaspase-9及Procaspase-3的活化機制被破壞，所以在大部分癌細胞中發現的Procaspase-9、Procaspase-3量均高於正常細胞。

Bcl-2的生理功能是抑制細胞凋亡，而Bax則參與細胞凋亡作用。此外，當細胞毒性藥物誘發凋亡時，核膜Bax量的上升與核蛋白PARP的降解呈正相關。p53為凋亡活化基因，其藉由調控Bc1-2和Bax基因的表達來促進細胞凋亡。

先前之試驗例已證實化合物(I)具有促進細胞凋亡之效果，因此可藉由探討細胞凋亡途徑相關的蛋白質含量與化合物(I)劑量之相關性，進一步釐清其抑制腫瘤發展的相關機制。

第15圖為利用西方墨點法偵測在化合物(I)存在下細胞凋亡相關蛋白質的表現量。

第15圖的結果顯示，隨著化合物(I)處理的濃度增加，腫瘤細胞中抑制細胞凋亡的蛋白質包括Procaspase-9、Procaspase-3、ProPARP及Bcl-2的含量均隨之下降，呈現劑量相關性；相反地，參與細胞凋亡作用的蛋白質Bax及p53則隨化合物(I)處理濃度提高而增加。

上述結果證實化合物(I)具有誘發細胞凋亡的能力，並伴隨p53的蛋白表現增加、Bax/Bcl-2的比值(ratio)提高以及caspase-3、caspase-9以及PARP的裂解。藉由促進參與細胞凋亡作用的蛋白質表現，以及降低細胞中抑制細胞凋亡的蛋白質表現，達到抑制腫瘤細胞生長增殖的效果。

三、化合物(I)抑制黑色素瘤細胞轉移(Metastasis)

腫瘤轉移是腫瘤細胞從原位處經由一連串步驟擴散到遠端的器官組織，形成另一新腫瘤塊的過程。癌症轉移包括啟動侵入能力(invasion)、滲出(extravasation)與轉移(metastasis)的過程。在侵入過程，腫瘤細胞失去細胞與細胞間的粘著性，獲得移動性；接著滲出的細胞進入血液及淋巴系統，最後癌細胞轉移到目標位置成為新的腫瘤細胞。

試驗例6-1：化合物(I)降低黑色素瘤細胞中MMPs表現

癌細胞轉移的過程中通常伴隨著細胞外基質(Extracellular matrix；ECM)的分解，而主要扮演分解ECM的角色為基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase；MMPs)。腫瘤細胞會大量分泌MMPs，許多研究指出MMP-2及MMP-9在腫瘤轉移過程中扮演重要角色。此外基質金屬蛋白酶抑制劑TIMP-1、TIMP-2的表現則能抑制MMPs的活性，達到抑制腫瘤細胞入侵與轉移的作用。

因此，以下就上述與腫瘤轉移相關的細胞蛋白質進行西方墨點分析，以說明化合物(I)對抑制黑色素瘤細胞轉移之作用機制。

請參照第16圖，為利用西方墨點分析法偵測施予濃度0、2.5、5、7.5 μM之化合物(I)不同劑量的化合物(I)對黑色素瘤高轉移細胞中與轉移相關的蛋白質含量的影響。β-actin為內控制組。

第16圖的結果顯示，隨著化合物(I)的劑量增加，黑色素瘤高轉移細胞中MMP-2、MMP-9的表現被抑制，且呈 現劑量相關性；相反地，隨著化合物(I)的劑量增加，黑色素瘤高轉移細胞中TIMP-1、TIMP-2的表現量均隨之增加。

根據上述結果可知化合物(I)能藉由促進MMP抑制劑TIMP-1、TIMP-2表現抑制MMPs的活性，而達到抑制腫瘤細胞入侵與轉移的作用。

試驗例6-2：化合物(I)抑制黑色素瘤細胞遷移(migration)

