CN107349191A

CN107349191A - 伏立诺他在制备治疗肺癌的药物中的应用

Info

Publication number: CN107349191A
Application number: CN201710679802.3A
Authority: CN
Inventors: 夏承来
Original assignee: Healthcare Hospital For Women & Children Of Foshan City
Current assignee: Healthcare Hospital For Women & Children Of Foshan City
Priority date: 2017-08-10
Filing date: 2017-08-10
Publication date: 2017-11-17

Abstract

本发明提供了伏立诺他在制备治疗肺癌的药物中的应用，所述药物应用在治疗非人小细胞肺癌的治疗中，能直接激活肿瘤细胞表面的MHC‑I类分子相关蛋白MICA表达，增加NK细胞对肺癌细胞株的杀伤能力，抑制肿瘤细胞生长；相比目前广泛用于肺癌治疗的化疗药物，副作用小；而且该药物容易定量和标准化，安全性、有效性、生物活性成分等能用常规检测手段分析，便于监管，避免因检测成本昂贵而导致的产品价格高昂，具有良好的开发前景。

Description

伏立诺他在制备治疗肺癌的药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，特别涉及伏立诺他在制备治疗肺癌的药物中的应用。

背景技术

肺癌是全球发病率最高的恶性肿瘤之一，也是引起恶性肿瘤性死亡的主要原因(参见文献Sundar R, Soong R, Cho BC, et al. Immunotherapy in the treatment ofnon-small cell lung cancer[J]. Lung Cancer, 2014,85(2): 101-9.)。其中85%的肺癌为非小细胞肺癌。由于肺癌缺乏特异性临床表现，多数患者在确诊时已属于中晚期。肺癌患者愈后欠佳，其5年生存率仅16.6%，伴远处转移的肺癌患者5年生存率仅3.9%(参见文献Domingues D, Turner A, Silva MD, et al. Immunotherapy and lung cancer:current developments and novel targeted therapies[J].Immunotherapy, 2014, 6(11): 1221-35.)。目前治疗肺癌的手术仍为手术、化疗、放疗、靶向治疗及生物免疫支持治疗。近年来，化疗药物无重大进展，且价格昂贵，副作用大，因此开发新药物及新的治疗策略，减少药物副作用，以提高病人生存率及生活质量，是肺癌治疗的发展方向。近年随着肿瘤生物学研究的深入，肿瘤免疫治疗取得较大的突破，利用肿瘤抗原物质或者药物诱导机体产生特异性细胞免疫和体液免疫应答，增强机体的抗肿瘤能力，阻止肿瘤的生长、扩散和复发，清楚或控制肿瘤，是近年研究的热点之一(Mellstedt H, Vansteenkiste J,Thatcher N. Vaccines for thetreatment of non-small cell lung cancer:investi-gational approachesand clinical experience[J]. Lung Cancer, 2011, 73(1): 11-7)。但是截至目前，暂无一个新产品被批准上市。肿瘤细胞免疫治疗产品为“活细胞”，该细胞进入体内后，具有自主性与自适性能力，不易定量，难以标准化，具有显著个性化特征，不同于药物的普适性，难以完成常规生物所需要的安全性、有效性、生物活性成分等难以接受的地步，最终导致产品因价格昂贵而根本无法惠及普通百姓，美国针对CD19的CAR-T价格估计为25万至50万美元。因此，对于“活细胞”药物的监管也是一个难题。

伏立诺他是第一个被 FDA (Food and Drug Administration，美国食品与药物管理局)批准用于治疗CTCL（cutaneous T cell lymphoma，皮肤T细胞淋巴瘤）的HDAC（histone deacetylase,组蛋白去乙酰化酶）抑制剂。伏立诺他能通过诱导细胞分化、阻断细胞周期、诱导细胞调控而发挥治疗CTCL的作用。研究显示，伏立诺他联合PARP抑制剂(poly ADP-ribose polymerase,聚腺苷二磷酸核糖聚合酶)PJ34可明显抑制HL60、MOLT4、U937、K562细胞增殖，细胞线粒体膜电位减弱，凋亡细胞百分率增加(JASEK E，GAJDA M，LISGJ，et al． Combinatorial effects of PARP inhibitor PJ34 and histonedeacetylase inhibitor vorinostat on leukemia cell lines. [J] Anticancer Res，2014，34(4):1849 -1856)。低浓度的伏立诺他和致死浓度的卡非佐米联用，可促进T淋巴细胞白血病细胞凋亡，诱导白血病细胞的G2-M 期周期阻滞，诱导细胞内ROS（Reactiveoxygen species，活性氧）急剧增加，抑制MMP（Mitochondrial membrane potential，线粒体膜电位），促进细胞色素C 释放增加，活化半胱天冬酶-9 和半胱天冬酶-3，诱导PARP 激酶分裂(参见文献GAO M，GAO L，TAO Y，et al． Proteasome inhibitor carfilzomibinteracts synergistically with histone deacetylase inhibitor vorinostat inJurkat T-leukemia cells. [J] ActaBiochimBiophys Sin (Shanghai) 2014，46(6):484-491)。随机、双盲、多中心的大规模临床研究发现，伏立诺他联合硼替佐米治疗多发性骨髓瘤能延长患者的中位生存期(参见文献DIMOPOULOS M，SIEGEL DS，LONIAL S，et al．Vorinostat or placebo in combination with bortezomib in patients withmultiple myeloma(VANTAGE 088): A multicentre，randomised，doubleblind study[J]. Lancet Oncol，2013，14(11):1129-1140)。伏立诺他可促进HSP90和微管蛋白乙酰化，抑制原发性肿瘤中HSP90病变蛋白和HDAC6的表达，增加乳腺癌细胞对紫杉类和单抗类药物敏感性(TU Y，HEＲSHMAN DL，BHALLA K，et al． A phase I-II study of the histonedeacetylase inhibitor vorinostat plus sequential weeklypaclitaxel anddoxorubicin-cyclophosphamide in locally advanced breast cancer．[J] BreastCancer Res Treat，2014，146(1):145 -152)。

但目前，尚未有文献报道伏立诺他在肺癌中的治疗作用，因此，现有技术还有待改进和提高。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供伏立诺他在制备治疗肺癌的药物中的应用，旨在解决现有技术中通过手术、化疗的方式治疗肺癌容易引起不良反应，复发率高；通过肿瘤细胞免疫治疗肺癌安全性、有效性等还有待提高，且价格高昂，难以普及应用的技术问题。

为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：

伏立诺他在制备治疗肺癌的药物中的应用。

所述的伏立诺他在制备治疗肺癌的药物中的应用，其中，所述伏立诺他为伏立诺他及其衍生物。

所述的伏立诺他在制备治疗肺癌的药物中的应用，其中，所述肺癌的癌细胞为A549、H226细胞。

所述的伏立诺他在制备治疗肺癌的药物中的应用，其中，所述药物为伏立诺他、伏立诺他的衍生物、含有伏立诺他的组合物或含有伏立诺他的衍生物的组合物中的一种。

所述的伏立诺他在制备治疗肺癌的药物中的应用，其中，所述药物的给药方式为口服或注射。

所述的伏立诺他在制备治疗肺癌的药物中的应用，其中，所述药物的剂型为片剂、糖衣丸、明胶胶囊、可注射制剂、可饮用混悬剂或可崩解糊剂中的一种或几种。

有益效果：

本发明提供了伏立诺他在制备治疗肺癌的药物中的应用，所述药物能直接激活肿瘤细胞表面的MHC-I类分子相关蛋白MICA表达，增加NK细胞对肺癌细胞株的杀伤能力，抑制肿瘤细胞生长。相比目前广泛用于肺癌治疗的化疗药物，副作用小；而且该药物容易定量和标准化，安全性、有效性、生物活性成分等能用常规检测手段分析，便于监管，避免因检测成本昂贵而导致的产品价格高昂，具有良好的开发前景。

附图说明

图1为本发明提供伏立诺他对A549、H226细胞增殖的抑制作用图。

图2为伏立诺他促进A549、H226细胞MICA mRNA表达图。

图3为伏立诺他促进A549、H226细胞表面MICA蛋白表达图。

具体实施方式

本发明提供伏立诺他在制备治疗肺癌的药物中的应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供伏立诺他在制备治疗肺癌的药物中的应用。