癌細胞轉移時，若為高轉移細胞株，當細胞間受到破壞，加上細胞本身釋放大量的蛋白分解酵素促進細胞外基質降解，會增加癌細胞的遷移情形，造成癌細胞的轉移。

第17圖的(a)部分，為以細胞刮傷試驗(Wound scratching assay)分析不同劑量的化合物(I)對於黑色素瘤高轉移細胞遷移的影響效應。

觀察細胞遷移(Wound migration)的方法係將B16F10(3×10⁵ )種於12孔盤，隔天以PBS清洗2次，換成含1% FBS細胞培養液，隔天以在孔盤底部刮一條空間後，移除細胞培養液並以PBS洗2次，加入含1% FBS的細胞培養液與不同濃度的化合物(I)，在0及24小時分別拍照觀察細胞遷移的情形，反應結束後，以75%冰酒精固定30分鐘，待酒精完全揮發後，以Giemsa Stain染色，於顯微鏡底下(200X)隨機選三個視野計數遷移的細胞量(Lin et al.,2008)。細胞刮傷試驗以未添加化合物(I)為對照組、添加2.5、5、7.5 μM的化合物(I)為試驗組處理細胞24、小時後，觀察化合物(I)對黑色素瘤高轉移細胞B16F10遷移的量化結果，數據結果以mean±SD值表示，n=3。

如第17圖的(b)部分所示，計數遷移的細胞量在較低濃度(2.5μM)的化合物(I)存在下，在24小時後尚有細胞遷移，而當化合物(I)的濃度在5 μM以上時，即能顯著抑制細胞的遷移能力。

試驗例6-3：化合物(I)抑制黑色素瘤細胞侵入(invasion)

當惡性腫瘤準備進行轉移的時候，腫瘤細胞藉由破壞extracellular matrix(ECM)進而侵入組織的基膜(basement membrane)，稱為侵入(invasion)，是藉由金屬蛋白質酶群MMPs的參與，促進癌症細胞侵犯的能力。

請參照第18圖，為以細胞轉移試驗(Transwell invasion assay)分析不同劑量的化合物(I)對於黑色素瘤高轉移細胞侵襲的影響效應，其中(a)部分為細胞轉移試驗染色後的顯微鏡照片；(b)部分為(a)部分之結果的量化圖，數據結果以mean±SD值表示，n=3。

細胞轉移試驗係利用Matrigel為細胞外基質的成分，可以模擬細胞間環境，當BD MatrigelTM Invasion Chamber中的細胞受到Matrigel matrix中的生長因子刺激，則細胞會分泌一些基質分解酵素，將Matrigel分解，會吸引細胞的轉移，若細胞轉移能力強，染色後可以在濾膜上觀察到細胞。

試驗方法為於轉移盤(Transwell)加入800 μl含有10% FBS的DMEM當趨化劑，再將500 μl的細胞(1×105)種入轉移盤，分別加入無FBS的DMEM培養液以及0.5、1、2 μM的化合物(I)移入37℃、5% CO₂ 的培養箱培養20小時，以Giemsa染色15分鐘後，以光學顯微鏡在200倍視野下觀察並拍照。每次實驗中之各組皆以3個重覆之 轉移盤的平均值為代表。

細胞轉移試驗量化的方法為隨機選取位於轉移盤膜下表面中的9個視野，並計算每一視野中的總細胞數；9個視野細胞數的平均值為每個轉移盤之細胞趨化性移動的指標，每次實驗中之各組皆以3個重覆之轉移盤的平均值為代表(Rose et al.,2005)。

由第18圖(a)部分的顯微鏡照片觀察細胞轉移情形，可以明顯看到隨著化合物(I)濃度增加，能顯著降低癌細胞的轉移。B16F10為一種高轉移黑色素瘤細胞株，因此照片中可以觀察到對照組有許多細胞受到趨化劑(10% FBS細胞培養液)的吸引，轉移通過模擬細胞外基質的Matrigel到濾膜上，而在加入2.5、5、7.5 μM的化合物(I)的試驗組中，隨著化合物(I)濃度增加則顯著的降低黑色素瘤細胞B16F10的轉移。

另外，(b)部分中顯示計數轉移的細胞量隨著化合物(I)的濃度增加而顯著減少轉移的能力。

根據上述結果，可得知化合物(I)可使MMP-9、MMP-2表現量減少並降低癌細胞侵入的表現。

試驗例7：化合物(I)抑制黑色素瘤細胞侵襲與轉移相關蛋白表現

黑色素瘤高轉移細胞中會有β-catenin積累及下游蛋白質c-myc、細胞週期蛋白D1、生存素等表達增加的現象，藉由β-catenin的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)使β-catenin的基因缺失，可觀察化合物(I)調控Wnt/β-catenin訊息路徑之相關蛋白參與的細胞侵襲及轉移 作用。