具体地，所述伏立诺他为伏立诺他及其衍生物。

具体地，所述肺癌的癌细胞为A549（人非小细胞肺癌细胞）、H226（人肺鳞癌细胞）细胞。

具体地，所述药物为伏立诺他、伏立诺他的衍生物、含有伏立诺他的组合物或含有伏立诺他的衍生物的组合物中的一种。

具体地，所述药物的给药方式为口服或注射。

具体地，所述药物的剂型为片剂、糖衣丸、明胶胶囊、可注射制剂、可饮用混悬剂或可崩解糊剂中的一种或几种。

以下实施例所用的材料、试剂等，如果没有特别说明，均可通过普通商业途径获取。

下述实施例中所使用的实验方法如无特别说明，均为常规方法。

实施例1 伏立诺他溶液的制备

伏立诺他购自Sigma-aldrich公司，化学文摘登记号：329825127。

DMSO（二甲基亚砜）购自Singma-aldrich公司。

用二甲基亚砜将伏立诺他配制成100mM的溶液，细胞实验使用前用PBS（磷酸盐缓冲液）稀释至所需要的浓度；动物实验中，直接称取伏立诺他0.04g溶于1mLDMSO中，配成40mg/mL的溶液，然后取100µl上述40mg/mL的伏立诺他溶液用10mL的PBS稀释，配制成4mg/mL的伏立诺他使用液。

实施例2 伏立诺他对A549、H226细胞增殖的抑制作用

将处于对数生长期的人非小细胞肺癌细胞株A549（购自中国非典型物收藏中心）、人肺鳞状细胞癌细胞株H226（购自中国非典型物收藏中心），以1000-2000细胞/孔的密度接种于96孔板中，24小时后更换为含有不同浓度（400μM、200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.13μM、1.57μM、0.78μM、0.39μM、0μM）伏立诺他的完全培养基处理细胞72小时，用CCK-8法（细胞活性毒性检测法）检测细胞增殖情况，检测方法参见《医学免疫学实验技术》（苏州大学出版社，出版日期：2011年2月）。

如图1所示，随着浓度的增加，伏立诺他抑制人非小细胞肺癌细胞株A549增殖的IC50（half maximal inhibitory concentration，半抑制浓度）值是3.29±0.36μM；伏立诺他对人肺鳞状细胞癌细胞株H226的IC50值大于400μM。说明伏立诺他能直接抑制人非小细胞肺癌细胞株A549，不能直接抑制人肺鳞状细胞癌细胞株H226。

实施例3 伏立诺他促进A549、H226细胞MICA mRNA表达

1. Trizol法抽提细胞RNA：

（1）将处于对数生长期的A549、H226细胞（购自中国非典型物收藏中心），分别用浓度为0μM、0.5μM、1.0μM、1.5μM、2.0μM、5μM、10μM、15μM、20μM的伏立诺他溶液处理72h以及分别用10μM的伏立诺他处理0h、24h、48h、72h；

（2）然后将上述经伏立诺他溶液处理后的A549、H226细胞用PBS洗涤两次（2000rpm离心5min），再加入1mLTrizol试剂，轻微晃动，均匀吹打，确保裂解液均匀分布于细胞表面；

（3）将上述含有细胞的裂解液转移至1.5mL的EP管（离心管）中，用移液枪反复吹打直至裂解充分无明显沉淀，然后室温静置5min；

（4）加入氯仿200μL，剧烈震荡30s，混匀至溶液呈乳白色，室温静置5min；（5）将上述（4）中所得的溶液在4℃、12000 rcf的条件下离心15min；

（6）取出离心管，离心管中分为三层：含有RNA的无色上清液、中间白色蛋白层及带颜色的有机层，小心吸取上层水相至新的无RNA酶的1.5mLEP管中，切忌吸入中间层物质，以保证RNA纯度；加入预冷的异丙醇550μL，上下颠倒震荡混匀，-20℃静置20min；

（7）将上述（6）中所得的溶液，在4℃、16000rcf的条件下，离心20min；小心弃掉上清液，可观察到离心管底部有白色沉淀；

（8）向含有沉淀的EP管中加入1mL预冷的75%乙醇（0.75mL无水乙醇加入0.25mLDEPC水，临用前配制），上下轻轻颠倒洗涤沉淀， 4℃、7500rcf，离心5min，清洗2次；弃上清液，室温下空气干燥5-10min，使酒精完全挥发，注意时间不宜过长，以免影响RNA的溶解；待酒精挥发后，加入15-20μL的DEPC（diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯）水溶解处理沉淀，所得RNA溶解液于-80℃保存。

2. RNA质量检测：将提取的RNA稀释一定比例后，用Nanodrop分光光度计检测RNA的OD260/OD280（OD,optical dendity，光密度）比值，以OD260/OD280比值在1.8-2.0之间为标准，记录RNA浓度。

3. RNA反转为cDNA（complementary DNA，脱氧核糖核苷酸），在PCR仪上设定反应条件：37℃，15min；85℃，5s；反应后于4℃保存。合成好的cDNA放置于-20℃冰箱长期储存。实验反应体系如表1所示：

表1：

4.荧光定量PCR，反应体系的配制在冰上操作。在ABI公司的Step one plus设定反应条件：95℃，30s；（95℃，5s；60℃，30s）循环40次；60℃，30s；95℃，15s； 60℃，1min；95℃，15s。实验反应体系如表2所示：

表2：

如图2所示，随着伏立诺他的浓度的增加及处理时间的增长，A549、H226细胞MICA mRNA表达增加。说明伏立诺他可以促进A549、H226细胞MICA mRNA表达，并具有浓度及时间依赖性。

实施例4 伏立诺他促进A549、H226细胞表面MICA蛋白表达

以正常肺上皮细胞Bease-2B细胞为对照，取处于对数生长期的Bease-2B、A549、H226细胞（购自中国非典型物收藏中心），分别用伏立诺他（0μM、2.5μM、5μM、10μM）处理后，收集细胞到离心管，1200rpm离心10分钟；弃掉上清液，用PBS 2mL洗涤2次,分别对上述3种细胞进行计数,调整细胞浓度为1 X 10⁷/mL；分管，每管加入lX10⁶/0.1mL细胞悬液，按1μg/10⁶细胞浓度加入鼠抗人MICA mAb（MICA抗体），对照管加入鼠抗人IgGl（IgG，免疫球蛋白），4℃标记30min；加入含0.5%BSA（牛血清白蛋白）的PBS液洗涤，1500rpm离心5min，离心2次；混匀细胞，加入FITC（异硫氰酸荧光素）标记的山羊抗鼠IgG(l:100)100uL二抗，4℃标记30min，PBS洗涤2次；混匀细胞,最后加入300μL PBS液，用流式细胞仪检测，以对照管作为空白定标，分析10⁴个细胞中阳性细胞表达率，计算百分率。

如图3所示，随着伏立诺他浓度的增加，A549、H226细胞表面MICA表达增加。而正常肺上皮细胞Bease-2B表面MICA表达增加不明显。说明伏立诺他可以促进A549、H226肿瘤细胞表面MICA表达，并具有浓度依赖性；对正常肺上皮细胞Bease-2B表面MICA表达增加不明显。

实施例5 伏立诺他增强NK细胞识别并清除肿瘤细胞的能力

采用LDH释放测定法,取A549、H226细胞为靶细胞，用含5%的胎牛血清RPMI 1640完全培养液调整细胞密度为1×10⁵/mL，添加于96孔板中，每孔50μL。分别用0μM、2.5μM、5μM、10μM伏立诺他处理靶细胞。以NK92细胞为效应细胞，倍比稀释，按（效应细胞：靶细胞）等于(5:1)的比例分别加入靶细胞各50μL；效、靶细胞自然释放组：效应细胞或靶细胞50μL， 5%的胎牛血清RPMI 1640完全培养液50μL；靶细胞最大释放组：每孔50μL靶细胞，50μL 5%的胎牛血清RPMI 1640完全培养液。铺完板后置于37℃、5%CO₂培养箱继续培养3小时，靶细胞最大释放组分别加入10μL裂解液，继续培养1小时，l000rpm，离心5min，小心吸取50μL上清，加入96孔平底酶标板中，再加入50μL LDH（乳酸脱氢酶）底物反应液，室温避光放置30min，每孔加50μL反应终止液终止反应，酶标仪上波长490nm处以空白组为基准测OD值，分别计算各组的NK细胞杀伤活性，所述NK细胞的杀伤活性的计算公式为：