第19圖為利用西方墨點分析法化合物(I)存在下，偵測β-catenin的小干擾RNA轉染的黑色素瘤高轉移細胞之轉移相關的蛋白質含量變化。β-actin為內控制組。結果顯示，與未轉染的細胞相比，以β-catenin小干擾RNA轉染的黑色素瘤高轉移細胞的累積較少，而加入化合物(I)處理更加對於其下游轉移相關蛋白的表現具有抑制效果。

四、化合物(I)抑制裸鼠黑色素腫瘤生長

根據上述結果，可知化合物(I)係經由抑制Wnt/β-catenin訊息路徑以抑制黑色素瘤高轉移細胞之生長、轉移、侵入的效果，以下將以體內試驗(in vivo )方式進一步驗證其功效。

試驗例7-1：化合物(I)抑制腫瘤移植裸鼠之黑色素腫瘤生長

體內試驗以裸鼠異位移植腫瘤模式(nude mice xenograft tumor model)進行。實驗動物係購自中華民國國家動物中心的BALB/c-nu種系裸鼠，飼養在無菌箱中，光照時間為7：00-19：00，提供過濾過的空氣及滅菌過的水及飼料，讓其自行食用。採用8-10週成熟的母性裸鼠來進行實驗。

將黑色素瘤高轉移細胞B16F10(2x10⁶ /100 μl)以皮下注射的方式植入60隻裸鼠背部一側，約10天裸鼠背部長出1-3 mm的腫瘤後任意分成4組，再將3組給與不同劑量之化合物(I)，每天觀察其腫瘤生成的情形並照相保存，每三 天量一次腫瘤體積，而體積的計算方式根據1987年Osborne等人提出的公式。

試驗動物分為對照組(無任何處理)、溶劑組(只施打生理食鹽水)及注射化合物(I)組(劑量為2 mg/Kg)，每天注射，將動物於正常情形下養育、照相記錄，以比較各組實驗動物腫瘤生長的情形。

請參照第20圖，(a)部分為對照組與注射化合物(I)組的B16F10移植裸鼠之腫瘤體積的照片；(b)部分為對照組與注射化合物(I)組的B16F10移植裸鼠之生長天數與腫瘤體積的大小比較圖；(c)部分為對照組與注射化合物(I)組的B16F10移植裸鼠之腫瘤重量的比較圖。

由第20圖之(a)部分可看出，注射化合物(I)的移植裸鼠，其腫瘤體積明顯較對照組小。

第20圖之(b)部分的比較圖中亦可明顯看出注射化合物(I)的移植裸鼠，其腫瘤體積較對照組為小。

第20圖之(c)部分的比較圖中顯示對照組與注射組之間的腫瘤重量具有顯著性差異。

根據上述結果，化合物(I)具有直接抑制腫瘤組織生長的功效。

試驗例7-2：腫瘤移植裸鼠之組織病理學檢查比較

腫瘤移植裸鼠之組織病理學檢查係以病理H&E染色法進行。將腫瘤及內臟以石蠟包埋組織，並將切片機切成5 mm之厚度玻片，再經脫臘、回水、復性等，以二次水清洗用Hematoxylin solution染30至50秒，再以0.1%醋酸水中反應20秒，並用二次水沖洗，最後再用Eosin染100 秒，並以Histoclad封片。

第21圖為組織病理學檢查的顯微照片。從圖中可看到未注射化合物(I)的對照組移植裸鼠，且其腫瘤細胞呈現高度的有絲分裂狀態(放大倍率400X)；相反地，以2 mg/Kg/天注射化合物(I)的注射組移植裸鼠，其腫瘤細胞呈現低度的有絲分裂狀態(放大倍率400X)。上述結果顯示直接注射適當劑量的化合物(I)可有效抑制腫瘤細胞的分裂。