NK细胞杀伤活性(%)﹦（实验组OD值-靶细胞自然释放组OD值-效应细胞自然释放组OD值)/ (靶细胞最大释放组OD值-靶细胞自然释放组OD值）X 100%。

如表3和表4所示，随着伏立诺他的浓度的增加，NK92细胞对A549、H226细胞的杀伤活性增强，有显著性差异（概率P<0.05）。

表3 伏立诺他作用A549细胞前后对NK细胞的杀伤敏感性变化

表中，药物组vs对照组，标有“**”的P<0.05，标有“*”的P<0.1。

表4 伏立诺他作用H226细胞前后对NK细胞的杀伤敏感性变化

表中，药物组vs对照组，标有“**”P<0.05。

实施例6 伏立诺他对裸鼠非小细胞肺癌异位移植瘤的抑制作用

1.实验动物来源及饲养条件：

（1）周龄BALB/c裸鼠，体重约15-17g，购于广东省医学实验动物中心，饲养于广州医科大学实验动物中心SPF级（specific pathogen free，无特定病原体）动物房。

（2）饲养环境：温度22-25℃，湿度40-60%，昼夜明暗交替时间为12h:12h。2.人非小细胞肺癌悬液制备：

（1）取状态良好的的A549细胞，培养在37℃饱和湿度、5%的CO2培养箱中；（2）光学显微镜下观察，当A549细胞达到80％左右融合时，用0.25％胰蛋白酶消化传代；

（3）在超净工作台内用 0.25％胰蛋白酶消化对数生长期的细胞，收集于离心管中，在转数为1000r/min 的离心机上离心5min，去掉上清液，加入不含血清的培养基，制成细胞悬液，按细胞密度（个/mL）=（4大格细胞总数/4）×10000×稀释倍数进行计数，并制备成浓度为5.0×10⁷个/mL的单细胞悬液备用。

3.裸鼠移植瘤模型构建：取在 SPF 环境中饲养的4周龄BALB/c裸鼠32只，体重约15-17g，消毒裸鼠左前肢近腋窝处皮肤，注射无血清培养基重悬好的A549细胞悬液0.1mL（约含5×10⁶个细胞），接种癌细胞后，继续放回原饲养室饲养，待裸鼠皮下出现粟粒大小结节时（约需1周）表示裸鼠模型构建成功。

4.裸鼠移植瘤模型药物干预及处理：

（1）采用电子游标卡尺测量裸鼠皮下肿瘤直径在0.3～0.5cm 左右，将裸鼠编号，采用随机数字表法随机分为4组，每组8只，各组的处理如表5所示：

表5：

（2）对上述裸鼠进行药物干预的时间24天后，观察其皮下肿瘤的变化，结果如表6所示：

表6 伏立诺他对裸鼠人非小细胞肺癌异位移植瘤生长的抑制作用

由表6可以看出，伏立诺他对裸鼠的人非小细胞肺癌异位移植瘤的生长有明显的抑制作用。

综上所述，本发明提供了伏立诺他在制备治疗肺癌的药物中的应用，所述药物能直接激活肿瘤细胞表面的MHC-I类分子相关蛋白MICA表达，增加NK细胞对肺癌细胞株的杀伤能力，抑制肿瘤细胞生长；相比目前广泛用于肺癌治疗的化疗药物，副作用小；而且该药物容易定量和标准化，安全性、有效性、生物活性成分等能用常规检测手段分析，便于监管，避免因检测成本昂贵而导致的产品价格高昂，具有良好的开发前景。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims

1.伏立诺他在制备治疗肺癌的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的伏立诺他在制备治疗肺癌的药物中的应用，其特征在于，所述伏立诺他为伏立诺他及其衍生物。

3.根据权利要求1所述的伏立诺他在制备治疗肺癌的药物中的应用，其特征在于，所述肺癌的癌细胞为A549、H226细胞。

4.根据权利要求1所述的伏立诺他在制备治疗肺癌的药物中的应用，其特征在于，所述药物为伏立诺他、伏立诺他的衍生物、含有伏立诺他的组合物或含有伏立诺他的衍生物的组合物中的一种。

5.根据权利要求1所述的伏立诺他在制备治疗肺癌的药物中的应用，其特征在于，所述药物的给药方式为口服或注射。

6.根据权利要求1所述的伏立诺他在制备治疗肺癌的药物中的应用，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、糖衣丸、明胶胶囊、可注射制剂、可饮用混悬剂或可崩解糊剂中的一种或几种。