試驗例7-3：注射化合物(I)對腫瘤移植裸鼠細胞凋亡之影響

第22圖為施予化合物(I)對腫瘤移植裸鼠之細胞凋亡的比較分析，以去氧核糖核酸末端轉移酶的缺口末端標記法(TUNEL)進行。

由第22圖的結果顯示，以2 mg/kg/天之劑量注射化合物(I)的裸鼠，其腫瘤細胞凋亡的程度明顯高於未注射的控制組，且兩組之差異具有統計上的意義。

試驗例7-4：注射化合物(I)對腫瘤移植裸鼠細胞中訊息傳遞相關蛋白的表現量之影響

腫瘤移植裸鼠之細胞內的訊息傳遞蛋白之表現量以免疫組織化學染色分析(Immunochemistry Staining)方法進行。本試驗針對Wnt/β-catenin訊息路徑的相關蛋白表現進行偵測。

第23圖(a)-(d)所示分別為腫瘤移植裸鼠之細胞內的各種相關蛋白表現之免疫組織化學染色的顯微鏡照片，其中(a)為控制組及注射組之β-catenin表現情形；(b)為cyclin D1 表現情形；(c)為survivin表現情形；(d)為MMP-9表現情形；右邊為(a)-(d)所示之結果量化後的比較。

由第24圖的結果顯示，與控制組相比較，以2 mg/Kg/天注射化合物(I)的注射組移植裸鼠，其腫瘤組織內促進腫瘤發展的Wnt/β-catenin訊息路徑蛋白質表現均受到抑制，且兩組之間的差異均具有統計上的意義。

第24圖為移植裸鼠腫瘤組織內的Wnt/β-catenin訊息路徑相關之蛋白質表現的西方墨點分析。從圖中可看到，未給予化合物(I)移植裸鼠對照組，其腫瘤細胞中促進腫瘤發展的蛋白質量均較高，例如β-catenin、c-myc、cyclin D1、survivin、ProPARP及Bcl-2，而促進細胞凋亡的蛋白質如p53、Bax則量較少；相反地，給予2 mg/Kg/天注射化合物(I)的注射組移植裸鼠，其腫瘤組織內促進腫瘤發展的蛋白質量均受到抑制，而促進細胞凋亡的蛋白質量則相對提升。

第25圖為第24圖之量化分析，以控制組之表現量為100%，分析注射組的表現受到抑制或促進的程度。其中，比較各個蛋白在控制組與注射組的組織中含量，不論哪種蛋白，其兩組之間的差異均具有統計上的意義。此外，從Bax/Bcl2 ratio來看，注射組的比值顯著地高於控制組，代表化合物(I)能促進腫瘤組織細胞凋亡。

根據上述，本發明實施例之化合物(I)及其醫藥組合物，可用以應用於經由調節Wnt/β-catenin訊息路徑之訊號傳遞而抑制黑色素瘤之細胞增生、黑色素瘤細胞轉移、促進黑色素瘤癌細胞凋亡或應用於製備與上述功能有關之藥物。

因此，化合物(I)或以化合物(I)為有效成份的混合物能抑制腫瘤細胞增生，因此化合物(I)或以化合物(I)為有效成份的混合物能以醫藥組合物形式提供作為治療的藥物。此外，亦可以補充劑形式提供作為保健品。

例如，含有化合物(I)的醫藥組合物中，化合物(I)係以自由態形式或以藥學上可接受之鹽形式存在。此外，含有化合物(I)的醫藥組合物，可更包含一或多種藥學上可接受之載劑，例如賦形劑、溶劑、乳化劑、懸浮劑、分解劑、黏結劑、安定劑、防腐劑、潤滑劑、吸收延遲劑及脂質體。含有化合物(I)的醫藥組合物，可依照實際需要被製成一適用的投藥形式，例如口服投藥、注射劑或外用塗敷劑的形式，用以抑制腫瘤細胞增生。

本發明實施例之苯醌類化合物(I)為有效成分製成之的醫藥組合物或補充劑，其苯醌類化合物之來源可為人工合成、樟芝發酵液或樟芝發酵液萃取物，補充劑可為液態、粉末、錠劑、膠囊或注射劑形式。

雖然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖為施予不同劑量之化合物(I)對HaCaT、 A2058、B16F1和B16F10細胞株存活率的影響之量化圖。

第2圖為以細胞群落形成分析法分析化合物(I)對高轉移细胞B16F10的群落形成之影響。

第3圖為利用西方墨點分析法偵測施予不同劑量的化合物(I)對B16F10細胞中β-Catenin、p-β-catenin、GSK3β及p-GSK3β蛋白質含量的影響。

第4圖為利用西方墨點分析法偵測黑色素腫瘤細胞中會促進腫瘤發展的蛋白質表現情形。

第5圖為利用細胞免疫螢光染色方法，使用β-Catenin之一級抗體並以螢光顯微鏡在200倍視野下的照片。

第6圖為利用以西方墨點法分析以不同濃度的化合物(I)處理，對細胞質及核內的β-catenin表現量的影響。

第7圖為偵測同時給予化合物(I)及蛋白酶體抑制劑MG132後β-catenin蛋白的表現情形。

第8圖為偵測同時給予化合物(I)及GSK3β抑制劑SB216763後β-catenin蛋白的表現情形。

第9圖為偵測於不同時間點給予化合物(I)或蛋白合成抑制劑後β-catenin的表現情形。

第10圖為利用免疫沉澱法分析在化合物(I)存在下，β-catenin與其降解複合物中的GSK3β、Axin之交互作用。

第11圖為以螢光報導基因分析β-catenin啟動子之表現的量化圖，其中(a)部分為β-catenin啟動子分析結果；(b)部分為對照組。

第12圖為以西方墨點法分析在化合物(I)存在下，β-catenin下游標的基因產物的表現情形。

第13圖為利用去氧核糖核酸末端轉移酶的缺口末端標記法偵測細胞凋亡的結果量化圖。

第14圖為利用流式細胞儀分析不同劑量化合物(I)對細胞型態的影響。

第15圖為利用西方墨點法偵測在化合物(I)存在下細胞凋亡相關蛋白質的表現量。

第16圖為利用西方墨點分析法偵測施予不同劑量的化合物(I)對黑色素瘤高轉移細胞中特定的蛋白質含量的影響。

第17圖為以細胞刮傷試驗分析不同劑量的化合物(I)對於黑色素瘤高轉移細胞遷移的影響效應，其中(a)部分為顯微鏡在200倍視野下的照片，(b)部分為(a)部分計數之遷移細胞的量化結果。

第18圖為以細胞轉移試驗分析不同劑量的化合物(I)對於黑色素瘤高轉移細胞侵襲的影響效應，其中(a)部分為染色後的顯微鏡照片；(b)部分為(a)部分之結果的量化圖。

第19圖為利用西方墨點分析法化合物(I)存在下，偵測β-catenin的小干擾RNA轉染的黑色素瘤高轉移細胞之細胞轉移相關的蛋白質含量變化。

第20圖為對照組與注射化合物(I)組的B16F10移植裸鼠之生長天數與腫瘤體積的大小比較結果，其中(a)部分為受試裸鼠之腫瘤體積的比較照片；(b)部分為受試裸鼠之生長天數與腫瘤體積的大小比較圖；(c)部分為受試裸鼠之腫瘤重量的大小比較圖。

第21圖為腫瘤移植裸鼠之組織病理學檢查的顯微照片。

第22圖為化合物(I)對腫瘤移植裸鼠之細胞凋亡率的比較分析。

第23圖分別為腫瘤移植裸鼠之細胞內的各種相關蛋白表現之免疫組織化學染色的顯微鏡照片

第24圖為移植裸鼠腫瘤組織內的Wnt/β-catenin訊息路徑相關之蛋白質表現的西方墨點分析。

第25圖為第24圖之結果的量化分析。

Claims (5)

1. 一種苯醌類化合物(I)之用途，其中該苯醌類化合物(I)具有如下所示之結構： 係應用於製備抑制黑色素瘤細胞轉移(metastasis)之藥物。
2. 如請求項1所述苯醌類化合物(I)之用途，其中該抑制黑色素瘤細胞轉移之藥物為抑制黑色素瘤細胞遷移(migration)之藥物。
3. 如請求項1所述所述苯醌類化合物(I)之用途，其中該抑制黑色素瘤細胞轉移之藥物為抑制黑色素瘤細胞侵入(invasion)之藥物。
4. 如請求項1所述苯醌類化合物(I)之用途，其中該抑制黑色素瘤細胞轉移之藥物為抑制MMP-2或MMP-9活性之藥物。
5. 如請求項1所述苯醌類化合物(I)之用途，其中該製備抑制黑色素瘤細胞轉移藥物為抑制β-catenin表現之藥物。